CN116004597A

CN116004597A - 糖代谢相关蛋白质IbpPGM及其生物材料和应用

Info

Publication number: CN116004597A
Application number: CN202211488221.9A
Authority: CN
Inventors: 王雁楠; 杨育峰; 曹郭郑; 康志河; 陈金金; 卞倩倩; 乔守晨; 赵国瑞; 尹雨萌; 杨国红
Original assignee: Institute Of Grain Crop Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Grain Crop Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了糖代谢相关蛋白质IbpPGM及其生物材料和应用。属于生物技术领域。本发明所要解决的问题是如何调控植物淀粉和/或葡萄糖和/或果糖含量和/或蔗糖含量。本发明提供了IbpPGM蛋白或调控所述IbpPGM蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbpPGM蛋白活性或含量的物质在调控植物淀粉和/或葡萄糖和/或果糖含量和/或蔗糖含量中的应用；所述IbpPGM蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。促进或提高或上调IbpPGM基因表达的物质可用于提高或提升植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或减少或降低蔗糖含量或用于植物育种。

Description

糖代谢相关蛋白质IbpPGM及其生物材料和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及糖代谢相关蛋白质IbpPGM及其生物材料和应用。

背景技术

淀粉是植物中碳水化合物的主要储藏形式。在白天，叶片通过光合作用在叶绿体中合成过渡型淀粉(transitory starch)，其在夜间又被降解成蔗糖并运往非光合器官作为能量来源。叶绿体中过渡型淀粉的合成底物是ADP-葡萄糖(ADP-glucose，ADPG)，其主要由质体型葡萄糖磷酸异构酶(pPGI)、葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase，PGM)以及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADPase)催化合成，之后ADPG在淀粉合成酶等的催化下生成直链淀粉以及支链淀粉。

PGM是葡萄糖-6-磷酸(G6P)与葡萄糖-1-磷酸(G1P)相互转变的催化酶，而G1P则是ADPG的前体物质。植物PGM分为质体型(pPGM)和胞质型(cPGM)，二者在光合碳产物的代谢分配中起着相互协同的作用。在植物细胞中，PGM通过参与3个催化步骤来维持淀粉和蔗糖之间的平衡：1、pPGM将自养器官(叶绿体)或异养器官(造粉体)中的G6P催化转变为G1P；2、pPGM将淀粉磷酸化酶磷酸解淀粉形成的G1P催化转变为G6P；3、cPGM通过将细胞质中的G6P催化转变为G1P参与蔗糖合成。马铃薯、菠菜、豌豆中均有1个pPGM成员和1个cPGM成员，而在拟南芥、烟草、以及玉米中则有1个pPGM成员和2个cPGM成员。

拟南芥和烟草pPGM基因缺失突变体的叶片中几乎检测不到淀粉含量，但是可溶性糖的含量提高。豌豆中编码pPGM基因的位点rug3突变后导致叶片和种子中的淀粉含量均降低，从而证明了G6P是豌豆造粉体中磷酸己糖的来源。对马铃薯中pPGM或cPGM基因进行抑制表达后其块茎淀粉含量降低，同时叶片光合速率下降。拟南芥AtpPGM突变体同样出现了光合抑制现象，然而过表达拟南芥AtpPGM基因或AtcPGM基因的烟草植株并未出现光合速率的变化。虽然PGM在光合碳产物的代谢分配中有重要作用，但是其如何影响光合速率仍然需要进一步研究。此外，研究发现PGM功能的缺失会导致配子体败育，原因可能是生殖器官中碳能源物质的供应不足。因此，对花粉中淀粉或蔗糖代谢途径进行调控是诱导雄性不育的有效手段，该手段也被广泛应用于育种实践中。

近年来，越来越多的证据表明植物中存在淀粉合成分支途径，即作为淀粉合成底物的ADPG直接在细胞质中由蔗糖合成酶催化生成并转运至叶绿体中。分别抑制马铃薯pPGM或cPGM基因的表达会导致其块茎淀粉含量的下降，然而当这两个基因被同时抑制表达时转基因马铃薯块茎淀粉含量同野生型相比则无显著差异，这说明淀粉合成的前体物质(如UDPG、ADPG、G1P)可被转运至异养器官中来代替G6P。在谷类胚乳中，ADPG的前提物质G6P可从胞质中转运至造粉体，而ADPG也可直接由胞质型APGase合成并由ADPG转运蛋白转运至造粉体中进行淀粉合成。因此，除了依靠PGM进行质体内G6P和G1P的催化转换，自养器官和异养器官中均存在跨质体膜的转运途径来向质体内提供淀粉合成的前体物质。

甘薯是重要的根茎类作物，其块根富含淀粉，既可食用也可作为生物能源原料。甘薯中淀粉合成途径的关键基因功能已有报道。然而作为淀粉合成途径中有重要功能的PGM基因的功能却尚未明确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物蔗糖含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或淀粉含量以及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因1(IbAGP-sTL1)、葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因2(IbAGP-sTL2)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因(IbAGP-TLI)、颗粒结合型淀粉合成酶(IbGBSSI)、可溶性淀粉合成酶基因I(IbSSI)、可溶性淀粉合成酶基因II(IbSSII)、可溶性淀粉合成酶基因III(IbSSIII)、可溶性淀粉合成酶基因IV(IbSSIV)、淀粉分支酶基因I(IbSBEI)、淀粉分支酶基因II(IbSBEII)、异淀粉酶基因(IbIsa1)或普鲁兰酶基因(IbPUL)的表达量。

