CN116024120A - 一株具有抑制呼吸道感染致病菌功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新型的鼠李糖乳酪杆菌及其应用，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2022361。所述鼠李糖乳酪杆菌的活菌和发酵上清液均能显著抑制鼻窦炎主要致病微生物流感嗜血杆菌的生长，且对鼻腔上皮细胞有较强的粘附作用。本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌对机体无毒害作用，安全性好，可以添加在功能性食品、保健品或药品中，用于预防呼吸道疾病或改善细菌性鼻窦炎症状，具有广阔的应用前景。

Description

一株具有抑制呼吸道感染致病菌功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株能够抵抗流感嗜血杆菌呼吸道感染的鼠李糖乳酪杆菌及其应用。

背景技术

鼻窦炎是鼻窦黏膜炎症性疾病的统称，是一种耳鼻喉科常见病，主要表现为鼻塞、流脓涕和头痛，且常常伴随嗅觉减退或丧失等症状。鼻窦炎分为急性鼻窦炎和慢性鼻窦炎，急性鼻窦炎发病率较高，所有人群都可能发生，尤其是儿童、老人等全身抵抗率较低的群体。研究表明流感嗜血杆菌是急性鼻窦炎的主要病原菌之一，另外，化脓性球菌、大肠埃希菌、厌氧菌等也可能会引起急性鼻窦炎。慢性鼻窦炎多由急性鼻窦炎反复发作而来，我国慢性鼻窦炎总体患病率达8％。

在目前的治疗实践中，对急性鼻窦炎患者需使用足量足疗程的抗生素，但抗生素服用过多容易使菌产生抗药性。且患者在服用前需注意胃肠道反应、过敏反应、神经系统反应、肝肾功能异常等不良反应。而其他治疗方法如内服中成药，长期服用会引起胃黏膜细胞增生或慢性萎缩性胃炎等诸多不良反应。因此寻找天然的、安全的新型抗菌剂具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株新型的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)及其应用。该菌株分离自健康成年人粪便样品，其活菌和发酵上清液都具有抑制鼻窦炎致病微生物生长的效果。因此，本发明的鼠李糖乳酪杆菌可用于制备用于预防、杀灭鼻窦炎致病微生物的制品，对于防治鼻窦炎等呼吸道疾病具有重要的应用价值。

本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌，命名为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20(Lacticaseibacillus rhamnosus VHProbi F20)，已于2022年4月1日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022361。

本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20株，其MALDI-TOF核糖体蛋白分子量图谱如图3所示；其Riboprinter指纹图谱如图4所示；其RAPD指纹图谱如图5所示；rep-PCR指纹图谱如图6所示。

本发明还提供了鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20株的一种用途，是在制备用于预防或治疗呼吸道疾病的制品中的应用；

所述的呼吸道疾病，作为一个实施例的具体记载，为由致病微生物导致的鼻窦炎；

作为实施例的一个具体记载，所述的致病微生物为流感嗜血杆菌、β溶血性链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌或金黄色葡萄球菌；

所述的制品，为功能性食品、保健品或药品。

本发明再一个方面还提供一种益生菌制剂，包含有所述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20株的活菌、灭活菌体、胞外代谢产物或胞内提取物中的至少一种。

本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20的活菌和发酵上清液均能显著抑制鼻窦炎主要致病微生物流感嗜血杆菌的生长，在一个具体实施例中，含鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20活菌的发酵液抑菌圈直径达到20.12±0.15mm，发酵上清液添加量为15％时，对流感嗜血杆菌的生长抑制率高达43.16％。

本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20株，对鼻腔上皮细胞有较强的粘附作用，为其在鼻腔中粘附和定植提供了有利条件；并且能够显著抑制流感嗜血杆菌的粘附，粘附抑制率达到59.15％。

本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20，其菌体具有较强的凝集能力，为其在鼻腔环境中与其他微生物，尤其是致病微生物共凝集提供了必要的条件。

本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20，对鼻窦炎致病微生物的生长具有抑制作用。

本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20，对机体无毒害作用，安全性好，可以添加在功能性食品、保健品或药品中，用于预防呼吸道疾病或改善细菌性鼻窦炎症状，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为菌株F20的菌落图及革兰氏染色图；其中A为菌落图，B为革兰氏染色图；

