CN116042497A - 一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物育种，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌基因组中缺失了噬菌体蛋白合成相关基因簇，作为适宜的底盘菌株，还可以进一步异源过表达耐酸性高温α‑淀粉酶基因。本发明从实验和生产中的实际情况出发，分析影响高密度发酵菌体裂解的不良因素，通过对基因工程宿主的改造，最终获得了一种能够减缓菌体自溶以及高产耐酸性高温α‑淀粉酶的基因工程菌株，并且为构建耐酸性高温α‑淀粉酶高产底盘菌株提供了新的思路。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用。

背景技术

在众多的工业用酶中，主要产自微生物的耐酸性高温α-淀粉酶的最适pH值为4.0～6.0，最适温度在24～115℃，多项研究表明耐酸性高温α-淀粉酶可按照生产需求应用于以淀粉为原料的部分行业，可谓是淀粉深加工业的福音，例如可应用于淀粉深加工业生产各种黏着剂、浆糊等，生产各种糊精；应用于酿造发酵业进行原料的液化处理；应用于纺织品工业用于各种织物退浆以及用于医药行业制备消化助剂等；应用于饲料行业制备饲料添加剂；用于清洁行业制造清洁剂等。耐酸性高温α-淀粉酶凭借其节约淀粉加工原料、降低不必要劳动力消耗、简化部分淀粉深加工的加工工艺、减少酸碱等废弃物的排放、促进经济发展的优势在酶制剂市场占有举足轻重的地位。

虽然产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株众多，但是各种菌株的产量有所不同，能够满足工业化大规模生产需求的菌株只有其中一小部分。据已有报道，与其他菌种相比芽孢杆菌发酵周期相对较短且易于操作、酶活力高。基于以上优点，工业化生产耐酸性高温α-淀粉酶多用芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌作为重要的工业用菌，对其基因组进行精简，在维持其基因稳定的同时，也能达到优化代谢网络，改善细胞的能量利用效率，提高细胞生理性能的预测性及可控性的目的，获得性能优秀的工业底盘。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是通过对基因工程宿主的基因组精简改造，提供一种能够减缓菌体自溶或裂解的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株，以及将其应用于生产耐酸性高温α-淀粉酶能够显著提高产量。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌基因组中缺失了如下基因：

(a)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第2058955-2098506位的DNA片段，

(b)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第91163-113038位的DNA片段，

(c)核苷酸序列如NCBI GenBank:FN597644.1所示的基因组第3129769-3164233位的DNA片段，

(d)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP021505.1所示的基因组第1338404-1369338位的DNA片段，

和可选的缺失了(e)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP054415.1所示的基因组第905524-928629位的DNA片段；

优选的，该基因工程菌还异源过表达耐酸性高温α-淀粉酶基因。

第二方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括：在解淀粉芽孢杆菌中，将所述(a)、(b)、(c)、(d)的基因全部或部分的敲除，和可选的将所述(e)的基因全部或部分的敲除，获得底盘菌株；优选的，进一步在底盘菌株中引入耐酸性高温α-淀粉酶基因。

第三方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在生产耐酸性高温α-淀粉酶中的应用。

第四方面，本发明提供一种高效生产耐酸性高温α-淀粉酶的方法，所述方法是指在培养基中培养如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，并从其培养后的细胞和/或培养基中收集耐酸性高温α-淀粉酶。

本发明的有益效果如下：

本发明从实验和生产中的实际情况出发，分析影响高密度发酵菌体裂解的不良因素。基因组岛是一类具有特定结构和功能的大片段DNA的总称，一般被认为是通过水平基因转移产生的，细菌可经过接合、转导、转化等方式获得基因组岛。本发明中通过基因组、转路组信息以及结合预测软件，预测得出解淀粉芽孢杆菌中噬菌体来源的基因组岛基因序列，并从中选取了噬菌体基因1，噬菌体基因2，噬菌体基因3，噬菌体基因4，噬菌体基因5序列作为靶基因缺失，进而有针对性地简化解淀粉芽孢杆菌基因组，去除非必需基因干扰，以降低基因组的复杂度，提高解淀粉芽孢杆菌对底物和能量的利用效率，最终获得能够表达异源蛋白的理想宿主细胞。