为了解决上述问题，本申请提供了蛋白质。

所述蛋白质为如下述任一项：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控植物蔗糖含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或淀粉含量的蛋白质；

A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

序列2如下所示(SEQ ID No.2)：

MASFCARIEPTSISISKQFKSARNAFPLSPPIRCLSFFNSPSSNFPLRKTVPSSSSPIFAASSSPSS

SSSSPPATVAESQALKIKSVPTKPIEGQKTGTSGLRKKVKVFMQDNYLANWIQALFNSLAPE

DYKDQLLVLGGDGRYFNREAAQLIIQIAAGNGVGQIMIGKDGIMSTPAVSAVIRKRKANGG

FIMSASHNPGGPDYDWGIKFNYSSGQPAPESITDKIYGNTLSISEIKMADIPDVDLSQLGVTR

YGNFSVEVVDPVGDYLELMQEVFDFSLIRDLLSRPNFRFVFDAMHAVTGAYAKPIFVDMLG

ASPESIVNGVPLEDFGHGHPDPNLTYAKDLVNVMFGENGPDFGAASDGDGDRNMILGRQF

FVTPSDSVAIIAANAKEAIPYFKSGPKGLARSMPTSGALDRVAEKLNLLFYEVPTGWKFFGN

LMDAGKLSVCGEESFGTGSDHIREKDGIWAVLAWLSIIAYRNKDKKPGEALVSVGDVVKQ

HWATYGRNFFSRYDYEECESEGANKMVAYLRELISTSKAGDKYGSYVLKFADDFSYVDPV

DGSVASKQGVRFVFTDGSRIIFRLSGTGSAGATVRVYIEQFESDASKHDVDAQIALKPLIELA

LSLSKLKEFTGREKPTVIT

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由个638个氨基酸残基组成。

上述蛋白质中，所述蛋白质来源于甘薯。

发明内容：

所述蛋白质的名称可为IbpPGM，可来源于甘薯。具体可为甘薯块根。所述甘薯可为甘薯高淀粉品系徐781、甘薯高淀粉品种郑红22或郑红23号。

为了解决上述问题，本申请还提供了生物材料。

所述生物材料为下述任一种：

B1)、编码上所述蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。

上文中，B1)所述的核酸分子为下列任一中：

C1)编码链的核苷酸序列为序列1的DNA分子；

C2)将C1)所述核酸分子的经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的核酸分子具有80％以上的同一性且具调控植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或蔗糖含量的核酸分子

