CN116036244A - 培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于治疗含抑制物的血友病A的用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了培重组人凝血因子VIII‑Fc融合蛋白用于制备治疗含抑制物的血友病A的药物的用途。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域,特别是涉及培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于治疗含抑制物的血友病A的用途。
背景技术
在接受FVIII替代疗法的重度血友病A患者中(血浆FVIII:C<1%),20-30%的患者体内都会在接受一定暴露日的FVIII治疗后,产生不同程度的FVIII抑制物,当抑制物滴度≥0.6BU/mL,即确诊为含抑制物的血友病A。患者体内的抑制物会中和注射入体内的FVIII活性,导致因子替代治疗无效。大部分含抑制物的血友病A(HAWI)患者,只能接受高剂量FVIII治疗、猪源FVIII、旁路凝血药物治疗(凝血酶原复合物、活化七因子)、非因子药物治疗(艾美赛珠双抗)、或者采用免疫耐受诱导治疗(ITI治疗),进行止血、预防或者通过降低抑制物滴度来缓解症状。这些疗法,存在治疗费用高昂,或者治疗效果有限等限制因素。目前,在临床应用上,针对HAWI患者的特效药物十分短缺。
专利申请WO2019219049A1公开了培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白,是一种聚乙二醇(PEG)修饰的重组人凝血FVIII-Fc融合蛋白,不仅具有常规FVIII的即时止血疗效,而且具备超长的体内半衰期具有优良的预防治疗效果,然而对于HAWI是否具有治疗作用尚未有研究。
发明内容
本申请发明人在研究中意外地发现,培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白(PEG-rhFVIII-Fc)的PEG修饰,出人意料地降低了重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白与其抗体的结合亲和力,因此能够减小抑制物对药物的中和作用,从而能够用于治疗含抑制物的血友病A,并基于此完成了本申请。
本申请第一方面提供了培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于制备治疗含抑制物的血友病A的药物的用途,其中,所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白为聚乙二醇(PEG)随机修饰的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
本申请第二方面提供了培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于治疗含抑制物的血友病A的用途。
本申请第三方面提供了一种治疗含抑制物的血友病A的方法,其包括向患有含抑制物的血友病A的对象施用有效剂量的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
本申请的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白(PEG-rhFVIII-Fc)在体外实验中表现出降低的与抗体的亲和力,在HAWI人血浆以及HAWI小鼠体内均表现出更高的VIII-Fc活性和降低的抑制物滴度,因此可用于治疗含抑制物的血友病A。
附图说明
图1示出了rhFVIII-Fc和PEG-rhFVIII-Fc与兔抗人凝血因子VIII重链抗体结合能力的比较结果;
图2A和图2B示出了HAWI患者血浆体外添加PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha活性回收率的比较结果;
图3示出了PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha按滴度治疗后的FVIII活性和活性回收率变化曲线;
图4示出了PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha按滴度治疗后抑制物滴度变化曲线;
图5示出了按滴度治疗,不同滴度HAWI鼠随治疗次数增加,FVIII活性回收变化图;
图6示出了按滴度治疗,不同滴度HAWI鼠随治疗次数增加,抑制物滴度变化图;
图7示出了PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha固定剂量治疗后的血浆FVIII活性变化曲线;