图2为菌株F20的API试验结果图；

图3为菌株F20的MALDI-TOF核糖体蛋白指纹图谱；

图4为菌株F20的Riboprinter指纹图谱；

图5为菌株F20的RAPD指纹图谱；

图6为菌株F20的rep-PCR指纹图谱；

图7为菌株F20对流感嗜血杆菌的抑菌圈照片图；

图8为菌株F20与流感嗜血杆菌共凝集的照片图；

图9为菌株F20与流感嗜血杆菌共凝集的显微图片(油镜，100×放大)；

图10为菌株F20的自凝聚率和与流感嗜血杆菌的交互凝聚率图；

图11为菌株F20对鼻咽癌细胞5-8F的细胞毒性图；

图12为菌株F20对鼻咽癌细胞5-8F的粘附图；

图13为菌株F20对流感嗜血杆菌对鼻咽癌细胞5-8F的粘附抑制图；

图14为菌株F20发酵上清液抑制流感嗜血杆菌的生长图；

图15为菌株F20对其他鼻窦炎致病菌的抑制作用图。

具体实施方式

本发明筛选得到一株对流感嗜血杆菌及其它细菌性鼻窦炎致病菌具有显著抑制效果的鼠李糖乳酪杆菌，对治疗细菌性鼻窦炎具有非常重要的应用价值。

本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20筛选过程的各个环节都按照法规要求进行。经多相分类学鉴定，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20为一株新型的鼠李糖乳酪杆菌菌株。

申请人于2022年4月1日将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022361。

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。

实施例1鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20的分离筛选

1.1初筛

配制MRS琼脂培养基，调pH 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。

取1g健康成年人粪便样本(取样过程符合生物取样的伦理标准)，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出31株潜在的乳酸杆菌，分别命名为F01、F02、……、F20、F21、F22、......、F30、F31。

2.2复筛

配制1L MRS液体培养基，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后，加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中水浴1h制成耐酸性培养基。将筛选得到的31株乳酸杆菌按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。

结果显示，初筛得到的31株乳酸杆菌中，F20菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达9.65Log CFU/mL，表明F20菌株耐酸能力最强。

实施例2菌株鉴定

2.1菌落和菌体形态鉴定

将F20菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见F20单菌落呈白色，表面湿润光滑呈圆形，不透明，菌落直径在0.5～2mm左右；菌体在显微镜下呈短杆状，成单、成对或成链，不形成芽孢，革兰氏染色阳性，无运动性，无鞭毛。F20单菌落及光学显微镜下培养状态如图1所示。

2.2碳源代谢试验

利用API 50CHL试剂验证菌株F20的碳源代谢性能。API 50CHL试剂可用来鉴定菌株在属或种水平上的差异。实验方法及结果分析具体参见API 50CHL试剂盒说明书。分析结果显示菌株F20与鼠李糖乳酪杆菌的ID值为99.8％，碳水化合物代谢活性相同，API试验结果见图2。

2.3分子生物学鉴定

2.3.1 16s rDNA基因序列分析

1)基因组DNA提取

参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。

2)16s rDNA基因扩增

引物序列：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

通过测序获得F20菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1，具体如下：

CCGCCGGTTGATCACCTTAGACGGCTCGCTCCCTAGAAGGGTTACTACCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTTTCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAACTCGTTCGACTGCATGTATAGGCACGAAGCTCAATCGG。

将序列为SEQ ID NO:1的16s rDNA序列在NCBI数据库中进行比对，确定F20菌株为鼠李糖乳酪杆菌。

2.3.2 MALDI-TOF-MS检测菌株核糖体蛋白表达

按照0.1％的接种量在MRS液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20KV电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用Autofms 1000分析软件Autof Analyzer v1.0获取蛋白指纹图谱，菌株F20主要的离子峰为：m/z 3419.341、4696.587、5348.637、5914.392、6842.358、9392.936等，鉴定结果如图3所示。

2.3.3 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到菌株F20的Riboprinter指纹图谱(图4)。

2.3.4 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定

2.3.4.1 RAPD指纹图谱鉴定

1)引物序列：M13(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′)；

2)RAPD反应体系如表1所示。

表1：RAPD反应体系表

3)电泳

制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。菌株F20的RAPD指纹图谱如图5所示。

2.3.4.2 rep-PCR指纹图谱

1)引物序列：5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′。

2)rep-PCR的反应体系如表2所示。

表2：rep-PCR的反应体系表

3)电泳

DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果。F20菌株的rep-PCR指纹图谱如图6所示。

2.3.5全基因组测序

取新鲜F20菌液按照1％的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中，37℃培养20h，8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因序列，基因序列上传至NCBI基因数据库，GenBank登录号为CP094952-CP094953。