上文中，所述B1)所述的核酸分子为序列1所示的DNA分子。

序列1如下所示(SEQ ID No.1)：

ATGGCGTCGTTTTGTGCGAGGATCGAACCGACCTCCATTTCCATCTCGAAGCAGTTCAAA

TCCGCCAGGAATGCCTTTCCTCTCTCTCCACCAATCCGATGCCTCTCCTTCTTCAATTCCC

CTTCCTCTAATTTCCCTCTCAGGAAAACTGTGCCTTCTTCTTCGTCTCCCATCTTCGCCGC

TTCTTCATCTCCTTCCTCCTCCTCCTCTTCTCCTCCCGCTACCGTCGCCGAATCTCAAGCA

CTCAAGATTAAATCGGTTCCGACAAAGCCAATCGAAGGACAGAAGACGGGAACTAGTG

GGCTCCGTAAGAAGGTTAAAGTTTTTATGCAAGATAATTACCTTGCGAATTGGATTCAGG

CATTGTTTAATTCGTTGGCGCCTGAGGATTATAAGGACCAGTTGTTGGTTCTCGGAGGTG

ATGGCCGATATTTTAATCGCGAAGCTGCACAGTTAATCATTCAAATTGCTGCTGGCAATG

GGGTTGGTCAAATTATGATTGGCAAGGATGGAATAATGTCTACTCCAGCTGTGTCTGCTG

TGATACGAAAGAGAAAGGCTAATGGTGGCTTTATAATGAGTGCAAGCCATAATCCTGGTG

GTCCAGACTATGATTGGGGCATCAAGTTCAATTACAGCAGTGGTCAACCAGCACCAGAA

TCTATTACTGACAAAATATACGGGAACACGCTTTCTATTTCTGAAATTAAGATGGCTGACA

TTCCTGATGTTGATCTCTCTCAACTTGGAGTTACTAGATATGGGAATTTTAGTGTTGAAGT

GGTTGACCCAGTAGGTGACTATTTGGAGCTAATGCAGGAAGTGTTTGATTTTTCACTTAT

CAGAGATCTTCTTTCCAGACCAAATTTCAGGTTTGTGTTTGATGCCATGCATGCTGTCAC

TGGTGCTTATGCAAAGCCTATTTTTGTTGACATGCTAGGAGCTAGCCCGGAATCTATTGTT

AATGGCGTGCCTCTTGAAGATTTTGGACATGGTCATCCAGACCCTAATCTTACATATGCG

AAAGATTTGGTCAATGTAATGTTTGGCGAGAATGGACCTGATTTTGGTGCTGCAAGTGAT

GGGGATGGTGACAGAAATATGATTCTAGGTAGGCAATTTTTTGTTACTCCGTCAGATTCT

GTAGCAATTATTGCTGCCAATGCAAAAGAGGCCATTCCATACTTCAAAAGTGGTCCCAA

GGGATTGGCTCGCTCTATGCCCACTAGTGGTGCTTTGGACCGTGTTGCGGAAAAGCTAA

ATCTTCTGTTTTACGAGGTTCCTACTGGATGGAAATTCTTTGGGAATCTAATGGATGCAG

GAAAGTTGTCAGTTTGTGGGGAAGAAAGTTTTGGGACAGGTTCTGACCACATTCGTGA

GAAAGATGGTATATGGGCTGTATTAGCTTGGCTTTCAATAATTGCATATAGGAACAAGGA

CAAGAAACCAGGGGAGGCATTGGTTTCTGTTGGTGATGTTGTCAAGCAGCATTGGGCAA

CTTATGGGAGGAATTTCTTTTCTAGATATGACTATGAGGAATGTGAATCTGAAGGAGCCA

ATAAGATGGTTGCATATCTTAGAGAACTAATCTCTACCAGTAAGGCTGGTGATAAGTATG

GAAGTTATGTCCTCAAATTTGCCGATGACTTCTCCTATGTTGATCCAGTAGATGGAAGTG

TTGCATCCAAACAGGGGGTCCGATTTGTGTTCACTGATGGATCAAGGATCATCTTTAGAT

TATCGGGTACTGGTTCTGCTGGTGCAACAGTAAGAGTGTATATTGAACAGTTTGAGTCTG

ATGCCTCTAAGCATGATGTGGATGCCCAAATTGCATTGAAACCATTGATAGAACTCGCTC

TGTCTTTATCAAAGCTAAAGGAATTTACCGGAAGAGAGAAGCCAACTGTCATAACATAAB1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbpPGM的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbpPGM的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbpPGM且具有蛋白质IbpPGM功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。B1)所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列1所示的DNA分子。

本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pET-28a和/或pMDC83和/或pBI121；

上述生物材料中，B2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(1985)Nature，313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；

Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcids Res.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcid Res.,15:9627)。

上述B3)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用IbpPGM构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

作为一个具体实施例，本申请使用的原核表达载体可为pET-28a。双元载体可为pMDC83或pBI121。

为了解决上述问题，本申请提供了下述用途：

材料的下述任一种用途：

U1、所述材料在调控植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或蔗糖含量

U2、所述材料在制备调控植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或蔗糖含量的产品；

U3、所述材料在植物育种中的用途；

U4、所述材料在调控植物下述至少一种基因的表达：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因1、葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因2、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、颗粒结合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶基因I、可溶性淀粉合成酶基因II、可溶性淀粉合成酶基因III、可溶性淀粉合成酶基因IV、淀粉分支酶基因I、淀粉分支酶基因II、异淀粉酶基因和普鲁兰酶基因；

所述材料为下述任一种：

C1)上述的蛋白质；

C2)上述的生物材料；

C3)调控所述蛋白质的编码基因表达的物质；

C4)调控所述蛋白质的活性和/或含量的物质。

本文中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因1为IbAGP-sTL1基因、葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因2为IbAGP-sTL2基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因为IbAGP-TLI基因、颗粒结合型淀粉合成酶为IbGBSSI基因、可溶性淀粉合成酶基因I为IbSSI基因、可溶性淀粉合成酶基因II为IbSSII基因、可溶性淀粉合成酶基因III为IbSSIII基因、可溶性淀粉合成酶基因IV为IbSSIV基因、淀粉分支酶基因I为IbSBEI基因、淀粉分支酶基因II为IbSBEII基因、异淀粉酶基因为IbIsa1基因和普鲁兰酶基因为IbPUL基因。IbAGP-sTL1基因CDS序列为GenBank：Z79635(Feb-4-2011)；IbAGP-sTL2基因CDS序列为GenBank：Z79636(Feb-4-2011)；IbAGP-TLI基因CDS序列为GenBank：AJ252316(Jul-26-2016)；IbGBSSI基因CDS序列为GenBank：AB071604(Aug-9-2006)；IbSSII基因CDS序列为GenBank：AF068834(Mar-10-2010)；IbSBEI基因CDS序列为GenBank：AB194725(Aug-22-2006)；IbSBEII基因CDS序列为GenBank：AB071286(Aug-9-2006)；IbIsa1基因CDS序列为Gen Bank：DQ074643(Jan-27-2009))。

上述基因可来源于甘薯。

本文中，所述调控植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或蔗糖含量可为下调或抑制或降低植物蔗糖含量，和/或，上调或增强或提高植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量。

本文中，所述调控植物IbAGP-sTL1基因和/或IbAGP-sTL2基因和/或IbAGP-TLI基因和/或IbGBSSI基因和/或IbSSI基因和/或IbSSII基因和/或IbSSIII基因和/或IbSSIV基因和/或IbSBEI基因和/或IbSBEII基因和/或IbIsa1基因和/或IbPUL基因的表达可为上调或增强或提高IbAGP-sTL1基因和/或IbAGP-sTL2基因和/或IbAGP-TLI基因和/或IbGBSSI基因和/或IbSSI基因和/或IbSSII基因和/或IbSSIII基因和/或IbSSIV基因和/或IbSBEI基因和/或IbSBEII基因和/或IbIsa1基因和/或IbPUL基因的表达。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码的蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控植物淀粉含量、葡萄糖含量、果糖含量和蔗糖含量的蛋白质；

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述的用途中，其所述植物育种包括培育或选育具有更高淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或具有更低蔗糖含量的植物。

上文中，所述具有高淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或具有更低蔗糖含量为植物的淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量高于所述出发植物，蔗糖含量低于所述出发植物。

所述出发植物可为通过基因工程手段进行育种的受体植物或通过有性繁殖手段进行育种的供体植物。

所述植物可为植物根部。

为了解决上述问题，本申请还公开了一种调控植物糖含量的方法。

所述调控植物糖含量的方法为A和/或B，所述A为下调或抑制或降低(植物蔗糖含量，所述B为上调或增强或提高植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量；所述方法包括上调或增强或提高目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达或上述蛋白质的活性和/或含量来调控植物糖含量。