本发明提供了一种菌体裂解减缓且能够高产耐酸性高温α-淀粉酶的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株，在单个敲除噬菌体基因1，噬菌体基因2，噬菌体基因3，噬菌体基因4，噬菌体基因5后发现菌体自溶减缓；进一步在此基础上串联敲除以上噬菌体基因簇分别获得了重组菌，通过60h摇瓶发酵，发现24h发酵液酶活力最高达到910.4821U/mL，相比对照菌(674.33U/mL)提高了35％。串联敲除菌株在60h仍有效的表达耐酸性高温α-淀粉酶，而且酶活分别是对照菌的1.34倍、1.44倍、2.05倍、1.51倍。说明串联敲除基因簇能够有效的提高活菌数量的同时显著提高高温α-淀粉酶的酶活，此种方法也适合于提高其他外分泌蛋白的表达量。

附图说明

图1：基因敲除验证；其中，M：Marker；1：噬菌体基因1验证条带；2：噬菌体基因2验证条带；3：噬菌体基因3验证条带；4：噬菌体基因4为验证条带；5：噬菌体基因5验证条带。

图2：基因单个敲除菌株与对照菌株△upp的生长曲线比较。

图3：基因单个敲除菌株与对照菌株△upp的活菌计数比较。

图4：基因串联敲除菌株与对照菌株△upp的生长曲线比较。

图5：基因串联敲除菌株与对照菌株△upp的活菌计数比较。

图6：基因串联敲除菌株和对照菌株△upp表达耐酸性高温α-淀粉酶的酶活比较。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明用语“前噬菌体”或“噬菌体基因”是指温和噬菌体侵入其敏感宿主后，整合在宿主基因组上的核酸。示例性的，在本发明中，“噬菌体基因1”代表了核苷酸序列如NCBIGenBank:CP018902.1所示的基因组第2058955-2098506位的DNA片段；“噬菌体基因2”代表了核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第91163-113038位的DNA片段；“噬菌体基因3”代表了核苷酸序列如NCBI GenBank:FN597644.1所示的基因组第3129769-3164233位的DNA片段；“噬菌体基因4”代表了核苷酸序列如NCBI GenBank:CP021505.1所示的基因组第1338404-1369338位的DNA片段；“噬菌体基因5”代表了核苷酸序列如NCBIGenBank:CP054415.1所示的基因组第905524-928629位的DNA片段。

第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌基因组中缺失了如下的基因：

(a)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第2058955-2098506位的DNA片段，

(b)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第91163-113038位的DNA片段，

(c)核苷酸序列如NCBI GenBank:FN597644.1所示的基因组第3129769-3164233位的DNA片段，

(c)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP021505.1所示的基因组第1338404-1369338位的DNA片段，

和可选的缺失了(e)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP054415.1所示的基因组第905524-928629位的DNA片段。

根据本发明，作为底盘菌株为了进一步高产耐酸性高温α-淀粉酶，该基因工程菌还异源过表达耐酸性高温α-淀粉酶基因。

根据本发明一种优选的实施方式，所述耐酸性高温α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述耐酸性高温α-淀粉酶基因不限于SEQ ID NO：1，还可以包括作为SEQ ID NO:1的变体核苷酸序列或与SEQ ID NO:1同源，且编码耐酸性高温α-淀粉酶的变体的基因。例如，还可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列。

根据本发明，缺失上述基因的方式可以采取遗传工程技术常规手段，例如，通过同源重组、基因编辑技术等具体手段使该基因全部或部分的被敲除。

根据本发明一种优选的实施方式，所述解淀粉芽孢杆菌基因组中如上所述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的基因被敲除至少一个，例如，单个敲除核苷酸序列如(a)或(b)或(c)或(d)或(e)所示的基因，或串联敲除核苷酸序列如(a)和(b)所示的基因，或串联敲除核苷酸序列如(a)和(b)和(c)所示的基因，或串联敲除核苷酸序列如(a)和(b)和(c)和(d)所示的基因，或串联敲除核苷酸序列如(a)和(b)和(c)和(d)(e)所示的基因。敲除的方式可以采取本领域常规手段，例如，可以利用CRISPR/Cas9n技术，通过构建敲除载体实现上述基因从基因组中敲除。

根据本发明，异源过表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使耐酸性高温α-淀粉酶基因的表达盒插入在解淀粉芽孢杆菌的基因组中，或者通过本领域常规手段将包含有耐酸性高温α-淀粉酶基因表达盒的表达载体转入解淀粉芽孢杆菌中。

