CN116004381A - 一种用于细胞三维培养的低粘附孔板、多器官微流控芯片及其应用 - Google Patents
一种用于细胞三维培养的低粘附孔板、多器官微流控芯片及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，该低粘附孔板上具有一个或多个培养孔，培养孔的底面修饰有微纳米形貌的高分子涂层，高分子涂层与水相溶液之间的接触角小于90°。本发明还公开了一种多器官微流控芯片，包括上述低粘附孔板、多孔膜和上层基板；上层基板盖合于低粘附孔板上，多孔膜位于低粘附孔板与上层基板之间；上层基板上设置有微通道，微通道通过多孔膜与低粘附孔板上的培养孔连通，且上层基板上设有与微通道连通的进口与出口；培养孔中用于培养悬浮细胞、细胞球、原代组织块或者类器官，微通道中用于添加药物或者外源性刺激物。本发明的低粘附孔板，能长期使用、多次使用，降低了细胞三维培养的成本。
Description
技术领域
本发明涉及细胞三维培养和器官芯片技术领域，具体涉及一种用于细胞三维培养的低粘附孔板、多器官微流控芯片及其应用。
背景技术
细胞三维培养比传统的二维贴壁培养更仿生，已日渐成为生物学研究中细胞培养的主流模式。细胞三维培养可以分为无支架三维培养和有支架三维培养两大类。其中无支架培养方式对于细胞的操控更为灵活。而无支架三维培养又依赖于Hanging dropmicroplate,Micropatterned surface microplate和Ultra-low adhesion microplate(低粘附孔板)三种模式，其中低粘附孔板是使用较普遍和方便的。
传统低粘附孔板的原理是在孔的表面修饰化学涂层。这一层化学涂层可以阻碍细胞粘附在孔底，从而可以使细胞悬浮在培养液中自发聚团生长，形成三维的细胞球、原代组织块或者类器官。但是，传统低粘附孔板的问题在于，原始的细胞、原代组织或者最终聚合的细胞球和类器官会不停的向培养液中分泌细胞外基质和蛋白，化学涂层对这些细胞外基质和蛋白是不抗拒的，这些细胞外基质和蛋白便会沉降并粘附在化学涂层上，使化学涂层失效，从而细胞、原代组织块或者生成的细胞球和类器官便会贴附在孔底、从而影响到三维培养。
传统低粘附孔板存在的上述问题导致了三个后果：第一，它并不普适于所有细胞的三维培养，特别是那些细胞外基质和蛋白分泌旺盛的细胞(譬如肾细胞)；第二，对于大多数普通的细胞，传统低粘附孔板一般也很难实现长时间三维培养；第三，传统低粘附孔板一般很难多次使用。此外，传统的低粘附孔板中孔的尺寸，形状，大小是固定的，很难随具体实验的需求而调整，而且，它不能和微流控芯片等下游分析平台集成，实现自动化的细胞分析。
上述缺点限制了传统低粘附孔板的应用范围和潜力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，解决了传统低粘附孔板的上述问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，所述低粘附孔板上具有一个或多个培养孔，所述培养孔的底面修饰有微纳米形貌的高分子涂层，所述高分子涂层与水相溶液之间的接触角小于90°。
本发明中，培养孔底面具有微纳米形貌的高分子涂层具有亲水性，与水相溶液(如培养基)之间的接触角小于90°。这种微纳米结构的高分子涂层可以防止微型组织中细胞的爬出，其原理为：第一，高分子涂层表面本身既抗细胞吸附，又抗蛋白吸附，因此沉积在上面的这些物质很容易被清洗掉，从而可以实现低粘附孔板的反复使用和长期使用；其次，高分子涂层具有表面微纳米结构，类似于丘陵，蛋白沉降下来，会掉入到沟壑当中，不会直接暴露在表面上，因此更进一步增加了底面防细胞粘附和爬出的能力。
进一步地，制作所述低粘附孔板的材料既可以为高分子聚合物材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)等；也可以为金属、陶瓷、玻璃、石英、硅等材料；或者上述一种或多种材料的组合。