图8示出了PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha固定剂量治疗后抑制物滴度变化曲线;
图9示出了固定剂量治疗,不同滴度HAWI鼠随治疗次数增加,FVIII活性回收变化结果;
图10示出了固定剂量治疗,不同滴度HAWI鼠随治疗次数增加的滴度变化结果;
图11示出了药代动力学实验中FVIII:C活性变化曲线。
具体实施方式
定义:
术语“培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白”意指聚乙二醇(PEG)随机修饰的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白,PEG的活性接头为琥珀酰亚胺酯,易与蛋白质中赖氨酸残基上的伯胺(-NH2)基团发生反应形成稳定的酰胺键,从而得到蛋白质-PEG交联产物,即PEG随机修饰产物。
PEG修饰为本领域的常用技术手段,PEG分子式如下式I所示,其分子量可以是例如≥1、≥10、≥120、≥130、≥140、≥150或≥160kDa,例如是5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa或100kDa,或者以上任意二数值之间的值。
术语“凝血因子VIII”,也叫做因子VIII,或者FVIII,是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖蛋白。术语“凝血因子VIII活性部分”是指使本申请的融合蛋白表现出FVIII活性的部分。天然人FVIII由2351个氨基酸组成,包括信号肽,并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、1个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆内以在B-A3边界分开的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC),而A3-C1-C2称为轻链(LC)。
术语“IU”,即国际单位,是根据标准测定方法检测获得的FVIII血液凝血活性(效能)的单位。标准测定包括根据现有技术中描述的一步法测定。例如采用Lee等,An effectof predilution on potency assays of Factor Vlll concentrates,30,THROMBOSISRESEARCH 511-519(1983)所提供的方法。即在因子IXa、钙和磷脂同时存在的条件下,FVIII作为因子X酶促转化为因子Xa的辅因子。在该测定中,将经过稀释的待测样品在37℃下与无FVIII的血浆底物和aPTT试剂的混合物孵育。形成凝血块的时间(秒)与FVIII浓度的对数之间存在负相关。通过对待测物不同稀释梯度的凝血时间与由使用已知活性的标准物质的一系列稀释梯度构建的曲线进行比较,确定样品的活性水平,进一步确定单位体积(每mL)的国际单位(IU/mL),本申请中还包括单位IU/dL(分升,100ml)。
术语“BU”,即Bethesda Unit,一个Bethesda单位定义为Bethesda试验检测体系中剩余FⅧ活性为50%时的患者血浆稀释度。
本申请提供了培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于制备治疗含抑制物的血友病A的药物的用途,其中,所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白为聚乙二醇(PEG)随机修饰的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
在一些实施方式中,所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白中聚乙二醇具有如下的结构式:
在一些实施方式中,所述聚乙二醇的分子量为40kDa。
在一些实施方式中,所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白通过重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白与PEG以1:(30-120),优选1:100的摩尔比,在15℃-25℃下交联获得。
在一些实施方式中,所述重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白包括在N端至C端依次连接的成熟人凝血因子VIII、柔性接头、人绒毛膜促性腺激素β亚基(UniProKB:P0DN86)第138至165位氨基酸所组成的序列,以及含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。
