CN116042644A - 一种利用CRISPR/Cas9系统突变OsHOX3基因制备改良水稻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统突变OsHOX3基因制备改良水稻的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明根据OsHOX3基因设计靶标序列，采用CRISPR/Cas9对OsHOX3基因的第一外显子进行人工突变，并筛选出功能缺失突变体。OsHOX3突变体植株穗数和穗粒数增加，穗结构得到优化，一次枝梗数增加而二次枝梗数减少，同时籽粒变得细长和垩白降低，表明OsHOX3参与改善水稻产量和稻米外观品质。OsHOX3基因可作为水稻种质资源的遗传改良育种的重要资源，有助于水稻产量和外观品质的提升。
Description
技术领域
本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统突变OsHOX3基因制备改良水稻的方法。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，提高水稻产量，对保障国家粮食安全有重大意义。确保水稻高产、稳产，是解决我国粮食安全的重要内容。随着经济的发展，人均消费能力的提高，我国人民对稻米的需求逐渐从产量向品质上转变。稻米品质是决定稻米市场竞争力的主要因素。水稻外观品质主要指垩白性状和粒形性状。
OsHOX3编码一个HD-Zip转录抑制因子，该类基因在植株的生长和发育过程中发挥重要的功能(Agalou et al.,2008,Zhou et al.,2014,Gao et al.,2016)。有课题组在KitaaKe材料中发现了OsHOX3的等位基因Small Grain and Dwarf 2，其含有9bp碱基的缺失，导致三个氨基酸的缺失。研究发现OsHOX3转录因子通过调节赤霉素生物合成，影响水稻整个生命周期中多个组织和器官的生长发育；其中该突变体植株表现出矮小，穗子和籽粒变小，千粒重下降(Chen et al.,2019)。另外为了验证，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制了两个突变体，分别在第一个外显子区域发生了3bp的缺失和1bp碱基的插入，理论上导致一个氨基酸缺失和氨基酸序列混乱(Chen et al.,2019)。
目前水稻的品种改良虽然已育出大批高产品种，但是在稻米品质尤其外观品质等指标上仍然较差。因此，本领域迫切需要发掘参与调控水稻产量和稻米品质的基因功能研究，以利于保障水稻的高产优质。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种OsHOX3突变体。
本发明的第二个目的在于提供一种OsHOX3突变体的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明保护一种OsHOX3突变体，利用CRISPR/Cas9技术将OsHOX3基因突变，导致不能翻译出有正常功能的OsHOX3蛋白，进而获得OsHOX3突变体。
现有研究表明，OsHOX3参与水稻的生长和发育过程，其中调控株高和种子大小。本发明通过二代测序技术构建和分析了水稻全生育期基因转录组数据库，归纳了水稻基因在穗发育过程中的表达模式。接着通过比较基因在幼穗时期和其他组织中的表达水平，筛选出在幼穗中高表达而在其他组织中低表达的基因，OsHOX3为其中的一个候选基因。发现对OsHOX3基因进行突变后，导致不能翻译出有正常功能的OsHOX3蛋白，可以提高水稻的产量和改善稻米外观品质。其中，OsHOX3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
OsHOX3基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
OsHOX3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，所述的突变为将SEQ ID NO.2所示的碱基序列经过插入，缺失或者替换一个或者几个碱基。
上述的突变无论采用现有技术中基因编辑的方式，还是采用还未开发的新的基因编辑技术，总之能够实现碱基序列的一个或者多个碱基的插入，缺失或者替换均可以被采用。
作为一种优选的实施方式，利用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对HOX3基因进行突变。
具体地，针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变。
其中sgRNA靶点位于第一外显子处，sgRNA序列为：5’-AACCAGAGGAGCTGAGGCCG-3’(SEQ ID NO.4)。
更具体地，利用CRISPR/Cas9系统突变OsHOX3基因的方法，具体包括以下步骤：
(1)获得转基因植株：
具体地，将设计好的靶点序列，以水稻中的粳稻品种日本晴作为受体，交托给生物公司构建载体和遗传转化，获得T0代转基因植株。
(2)对突变位点的鉴定：
具体地，步骤(2)为提取转基因植株的DNA，设计鉴定引物扩增上述DNA，送生物公司测序，获得测序结果，分析突变情况。
作为优选的实施方式，步骤(2)中，采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所述的引物对进行鉴定。