根据本发明，所述过表达是指该基因表达产物的量显著高于原有水平。例如，提高了150％或更多，200％或更多，300％或更多。

根据本发明一种优选的实施方式，所述耐酸性高温α-淀粉酶基因的异源过表达是通过将包含耐酸性高温α-淀粉酶表达盒的表达质粒(P_ly-2-SPamyE-amyd-pWB980)电转入解淀粉芽孢杆菌中实现的。该表达质粒包含了优选的强启动子P_ly-2和信号肽SPamyE。

根据本发明，用于构建所述解淀粉芽孢杆菌基因工程菌株的出发菌株可以是任意的解淀粉芽孢杆菌，根据本发明一种优选的实施方式，所述出发菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.11218(该菌种的生物保藏信息已公开于专利申请CN105087448A)。

第二方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括：在解淀粉芽孢杆菌中，将如上所述(a)、(b)、(c)、(d)的基因全部或部分的敲除，和可选的将所述(e)的基因全部或部分的敲除，获得底盘菌株；优选的，进一步在底盘菌株中引入耐酸性高温α-淀粉酶基因。

以上第一方面已经详细介绍了上述各基因的选择、宿主的选择等，此处不再赘述第一方面已经介绍过的内容。

根据本发明一种具体实施方式，所述构建方法包括：在出发菌株解淀粉芽孢杆菌中单个敲除如上所述(a)或(b)或(c)或(d)或(e)所示的基因，得到菌株BA△1或BA△2或BA△3或BA△4或BA△5；或在菌株BA△1中进一步敲除如(b)所示的基因，得到菌株BAΔ12；或在菌株BAΔ12中进一步敲除如(c)所示的基因，得到菌株BAΔ123；或在菌株BAΔ123中进一步敲除如(d)所示的基因，得到菌株BAΔ1234；或在菌株BAΔ1234中进一步敲除如(e)所示的基因，得到菌株BAΔ12345。

如上所述构建的各敲除菌株作为解淀粉芽孢杆菌底盘菌株具有不同程度的菌体自溶减缓或降低的效果。进一步地，将含有耐酸性高温α-淀粉酶基因表达盒的表达载体转入上述菌株中，得到高产耐酸性高温α-淀粉酶的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌。

根据本发明一种更为优选的实施方式，所述构建方法包括如下步骤：

S1、敲除靶基因、获得各敲除菌株

所述靶基因包括如上所述(a)或(b)或(c)或(d)或(e)所示的基因，更优选的，所述基因包括如上所述(a)、(b)、(c)和(d)的基因；所述靶基因均按照如下步骤敲除，需要说明的是，上述基因敲除的顺序并不影响本发明目的的实现，只要最终能达到对应的基因DNA片段全部被敲除的结果即可，根据本发明具体实施方式所采取的敲除顺序仅仅是为了获得各步骤中间菌株以便于进行敲除效果的比较：

使用CRISPR/Cas9n基因敲除系统，以芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHY300PLK和温敏型芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pWH-T2为载体，将由启动子P_xylA控制的Cas9n蛋白构建到pHY300PLK质粒得到Cas9n表达质粒，将由启动子P_amy控制的sgRNA表达盒以及上下游同源臂修复序列构建到温敏型pWH-T2质粒得到sgRNA表达质粒。

上述两个质粒化转至大肠杆菌EC135/pM.Bam中进行甲基化修饰。

1)将Cas9n表达质粒pHY300-plk-Cas9n，经甲基化修饰后，电转至解淀粉芽孢杆菌中；

2)制备带有pHY300-plk-Cas9n的解淀粉芽孢杆菌的感受态；

3)构建双质粒系统的菌株；

4)将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入LB液体培养基中，培养4-6h，培养基中加入4％浓度的木糖诱导Cas9n切割基因组；