在一些实施方式中,所述成熟人凝血因子VIII为天然人凝血因子VIII(UniProtKB:P00451)切掉第1至19位信号肽且缺失第743至1655位氨基酸的多肽。
在一些实施方式中,所述成熟人凝血因子VIII具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述柔性接头可以是包含GS重复序列的柔性接头,其可以具有不同的合适长度,诸如从1个氨基酸(例如一个甘氨酸(G)或一个丝氨酸(S)残基)到30个氨基酸。
在一些实施方式中,所述柔性接头为GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.3)。
在一些实施方式中,所述人绒毛膜促性腺激素β亚基第138至165位氨基酸所组成的序列具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述含抑制物的血友病A的抑制物滴度为0.6-10BU/mL。
本领域中,通常将抑制物滴度≤5BU/mL定义为低滴度,大于5BU/mL定义为高滴度。发明人在研究发现,本申请的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白在低滴度时具有优异的治疗作用,培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的活性几乎不受抑制物的影响(FVIII活性回收率接近100%)。因此,在一些实施方式中,所述含抑制物的血友病A为抑制物滴度为0.6-5BU/mL。在一些实施方式中,所述含抑制物的血友病A为抑制物滴度为3-5BU/mL。
在另一些实施方式中,发明人发现,本申请的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白在高滴度(抑制物滴度为5-10BU/mL,尤其是抑制物滴度为5-8BU/mL)抑制物存在时,FVIII活性仍能保持中水平(FVIII活性回收率高于20%)或较高水平(FVIII活性回收率高于50%),其对血友病A仍具有良好的治疗效果。因此,在一些实施方式中,所述含抑制物的血友病A为抑制物滴度为5-10BU/mL;优选地,所述含抑制物的血友病A为抑制物滴度为5-8BU/mL。
在一些实施方式中,所述每单位剂量的药物包含100-2000IU的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
本申请第二方面提供了培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于治疗含抑制物的血友病A的用途。
本申请第三方面提供了一种治疗含抑制物的血友病A的方法,其包括向患有含抑制物的血友病A的对象使用有效剂量的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
在一些实施方式中,施用方式包括固定剂量施用或根据抑制物滴度施用。
在一些实施方式中,当采用固定剂量施用的方式时,所述有效剂量为60-200IU/kg体重;优选为80-120IU/kg体重。
在一些实施方式中,当采用根据抑制物滴度施用的方式时,所述有效剂量为15-25IU/kg体重/BU抑制物。
在一些实施方式中,根据有效剂量为约100IU/kg体重,或约20IU/kg体重/BU抑制物计算,每单位剂量的药物可以包含100-2000IU的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
实施例
材料与方法
1.试剂材料
重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白(rhFVIII-Fc)(SEQ ID NO.1,由郑州晟斯制备);
培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白(本文也简称PEG-rhFVIII-Fc)由郑州晟斯制备,通过聚乙二醇(PEG)随机修饰rhFVIII-Fc制备而成,其中聚乙二醇具有如下式(I)所示的结构式:
制备方法:采用式I的分子量为40kD的PEG(购自北京键凯科技有限公司)与rhFVIII-Fc融合蛋白进行交联反应。按照PEG与融合蛋白的不同摩尔比制备缀合物,例如1:30、1:50、1:100、1:120。其中,按照1:100比例制备的缀合物在之后的检测中显示优异的延长半衰期效果,其制备方法如下:按照摩尔比PEG∶蛋白=100:1(质量比10.26:1)进行投料,于20℃±5℃反应2小时,交联后样品0.2μm滤膜过滤后,样品2-8℃暂存待进行纯化。
