CN116035994A - 一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法。本发明选择植物乳杆菌对玉竹进行发酵，实现发酵液中玉竹皂苷与多糖浓度的双提升，继而采用离心微滤等手段制备富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物。本发明采用益生菌发酵乳化体系使水难溶的甾体皂苷更易溶出，提升产物中玉竹皂苷的含量，利用微生物代谢调控提升产物中玉竹多糖的含量，基于玉竹皂苷与多糖的协同作用，该玉竹提取物表现出优异的酪氨酸酶与黑素生成抑制活性，有效实现长效抑制氧化应激反应、多靶点抵御黑素生成、源头阻断色斑堆积的效果，并且产物无溶剂残留生物安全性高，工艺条件温和保持大分子完整活性，低免疫原性应用广泛。

Description

一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法
技术领域
本发明涉及一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
中药玉竹系百合科黄精属植物玉竹的干燥根茎，其主要化学成分皂苷、多糖、黄酮、甾醇、生物碱、氨基酸、鞣质、黏液质等含量丰富，其中皂苷及多糖含量分别能达到51.7mg/g，47.8mg/g，是玉竹的主要活性组分。众多研究表明，植物提取物实现其生物活性往往通过多组分相互协同作用，这种互作可以实现比单组分更好的生物活性。例如对苦瓜的研究结果表明，在苦瓜皂苷及其多糖协同作用下，可协同增强抗氧化能力，实现对超氧化物歧化酶(SOD)活性的显著上调，达到抵御氧化应激反应的效果。尽管目前玉竹提取物作为化妆品的一种亮白褪黑原料被收录并使用，但玉竹皂苷及多糖协同互作对酪氨酸酶及黑素生成方面的研究鲜有报道。
玉竹的皂苷属于甾体类皂苷，它难溶或不溶于水，分子量分布一般在1-2kDa；玉竹多糖则以大分子中性多糖为主，水溶性相对较好，分子量＞10kDa。由于这两种活性物在亲水性/疏水性等理化性质上存在差异，造成传统提取方法，无论是水提法还是溶剂提取法，很难实现这两种组分的均衡高浓度溶出。如发明专利CN 112516048 A一种玉竹提取物及其制备方法和应用，CN 108359023A一种玉竹多糖的提取方法及玉竹多糖提取物，采用酶的水解亦或是基于“相似相溶”理论采用山梨糖醇水溶液增溶提取玉竹多糖，产物中整体多糖含量提升，但导致甾体皂苷、黄酮类化合物的溶出降低；发明专利CN 111184810 A一种玉竹提取物的制备方法，采用多效破壁浓缩，大孔树脂分离汇集制备的玉竹提取物中主要为具有强紫外吸收的甾体皂苷、黄酮类组分，但未有提及可溶性多糖的占比。因此，克服上述不足是提升玉竹提取物生物活性的重要研究方向和内容。
发酵中药技术现已在日化领域获得广泛的认可与应用，通过发酵技术可以使植物的多个活性组分得以充分释放，并且可以补充产物中微生物表达的多糖、多肽或蛋白等活性物质，成为一种高效、绿色可降解的新型提取技术，它对化妆品原料产品的制备具有较为长远的价值与意义。然而目前尚无发酵制备玉竹提取物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是：为攻克提升玉竹皂苷与多糖双组分高水平溶出的技术难点，本发明选择植物乳杆菌对玉竹进行发酵，同时提升发酵液中玉竹皂苷与多糖的浓度，继而采用离心微滤等手段制备富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物；基于玉竹皂苷与多糖的协同作用，该玉竹提取物对酪氨酸酶及黑素生成的抑制效果得到显著提升。
为了实现上述目的，本发明提供了一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，选择植物乳杆菌对玉竹进行发酵，实现发酵液中玉竹皂苷与多糖浓度的双提升，后续通过分离制备得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物；
所述方法具体包括以下步骤：
步骤1：植物乳杆菌经过活化培养后得到种子液；
步骤2：将步骤1获得的种子液接种至含有玉竹的发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
步骤3：将所得发酵液依次经过离心和微滤，收集上清液，得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物。基于玉竹皂苷与多糖的协同作用，该玉竹提取物对酪氨酸酶及黑素生成的抑制效果得到显著提升。
优选地，所述步骤1中活化培养所采用的种子培养基的组成为：菊粉0.10-0.20wt％、复合氨基酸0.08-0.20wt％、氯化钠0.10-0.50wt％、磷酸二氢钾0.10-0.50wt％和余量的水。
优选地，所述步骤1中活化培养的工艺条件为：植物乳杆菌活菌粉接种量0.50wt％-1.00wt％；37℃下活化培养24-48h。
优选地，所述步骤2中发酵培养基的组成为：玉竹2.00-5.00wt％、菊粉0.10-0.20wt％、复合氨基酸0.08-0.20wt％、氯化钠0.10-0.50wt％、磷酸二氢钾0.10-0.50wt％和余量的水。
优选地，所述步骤2中发酵培养基的工艺条件为：种子液接种量1.00wt％-2.00wt％；37℃下静态培养48-96h。
优选地，所述步骤3中离心的条件为：4000～6000rpm冷冻离心5～20min；所述微滤采用的是0.22μm的微孔滤膜。
优选地，对所述步骤3获得的玉竹提取物进行超滤分离，收集分子量＞2kDa的组分为主要为玉竹多糖的组分，以及分子量＜2kDa的组分主要为玉竹皂苷的组分，两种组分对酪氨酸酶及黑素生成具有不同的抑制效果。