5)木糖诱导培养18小时后的菌液，传代到45度培养，每12小时进行一次传代，传代2次后，将菌液稀释涂布于无抗平板；

6)将无抗平板上的单菌落对点于Tet+Kan平板，不能在Tet+Kan平板上生长的菌落是质粒消除的菌株，对此菌株进行菌批验证。

上述各步骤的具体操作方法根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现。

S2、异源过表达耐酸性高温α-淀粉酶基因

将携带耐酸性高温α-淀粉酶表达盒的重组质粒电转化入步骤S1获得的单基因敲除菌株BA△1以及串联敲除菌株BA△12，BA△123，BA△1234，BA△12345中，得到高产耐酸性高温α-淀粉酶的各基因工程菌株命名为BA△P1，BA△P12，BA△P123，BA△P1234，BA△P12345，作为对比，同时也将重组质粒电转化入出发菌株中得到基因工程菌株命名为BA△upp，上述得到基因工程菌株通过摇瓶发酵生产耐酸性高温α-淀粉酶，参照国标法测定耐酸性高温α-淀粉酶的酶活力。

根据本发明一种优选的实施方式，所述耐酸性高温α-淀粉酶通过重组质粒P_ly-2-SPamyE-amyd-pWB980转入菌株，其中启动子P_ly-2与信号肽SPamyE的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。所述重组质粒P_ly-2-SPamyE-amyd-pWB980的构建可以参照专利申请CN112522173A的实施例1，也可以采取其他本领域常规手段。

第三方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌株在生产耐酸性高温α-淀粉酶中的应用。

第四方面，本发明提供一种高效生产耐酸性高温α-淀粉酶的方法，所述方法是在培养基中培养上述解淀粉芽孢杆菌基因工程菌株，并从其培养后的细胞和/或培养基中收集耐酸性高温α-淀粉酶。

根据本发明一种优选的实施方式，所述培养基的组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；

解淀粉芽孢杆菌感受态制备培养基：

LBS培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L；

复苏培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L，甘露醇6.92246g/L。

耐酸性高温α-淀粉酶酶活力的测定方法参照GB/T24401-2009：包括稀碘液、终浓度20g/L可溶性淀粉溶液PH6.0的磷酸缓冲液和浓度为0.1mol/L的盐酸溶液。4mL可溶性淀粉溶液(20g/L)和1mL磷酸缓冲液(PH6.0)混匀，70℃预热8分钟后加入适当稀释后的酶液1mL在70℃下反应5分钟后加入到5mL稀碘液和500uL盐酸(0.1mol/L)的混合溶液中显色，在660nm下测定吸光度。每一样品设三次重复，结果取平均值。

以下实施例所涉及的部分菌株及质粒见于表1和表2：

表1菌株信息

表2质粒信息

质粒	用途	抗性
			pHY300-PLK	敲除载体	穿梭质粒
pWH-T2	敲除载体	Kana
			<![CDATA[P<sub>ly-2</sub>-SPamyE-amyd--pWB980]]>	携带耐酸性高温α-淀粉酶表达盒	Kana

以下实施例所涉及的引物信息如表3所示：

表3引物信息

实施例1：基因工程菌株的构建

(1)敲除靶基因

1)pHY300-Cas9n质粒构建

分别用引物P_xylA-F/P_xylA-R和Cas9n-1-F/Cas9n-1-R、Cas9n-2-F/Cas9n-2-R以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)和质粒DNA为模板扩增纯化回收后，通过无缝克隆酶，重组至已双酶切(Bgl Ⅱ/BamH Ⅰ)回收的pHY300PLK载体，连接产物热击化转至大肠杆菌JM109。经PCR验证并进一步测序确认后，获得重组载体pHY300-Cas9n。

无缝克隆酶反应体系如下：

无缝克隆酶	5μL
		线性载体	xμL
插入片段	yμL

混合均匀后，50℃水浴反应15min。

PS：首先使用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测量线性载体，上下游同源臂UP和DOWN端的DNA浓度，根据公式：