所述培育糖含量改变的植物的方法包括上调或增强或提高目的植物中上所述蛋白质的编码基因的表达或上述蛋白质的活性和/或含量，得到糖含量改变的植物，所述糖含量改变的植物与目的植物相比，具有下述至少一种特性：蔗糖含量降低、淀粉含量升高、葡萄糖含量升高和果糖含量升高。

上文中，所述上调或增强或提高目的植物所述蛋白质的编码基因的表达量可通过转基因技术过表达上述蛋白编码基因来实现。

上文中，所述过表达上述蛋白编码基因载体可为植物表达载体。

所述植物表达载体可为上述B3)所述载体。作为一个具体实施例，本申请的植物表达载体可为pCAMBIA3301载体。

上述的方法中，所述蛋白质的编码基因为下述任一种：

C1)编码链的核苷酸序列为序列1的DNA分子；

C2)将C1)所述核酸分子的经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的核酸分子具有80％以上的同一性且具调控植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或蔗糖含量的核酸分子。

上文中，所述蛋白质的编码基因可为序列1的DNA分子。

为了解决上述问题，本申请还公开了一种上调或增强或提高甘薯中基因表达的方法。

所述上调或增强或提高甘薯中基因表达的方法包括上调或增强或提高目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达或上述蛋白质的活性和/或含量，得到下述至少一种基因表达被上调或增强或提高的甘薯：基因为下述至少一种基因：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因1、葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因2、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、颗粒结合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶基因I、可溶性淀粉合成酶基因II、可溶性淀粉合成酶基因III、可溶性淀粉合成酶基因IV、淀粉分支酶基因I、淀粉分支酶基因II、异淀粉酶基因和普鲁兰酶基因。

上述的用途、上述的方法中，所述植物为如下任一种：

C1)双子叶植物或单子叶植物；C2)管状花目植物，C3)旋花科植物，C4)甘薯属植物，C5)甘薯。

所述甘薯可为甘薯高淀粉品系徐781、甘薯高淀粉品种郑红22或郑红23号。

有益效果：

本研究从甘薯中克隆到质体型PGM基因IbpPGM并对其进行了表达分析以及初步功能鉴定，为通过基因工程手段提高甘薯块根淀粉含量提供了新的候选基因。本申请通过生物工程技术获得IbpPGM基因过表达的转基因甘薯。实验证明IbpPGM基因的过表达的转基因植株的淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量高于野生型和/或蔗糖含量低于野生型。本发明克隆并鉴定了一个糖代谢相关蛋白质IbpPGM，将其过表达后显著提高甘薯淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或显著降低蔗糖含量。为甘薯高淀粉含量和/或高葡萄糖含量和/或高果糖含量和/或低蔗糖含量育种提供了新策略、新思路。

附图说明

图1为重组过表达载体pC3301-121-IbpPGM的T-DNA插入区段示意图。

图2为PGM蛋白多重序列比较。

图3为利用GSDS分析IbpPGM同其他物种PGM蛋白的系统进化关系与基因结构。

图4为IbpPGM基因的表达模式分析。

图5为IbpPGM基因在大肠杆菌中的原核表达。

图6为IbpPGM蛋白在本氏烟草叶片中的叶细胞定位，标尺为50μm。

图7为转基因甘薯株系及对照株系中IbpPGM基因的表达水平。

图8为转基因甘薯株系及对照株系中淀粉代谢相关基因的表达水平。

图9为过表达IbpPGM基因的甘薯转基因过程。

图10为转基因甘薯株系与对照株系试管苗的叶片表型及植株生长势差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用Excel及SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’s t检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

植物材料与试剂

甘薯高淀粉品系徐781：由河南省农业科学院粮食作物研究所薯类研究室保存。

甘薯低淀粉品种栗子香：由河南省农业科学院粮食作物研究所薯类研究室保存。

本氏烟草植株(Nicotiana benthamiana)：由河南省农业科学院粮食作物研究所薯类研究室保存。

甘薯高淀粉品系徐781(Xu 781)、甘薯低淀粉品种栗子香(Lizixiang)和本氏烟草植株(Nicotiana benthamiana)在申请日前，均记载在如下文献：WangYN,Li Y,Zhang H,Zhai H,Liu QC,He SZ.A soluble starch synthase I gene,IbSSI,alters thecontent,composition,granule size and structure ofstarch in transgenicsweetpotato.Scientific Reports,2017,7,2315。公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。原核表达载体pET-28a：翌圣生物科技(上海)股份有限公司(11905ES03)。

亚细胞定位载体pMDC83：武汉普因特生物工程有限公司(ZT5375)。

植物表达载体pCAMBIA3301：长沙艾碧维生物科技有限公司(HG-VZC0333)。

植物表达载体pBI121：上海懋康生物科技有限公司(MF3721)。

农杆菌感受态EHA105：上海唯地生物技术有限公司(AC1012)。

基因克隆、荧光定量PCR相关试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司及天根生化科技(北京)有限公司，大肠杆菌感受态细胞Trans5α以及Transetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，引物合成及一代测序由上海生工生物工程有限公司完成。