本发明还提供了上述采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法制备得到的玉竹提取物。
本发明还提供了上述玉竹提取物在制备美白化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
不同于传统的水提法和溶剂提取法，本发明提供了一种获取玉竹提取物的微生物发酵方法，即以玉竹和益生元等营养物为培养基，采用植物乳杆菌进行发酵，结果可以实现发酵液中玉竹皂苷与多糖浓度的双提升，继而采用离心微滤等手段制备富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物；其优势在于：1)益生菌发酵乳化体系可以使水难溶的玉竹皂苷更加容易溶出；2)微生物发酵过程能改变玉竹植物纤维的微结构，促进大分子多糖等水溶性活性物的高水平释放；3)玉竹皂苷与多糖产生的协同增效作用，使得该玉竹提取物对酪氨酸酶及黑素生成的抑制效果得到显著提升。
附图说明
图1为对比例3获得的玉竹提取物的GPC凝胶色谱图；
图2为实施例1-3、对比例1-4获得的样品对小鼠黑色素瘤细胞(B16)酪氨酸酶活性的抑制效果；
图3为实施例1-3、对比例1-4获得的样品对小鼠黑色素瘤细胞(B16)黑素生成的抑制效果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。
本发明实施例中所用的植物乳杆菌为常规市售菌株。
实施例1
一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在由菊粉0.20wt％、复合氨基酸0.20wt％、氯化钠0.50wt％、磷酸二氢钾0.50wt％和余量的水组成的种子培养基中接种1.00wt％植物乳杆菌活菌粉(1010个/g)，于37℃活化培养48h，得到种子液。
(2)发酵液制备：在由玉竹5.00wt％、菊粉0.20wt％、复合氨基酸0.20wt％、氯化钠0.50wt％，磷酸二氢钾0.50wt％和余量的水组成的发酵培养基中接种2.00wt％种子液，于37℃静态培养96h，得到发酵液。
(3)产物制备：将所得发酵液于5000rpm冷冻离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤收集上清液，得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物。
实施例2
一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在由菊粉0.15wt％、复合氨基酸0.10wt％、氯化钠0.30wt％、磷酸二氢钾0.30wt％和余量的水组成的种子培养基中接种0.80wt％植物乳杆菌活菌粉(1010个/g)，于37℃活化培养48h，得到种子液。
(2)发酵液制备：在由玉竹3.00wt％、菊粉0.15wt％、复合氨基酸0.10wt％、氯化钠0.30wt％，磷酸二氢钾0.30wt％和余量的水组成的发酵培养基中接种1.50wt％种子液，于37℃静态培养72h，得到发酵液。
(3)产物制备：将所得发酵液于5000rpm冷冻离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤收集上清液，得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物。
实施例3
一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在由菊粉0.10wt％、复合氨基酸0.08wt％、氯化钠0.10wt％、磷酸二氢钾0.10wt％和余量的水组成的种子培养基中接种0.50wt％植物乳杆菌活菌粉(1010个/g)，于37℃活化培养48h，得到种子液。
(2)发酵液制备：在由玉竹2.00wt％、菊粉0.10wt％、复合氨基酸0.08wt％、氯化钠0.10wt％，磷酸二氢钾0.10wt％和余量的水组成的发酵培养基中接种1.00wt％种子液，于37℃静态培养48h，得到发酵液。
(3)产物制备：将所得发酵液于5000rpm冷冻离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤收集上清液，得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物。
对比例1
采用水提法制备玉竹提取物：
准确称取玉竹5.00wt％、菊粉0.20wt％、复合氨基酸0.20wt％、氯化钠0.50wt％，磷酸二氢钾0.50wt％以及余量的水，采用高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温。将所得提取液于5000rpm冷冻离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤收集上清液，得到玉竹提取物。
对比例2
采用溶剂提取法制备玉竹提取物：
准确称取玉竹5.00wt％以及余量的70％乙醇，浸泡2h后，回流提取两次，一次30min，将所得提取物在80℃水浴条件下旋转蒸发去除乙醇，用无菌水恢复至与对比例1相同的体积，将该提取液于5000rpm冷冻离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤收集上清液，得到玉竹提取物。
对比例3
一种采用益生菌制备玉竹活性物的发酵方法，具体步骤同实施例1，不同之处在于将所得提取物于0.2Mpa操作压力下进一步超滤分离出大于2kDa的组分，得到富含玉竹多糖的玉竹提取物。
对比例4
一种采用益生菌制备玉竹活性物的发酵方法，具体步骤同实施例1，不同之处在于将所得提取物于0.2Mpa操作压力下进一步超滤分离出小于2kDa的组分，得到富含玉竹皂苷的玉竹提取物。