更具体地，本发明通过CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术使得OsHOX3基因的第一外显子的碱基发生缺失，而获得2个OsHOX3突变体，这两个突变体均能够提高水稻产量和改善稻米外观品质。
所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第一个外显子上的第54位碱基到第63位碱基缺失，即靶点处CCTCAGCTCC的10bp碱基缺失，得到突变体oshox3-1，突变体oshox3-1的CDS碱基序列如SEQ ID NO.7所示，该突变体能提高水稻产量20％左右，稻米垩白度降低55％左右，外观品质得到大幅度改善。
进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第一个外显子上的第55位碱基缺失，即靶点处缺失单碱基C，得到OsHOX3基因突变体oshox3-2，突变体oshox3-2的CDS碱基序列如SEQ ID NO.8所示，该突变体能提高水稻产量30％以上，稻米垩白度降低65％左右，外观品质得到大幅度改善。
进一步地，突变体oshox3-1和突变体oshox3-2均导致终止子提前，理论编码蛋白序列截断至36个(SEQ ID NO.11)和39个(SEQ ID NO.12)氨基酸。
第二方面，本发明保护OsHOX3蛋白，或OsHOX3蛋白相关生物材料，或权利要求1-3任一所述的OsHOX3，或权利要求4所述的生物材料在如下任一种中的应用：
H1)提高水稻产量；
H2)改善稻米外观品质；
H3)制备转基因水稻；
H4)水稻育种。
进一步地，所述提高水稻产量表现为与如下F1)-F3)性状中的至少一种正相关：
F1)穗数增加；
F2)穗粒数增加；
F3)穗结构优化，具体表现为一次枝梗数增加而二次枝梗数减少。
进一步地，所述改善稻米外观品质表现为与如下G1)-G2)性状中的至少一种正相关：
G1)籽粒长度增加；
G2)籽粒宽度减少；
G3)垩白米率、垩白面积和垩白度降低。
第三方面，本发明还保护如下任一种方法：
I1)一种制备OsHOX3基因突变的水稻突变体的方法，包括如下步骤：
针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变，得到纯合水稻突变体；
I2)一种提高水稻产量的方法，包括如下步骤：
针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变，从而实现产量提高；
I3)一种改善稻米外观品质的方法，包括如下步骤：
针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变，从而实现稻米外观品质改善；
I4)一种水稻育种的方法，按照I1)所述的方法获得含有OsHOX3突变体，以所述水稻突变体为品种或作为亲本材料进行育种。
进一步地，所述sgRNA靶点位于第一外显子处，sgRNA序列为：5’-AACCAGAGGAGCTGAGGCCG-3’，如SEQ ID NO.4所示。
优选的，受体水稻为粳稻。
进一步地，所述I1)-I3)具体包括如下步骤：
(1)将含有编码sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，获得T0代阳性苗；
(2)对T0代及其自交后代进行突变位点的鉴定；
优选的，步骤(2)中，突变位点的鉴定采用的PCR引物为：
HOX3-PCR-F:GATGAAAGAGAAGAGCAGCG，如SEQ ID NO.5所示；
HOX3-PCR-R:CTCCAAACCAGAAGCAAACG，如SEQ ID NO.6所示。
有益效果
1、与现有技术相比，本发明采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对OsHOX3基因的第1外显子进行人工突变，并筛选出能够显著提高水稻产量和大幅度改善外观品质的突变体。本发明提供的OsHOX3基因突变体能够将水稻产量提高到20％以上，稻米垩白度降低60％左右。
2、本发明产量调控基因的调控效果好，不仅提高水稻产量，还明显改善了稻米外观品质。与WT相比，转基因植株有效穗数增加，穗粒数增加，显著提高水稻产量。同时，粒长增加，粒宽降低，垩白度大幅度下降，改善稻米外观品质。
3、本发明的技术可以从多个产量性状提高产量，有效穗数增加；穗粒数增加；粒长增加；粒宽降低；垩白度下降；而现有的发明技术一般从1个产量性状提高产量，如仅从粒长，或者仅从穗数等提高水稻产量。
附图说明
图1为野生型日本晴、突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的株型，标尺＝10cm。
图2为野生型日本晴、突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的产量性状比较。其中，Panicle number per plant，穗数；Panicle weight，单穗重；Yield per plant，单株产量；Total spikelet，穗粒数；Seed Setting，结实率；1000-Grain Weight，千粒重。“*”表示在0.05差异水平下达到显著水平，“**”表示在0.01差异水平下达到显著水平；WT为野生型(日本晴)对照。
图3为野生型日本晴、突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的穗型、一次枝梗和二次枝梗性状的比较，标尺＝10cm。其中，Panicle length，穗长；Primary branch，一次枝梗；Secondary branch，二次枝梗。“**”表示在0.01差异水平下达到显著水平；WT为野生型(日本晴)对照。