实施例1.甘薯IbpPGM基因的克隆及序列分析

提取甘薯品系徐781的总RNA并反转录成cDNA，利用植物中已克隆的pPGM基因序列设计简并引物DF/DR(如表1所示)，扩增得到EST序列后再利用RACE方法克隆到IbpPGM基因的全长cDNA序列并进行测序验证。之后设计引物GF/GR扩增得到IbpPGM基因组全长序列并进行测序验证。利用ORFfinder、ExPASy、TargetP-2.0以及GSDS(Gene Structure DisplayServer)在线分析IbpPGM基因的开放阅读框(ORF)、蛋白分子量、信号肽以及基因组结构。同时利用DNAMAN软件进行PGM蛋白的多序列比对。

结果表明：利用RACE方法从甘薯高淀粉品系徐781中克隆到IbpPGM基因的cDNA全长序列为2182bp，ORF为1917bp。IbpPGM基因组全长为5583bp，包含22个外显子和21个内含子。该基因编码蛋白长度为638个氨基酸，蛋白分子量大小为69.3kDa。TargertP-2.0结合ChloroP 1.1在线预测表明，IbpPGM蛋白N端有一段包含73个氨基酸残基的叶绿体转运肽，去除该转运肽后IbpPGM成熟蛋白为61.7kDa。PGM蛋白多重序列比较表明(图2)，IbpPGM蛋白同拟南芥、马铃薯等植物PGM以及真核生物酵母PGM拥有共同的保守结构域，同时，pPGM相比于cPGM拥有叶绿体转运肽。GSDS在线分析表明，IbpPGM与番茄pPGM蛋白(XP_004234144)的亲缘关系较近，且pPGM与cPGM形成了明显的两类分枝，pPGM基因均包含22个外显子，而cPGM均包含18个外显子(图3)。

实施例2.IbpPGM基因的表达分析

为检测IbpPGM基因在甘薯各部位的表达水平，取在大田环境生长100d的徐781植株，分别提取块根、纤维根、茎、叶以及叶柄的总RNA(天根生化科技有限公司，DP432)，反转录成cDNA(Takara，RR047A)后设计引物(qPGM-F/R)并利用ABI7500系统进行qRT-PCR(Takara，RR420A)，内参基因为IbActin(AY905538，Actin-F/R)。

为检测IbpPGM基因对外源蔗糖处理的响应，取在大田环境生长1m的徐781叶片(带叶柄)浸泡于灭菌水中暗培养1d进行饥饿处理，之后将叶片浸没于灭菌水中(CK)或用灭菌水配制的175mM蔗糖溶液中进行暗培养，并分别在0h、2h、4h、6h、12h、24h以及48h取样进行液氮冷冻保存，每处理每个时间点分别进行3次叶片重复。之后对样品进行RNA提取、反转录及qRT-PCR。

qRT-PCR分析表明，IbpPGM基因在徐781植株的各主要组织中均有表达(图4-A)，其中在块根中表达量最高，其次是叶片、纤维根、茎以及叶柄。利用175mM蔗糖溶液对叶片(带叶柄)进行黑暗浸泡处理后，IbpPGM基因受到了强烈的诱导表达，表达量在处理12h后开始大幅提高，在48h时达到最高，约为0h的28倍(图4-B)。

实施例3.IbpPGM基因的原核表达

为了验证IbpPGM基因能否编码成熟蛋白质，对其在大肠杆菌中进行原核表达。设计引物pET-F/R以及pET-ΔF/R分别扩增IbpPGM基因的ORF序列以及去除信号肽的ORF序列(ΔIbpPGM)，经测序验证后分别连接到原核表达载体pET-28a中。将重组载体pET-28a-IbpPGM、pET-28a-ΔIbpPGM以及pET-28a空载分别转化大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)，将阳性转化菌株分别以1:100(v/v)的比例接种至350mL液体LB培养基并28℃振荡培养至OD600＝0.8，加入IPTG(1mM)后置于摇床诱导表达12h(28℃，110rpm)。之后利用君意东方JY-SCZ2+型垂直电泳槽进行蛋白质SDS-PAGE电泳(引物序列如表1所示)。

载体的构建：使用了pET-28a载体，插入IbpPGM基因ORF片段(B片段，序列如序列1所示)或去除信号肽后的IbpPGM基因ORF片段(ΔB片段，序列如序列3所示)

将核苷酸序列是序列B或ΔB替换pET-28a载体(Novagen公司)的限制性核酸内切酶NcoI和XhoI识别位点间的片段，保持pET-28a载体的其它核苷酸序列不变，得到pET-28a-B和pET-28a-ΔB重组载体。

结果显示，将两个载体分别在大肠杆菌中进行诱导表达(图5)。具有完整编码框的IbpPGM基因在大肠杆菌中并未诱导表达出相应蛋白(69.3kDa)，而去除叶绿体转运肽序列的ΔIbpPGM基因则诱导表达出相应大小的蛋白(61.7kDa)，说明叶绿体转运肽可能对IbpPGM基因在大肠杆菌中的表达有一定的阻碍作用。

实施例4.IbpPGM基因的亚细胞定位

以甘薯品系徐781的总RNA并反转录成cDNA为模板，用引物83-F/83-R(如表1所示)扩增IbpPGM基因的ORF(如序列1所示)，将扩增出的IbpPGM基因的ORF片段(如序列1所示)替换pMDC83载体限制性核酸内切酶Pac I和Asc I识别位点之间的片段，保持pMDC83载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pMDC83-IbpPGM。将重组载体pMDC83-IbpPGM以及空载对照分别转化农杆菌EHA105菌株，筛选出阳性转化菌株后分别对本氏烟草叶片下表皮进行注射，之后置于28℃培养36h(16h light-8h dark)，培养结束后使用激光共聚焦显微镜(Nikon Inc.,Melville,NY,USA)进行荧光观察。