将上述实施例和对比例制备的玉竹提取物进行如下检测：
1、总皂苷含量的测定：
参考T/GDFDTAEC 02-2021《保健食品中总皂苷的测定-分光光度法》。
2、总糖含量的测定：
参考SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》。
3、GPC多糖分子量的测定：
凝胶渗透色谱条件：选择乙酸-乙酸钠为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃。
4、小鼠黑色素瘤细胞(B16)酪氨酸酶活性的抑制活性测定：
(1)待测样配制：将实施例1-3、对比例1-3样品用含10％FBS的DMEM培养基稀释20倍作待测样。
(2)将小鼠黑素瘤细胞(B16)以105Cell/孔接种于96孔板，每孔100μL。
(3)24h后吸弃上清液，加入待测样对细胞进行处理，每孔10μL。
(4)48h后弃去培养液并使用PBS洗涤3次后，每孔按顺序加入1％ Triton X-100溶液50μL，低温冷冻1h，取出后室温融化，加入1％ L-DOPA溶液10μL于37℃孵育1h，测定450nm下吸光值。
酪氨酸酶抑制率/％＝1-实验组平均吸光值/空白组吸光值。
5、小鼠黑色素瘤细胞(B16)黑素生成的抑制效果测定：
(1)待测样配制：将实施例1-3、对比例1-3样品用含10％FBS的DMEM培养基稀释20倍作待测样。
(2)将小鼠黑素瘤细胞(B16)以3×105Cell/孔接种于24孔板，每孔1mL。
(3)24h后弃上清液，加入待测样对细胞进行处理，每孔1mL。
(4)48h后弃去培养液并使用PBS洗涤3次后，加入1mL胰酶消化细胞，加入2mL新鲜培养基终止消化，离心重悬后弃上清，沉淀中加入1M氢氧化钠(含10％DMSO)溶液，80℃下孵育30min，混匀后于450nm测定吸光度。
黑素合成抑制率/％＝1-样品组吸光度/空白组吸光度。
表1为实施例1-3、对比例1-4获得的样品中总皂苷与总糖含量；图1为对比例3获得的玉竹提取物的GPC凝胶色谱图；图2为实施例1-3、对比例1-4获得的样品对小鼠黑色素瘤细胞(B16)酪氨酸酶活性的抑制效果；图3为实施例1-3、对比例1-4获得的样品对小鼠黑色素瘤细胞(B16)黑素生成的抑制效果。
表1玉竹提取物中总皂苷、总糖含量
实验组 总皂苷(g/L) 总糖(g/L)
实施例1 0.22 3.75
实施例2 0.13 3.04
实施例3 0.08 2.58
对比例1 0.02 1.15
对比例2 0.27 0.16
对比例3 0.02 3.83
对比例4 0.23 0.12
由表1结果可知，相对于传统的水提法和溶剂提取法，本发明采用益生菌发酵制备的玉竹提取物，总皂苷、总糖含量均得到明显提高；结合表1、图2和图3可知：发酵法能同时显著提升玉竹提取物中多糖和皂苷的含量，此外，玉竹提取物中的多糖和皂苷通过相互协同作用，实现了比单组分更好的对酪氨酸酶和黑色素生成的抑制效果，可广泛应用于具有美白褪黑功效的化妆品中。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，其特征在于，选择植物乳杆菌对玉竹进行发酵，实现发酵液中玉竹皂苷与多糖浓度的双提升，后续通过分离制备得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物；
所述方法具体包括以下步骤：
步骤1：植物乳杆菌经过活化培养后得到种子液；
步骤2：将步骤1获得的种子液接种至含有玉竹的发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
步骤3：将所得发酵液依次经过离心和微滤，收集上清液，得到富含玉竹皂苷与多糖的玉竹提取物。
2.根据权利要求1所述的采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，其特征在于，所述步骤1中活化培养所采用的种子培养基的组成为：菊粉0.10-0.20wt％、复合氨基酸0.08-0.20wt％、氯化钠0.10-0.50wt％、磷酸二氢钾0.10-0.50wt％和余量的水。
3.根据权利要求1所述的采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，其特征在于，所述步骤1中活化培养的工艺条件为：植物乳杆菌活菌粉接种量0.50wt％-1.00wt％；37℃下活化培养24-48h。
4.根据权利要求1所述的采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵培养基的组成为：玉竹2.00-5.00wt％、菊粉0.10-0.20wt％、复合氨基酸0.08-0.20wt％、氯化钠0.10-0.50wt％、磷酸二氢钾0.10-0.50wt％和余量的水。
5.根据权利要求1所述的采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵培养基的工艺条件为：种子液接种量1.00wt％-2.00wt％；37℃下静态培养48-96h。
6.根据权利要求1所述的采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法，其特征在于，所述步骤3中离心的条件为：4000～6000rpm冷冻离心5～20min；所述微滤采用的是0.22μm的微孔滤膜。
7.权利要求1～6中任意一项所述的采用益生菌发酵制备玉竹提取物的方法制备得到的玉竹提取物。
8.权利要求7所述的玉竹提取物在制备美白化妆品中的应用。
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