CN1160080C

CN1160080C - 褐藻胶寡糖作为制备预防因东莨菪碱所致痴呆药物的应用

Info

Publication number: CN1160080C
Application number: CNB011275332A
Authority: CN
Inventors: 管华诗; 李桂玲; 于广利; 蒋新
Original assignee: Ocean University of Oingdao
Current assignee: Qingdao Haida Haitang Biotech Co ltd
Priority date: 2001-10-01
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2004-08-04
Anticipated expiration: 2021-10-01
Also published as: CN1408360A

Abstract

褐藻胶寡糖作为制备预防因东莨菪碱所致痴呆药物的应用，所述的褐藻胶寡糖为甘露糖醛酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖的混合物。小鼠服药后空间学习记忆水平提高，大脑皮层胆碱乙酰化酶活性提高2.3倍，脑内抗氧化酶SOD活性提高15%，单胺氧化酶B的活性降低到49%，NMDA受体活性降低1.17倍，结果表明褐藻胶寡糖可提高脑内抗氧化酶的活性，降低单胺氧化酶B的活性，促进乙酰胆碱合成，从而减少神经递质的氧化灭活，消除自由基对神经元的损伤，具有抗衰老和抗痴呆作用。

Description

褐藻胶寡糖作为制备预防因东莨菪碱所致痴呆药物的应用

本发明涉及一种褐藻胶寡糖，特别是涉及一种褐藻胶寡糖在抗衰老和抗痴呆中的应用。

本申请人在申请号为01107952.5的中国专利中披露了一种褐藻胶寡糖的制造方法，用该方法制造出来的褐藻胶寡糖包括甘露糖醛酸寡糖(MO)和古罗糖醛酸寡糖(GO)，这些寡糖均能大规模生产，价格低。经进一步研究得知，褐藻胶寡糖具有抗衰老和预防因东莨菪碱所致痴呆的作用，而目前在治疗这些疾病方面尚未见到有效的药物。

本发明的目的是提供一种褐藻胶寡糖在抗衰老和抗痴呆中的应用，它能弥补现有技术上的上述不足。

褐藻胶寡糖作为制备预防因东莨菪碱所致痴呆药物的应用，所述的褐藻胶寡糖为甘露糖醛酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖的混合物。

本发明能有效地抗衰老和抗痴呆，所制的药物能大规模生产，价格低廉。

下面通过实施例说明本发明。

采用东莨菪碱皮下注射的方法建立抗痴呆的小鼠模型。东莨菪碱水溶液的浓度为5mg/kg，将MO和GO按1∶1和1∶5的重量比分别配制成H1和H2的混合物，并将它们分别配制成水溶液，浓度均为120mg/kg，0.4ml/只/天灌胃给药。经检查，连续服用上述寡糖7天后，和模型组比较，小鼠的空间学习记忆水平(Morris水迷宫实验)提高，大脑皮层胆碱乙酰化酶(ChAT)活性提高了2.3倍，脑内抗氧化酶SOD活性提高了15％，单胺氧化酶MAO-B的活性降低到49％，NMDA受体活性降低1.17倍，这些结果表明褐藻胶寡糖可提高脑内抗氧化酶的活性，降低单胺氧化酶B的活性，促进乙酰胆碱合成，从而减少神经递质的氧化灭活，消除自由基对神经元的损伤，具有抗衰老和抗痴呆作用。

本实施例中的褐藻胶寡糖包括甘露糖醛酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖以及它们的混合物。本发明的药物为海洋多糖类药物，亦简称海洋药物。

下面对实验材料和方法以及实验结果做详细说明。

材料和方法

1.实验动物及分组

选用健康昆明种雄性小鼠，体重20±1.6克，由中国军事医学科学院实验动物中心提供。按随机方法将小鼠分为六组，每组8只。第一组为对照组；第二组为单独H1给药组；第三组为单独H2给药组；第四组为东莨菪碱给药模型组；第五组为模型加H1给药组；第六组为模型加H2给药组。

2.给药剂量及方法

两种药物由青岛海洋大学华海制药厂提供。药物为乳白色粉末，各取1.12g溶于100ml生理盐水中。用时稀释为11.2mg/ml，按140mg/kg，0.3ml/只/d灌胃给药，连续7天；对照组和模型组灌服等量蒸馏水。于开始灌胃后的第八天，第四、五、六组一次性皮下注射东莨菪碱5mg/kg。

3.Morris水迷宫实验

动物于造模前1天及造模后30min和24h共3次进行Morris水迷宫学习和检测试验。水迷宫主要由一圆柱型水池和一可移动位置的站台组成。水池高70cm，直径80cm，站台直径gcm，水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。预先在水池中注入清水，水深15cm，加入炭素墨水使池水变为不透明的黑色，站台表面为黑色，使小鼠不能看到，水面高出站台表面0.5cm。水温控制在22±0.5℃，在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。站台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持站台位置不变。每次实验以120s为限，纪录动物从入水点到达站台所需时间(潜伏期作为学习记忆成绩，若设定时间内未找到站台，计算机停止跟踪，记录时间为120s。