构建表达载体pMDC83-IbpPGM并注射入本氏烟草下表皮进行瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察发现(图6)，目的基因IbpPGM与GFP融合蛋白的绿色荧光则呈点状散布，并与叶绿体的红色荧光相重合，说明IbpPGM蛋白定位于叶绿体。

实施例5.过表达载体的构建及过表达转基因甘薯植株的获得

以甘薯品系徐781的总RNA并反转录成cDNA为模板，用OPGM-F(核苷酸序列是5｀-cgggatccATGGCGTCGTTTTGTGC-3｀)和OPGM-R(核苷酸序列是5｀-cgagctcTTATGTTATGACAGTTGGCTTCTCTCT-3｀)作为引物进行PCR扩增两端具有BamH I和Sac I识别位点的IbpPGM基因的CDS(CDS序列如序列1所示)，将IbpPGM基因的CDS序列PCR产物插入pBI121得到重组载体pBI121-IbpPGM。pBI121-IbpPGM是用编码链的核苷酸序列是序列2的IbpPGM基因的CDS序列(如序列1所示)替换pBI121载体的限制性核酸内切酶BamHI和Sac I识别位点间的片段(小片段)，保持pBI121的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pBI121-IbpPGM。用HindIII和EcoR I酶切pBI121-IbpPGM，收集小片段，该小片段简称35S-IbpPGM-NOS(部分图谱如图1)。将35S-IbpPGM-NOS插入pCAMBIA3301，得到IbpPGM基因重组载体pC3301-121-IbpPGM。pC3301-121-IbpPGM是用35S-IbpPGM-NOS替换pCAMBIA3301载体的限制性内切酶HindIII和EcoR I识别位点之间的片段(小片段)，保持pCAMBIA3301载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体pC3301-121-IbpPGM。

35S-IbpPGM-NOS序列(SEQ ID NO 8)：

AGCTTGCATGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGCGTCGTTTTGTGCGAGGATCGAACCGACCTCCATTTCCATCTCGAAGCAGTTCAAATCCGCCAGGAATGCCTTTCCTCTCTCTCCACCAATCCGATGCCTCTCCTTCTTCAATTCCCCTTCCTCTAATTTCCCTCTCAGGAAAACTGTGCCTTCTTCTTCGTCTCCCATCTTCGCCGCTTCTTCATCTCCTTCCTCCTCCTCCTCTTCTCCTCCCGCTACCGTCGCCGAATCTCAAGCACTCAAGATTAAATCGGTTCCGACAAAGCCAATCGAAGGACAGAAGACGGGAACTAGTGGGCTCCGTAAGAAGGTTAAAGTTTTTATGCAAGATAATTACCTTGCGAATTGGATTCAGGCATTGTTTAATTCGTTGGCGCCTGAGGATTATAAGGACCAGTTGTTGGTTCTCGGAGGTGATGGCCGATATTTTAATCGCGAAGCTGCACAGTTAATCATTCAAATTGCTGCTGGCAATGGGGTTGGTCAAATTATGATTGGCAAGGATGGAATAATGTCTACTCCAGCTGTGTCTGCTGTGATACGAAAGAGAAAGGCTAATGGTGGCTTTATAATGAGTGCAAGCCATAATCCTGGTGGTCCAGACTATGATTGGGGCATCAAGTTCAATTACAGCAGTGGTCAACCAGCACCAGAATCTATTACTGACAAAATATACGGGAACACGCTTTCTATTTCTGAAATTAAGATGGCTGACATTCCTGATGTTGATCTCTCTCAACTTGGAGTTACTAGATATGGGAATTTTAGTGTTGAAGTGGTTGACCCAGTAGGTGACTATTTGGAGCTAATGCAGGAAGTGTTTGATTTTTCACTTATCAGAGATCTTCTTTCCAGACCAAATTTCAGGTTTGTGTTTGATGCCATGCATGCTGTCACTGGTGCTTATGCAAAGCCTATTTTTGTTGACATGCTAGGAGCTAGCCCGGAATCTATTGTTAATGGCGTGCCTCTTGAAGATTTTGGACATGGTCATCCAGACCCTAATCTTACATATGCGAAAGATTTGGTCAATGTAATGTTTGGCGAGAATGGACCTGATTTTGGTGCTGCAAGTGATGGGGATGGTGACAGAAATATGATTCTAGGTAGGCAATTTTTTGTTACTCCGTCAGATTCTGTAGCAATTATTGCTGCCAATGCAAAAGAGGCCATTCCATACTTCAAAAGTGGTCCCAAGGGATTGGCTCGCTCTATGCCCACTAGTGGTGCTTTGGACCGTGTTGCGGAAAAGCTAAATCTTCTGTTTTACGAGGTTCCTACTGGATGGAAATTCTTTGGGAATCTAATGGATGCAGGAAAGTTGTCAGTTTGTGGGGAAGAAAGTTTTGGGACAGGTTCTGACCACATTCGTGAGAAAGATGGTATATGGGCTGTATTAGCTTGGCTTTCAATAATTGCATATAGGAACAAGGACAAGAAACCAGGGGAGGCATTGGTTTCTGTTGGTGATGTTGTCAAGCAGCATTGGGCAACTTATGGGAGGAATTTCTTTTCTAGATATGACTATGAGGAATGTGAATCTGAAGGAGCCAATAAGATGGTTGCATATCTTAGAGAACTAATCTCTACCAGTAAGGCTGGTGATAAGTATGGAAGTTATGTCCTCAAATTTGCCGATGACTTCTCCTATGTTGATCCAGTAGATGGAAGTGTTGCATCCAAACAGGGGGTCCGATTTGTGTTCACTGATGGATCAAGGATCATCTTTAGATTATCGGGTACTGGTTCTGCTGGTGCAACAGTAAGAGTGTATATTGAACAGTTTGAGTCTGATGCCTCTAAGCATGATGTGGATGCCCAAATTGCATTGAAACCATTGATAGAACTCGCTCTGTCTTTATCAAAGCTAAAGGAATTTACCGGAAGAGAGAAGCCAACTGTCATAACATAAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG

