CN116004520A - 带双安全开关的诱导多功能干细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种带双安全开关的诱导多功能干细胞，其AAVS1基因位点处插入有CAG启动子、Caspase9自杀基因，以及T2A连接的截短CD19基因。本发明还提供了其构建方法。本发明通过基因编辑技术，在iPS细胞基因组的“安全港”AVVS1位点敲入了双安全控制开关：CAG启动子控制下的Caspase9自杀基因，以及T2A连接的截短CD19基因，可以在必要时启动开关，杀死未分化的iPS细胞，防止形成畸胎瘤的风险。本发明在不改变iPS细胞干性的情况下，给iPS细胞装了双保险安全开关，对未来iPS衍生细胞疗法的临床应用提供了安全保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种带双安全开关的诱导多功能干细胞及其制备方法，属于干细胞技术领域。
背景技术
2006年，日本山中伸弥研究小组通过将逆转录病毒介导的Oct-4，Sox2，Klf4及c-Myc四个转录因子基因转入鼠成纤维母细胞，将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞,并将该类干细胞命名为induced pluripotent stem cells(iPSCs)，简称为iPS细胞。2007年，美国Thomson实验室报道了Oct-4，Sox2，Nanog及Lin28四个基因的转染可将人成纤维母细胞重编程为iPS细胞。iPS细胞在形态学、表观遗传学、全基因表达谱以及分化多潜能性方面与胚胎干细胞(ES)极其相似，但又具有自身优点：1)iPS细胞的生成技术不涉及胚胎毁损等伦理学问题；2)个体特异来源的iPS细胞，未来临床应用时不涉及免疫排斥问题；3)iPS细胞具有在体外无限扩增并分化成体内任何细胞类型的潜力。所以，iPS细胞具备成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞。
随着重编程技术的日臻成熟，iPS细胞从基础研究迈向了临床转化研究。截止2020年，使用iPS细胞开展的临床试验批件已达53个，主要集中在神经退行性疾病，视网膜黄斑性病变，心肌损伤和免疫细胞治疗等方面。2019年2月，FDA批准Fate Therapeutics公司的iPS细胞来源NK细胞疗法的IND申请，标志全球首个“现货”iPS衍生NK细胞免疫疗法治疗实体瘤进入临床试验阶段。
尽管基于iPS的细胞疗法在未来临床应用上展现了非常好的前景，但是iPSCs分化的功能细胞中一旦有残存的未分化iPS细胞，在病人体内有形成畸胎瘤的潜在风险。因此iPS细胞的临床应用亟待解决的问题就是安全性，有必要研发一种在必要时可杀死未分化的iPS细胞的技术，以降低形成畸胎瘤的风险。
CRISPR/Cas9技术是一种新兴的基因组编辑工具，使用一段序列特异性向导RNA分子(sequence-specific guide RNA，sgRNA)引导核酸内切酶到靶点处，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas9技术能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰提供了全新的平台。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种带双安全开关的诱导多功能干细胞及其制备方法。本发明通过基因编辑技术，在iPS细胞基因组的“安全港”AVVS1位点敲入了双安全控制开关，其目的是在必要时启动此开关，杀死未分化的iPS细胞，防止形成畸胎瘤的风险。
本发明是通过以下技术方案实现的：
带双安全开关的诱导多功能干细胞，其AAVS1基因位点处插入有CAG启动子、Caspase9自杀基因(iCASP9)，以及T2A连接的截短CD19基因(ΔCD19)；其中，CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Caspase9自杀基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，截短CD19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述带双安全开关的诱导多功能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建靶向AAVS1靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA(ribonucleoprotein，RNP)和AAVS1-CAG－Caspase9-T2A－tCD19(donor载体)；所述RNP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示；所述donor载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(2)将上述构建的RNP和donor载体共同电转导入iPS细胞中；
(3)用CD19抗体孵育电转后的iPS细胞，得到带双安全开关的iPS细胞。
所述带双安全开关的诱导多功能干细胞作为种子细胞在细胞治疗或组织器官再生中的应用，在制备用于细胞治疗或组织器官再生的种子细胞中的应用。
本发明构建的带双安全开关的诱导多功能干细胞，具有双开关(CAG启动子控制下的Caspase9自杀基因，以及T2A连接的截短CD19基因)，可以在必要时启动开关，杀死未分化的iPS细胞，防止形成畸胎瘤的风险，起到双保险安全开关的作用。具体启动开关的方式有两种：一是采用小分子AP20187诱导细胞凋亡；二是采用偶联了假单胞菌毒素的CD19单抗(CD19-ETA,an anti-CD19 Pseudomonas toxin conjugate)。所述AP20187(B/BHomodimerizer)是一种细胞渗透性分子，使FK506结合蛋白(FKBP)二聚化，启动生物信号传导级联反应和基因表达，或破坏蛋白-蛋白之间相互作用。是现有技术中已知的化合物，可通过商业途径购买得到。
本发明采用CRISPR/Cas9系统靶向iPS细胞AAVS1基因位点。AAVS1位点又称为PPP1R2C，位于人类基因组第19号染色体，是一个经过验证、能确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能正常转录。在该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。本发明之所以选用CAG启动子，是因为它在iPS细胞里对下游基因的驱动能力优于CMV和EFS等启动子。截短CD19基因是去掉了胞内信号，只剩下19个氨基酸的分子，既可以作为细胞表面标志物对基因敲入的iPS细胞进行跟踪和分选，必要的时候还可以加入偶联了假单胞菌毒素的CD19单抗杀死未分化的iPS细胞，起到双保险安全开关的作用。
本发明的带双安全开关的诱导多功能干细胞，在不改变iPS细胞干性的情况下，给iPS细胞装了双保险安全开关，对未来iPS衍生细胞疗法的临床应用提供了安全保障。
附图说明
图1：CRISPR/Cas9系统靶向iPS细胞AAVS1基因位点的原理示意图。设计和合成位点特异性sgRNA，引导Cas9靶向iPS细胞AARS1位点发挥核酸内切酶功能，产生DNA双链切口，提供带左右同源臂的模板，发生精确同源重组修复，敲入CAG启动子驱动下的iCaspase9自杀基因(iCASP9)，以及T2A连接的截短CD19基因(ΔCD19)，达到双安全开关的目的。
图2：iPS细胞形态示意图。
图3：sgRNA的位置示意图。
图4：donor载体的结构示意图。
图5：基因型鉴定引物示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1带双安全开关的iPS细胞的制备
步骤如下：
(1)将脐带血来源的单核细胞，用CytoTuneTM 2.0仙台病毒重编程试剂盒(Invitrogen)重编程为iPS细胞(形态如图2所示)。