4.酶活性检测

(1)过氧化物歧化酶(SOD)测定：于行为测试后将小鼠断头取脑，在冰浴中迅速匀浆，4000g离心20分钟，取3μl进行SOD活性测定。样品中氧自由基氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫色。当SOD活力较高时，超氧阴离子自由基被专一性的抑制，使形成的亚硝酸盐减少，用可见分光光度计测其吸光度，在550nm处比色测定SOD活力。

(2)胆碱乙酰化转移酶(ChAT)活性测定

采用同位素标记合成法。取脑匀浆上清20μl加入50μl反应液(含氯化胆碱10mmol/L，硫酸毒扁豆碱1mmol/L，乙二胺四乙酸10mmol/L，溶于300mmol/L PBS，pH7.4)和10μl³H-乙酰辅酶A(³H-CoA，终浓度0.1mmol/L)，于37℃反应30min后，用3ml冷的PBS(含氯化乙酰胆碱35.7mg/L)终止反应。并加入含有10mg四苯硼钠的乙腈2ml，再加入6ml甲苯闪烁液，轻轻振摇1min，使生成的³H-Ach移向有机溶媒层，10min后在液体闪烁记数仪上测定CPM值。结果以每分钟每毫克蛋白生成的³H-Ach的克分子数表示。

(3)单胺氧化酶B(MAO-B)活性测定

取10ul脑匀浆上清加40ul PBS，10ul含同位素的底物混匀后在37℃水浴中孵育20min，用0.1ml 2mol/L的HCl终止反应，用甲苯6ml萃取反应物离心吸取上清夜4ml移入闪烁瓶，每杯加5ml甲苯闪烁液，在液体闪烁记数仪上测定cpm值。

5.受体结合实验

(1)脑突触粗膜制备：大鼠断头取脑后以1∶20倍容积加入Tris-醋酸缓冲液(50mmol/L，pH7.4)，在冰浴中用玻璃匀浆器研磨1min，匀浆于4℃ 15000g离心30min，重复4遍，弃上清，将沉淀冻于-70℃备用，此即为脑突触粗膜。

(2)M受体测定：取100μl突触粗膜加入M受体的配基³H-QNB(二苯羟乙酸奎宁酯)10μl(终浓度0.1mol/L)，非特异结合管中加入0.1mmol/L阿托品，于25℃水浴振荡孵育60min后，加入预冷的0.05 M PBS 5ml，抽滤在玻璃纤维素膜上，再用15ml PBS淋洗。玻璃纤维素膜移入液闪杯中，加入含triton的甲苯闪烁液7ml，于液闪计数仪上测放射活性。

(3)NMDA受体测定：取100μl突触粗膜，加入NMDA受体的配基³H-MK801 10μl(终浓度0.5nmol/L)。非特异结合管中加入非标记的MK801，于30℃水浴振荡孵育30min后，加入预冷的Tris-醋酸缓冲液5ml，抽滤在纤维素膜上，再用20ml缓冲液淋洗。滤膜移入液闪杯中，加入含Triton的甲苯闪烁液7ml，于液闪计数仪上测放射活性。

6.蛋白测定

采用Bradford法。用考马斯亮蓝G-250与蛋白质相互作用后的光吸收值测定样品中的蛋白浓度，用牛血清白蛋白作为标准蛋白。

7.统计学处理

数据输入计算机，用Microsoft公司的Excel 2000进行统计学处理，实验结果均以“均值±标准误”(Means±SE)表示，组间比较用Student’s t检验。

实验结果

1.水迷宫试验结果：

以Morris水迷宫法检测小鼠空间学习记忆能力。从第一次学习测试可以看到各组间寻找到站台的潜伏期无明显差异。但造模30min后，未注射东莨菪碱的三组小鼠中，服用H1、H2的小鼠其潜伏期)缩短到对照组的73％和72％，说明给正常小鼠单独服用海洋药H1、H2有增强学习记忆的作用，24h后的也看到同样效果。但药物对模型鼠的作用在24h后比较明显，此时模型鼠的潜伏期最长，H1、H2给药组分别是其81％和76％，有改善作用(表1)。

表1.海洋多糖类药H1、H2对小鼠Morris水迷宫实验的影响

组别剂量 n 寻找平台潜伏期(秒)