将pC3301-121-IbpPGM转化根癌农杆菌EHA105菌株并筛选出阳性转化菌株pC3301-121-IbpPGM/EHA105。按照下述文献的方法构建甘薯低淀粉品种栗子香的胚性悬浮细胞培养系：Liu Q C,Zhai H,WangY,Zhang D P.Efficientplant regeneration fromembryogenic suspension cultures ofsweetpotato.In Vitro Cell Dev Biol-Plant,2001,37:564-567。

按照下述文献的方法用pC3301-121-IbpPGM/EHA105菌株侵染甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞进行甘薯遗传转化：Wang Y N,Li Yan,Zhang H,Zhai H,Liu Q C,He S Z.Aplastidic ATP/ADP transporter gene,IbAATP,increases starch and amylosecontents and alters starch structure in transgenic sweetpotato.JIntegrAgri,2016,15(9):1968-1982，得到再生植株，称为拟转基因植株。对拟转基因植株进行GUS染色及PCR鉴定，之后利用引物qPGM-F/R(引物序列见表1)对鉴定得到的阳性转基因植株进行qRT-PCR，内参基因为IbActin(引物序列见表1)，使用试剂盒：PerfectStart Green qPCRSuperMix(AQ601-02)，反应条件：94℃30s；94℃5s，60℃30s(42cycles)；Dissociationstage。仪器：Bio-Rad CFX96。选出IbpPGM表达量最高的三个株系进行后续的表型鉴定(引物序列如表1所示)。

结果表明：构建重组表达载体pC3301-121-IbpPGM并利用农杆菌侵染胚性悬浮细胞的方法对甘薯低淀粉品种栗子香进行过表达遗传转化，共获得97个拟转基因株系，其中10个为阳性转基因株系。对这10个株系中IbpPGM基因的表达水平进行qRT-PCR检测(图7)，结果表明，过表达株系中IbpPGM基因的表达水平是野生型对照的1.3～15.3倍不等，其中表达量最高的三个株系为OX17(6.2倍)、OX53(10.3倍)和OX85(15.3倍)，对这三个株系进行淀粉含量等指标的测定。

实施例6.转基因甘薯块根淀粉及可溶性糖含量测定

根据Smith和Zeeman的方法测定过表达转基因株系(OX17、OX53和OX85)和野生型对照(WT)的块根淀粉含量，每个株系重复3次。该方法基本原理为将淀粉酶解为葡萄糖，再利用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖生成NADPH，通过测定NADPH吸光度的差异来计算样品中的淀粉含量。同时利用液相色谱法测定块根中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量。

块根淀粉含量测定方法如下：

一、测定步骤

(1)称取0.2-0.5g上述新鲜块根并迅速用液氮冷冻。

(2)将块根转移至含有5mL 80％乙醇(v/v)的离心管中并沸水浴3min。以≥3000g的转速室温(20-25℃)离心5-10min，弃上清。重复该乙醇抽提过程2次，弃上清，并确保管中乙醇挥发干净。

(3)将块根转移至一个小型研钵中，加入少量水研磨至匀浆。将该匀浆液转移至带刻度的离心管中并用水补足至5mL。

(4)将上述匀浆液各转移0.5mL至四个1.5mL离心管中，100℃加热10min使淀粉粒糊化。

(5)室温冷却，向四个离心管中加入0.5mL 200mM醋酸钠(pH 5.5)。之后向其中的两个离心管中加入6U的α-淀粉转葡糖苷酶(α-amyloglucosidase)以及5U的α-淀粉酶(α-amylase)(此为样品管)。向另外两个离心管中加入等体积的ddH₂O(此为对照管)。将4个离心管置于37℃孵育4h(孵育后的样品在进行下一步测定前可在-20℃短暂存放数天，或在-80℃存放数月)。

(6)室温离心5min(≥10000g)。

(7)测定上清中的葡萄糖含量。从上述样品管和对照管中各吸取0.01mL的溶液至1.5mL离心管中，加入酶促缓冲液(含100mM HEPES(pH 7.5)、0.5mMATP、1mM NAD、4mMMgCl₂)至1mL，之后加入1.5U的己糖激酶(hexokinase)和1.5U的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)，30℃反应10min。

(8)将两管中的反应液转移至1cm宽的比色皿中，测定340nm处的吸光值，标记样品管的吸光值为OD_S，标记对照管的吸光值为OD_C(测定样品管和对照管的OD值时都各自以未加己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶时的溶液为空白进行调零)。每个样品设三次重复。

二、块根淀粉含量的计算

测定葡萄糖含量的反应原理如下：

根据朗伯比尔定律：A＝ε×C×L，其中A-吸光度(OD)，ε-消光系数(L mol^-1cm^-1)，C-样品浓度(mol L^-1)，L-光程(cm)。NADPH的消光系数为6.22×10³Lmol^-1cm^-1。可得出：ΔA＝OD_S-OD_C＝ε×ΔC×L，进而ΔC＝ΔA/(ε×L)，ΔA为10min内吸光值的变化，ΔC即为10min内NADPH的浓度变化，得出以下计算公式：