纯化方法:首先使用S200(GE healthcare)分子筛层析进行分离。使用结合缓冲液(binding buffer:20mM His-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02% Tween 80,pH6.8-7.2),以150cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV);以150cm/h的线性流速进行上样;上样完毕后,使用平衡buffer(20mM His-HCl,200mM NaCl,5mM CaCl2,0.02% Tween 80,pH6.8-7.2),以150cm/h的线性流速冲洗层析柱子3-5柱体积(CV),平衡至pH及电导同缓冲液一致;用缓冲液(20mM His-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02% Tween 80,pH6.8-7.2)进行洗脱,收集A280/260大于1.8的峰。第二步采用Source 15Q(GE healthcare)阴离子层析柱分离。使用结合缓冲液(binding buffer:20mM His-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02%Tween 80,pH6.8-7.2),以150cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV);经第一步分子筛层析后得到的样品以150cm/h的线性流速进行上样;上样完毕后,使用平衡buffer(20mMHis-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02% Tween 80,pH6.8-7.2),以150cm/h的线性流速冲洗层析柱子3-5柱体积(CV),平衡至pH及电导同缓冲液一致;用洗脱缓冲液(20mM His-HCl,2M NaCl,5mM CaCl2,0.02% Tween 80,pH6.8-7.2)按照0-100%以100cm/h线性速度进行洗脱,分管收集A280/260大于1.8的洗脱峰。
Xyntha(任捷,Wyeth),Advate(百因止,Baxter)。兔抗人凝血因子VIII重链抗体(北京义翘神州,13909-R226),小鼠抗人IgG-Fc-HRP抗体,人凝血因子VIII活性测定试剂盒(乏FVIII血浆)(SIEMENS,OTXV13),活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(凝固法)(SIEMENS,B4218-1),标准人血浆(SIEMENS,ORKL17),全自动血凝分析仪(SYSMEX,CS2000i)。HAWI患者血浆(中国医学科学院血液病医院)。
2.实验动物
小鼠品系:血友病A模型(HA)小鼠(FVIII-KO)。
饲养条件:饲养温度18-24℃,相对湿度40-70%,每笼饲养5/6只,喂以普通小鼠生长饲料,自由饮水。光照时间12h(08:00am-20:00pm),黑暗时间12h(20:00pm-08:am)。
3.含抑制物血友病A(HAWI)模型构建
3.1体内抑制物诱导模型
HA小鼠,按照一周一次的给药频率,连续注射50IU/kg剂量的全长重组人凝血FVIII(Advate)4次。选择抑制物滴度在3-10BU/mL范围的动物,作为HAWI动物,进行后续实验。
3.2抑制物血浆输注模型
输注模型:选择预先诱导的高滴度(65BU/mL和68BU/mL)的2只HA小鼠采集血浆,选择4只未注射过FVIII的HA动物,进行血浆回输,0.2ml/只,用于构建高滴度HAWI动物模型。在输注后0.5h、2h、8h、24h、48h进行滴度检测。
输注模型评价:输血后48h,选择滴度近似的动物,分别按160IU/kg的剂量注射PEG-rhFVIII-Fc和任捷,给药2h后,采血分离血浆,采用活化部分凝血活酶时间测定试剂盒检测FVIII活性(本文中也简称FVIII:C或血浆活性)。
4.PEG-rhFVIII-Fc治疗HAWI小鼠方案
4.1HAWI小鼠按滴度治疗实验
试验动物:HAWI(滴度3-10BU/mL)和HA鼠。
给药方式和频次:静脉给药,Xyntha每2天给药1次,PEG-rhFVIII-Fc每4天一次,连续给药8次。
剂量设置:前2次给药,根据常规重组FVIII的经验中和效率(1BU中和20IU/kg)和入组动物给药前滴度,给药剂量为20IU/kg/BU,第三次给药开始,给予固定的中和剂量(前两次滴度平均值的中和剂量),直至实验完成。
测量指标:每次给药后2h采血,检测血浆FVIII:C活性和抑制物滴度。
分析指标:FVIII:C活性、活性增量回收率、抑制物滴度。
4.2HAWI小鼠100IU/kg固定剂量治疗实验