综上，结合F20菌株的菌落形态特征、碳源代谢和分子生物学的鉴定结果，申请人确定F20菌株为一新型的鼠李糖乳酪杆菌，将其命名为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20(Lacticaseibacillus rhamnosus VHProbi F20)。

实施例3鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对流感嗜血杆菌的抑菌试验

3.1培养基配制

MRS培养基和MRS肉汤：青岛海博生物；

脑心浸液巧克力液体培养基：脑心浸液肉汤，121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右时，加入7％无菌脱纤维羊血混匀，在80℃水浴中加热10min左右，并不停摇动，直至培养基颜色变成棕色(巧克力色)，冷却至室温后4℃保存备用。

脑心浸液巧克力琼脂培养基：脑心浸液琼脂高压灭菌后，加入7％无菌脱纤维羊血，80℃水浴中加热10min直至培养基颜色变成棕色，冷至45～50℃时倾入无菌平皿，备用。

3.2菌株活化

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20：取冷冻保藏的甘油管，划线至MRS平板，37℃培养24～48h；待平板长出单菌落后，无菌条件下挑至MRS肉汤，37℃静置培养24h。

流感嗜血杆菌ATCC49766：取冷冻保藏的甘油管，划线至脑心浸液巧克力琼脂培养基，置于37℃、5％CO₂条件下，培养24h；待平板长出单菌落后，无菌条件下挑至脑心浸液巧克力液体培养基中，置于37℃、5％CO₂条件下，培养18～24h。

3.3抑菌试验

铺下层培养基，营养琼脂灭菌后倒入平板中，铺满平板即可。待琼脂凝固后，铺上层培养基，将脑心浸液巧克力琼脂培养基均匀铺在上层。待上层培养基凝固后，将培养好的流感嗜血杆菌菌液稀释后，取适宜稀释度涂布于培养基表面。打孔，并取混匀的100ul乳酸菌发酵液加入孔中。在37℃、5％CO₂条件下培养24h后，测量抑菌圈大小。

经测量，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌株对流感嗜血杆菌具有显著的抑制作用，抑菌圈直径达到20.12±0.15mm，结果如图7所示。

实施例4鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对流感嗜血杆菌的凝集吸附效果

取适量活化好的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20和流感嗜血杆菌新鲜菌液，分别在8000rpm条件下离心4min，用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)洗2次，并且调整至OD600＝4，得菌悬液。

取鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌悬液300μL加入24孔板中，再加入300μL流感嗜血杆菌菌悬液作为实验组；另取等量的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌悬液和缓冲液混合作为对照组，每个对照及实验组设2个平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温，振荡孵育。显微镜下观察并拍照记录初始孔板状态及不同时间的孔板状态，观察是否有凝集现象出现。

宏观观察结果如图8所示，实验组中鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20和流感嗜血杆菌结合出现明显的凝集物，而单独添加鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20的对照组中无凝集现象；而显微镜观察下，可以看到实验组中鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20和流感嗜血杆菌的凝集结块，如图9所示。

上述结果表明，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对流感嗜血杆菌具有显著的凝集吸附效果，取得了意料不到的技术效果。

实施例5鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20的聚集性分析

5.1菌悬液的制备

将活化好的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20在MRS肉汤中培养18h，流感嗜血杆菌用脑心浸液巧克力液体培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养18h，培养完毕后用磷酸盐缓冲溶液中(PBS，pH7.4)洗涤3次，调节菌的浓度，使菌数达到10^-7～10^-8CFU/mL，备用。

5.2聚集性分析

分别将20mL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌悬液、流感嗜血杆菌菌悬液以及两者的菌悬液等体积混合后，充分混匀，置于37℃恒温箱，分别取0h、2h、4h、5h时的菌悬液测其600nm处的吸光值，计算自聚合率和共聚合率。

自聚合率％＝[1-A_L/A₀]×100％。

共聚合率％＝[(A_L+A_H)/2-A_mix]/[(A_L+A_P)/2]×100％。

A₀：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F200h的吸光度值；

A_L：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20单独静置2、4、5h后的吸光度值；

A_H：流感嗜血杆菌单独静置2、4、5h后的吸光度值；

A_mix：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20和流感嗜血杆菌混合静置2、4、5h后的吸光度值。