ΔC＝ΔA/(6.22×10³Lmol^-1cm^-1×1cm)＝ΔA/(6.22×10³Lmol^-1)＝ΔA/6.22(μmol mL^-1)

由于反应体积为1mL，故10min内NADPH分子量的变化为ΔA/6.22(μmol)，即为该1mL反应体系中glucose的含量，而该1mL反应体系中存在的glucose实际为步骤(7)中0.01mL所含，则步骤(5)中1mL中所含glucose则为：

则步骤(3)中5mL溶液所含glucose为：

将淀粉含量换算成μmol glucose g^-1fresh weight则为：

换算成μg starch g^-1fresh weight则将上述公式×162，变为：

采用Excel及SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’s t检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

结果表明对转基因株系及对照的块根淀粉含量进行测定表明(表2)，过表达IbpPGM基因显著提高了甘薯块根淀粉含量，其中OX85的淀粉含量相比于对照提高了12％。同时，过表达株系块根中蔗糖含量显著下降，葡萄糖和果糖含量显著提高。

实施例7.淀粉合成相关基因的qRT-PCR检测

为研究IbpPGM基因的过表达对转基因株系中淀粉合成相关基因的影响，提取野生型(WT)和转基因株系(OX17、OX53和OX85)块根总RNA并反转录为cDNA，以野生型为对照，对以下12个基因进行qRT-PCR分析(引物序列见表1)：IbAGP-sTL1基因(CDS序列为GenBank：Z79635(Feb-4-2011))、IbAGP-sTL2基因(CDS序列为GenBank：Z79636(Feb-4-2011))、IbAGP-TLI基因(CDS序列为GenBank：AJ252316(Jul-26-2016))、IbGBSSI基因(granule-boundstarch synthase，CDS序列为GenBank：AB071604(Aug-9-2006))、IbSSI基因(solublestarch synthase，CDS序列如SEQ ID NO 4所示)、IbSSII基因(CDS序列为GenBank：AF068834(Mar-10-2010))、IbSSIII基因(CDS序列如SEQ ID NO 5所示)、IbSSIV基因(CDS序列如SEQ ID NO 6所示)、IbSBEI基因(starch branching enzyme，CDS序列为GenBank：AB194725(Aug-22-2006))、IbSBEII基因(CDS序列为GenBank：AB071286(Aug-9-2006))、IbIsa1基因(isoamylase，CDS序列为GenBank：DQ074643(Jan-27-2009))以及IbPUL基因(pullulanase，CDS序列如SEQ ID NO 7所示)。

内参基因为IbActin(引物序列见表1)，使用试剂盒：PerfectStart Green qPCRSuperMix(AQ601-02)，反应条件：94℃30s；94℃5s，60℃30s(42cycles)；Dissociationstage。仪器：7500Real-Time PCR System。

利用qRT-PCR分析过表达株系中淀粉合成相关基因的表达水平(图8)，与野生型相比，上述被检测基因在过表达株系(OX17、OX53和OX85)中均有不同程度的上调表达。其中，其中IbAGP-sTL1、IbAGP-sTL2、IbAGP-TLI位于IbpPGM下游，负责淀粉前体物质ADPG的合成，IbGBSSI主要负责直链淀粉的合成，其余IbSSI等基因则负责支链淀粉的合成。说明IbpPGM基因的过表达促进了淀粉合成前体物质的积累，进而引起下游相关基因的上调表达。

表1本研究所用到的引物

表2转基因株系及对照株系块根中淀粉含量及可溶性糖含量

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下述任一项：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质来源于甘薯。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

B1)、编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.材料的下述任一种用途：

U3、所述材料在植物育种中的用途；

所述材料为下述任一种：

C1)权利要求1或2所述的蛋白质；

C2)权利要求3所述的生物材料；

C3)调控所述蛋白质的编码基因表达的物质；

C4)调控所述蛋白质的活性和/或含量的物质。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述植物育种包括培育或选育具有更高淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量和/或具有更低蔗糖含量的植物。

6.一种调控植物糖含量的方法，其特征在于，所述调控植物糖含量为A和/或B，所述A为下调或抑制或降低植物蔗糖含量，所述B为上调或增强或提高植物淀粉含量和/或葡萄糖含量和/或果糖含量；所述方法包括上调或增强或提高目的植物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或权利要求1或2所述蛋白质的活性和/或含量来调控植物糖含量。

7.一种培育糖含量改变的植物的方法，所述方法包括上调或增强或提高目的植物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或权利要求1或2所述蛋白质的活性和/或含量，得到糖含量改变的植物，所述糖含量改变的植物与目的植物相比，具有下述至少一种特性：蔗糖含量降低、淀粉含量升高、葡萄糖含量升高和果糖含量升高。

8.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为下述任一种：

C1)编码链的核苷酸序列为序列1的DNA分子；

9.一种上调或增强或提高甘薯中基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括上调或增强或提高目的植物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或权利要求1或2所述蛋白质的活性和/或含量，得到下述至少一种基因表达被上调或增强或提高的甘薯：基因为下述至少一种基因：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因1、葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因2、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、颗粒结合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶基因I、可溶性淀粉合成酶基因II、可溶性淀粉合成酶基因III、可溶性淀粉合成酶基因IV、淀粉分支酶基因I、淀粉分支酶基因II、异淀粉酶基因和普鲁兰酶基因。

10.如权利要求4或5所述的用途、权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述植物为如下任一种：

C1)双子叶植物或单子叶植物；

C2)管状花目植物，

C3)旋花科植物，

C4)甘薯属植物，

C5)甘薯。