试验动物:HAWI(滴度3-10BU/mL)和HA鼠。
给药方式及频次:静脉给药,100IU/kg,每4天一次,连续给药4次。
测量指标:每次给药后2h采血,检测血浆FVIII活性和抑制物滴度。
分析指标:FVIII:C活性、活性增量回收率、抑制物滴度。
4.3PEG-rhFVIII-Fc和任捷在HAWI小鼠药代动力学
试验动物:HAWI(滴度3-10BU/mL)和HA鼠。
给药方式:200IU/kg;静脉给药。
采血时间:给药后1h、8h、24h、32h、48h、72h采抗凝全血120ul,分离血浆,检测血浆中FVIII:C活性,计算相关的药代参数。
5.ELISA检测(兔抗人凝血因子VIII重链抗体结合力)
用兔抗人凝血因子VIII重链抗体捕获,用人Fc抗体检测,建立夹心法ELISA方法,比较rhFVIII-Fc和PEG-rhFVIII-Fc对人兔抗人凝血因子VIII重链抗体的结合力。
6.样品定量
采用紫外分光光度计读取280nm处吸光度值,利用消光系数法进行计算样品的蛋白含量。
7.FVIII:C检测
采用一期法检测小鼠血浆FVIII:C活性水平。
按公式(1)计算活性回收率。
8.抑制物滴度检测
参考CDC-Nijmegen方法及文献C.H.Miller.Laboratory testing for factorVIII and IX inhibitors in haemophilia:A review.Haemophilia.2018March;24(2):186–197.建立检测小鼠血浆抑制物滴度方法。
抑制物系数采用以下公式进行计算:
9.统计方法
数据采用mean±SD方法展示。HAWI小鼠数据:EXP1采用单个动物数据展示与均值展示平行进行;EXP2采用按照滴度分组展示。利用Phoenix Winnonlin8.1进行药代参数分析。
实施例1PEG-rhFVIII-Fc与兔抗人凝血因子VIII重链抗体的结合力降低
包被兔抗人凝血因子VIII重链抗体,每孔加入40ng rhFVIII-Fc、40ng PEG-rhFVIII-Fc、280ng PEG-rhFVIII-Fc。用小鼠抗人Fc抗体检测,比较ELISA信号强弱,结果如图1所示。如图1所示,在本实验条件下,40ng PEG-rhFVIII-Fc的信号显著弱于40ngrhFVIII-Fc。PEG-rhFVIII-Fc质量增加7倍后,信号虽然显著增加,但仍然低于40ngrhFVIII-Fc组(图1)。以上实验证明,PEG修饰之后,PEG-rhFVIII-Fc对兔抗人凝血因子VIII重链抗体以及Fc抗体的综合亲和能力大大降低。体外实验结果表明,PEG-rhFVIII-Fc可能与抑制物的结合会显著减弱,进而FVIII抑制物对PEG-rhFVIII-Fc的中和效应很可能会显著降低。
实施例2PEG-rhFVIII-Fc在HAWI患者血浆中活性回收高于Xyntha
选择含不同滴度一型抑制物(稳定结合FVIII,稀释时不解离)的HAWI患者血浆,以乏FVIII血浆作为基线,通过1:1添加PEG-rhFVIII-Fc或对照药Xyntha,比较混合样品中,FVIII:C的活性回收率,结果如图2A和图2B所示。其中,图2A显示不同样品中,加入相同量PEG-rhFVIII-Fc或Xyntha后,FVIII的活性回收率比较结果;图2B显示了加入相同量PEG-rhFVIII-Fc或Xyntha后,FVIII的活性回收率随血浆中抑制物滴度变化情况;从结果中可以看出,每个患者样品中,PEG-rhFVIII-Fc的活性回收率都高于Xyntha,组间差异显著(p=0.0083)(图2A所示)。在高滴度患者中,Xyntha的活性回收接近0,但是PEG-rhFVIII-Fc的活性回收还在20%水平(图2B所示)。该结果提示,PEG-rhFVIII-Fc可以用于HAWI患者的治疗。
实施例3PEG-rhFVIII-Fc在HAWI输注模型小鼠中活性回收和抑制物系数优于Xyntha
选择未注射过人FVIII的HA小鼠,静脉注射等量的预先诱导的高滴度HAWI小鼠的血浆。选择滴度近似的动物,分别注射PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha,以不含抑制物的HA小鼠作为对照,比较PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha在HAWI小鼠中的活性回收率。结果显示,在滴度在3.0BU/mL水平的HAWI小鼠内,PEG-rhFVIII-Fc的相对活性回收~40%,Xyntha为~10%,与上述人血浆内的活性回收结果近似,进一步证明PEG-rhFVIII-Fc在体内也具有潜在的针对HAWI的治疗能力。
表1.PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha在HAWI输注模型鼠中的药效比较