结果如图10所示，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20的自聚合效果以及与流感嗜血杆菌的共聚合效果随着时间的延长不断增强，5h时该菌株的自聚率达到23％，与流感嗜血杆菌的共聚合率达到26％，取得了意料不到的效果。

实施例6鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对鼻咽癌细胞的细胞毒性测试

6.1菌悬液的制备

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20用MRS液体培养基培养至稳定期，用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)洗涤3次，调节菌的浓度，使菌数达到5×10⁷CFU/mL(OD600吸光度值约为0.4)，于70℃水浴中20min灭活备用。

6.2细胞毒性试验

复苏鼻咽癌细胞5-8F，接种至含10％小牛血清细胞培养液的24孔培养板中，接种密度为2×10⁵cells/孔，细胞培养24h。将灭活后菌株F20按MOI(Multiplicity ofInfection，感染复数)值为10的比例加入细胞中，并设置不加菌的空白对照组，培养箱中继续培养24h。在待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，终浓度为0.3mg/ml，二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，在每个24孔板细胞培养孔中加入500ul的DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解。检测490nm下的吸光度值。

检测结果如图11所示，与对照组相比，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对鼻咽癌5-8F细胞的增殖活性无显著影响，无细胞毒性，安全性良好。

实施例7鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对鼻咽癌细胞的粘附试验

7.1菌悬液的制备

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20用MRS液体培养基培养至稳定期，用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)洗涤3次，用细胞培养液重悬，并调节菌的浓度，使菌数达到1×10⁸CFU/mL，备用。

7.2鼻咽癌5-8F细胞的培养

从液氮罐中取出鼻咽癌细胞5-8F，进行复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量。将5-8F细胞接种于内置细胞爬片的含10％小牛血清细胞培养液的六孔培养板中，每个孔的细胞铺板个数约为2×10⁶cells，将六孔板置于二氧化碳培养箱中24h。

7.3粘附试验

六孔板中已贴壁的鼻咽癌5-8F单细胞层，使用PBS缓冲液洗涤3次，加入上述制备好的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌悬液，放入二氧化碳培养箱中培养1h。将细胞爬片用PBS缓冲液反复洗涤3次，去除未粘附的细菌。用无水甲醇固定20分钟，取出细胞爬片晾干，进行革兰氏染色，于100倍油镜下镜检观察20个随机视野，共100个细胞上粘附的乳酸菌，计算平均每个细胞上粘附的乳酸菌的个数。

经统计分析可知，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对鼻咽癌细胞的粘附量为13.35±0.71CFU/cell，说明该菌株对鼻咽癌细胞具有很强的粘附能力，结果如图12所示。

实施例8鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对流感嗜血杆菌的粘附抑制实验

8.1菌悬液的制备

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20和流感嗜血杆菌的新鲜菌液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)洗涤3次，用细胞培养液重悬，并调节菌的浓度，使菌数达到1×10⁸CFU/mL，备用。

8.2粘附抑制试验

六孔板中已贴壁的鼻咽癌5-8F单细胞层，使用PBS缓冲液洗涤3次，分别加入1mL上述鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20和流感嗜血杆菌菌悬液，不加鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌悬液的细胞作为空白对照，放入二氧化碳培养箱中培养2h。将细胞爬片用PBS缓冲液反复洗涤3次，去除未粘附的细菌。用无水甲醇固定20分钟，取出细胞爬片晾干，进行革兰氏染色，于100倍油镜下镜检观察20个随机视野，共100个细胞上粘附的流感嗜血杆菌，计算平均每个细胞上粘附的流感嗜血杆菌的个数。比较鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20存在和不存在条件下流感嗜血杆菌粘附数量的变化，以不加鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20组流感嗜血杆菌的粘附率计100％，计算鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对流感嗜血杆菌粘附细胞的抑制率。

粘附抑制率(％)＝(对照组流感嗜血杆菌粘附量-实验组流感嗜血杆菌粘附量)/对照组流感嗜血杆菌粘附量×100％。

结果显示，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20能显著降低流感嗜血杆菌对鼻咽癌细胞的粘附效果，粘附抑制率达59.15％，粘附效果如图13所示。

实施例9鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对流感嗜血杆菌的生长抑制作用

1)流感嗜血杆菌ATCC49766：接种至脑心浸液巧克力液体培养基中，37℃、5％CO₂条件下，培养16～24h。

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20按1％接种量接于MRS培养基中，37℃静置培养16～24h，发酵液经4℃，10000r/min离心30min收集上清液，并用0.22μm微孔滤膜过滤得到鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20无细胞发酵上清液。