pmols＝质量ng/(片段长度bp×0.65KDa)，

x：y＝1：2；x+y＝5，

此外，x、y的添加量应在0.01～0.25pmols之间，由此计算线性载体和插入片段的添加量。

2)重组质粒pWH-T2-sgRNA-Ha的构建

大片段噬菌体基因簇采用多个sgRNA进行敲除，以敲除噬菌体基因1为：通过CRISPR RGEN Tools网站在线设计sgRNA识别的靶序列，在基因CDs区+68和+37401位置各选择20bp，作为N20靶序列，从质粒pJMP2扩增sgRNA-scaffold支架，使用Pamy-F/R引物从pLY-3质粒中扩增出Pamy启动子，分别构建Pamy-sgRNA1和Pamy-sgRNA2，使用引物P1-UP-F/R和P1-DOWN-F/R将上、下游同源臂扩增得到各1500bp片段，组成同源修补模板HaP1。以质粒pWH-T2用作sgRNA构建骨架，将组装的片段Pamy-sgRNA1-Pamy-sgRNA2-HaP1插入经XBaⅠ/SmaⅠ双酶切的pWH-T2中，构建成pWH-T2-sgRNA-HaP1。以同样的方式分别构建噬菌体基因2、噬菌体基因3、噬菌体基因4、噬菌体基因5的敲除质粒pWH-T2-sgRNA-HaP2、pWH-T2-sgRNA-HaP3、pWH-T2-sgRNA-HaP4和pWH-T2-sgRNA-HaP5。

扩增反应体系如下：

引物F	2μL
		引物R	2μL
DNA模板	2μL
		PrimerStar酶	25μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	19μL

扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：56℃45s；延伸：72℃5s；反应30个循环；延伸：72℃，10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物。

3)构建成功的pHY300-Cas9n载体和pWH-T2-sgRNA-HaP1载体，通过热击法转化将其转入提前制备的大肠杆菌EC135/pM.Bam感受态，并将转化后的感受态细胞涂布于100μg/mL氨苄青霉素(Amp)和50μg/mL奇霉素(Spe)的抗性筛选平板，37℃倒置培养，提取转化子质粒并验证。挑取新活化的验证正确的转化子单菌落于5mL液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养，待OD₆₀₀达到0.2-0.4时，加入终浓度为80mg/L的阿拉伯糖诱导，37℃、220r/min振荡培养过夜，提取经芽孢杆菌限制—修饰系统中pM.Bam质粒修饰后的重组表达载体质粒，至此，靶基因敲除载体构建成功。

4)将构建成功的基因敲除载体转化入解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.11218)感受态细胞(吸取感受态细胞与DNA的混合物至预冷的电转杯中，冰浴静置3min，电击电压2500V，迅速加入1mL溶液C，混匀，37℃、220r/min复苏3h；)4000r/min离心5min，取适量涂布于40μg/mL Tet和50μg/mL Kan抗性筛选平板，37℃倒置培养，后挑取转化子单菌落进行PCR验证，将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入LB液体培养基中，培养4-6h，培养基中加入1％浓度的木糖诱导Cas9n切割基因组。木糖诱导培养18小时后的菌液经稀释，涂布于Tet+Kan双抗性的LB平板，获得一定数量的单菌落，待进一步验证。

5)将验证正确的克隆接种至无抗的液体培养基中，45℃，220r/min的摇床中培养2-3代，将菌液稀释涂布于无抗平板，将无抗平板上的单菌落对点于Tet+Kan平板，不能在Tet+Kan平板上生长的菌落是质粒消除的菌株，为保证成功率，可一次对点多个菌落以确保获得质粒消除的菌株。以丢失pHY300-Cas9n质粒和pWH-T2-sgRNA-HaP1质粒，最终筛选Tet和Kan抗性敏感的菌株，阳性克隆的PCR验证结果如图1所示，并进一步测序确认，获得基因敲除成功的重组菌。

6)按照上述步骤1)至步骤5)的操作分别敲除各靶基因，得到各敲除菌株命名为(表1)：BA△1，BA△2，BA△3，BA△4，BA△5，BA△12，BA△123，BA△1234，BA△12345。涉及的引物参见表3。除特别说明外，敲除各靶基因的操作方法与条件基本相同。以上得到的敲除菌株以及出发菌株(记为BA)均可以作为转入及表达耐酸性高温α-淀粉酶基因的宿主。

(2)引入耐酸性高温α-淀粉酶基因

耐酸性高温α-淀粉酶基因amyd通过重组质粒P_ly-2-SPamyE-amyd-pWB980转入上述各敲除菌株BA△1，BA△2，BA△3，BA△4，BA△5，BA△12，BA△123，BA△1234，BA△12345中分别得到重组菌命名为：BA△P1，BA△P2，BA△P3，BA△P4，BA△P5，BA△P12，BA△P123，BA△P1234，BA△P12345。

1)由生物技术公司合成启动子与信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)；

2)利用PCR技术扩增耐酸性高温α-淀粉酶基因(SEQ ID NO：1，GenBank:FJ792701.1)，对其进行纯化回收，引物的选择参见表3，反应体系及反应条件如下：