实施例4PEG-rhFVIII-Fc在HAWI诱导模型小鼠中的药效评估
4.1含抑制物HA小鼠按滴度治疗实验结果
4.1.1给药PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha后小鼠体内活性、活性回收率和滴度变化
HA小鼠提前用Advate 50IU/kg每周1次,共给药4次诱导抑制物,选择滴度在3-10BU/mL范围内小鼠进行给药,PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha给药剂量为20IU/kg/BU,第三次给药开始,按前两次滴度平均值计算,每个动物给予固定的中和剂量,各给药8次。
由图3可以看出,PEG-rhFVIII-Fc组给药8次,给药后2h的活性均值均维持在60IU/dL,Xyntha组前3次给药,给药后2h的活性均值均维持在30IU/dL,之后每次给药后2h的活性一直递减,降至9IU/dL;PEG-rhFVIII-Fc的活性回收率均高于Xyntha,与活性结果基本保持一致。
由图4可以看出,PEG-rhFVIII-Fc给药2h后滴度均值持续下降,最后基本维持在2-3BU/mL之间;Xyntha给药2h后滴度均值,前三次维持在初始水平,4次给药之后滴度均值逐渐上升。
由此看出,在含抑制物HA小鼠治疗上,PEG-rhFVIII-Fc给药后的活性和活性回收率均高于Xyntha组,多次给药后,PEG-rhFVIII-Fc组的滴度值远远低于Xyntha组,呈下降趋势。
4.1.2对滴度进行范围划分分析活性FVIII:C变化和滴度变化
将小鼠的抑制物滴度划分为5-8BU/mL、8-10BU/mL和大于10BU/mL三个区间,由图5和图6可以看出:PEG-rhFVIII-Fc给药组,当小鼠滴度<8BU/mL时,连续给药8次后,FVIII:C活性回收率接近100%,小鼠滴度降低到0.7BU/mL;当小鼠滴度8-10BU/mL时,连续给药5次后,FVIII:C能维持比较高的水平(活性回收率>30%),虽然后期活性降低,但滴度未出现明显增加;当小鼠滴度>10BU/mL时,连续给药2次后,FVIII:C能维持中水平(>20%);随后其连续给药,活性回收降低,滴度增加明显。
Xyntha给药组,三个滴度水平,给药后活性回收低,连续给药三次后,增量回收低,且随着给药次数增加,呈现明显的下降趋势,抑制物水平呈明显上升趋势,均表现为治疗无效。
从实验结果看:PEG-rhFVIII-Fc对低滴度水平(<8BU/mL)具有非常好的治疗效果,多次连续给药后能达到接近正常无抑制物小鼠治疗水平;对于高滴度水平(8-10BU/mL),仍能表现出一定的治疗效果,而对于更高滴度水平(>10BU/mL),至少在早期给药仍能表现出比Xyntha更好的治疗作用。
4.2含抑制物HA小鼠固定剂量治疗实验结果
5.2.1给药PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha后小鼠体内活性、活性回收率和滴度变化
HA小鼠提前用Advate 50IU/kg,每周2次,共给药4次,诱导抑制物,选择滴度在3-10BU/mL范围内小鼠,PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha给予同等剂量为100IU/kg,均给药4次。由图7可以看出,PEG-rhFVIII-Fc组给药4次,每次给药后2h的活性均值均维持在90IU/dL;
Xyntha组给药后,随着给药次数的增加,给药2h后的活性均值逐渐递减,最后维持在10IU/dL。由图8可以看出,前2次给药PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha的滴度均维持在初始滴度水平,2次给药后,PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha治疗后滴度均有上升,但PEG-rhFVIII-Fc组滴度均值远远小于Xyntha组滴度均值。
由此看出,在含抑制物HA小鼠治疗上,PEG-rhFVIII-Fc给药后的活性和活性回收率均高于Xyntha组,多次给药后,PEG-rhFVIII-Fc组的滴度值也低于Xyntha组,说明PEG-rhFVIII-Fc具有更好的治疗作用。
4.2.2对滴度进行范围划分分析活性FVIII:C变化和滴度变化