2)将流感嗜血杆菌ATCC49766新鲜菌液按1％接种量分别接种至添加5％、10％、15％(v/v)菌株F20无细胞发酵上清液的脑心浸液巧克力液体培养基中，不添加鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20无细胞发酵上清液的脑心浸液巧克力液体培养基作为对照，37℃、5％CO₂条件下，培养24h。在600nm波长下测定流感嗜血杆菌生长情况。

结果如图14所示，与对照组相比，添加鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20无细胞发酵上清液能显著抑制致病菌流感嗜血杆菌的生长，且随着添加量的增大，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20发酵上清液对流感嗜血杆菌的抑制作用增强，发酵上清液添加量为15％时，对流感嗜血杆菌的抑制率达到43.16％，取得了意料不到的效果。

实施例10鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对其他鼻窦炎致病菌的抑制作用

本实例中所用的鼻窦炎致病菌包括：

β溶血性链球菌：CMCC(B)32210，使用脑心浸液肉汤培养基添加5％(v/v)胎牛血清，37℃培养16～24h；

化脓性链球菌：BNCC337110、BNCC185918，使用哥伦比亚肉汤培养基添加5％(v/v)胎牛血清，37℃培养16～24h；

大肠埃希氏菌：BNCC337304、BNCC133264、BNCC269342，使用营养肉汤培养基，37℃培养16～24h；

金黄色葡萄球菌：ATCC29213、ATCC25923、ATCC6538，使用营养肉汤培养基，37℃培养16～24h。

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20按1％接种量接于MRS培养基中，37℃静置培养24h。

铺下层培养基，营养琼脂灭菌后倒入平板中，铺满平板即可。待琼脂凝固后，每个平板均匀放置3个无菌牛津杯。铺上层培养基，将培养的β溶血性链球菌、化脓性链球菌(2株菌等体积混合)、大肠埃希氏菌(3株菌等体积混合)、金黄色葡萄球菌(3株菌等体积混合)充分混匀后，分别取0.2％(v/v)加入相应的半固体培养基中，取适量均匀铺到下层培养基上。待上层培养基凝固后，取出牛津杯，取混匀的100ul鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20菌液加入牛津杯孔中，37℃静置培养24h，观察并测量抑菌圈大小。抑菌圈图片见图15，抑菌圈大小如表3所示。

表3：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对4种鼻窦炎致病菌的抑菌能力

从图15和表3的结果可知，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi F20对β溶血性链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌及金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制作用。

综上所述，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)VHProbi F20株，其活菌和发酵上清液均具有抑制鼻窦炎致病微生物的生长、杀灭鼻窦炎致病微生物的用途；菌体具有较强的凝集能力，为其在鼻腔环境中与其他微生物，尤其致病微生物共凝集提供了必要的条件；对鼻腔上皮细胞有较强的粘附作用，为其在鼻腔中粘附和定植提供了有利条件，并且能够显著抑制鼻窦炎主要致病微生物流感嗜血杆菌的粘附；对其他大多数鼻窦炎致病微生物，如β溶血性链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的生长均具有显著抑制作用。无细胞毒性，安全性好，应用前景广阔，可用作液态食品、固态食品、胶状食品、鼻腔清洁用品和鼻腔治疗药品等的添加剂，并且对于预防呼吸道疾病及改善细菌性鼻窦炎症状具有重要的应用价值。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳酪杆菌，其特征在于，所述的鼠李糖乳酪杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2022361。

2.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌，其特征在于，所述的鼠李糖乳酪杆菌，其16srDNA序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌，其特征在于，所述的鼠李糖乳酪杆菌的MALDI-TOF核糖体蛋白分子量图谱如图3所示，Riboprinter指纹图谱如图4所示；RAPD指纹图谱如图5所示；rep-PCR指纹图谱如图6所示。

4.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在非疾病诊断治疗目的的抑制或杀灭呼吸道内的致病微生物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的致病微生物为流感嗜血杆菌、β溶血性链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种或几种。

6.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在制备用于预防或治疗呼吸道疾病的制品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的呼吸道疾病是由致病微生物导致的鼻窦炎。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的致病微生物为流感嗜血杆菌、β溶血性链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌或金黄色葡萄球菌中的任一种或几种。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制品为功能性食品、保健品或药品。

10.一种益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂包含有权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌的活菌、灭活菌体、胞外代谢产物或胞内提取物中的至少一种。

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