图4为野生型日本晴、突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的籽粒表型，标尺＝1cm。其中，Grain Length，粒长；Grain Width，粒宽。“**”表示在0.01差异水平下达到显著水平；WT为野生型(日本晴)对照。
图5为野生型日本晴、突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的籽粒外观品质。其中，Chalky rate，垩白米率；Chalky area，垩白面积；Chalkiness，垩白度。“**”表示在0.01差异水平下达到显著水平；WT为野生型(日本晴)对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段：若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1、OsHOX3基因靶点设计
本实施例基于CRISPR/Cas9技术完成载体设计和构建。通过在线工具CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)设计了OsHOX3基因的靶点，该靶点位置位于第1外显子第51-70碱基处，碱基序列为5’-AACCAGAGGAGCTGAGGCCG-3’(SEQ ID NO.4)。本实施例将靶点序列进行合成。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
本实施例确定靶点后，以水稻中的粳稻品种日本晴作为受体，委托伯远生物公司构建载体和遗传转化，获得含有T0代转基因阳性苗。采集T0代植株叶片提取DNA，在OsHOX3基因靶点外围设计检测引物进行PCR检测，检测引物为：
HOX3-PCR-F:GATGAAAGAGAAGAGCAGCG(SEQ ID NO.5)，
HOX3-PCR-R:CTCCAAACCAGAAGCAAACG(SEQ ID NO.6)。
将PCR产物送到擎科生物公司测序，将测序结果与OsHOX3基因原始序列(SEQ IDNO.1)比对，确定各个株系的OsHOX3基因编辑情况，筛选出发生突变的T0代阳性植株，移到温室繁种。
T0代阳性植株自交一代得到T1代。将T0代阳性植株进行收种，进行T1代的种植，采集T1代植株叶片提取DNA，使用如上的检测引物进行检测，确定OsHOX3基因突变类型为杂合突变体或者纯合突变体；同时设计潮霉素检测引物，引物序列为：HPTF2：CTCTATTTCTTTGCCCTCGG(SEQ ID NO.9)，HPTR2：CAAGGAATCGGTCAATACAC(SEQ ID NO.10)，筛除潮霉素抗性基因。筛选出2种突变类型为杂/纯合突变同时HPT检测为阴性(即无抗性)的植株进行收种。
将筛选出的T1代进行收种，进行T2代的种植。对T2代植株进行如T1代的检测方法，筛选出2种纯合且无抗性的突变体植株进行收种。
相应突变体如下：突变体oshox3-1第一个外显子上的第54位碱基到第63位碱基缺失，即靶点处CCTCAGCTCC的10bp碱基缺失，CDS碱基序列如SEQ ID NO.7所示；
突变体oshox3-2第一个外显子上的第55位碱基缺失，即靶点处缺失单碱基C，CDS碱基序列如SEQ ID NO.8所示；
突变体oshox3-1和突变体oshox3-2均导致终止子提前，理论编码蛋白序列截断至36个(SEQ ID NO.11)和39个(SEQ ID NO.12)氨基酸。
实施例3、转基因植株的产量性状和籽粒外观品质鉴定
本实施例将获得的纯合突变体oshox3-1和纯合突变体oshox3-2在田间种植，观察不同时期的植株形态，对两种突变体的结实率、穗粒数、有效穗、千粒重和单株产量等产量指标进行统计，发现突变体oshox3-1和突变体oshox3-2都显著增加单株产量。
突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的株高没有变化(图1)。
和WT(NIP)相比，突变体oshox3-1和突变体oshox3-2每株穗数和穗粒数均极显著增加，突变体oshox3-1结实率和千粒重显著减少，而突变体oshox3-2结实率和千粒重没有显著变化，但突变体oshox3-1单株产量提高20％以上，突变体oshox3-2单株产量提高30％以上(图2)。
另外，OsHOX3基因的突变导致穗型发生变化。突变体oshox3-1和突变体oshox3-2穗子变长，穗结构得到优化，表现为一次枝梗数显著增加和而二次枝梗数显著减少(图3)。
接着，对突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的籽粒形态进行了考察。统计结果显示，突变体oshox3-1和突变体oshox3-2籽粒变得细长，籽粒变长且达到显著水平，籽粒宽度变小且达到显著水平(图4)。
进一步地，对OsHOX3突变体的稻米外观品质进行考察。OsHOX3基因的突变导致垩白米率、垩白面积和垩白度显著降低(图5)。如图5所示，可以直观看出与野生型相比，突变体oshox3-1和突变体oshox3-2的精米垩白度降低，其中突变体oshox3-1垩白度下降55％左右，突变体oshox3-2垩白度下降了65％左右。两种突变体稻米外观品质均得到大幅度改善。