本发明中，对于低粘附孔板上培养孔的数目不限，例如可以为1-2000个。对于培养孔的底面形状和平整度也不做限制，例如可以为圆形、正方形、长方形、三角形或者其他不规则形状，也可以为凹凸不平的形状。同样的，对于培养孔的大小和深度也不做限制，可根据需要进行设置。例如，培养孔的深度可以为0.5-20cm，直径可以为0.5-20cm。
本发明中，所述高分子涂层的制备方法包括以下步骤：
S1.将甲基丙烯酸缩水甘油酯和其他聚合单体于水中混合，加入四甲基乙二胺和引发剂，进行共聚反应；反应结束后，将共聚物溶液进行透析，除去未聚合的单体和引发剂，得到高分子涂层液；
S2.对孔板进行预处理，使培养孔底面产生极性基团，再将预处理后的孔板置于所述高分子涂层液中进行浸泡处理；接着取出孔板，清洗掉表面的高分子涂层液，干燥后，即在所述孔板的底面形成高分子涂层；
其中，所述其他聚合单体包括2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲氧基乙酯、二甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸六弗丁酯、甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种；所述极性基团包括羟基、氨基、羧基中的一种或多种。
进一步地，步骤S1中，甲基丙烯酸缩水甘油酯和其他聚合单体在水中的混合时间为5-30分钟，以确保混合均匀。
进一步地，步骤S1中，所述四甲基乙二胺的添加浓度为0.1％-3％，所述引发剂的添加浓度为0.1％-3％。
进一步地，步骤S1中，所述引发剂可为本领域常用的引发剂，优选为过硫酸钾。共聚反应的时间优选为30分钟-1天。
进一步地，步骤S1中，所述透析具体为：利用透析膜将共聚物溶液完全透析两天，每6-12小时换液，以除去没有发生聚合反应的单体和小分子，透析袋中的溶液即为高分子涂层液。
本发明步骤S2中，通过在培养孔底面引入羟基、氨基、羧基等基团，从而可以通过共价键结合亲水修饰液，使其牢牢地键合在培养孔的底面上，形成微纳米形貌的高分子涂层。优选地，采用等离子体处理孔板，以使孔板表面引入极性基团。例如，采用氧等离子处理以引入羟基。
进一步地，步骤S2中，所述浸泡处理的温度为30-70℃，浸泡处理的时间为30分钟-5天；所述干燥的温度为0-75℃，干燥的时间为30分钟-5天。
本发明提供的上述亲水低粘附孔板，其培养孔的底面既抗细胞吸附，又抗蛋白吸附，当将包含细胞的溶液注入该培养孔后，细胞处于悬浮培养的状态，可以使细胞悬浮在培养液中自发聚团生长，因此既可以用于细胞球、原代组织块、类器官等细胞的三维培养，也可以用于血细胞、免疫细胞等悬浮细胞的培养。此外，其还可以用于药物成药性评价，包括药效，药代和毒性。
本发明还提供了一种多器官微流控芯片，包括所述的低粘附孔板、多孔膜和上层基板；所述上层基板盖合于所述低粘附孔板上，所述多孔膜位于所述低粘附孔板与上层基板之间；所述上层基板上设置有微通道，所述微通道通过所述多孔膜与低粘附孔板上的培养孔连通，且所述上层基板上设有与所述微通道连通的进口与出口；
所述培养孔中用于培养悬浮细胞、细胞球、原代组织块或者类器官，所述微通道中用于添加药物或者外源性刺激物；微通道中的药物或者外源性刺激物可通过所述多孔膜进入到下方的培养孔中。
本发明中，所述上层基板的材质可以为高分子聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯等)、金属、陶瓷、玻璃、石英、硅等材料，且其可以采用与低粘附孔板相同或不同的材质。多孔膜的材质包括聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯膜、PES(聚醚砜)、纤维素及其衍生物、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯PVDF、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物、聚四氟乙烯(PTFE)多孔薄膜、多孔聚氨酯薄膜、中空纤维超滤膜、quantifoil铜网多孔膜，quantifoil二氧化硅支持膜，quantifoil碳膜、多孔氧化铝膜或无机陶瓷膜。