将小鼠的抑制物滴度划分为<5BU/mL、5-8BU/mL和8-10BU/mL三个区间,由图9和图10可以看出:PEG-rhFVIII-Fc给药组:当小鼠滴度<5BU/mL时,连续给药4次,FVIII活性回收率接近100%,小鼠滴度降低到0.66BU/mL以下,呈抑制物阴性;当小鼠滴度5-8BU/ml时,前2次给药后,FVIII:C能维持比较高的水平(>20%),随着连续给药,活性回收降低,滴度增加;当小鼠滴度8-10BU/mL时,前2次给药后,FVIII:C能维持比较高的水平(>20%);随着连续给药,活性回收降低,滴度增加。Xyntha给药组,三个滴度水平,给药后活性回收均低,连续给药4次,FVIII:C活性回收低,且随着给药次数增加,呈现明显的下降趋势,抑制物水平呈明显上升趋势,均表现为治疗无效。
从实验结果来看:PEG-rhFVIII-Fc对低滴度水平(<5BU/mL)治疗效果更好,多次连续给药后FVIII:C活性回收升高,抑制物滴度呈阴性;而对于高滴度水平(>5BU/mL),也表现出比Xyntha更明显的治疗效果。
实施例5PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha在含抑制物HA(HAWI)小鼠药代动力学
筛选滴度为3-10BU/mL的小鼠,同时设正常HA小鼠给药组作为对照,给药剂量均为200IU/kg,给药后,在不同时间点采抗凝血,分离血浆,检测血浆中FVIII:C活性。
由图11血浆中FVIII:C活性曲线来看,给药后,HA小鼠组,Xyntha和PEG-rhFVIII-Fc起始活性基本一致,在HAWI小鼠体内,PEG-rhFVIII-Fc和Xyntha初始活性较HA小鼠组均有一定降低,但明显看出Xyntha组的FVIII:C活性较PEG-rhFVIII-Fc组起始活性低很多,基本与PEG-rhFVIII-Fc-HAWI小鼠在48h的活性一致,说明PEG-rhFVIII-Fc更适用于HAWI小鼠的治疗。
由表2可以看出,通过相关药代动力学PK参数计算,PEG-rhFVIII-Fc在HAWI小鼠和HA小鼠体内的平均半衰期分别为17.9h和20.0h,Xyntha在HA小鼠体内在平均半衰期为9.5h,由于Xyntha在HAWI小鼠体内活性回收率极低,可选入点少,未获得相关PK参数。PEG-rhFVIII-Fc在低滴度(<5BU/mL)HAWI小鼠中的半衰期基本与HA小鼠一致,提示在低水平抑制物患者中,PEG-rhFVIII-Fc不仅可以用于HAWI患者的出血治疗,也可满足预防治疗的要求。
表2.PEG-rhFVIII-Fc和任捷在HAWI小鼠上相关PK参数
以上示例的结果表明,在体外试验条件下,PEG-rhFVIII-Fc与FVIII抗体的亲和力大大降低,不限于任何理论,发明人认为可能是PEG修饰降低了rhFVIII-Fc分子与抑制物的亲和力;HAWI患者血浆内,PEG-rhFVIII-Fc的活性回收显著高于常规FVIII产品,进一步支持PEG-rhFVIII-Fc可通过降低已有FVIII抑制物的中和效率,具有用于HAWI患者的治疗的潜力。通过构建含人重组FVIII抑制物的血友病A(HAWI)模型小鼠,体内试验也支持PEG-rhFVIII-Fc在含抑制物HA小鼠上治疗效果优于常规FVIII(Xyntha)的结论。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已,并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本申请的保护范围内。
Claims (9)
1.培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白用于制备治疗含抑制物的血友病A的药物的用途,其中,所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白为聚乙二醇(PEG)随机修饰的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其中,所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白中重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的用途,其中,所述含抑制物的血友病A的抑制物滴度为0.6-10BU/mL。
5.根据权利要求1所述的用途,其中,所述含抑制物的血友病A的抑制物滴度为0.6-5BU/mL。
6.根据权利要求1所述的用途,其中,所述含抑制物的血友病A的抑制物滴度为3-5BU/mL。
7.根据权利要求1所述的用途,其中,所述含抑制物的血友病A的抑制物滴度为5-10BU/mL。
8.根据权利要求1所述的用途,其中,所述含抑制物的血友病A的抑制物滴度为5-8BU/mL。
9.根据权利要求1所述的用途,其中,每单位剂量的药物包含100-2000IU的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
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