3)利用从生物技术公司购买的无缝克隆酶将启动子与信号肽片段、耐酸性高温α-淀粉酶基因回收片段及线性化载体连接；连接体系如下：

4)将步骤3)中的反应体系50℃反应15min后化转到大肠杆菌EC135.PM.Bam中，37℃，220r/min到OD＝0.2～0.3时加80uL阿拉伯糖诱导质粒甲基化，30℃摇床过夜培养，提质粒；

5)将验证正确的质粒电转至出发菌株；同时分别电转至各敲除菌株中，验证阳性转化子。

实施例2：利用基因工程菌生产耐酸性高温α-淀粉酶

摇瓶发酵：将实施例1得到的各基因工程菌株在LB平板上进行三区划线，37℃倒置培养过夜，挑取活化的单菌落于5mL LB培养基中，37℃，220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于50mL LB液体培养基，37℃，220r/min振荡培养60h。根据实验去求定点取样，适当稀释后按照国标法测定耐酸性高温α-淀粉酶活力。

通过测量生长曲线和活菌数(图2、图3)，单基因敲除菌株(BA△P1，BA△P2，BA△P3，BA△P4，BA△P5)与对照菌株(BA△upp)相比，自溶效果减缓，进一步通过敲除菌株与对照菌株的活菌计数比较(图3)，能明显看到，相关基因的缺失能够有效提高活菌的数量。为了进一步提升效果，又对相关基因进行了不同程度的串联敲除，相比单个基因敲除菌又明显进一步改善了菌株的生长状况(图4)，同时通过活菌计数(图5)可以看出，经过串联敲除更进一步缓解了菌体的自溶现象，串敲敲除菌株(BA△P12，BA△P123，BA△P1234，BA△P12345)在发酵48h后的活菌数量均高于对照菌(BA△upp)，分别是对照的2.15倍、2.20倍、2.18倍、2.17倍。通过国标法测定基因工程菌表达耐酸性高温α-淀粉酶的酶活力进行比较(图6)，发酵24h后菌株BA△P1234表达耐酸性高温α-淀粉酶的酶活力最高高达910.4821U/mL，比对照菌(674.33U/mL)提高了35％。串联敲除菌株(BA△P12，BA△P123，BA△P1234，BA△P12345)在60h仍有效的表达耐酸性高温α-淀粉酶，而且酶活分别是对照菌的1.34倍、1.44倍、2.05倍、1.51倍。

可见，本发明通过对解淀粉芽孢杆菌基因组进行精简，敲除相关噬菌体基因，最终获得了菌体自溶减缓并能够高效异源表达耐酸性高温α-淀粉酶的基因工程菌株，并且为构建淀粉酶高产底盘菌株提供了创新思路。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

Claims (9)

1.一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌基因组中缺失了如下基因：

(a)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第2058955-2098506位的DNA片段，

(b)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第91163-113038位的DNA片段，

(c)核苷酸序列如NCBI GenBank:FN597644.1所示的基因组第3129769-3164233位的DNA片段，

(d)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP021505.1所示的基因组第1338404-1369338位的DNA片段，

和可选的缺失了(e)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP054415.1所示的基因组第905524-928629位的DNA片段；

优选的，该基因工程菌还异源过表达耐酸性高温α-淀粉酶基因。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌基因组中缺失了所述(a)、(b)、(c)和(d)的基因，还异源过表达耐酸性高温α-淀粉酶基因。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌基因组中缺失了所述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的基因，还异源过表达耐酸性高温α-淀粉酶基因。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述耐酸性高温α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.如权利要求1-4所述的基因工程菌，其特征在于，所述耐酸性高温α-淀粉酶基因通过重组质粒P_ly-2-SPamyE-amyd-pWB980转入菌株，其中，启动子P_ly-2与信号肽SPamyE的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.如权利要求1-4所述的基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的出发菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.11218。

7.权利要求1-6任一所述基因工程菌在发酵生产耐酸性高温α-淀粉酶中的应用。

8.一种生产耐酸性高温α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法是在培养基中培养权利要求1-6任一所述基因工程菌，并从其培养后的细胞和/或培养基中收集耐酸性高温α-淀粉酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基的组成如下：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

Images