(mg/kg) 第1次第2次第3次

对照组等量生理盐水 8 87.1±15.4 78.5±15.8 46.3±12.3

海洋多糖H1 140 8 81.9±15.5 57.3±15.2 35.0±10.3

海洋多糖H2 140 8 103.9±13.2 56.4±13.6 37.9±10.9

东莨菪碱(Sco) 5 8 87.9±14.0 84.3±14.0 55.5±15.0

Sco+H1 5+140 8 102.5±10.7 75.8±13.1 45.0±11.9

Sco+H2 5+140 8 57.4±16.1 92.0±12.8 42.4±11.5

2.过氧化物歧化酶(SOD)活性

对照组与模型组未见明显差异，可能与模型类型有关。但所有给予海洋药物的小鼠SOD活性均明显高于未给药组。H1、H2单独给药与对照组比有显著差异，p＜0.001；H2对模型组SOD有明显增强作用，p＜0.05，H1的作用更显著，p＜0.001。见表2。

表2.海洋多糖类药H1、H2对小鼠脑SOD活性的影响

组别剂量(mg/kg) n SOD活性(UN/mg prot.)

对照组等量生理盐水 8 61.20±1.05

海洋多糖H1 140 8 68.86±1.58*

海洋多糖H2 140 8 68.65±0.86*

东莨菪碱(Sco) 5 8 62.93±2.71

Sco+H1 5+140 8 69.71±1.71#

Sco+H2 5+140 8 72.30±1.95##

^*p＜0.001，与对照组比较；# p＜0.05；## p＜0.001，与模型组比较

3.胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性

模型组ChAT活性低于对照组，但无明显统计学意义。在给药组，只有模型H2给药组其ChAT活性提高了2.23倍，有极显著性差异。其它给药组变化不明显，见表3。

表3.海洋多糖类药H1、H2对小鼠脑ChAT活性的影响

组别剂量(mg/kg) n ChAT活性(pmol/mg prot./min)

对照组等量生理盐水 8 22.72±2.29

海洋多糖H1 140 8 18.55±0.75

海洋多糖H2 140 8 16.88±2.04

东莨菪碱(Sco) 5 8 18.96±1.79

Sco+H1 5+140 8 18.05±1.00

Sco+H2 5+140 8 42.31±5.67#

#p＜0.001，与模型组比较

4.单胺氧化酶B(MAO-B)活性

MAO-B是代谢脑内单胺类介质的氧化酶，其活性随年龄增长而增高，是脑老化的重要指标之一。本实验观察到模型组小鼠脑内MAO-B高于其它任何组，但经过H1和H2给药的两组小鼠MAO-B活性明显下降，均有明显统计学差异，H1的抑制效果更强(见表4)。

表4. 海洋多糖类药H1、H2对小鼠脑MAO-B活性的影响

组别剂量(mg/kg) n MAO-B活性(pmol/mg prot./min)

对照组等量生理盐水 8 358.7±33.6

海洋多糖H1 140 8 331.2±25.7

海洋多糖H2 140 8 358.8±33.4

东莨菪碱(Sco) 5 8 402.4±26.6

Sco+H1 5+140 8 306.8±20.5#

Sco+H2 5+140 8 281.2±19.9##

#p＜0.05；##p＜0.001，与模型组比较

5.胆碱能毒蕈碱M受体结合活性

模型组在经东莨菪碱5mg皮下注射后，M受体结合活性代偿性增高了，对照组和H1、H2给药组之间无明显差异，说明两药物可以维持该受体在一个正常范围内。见表5。

表5. 海洋多糖类药H1、H2对小鼠脑内胆碱能M受体结合活性的影响

组别剂量(mg/kg) n ³H-QNB binding(pmol/mg prot.)

对照组等量生理盐水 8 7.59±0.34

海洋多糖H1 140 8 7.07±0.42

海洋多糖H2 140 8 7.91±0.23

东莨菪碱(Sco) 5 8 8.04±0.20

Sco+H1 5+140 8 7.75±0.17

Sco+H2 5+140 8 7.83±0.22

6.谷氨酸NMDA受体结合活性

谷氨酸是脑内含量最高的兴奋性神经传导介质。其受体的重要亚型NMDA受体与突触可塑性及学习记忆功能密切相关。本实验模型鼠的该受体结合活性最低，但服用H1、H2后可见显著提高，并具有明显统计学意义(p＜0.05)，见表5。

表6.海洋多糖类药H1、H2对小鼠脑内胆碱能NMDA受体结合活性的影响

组别剂量(mg/kg) n ³H-MK801 binding(fmol/mg prot.)

对照组等量生理盐水 8 289.45±19.25

海洋多糖H1 140 8 287.70±20.30

海洋多糖H2 140 8 307.65±10.50

东莨菪碱(Sco) 5 8 252.35±16.45

Sco+H1 5+140 8 292.60±21.35

Sco+H2 5+140 8 294.35±11.55#

#p＜0.05，与模型组比

Claims

1、褐藻胶寡糖作为制备预防因东莨菪碱所致痴呆药物的应用，所述的褐藻胶寡糖为甘露糖醛酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖的混合物。