(2)构建靶向AAVS1靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA(ribonucleoprotein，RNP)和AAVS1-CAG－Caspase9-T2A－tCD19(donor载体)。
本发明构建了3个sgRNA，其位置如图3所示。
donor载体的结构如图4所示。
(3)将RNP和donor载体共同电转(1900V，10ms，3puls)导入iPS细胞中。
(4)用CD19抗体(FMC63)孵育电转后的iPS细胞，孵育体系：Cas9:3μg；SgRNA:750ng；Buffer T:4μl；以上体系共同孵育10min后加入5μl细胞(细胞量为2×106,使用5μlbuffer T重悬)。然后流式细胞仪分选单个CD19阳性细胞到装有Essential 8培养基(Thermo Fisher Scientific)96孔板中(Vitronectin包被)培养。
(5)提取长出的单克隆iPS细胞基因组DNA，用引物PPP1R12C-F1，PPP1R12C-R1，PPP1R12C-F2，PPP1R12C-R2分别组合进行PCR(如图5所示)，确证外源基因敲入，同时鉴定是单等位还是双等位基因敲入。
引物PPP1R12C-F1，PPP1R12C-R1，PPP1R12C-F2，PPP1R12C-R2的核苷酸序列如表1所示。
表1
(6)挑选双等位基因敲入的iPS细胞，按1×104个细胞/孔种96孔板培养，按0.1，0.5，1.0nM浓度梯度加入小分子药物AP20187，加药培养24h后用
2.0cellviability kit分析细胞凋亡情况。
SEQ ID NO.1(方向为5’-3’；下同)：
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG。
SEQ ID NO.2所示：
AGGCAAGCAGCAAAGTTGTCGAAGCCAACCCTAGAAAACCTTACCCCAGTGGTGCTCAGACCAGAGATTCGCAAACCAGAGGTTCTCAGACCGGAAACACCCAGACCAGTGGACATTGGTTCTGGAGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCA。
SEQ ID NO.3：Gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct。
SEQ ID NO.4：
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGGAGGAAAAGAAAGCGAATGACTGACCCCACCAGGAGATTC。
SEQ ID NO.5：ACCCCACAGTGGGGCCACTA GGG。
SEQ ID NO.6：ACAGTGGGGCCACTAGGGAC AGG。
SEQ ID NO7：GTCACCAATCCTGTCCCTAG TGG。
SEQ ID NO.8：
tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGatgggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagtggattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaTCCGGTGGCGGGTCTAGGCAAGCAGCAAAGTTGTCGAAGCCAACCCTAGAAAACCTTACCCCAGTGGTGCTCAGACCAGAGATTCGCAAACCAGAGGTTCTCAGACCGGAAACACCCAGACCAGTGGACATTGGTTCTGGAGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGGAGGAAAAGAAAGCGAATGACTGACCCCACCAGGAGATTCccaaagaagaagcggaaggtctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtct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给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (6)
1.一种带双安全开关的诱导多功能干细胞，其特征在于：其AAVS1基因位点处插入有CAG启动子、Caspase9自杀基因，以及T2A连接的截短CD19基因；其中，CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Caspase9自杀基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，截短CD19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的带双安全开关的诱导多功能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建靶向AAVS1靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA和AAVS1-CAG－Caspase9-T2A－tCD19；
(2)将上述构建的AAVS1-Cas9-sgRNA和AAVS1-CAG－Caspase9-T2A－tCD19共同电转导入iPS细胞中；
(3)用CD19抗体孵育电转后的iPS细胞，得到带双安全开关的iPS细胞。
3.根据权利要求2所述的带双安全开关的诱导多功能干细胞的制备方法，其特征在于：所述AAVS1-Cas9-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求2所述的带双安全开关的诱导多功能干细胞的制备方法，其特征在于：所述AAVS1-CAG－Caspase9-T2A－tCD19的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.权利要求1所述的带双安全开关的诱导多功能干细胞作为种子细胞在细胞治疗或组织器官再生中的应用。
6.权利要求1所述的带双安全开关的诱导多功能干细胞在制备用于细胞治疗或组织器官再生的种子细胞中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310019818.7A CN116004520A (zh) | 2023-01-06 | 2023-01-06 | 带双安全开关的诱导多功能干细胞及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310019818.7A CN116004520A (zh) | 2023-01-06 | 2023-01-06 | 带双安全开关的诱导多功能干细胞及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116004520A true CN116004520A (zh) | 2023-04-25 |
Family
ID=86024535
Family Applications (1)
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| CN202310019818.7A Pending CN116004520A (zh) | 2023-01-06 | 2023-01-06 | 带双安全开关的诱导多功能干细胞及其制备方法 |
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-
2023
- 2023-01-06 CN CN202310019818.7A patent/CN116004520A/zh active Pending
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