因此，以上结果表明，利用CRISPR/Cas9系统突变OsHOX3基因能提高水稻产量20％以上，稻米垩白度降低60％左右，外观品质得到大幅度改善。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种OsHOX3突变体，利用CRISPR/Cas9技术将OsHOX3基因突变，导致不能翻译出有正常功能的OsHOX3蛋白，进而获得OsHOX3突变体；
所述OsHOX3基因为下述任一种：
A1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
A2)其CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的OsHOX3突变体，其特征在于，所述OsHOX3蛋白如下任一种：
B1）氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
B2）将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的OsHOX3突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列选自如下C1）-C4）：
C1）氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
C2）将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1）所示的蛋白质具有90%以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3）氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
C4）将SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C3）所示的蛋白质具有90%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
4.与权利要求1所述的OsHOX3突变体相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述D1)至D2）中的任一种；
D1）编码OsHOX3突变体的核酸分子；
D2）含有D1）所述核酸分子的重组载体、转基因植物细胞系、转基因植物组织；
优选的，所述核酸分子为如下任一种：
E1）核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
E2）核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.OsHOX3蛋白，或OsHOX3蛋白相关生物材料，或权利要求1-3任一所述的OsHOX3，或权利要求4所述的生物材料在如下任一种中的应用：
H1）提高水稻产量；
H2）改善稻米外观品质；
H3）制备转基因水稻；
H4）水稻育种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高水稻产量表现为与如下F1）-F3）性状中的至少一种正相关：
F1）穗数增加；
F2）穗粒数增加；
F3）穗结构优化，具体表现为一次枝梗数增加而二次枝梗数减少。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改善稻米外观品质表现为与如下G1）-G2）性状中的至少一种正相关：
G1）籽粒长度增加；
G2）籽粒宽度减少；
G3）垩白米率、垩白面积和垩白度降低。
8.如下任一种方法：
I1）一种制备OsHOX3基因突变的水稻突变体的方法，包括如下步骤：
针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变，得到纯合水稻突变体；
I2）一种提高水稻产量的方法，包括如下步骤：
针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变，从而实现产量提高；
I3）一种改善稻米外观品质的方法，包括如下步骤：
针对OsHOX3基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsHOX3基因的人工定点突变，从而实现稻米外观品质改善；
I4）一种水稻育种的方法，按照I1)所述的方法获得含有OsHOX3突变体，以所述水稻突变体为品种或作为亲本材料进行育种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述sgRNA靶点位于第一外显子处，sgRNA序列为：5’-CCCCGGCCTCAGCTCCTCTGGTT-3’，如SEQ ID NO.4所示；优选的，受体水稻为粳稻。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述I1)-I3）具体包括如下步骤：
（1）将含有编码sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，获得T0代阳性苗；
（2）对T0代及其自交后代进行突变位点的鉴定；
优选的，步骤（2）中，突变位点的鉴定采用的PCR引物为：
HOX3-PCR-F: GATGAAAGAGAAGAGCAGCG，如SEQ ID NO.5所示；
HOX3-PCR-R:CTCCAAACCAGAAGCAAACG，如SEQ ID NO.6所示。
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