进一步地，多孔膜上可以培养有血管内皮细胞和/或免疫细胞。
本发明中，培养孔孔顶和微通道连结，因此培养孔内的培养液可以通过微通道中的流动培养液进行实时更新，从而实现微型组织的长期培养，而且多个孔内不同的组织，可以通过上方微通道进行实时通讯，从而为多器官芯片的构建奠定了基础。
本发明的多器官微流控芯片中，微通道内的液体通过多孔膜与培养孔内的液体连通，微通道内流通的药物或者外源性刺激物可以穿过多孔膜与孔内的微型组织、悬浮细胞、类器官或者细胞球相互作用，从而可以评价该药物的成药性，包括药效，药代和毒性评价。因此本发明还提供了所述的一种多器官微流控芯片在药物成药性评价中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的亲水低粘附孔板，培养孔的表面并不粘附细胞外基质和蛋白，因此沉积在上面的这些物质很容易清洗掉，能长期使用、多次使用，降低了细胞三维培养的成本。
2.本发明中，微纳米高分子涂层可以在多种材质上实现，譬如玻璃，高聚物，陶瓷等，其中就包括可以用来加工微流控芯片的材质，因此利用微纳米高分子涂层可以把低粘附的孔板和微流控芯片集成起来得到多器官芯片，可以大幅增加多器官芯片集成器官的数目，从而可以构建一体化的细胞分析和药物筛选新平台。
附图说明
图1为肾原代组织块在传统低粘附孔板表面的粘附和崩解图；
图2为脑原代组织块在传统低粘附孔板表面的粘附和崩解图；
图3为聚二甲基硅氧烷高分子涂层孔板的结构示意图；
图4为高分子涂层表面的原子力显微镜图像；
图5为修饰PDMS表面(A)和未修饰PDMS表面(B)的荧光蛋白吸附情况；
图6为聚二甲基硅氧烷高分子涂层孔板中形成的肿瘤球；
图7为基于聚二甲基硅氧烷高分子涂层孔板的药物筛选微流控芯片设计图；
图8为基于聚二甲基硅氧烷高分子涂层孔板的药物筛选微流控芯片实物图(去掉多孔膜)；
图9为心脏细胞球的明场照片；
图10为肝细胞球的明场照片；
图11为神经细胞球的明场照片；
图12为加阿霉素3个小时后，肝细胞球(A)，神经细胞球(B)和心脏细胞球(C)的活死染色图，红色代表死细胞，绿色代表活细胞；
图13为肾组织芯片的设计图；
图14为传统PDMS芯片内肾微组织崩解过程图；
图15为高分子微纳表面PDMS芯片内肾脏组织第三天的状态图；
图16为多器官芯片的剖视图；
图17为多器官芯片的俯视图；
图18为多器官芯片的实物图(去掉多孔膜)；
图19为15种原代组织的明场照片；
图20为第3天时，顺铂对15种原代组织的毒性作用结果(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
对比例1：原代肾和脑组织块在传统低粘附孔板底面的粘附和崩解
将老鼠的肾和脑的原代组织块分别放入康宁公司的商品化低粘附孔板中培养，正常情况下，由于孔板底面低粘附，肾和脑的原代组织块处于悬浮培养的状态，其形态可以得到很好的保持，但是实际观察到的是，培养到第5天，肾和脑的原代组织块便贴附在孔板底部，而且细胞爬出，组织块崩解，如图1和2所示。
实施例1：聚二甲基硅氧烷高分子涂层孔板
将2ml甲基丙烯酸甲酯、0.04ml甲基丙烯酸缩水甘油酯和38ml水均匀混合10分钟，再加入0.4g过硫酸钾和2ml水，充分溶解后，加入0.04ml TEMED，25℃共聚反应15分钟，溶液颜色由透明变为乳白色后，停止反应，立刻转移到1.5w透析袋中透析两天，每12小时换液，以除去没有发生聚合反应的单体和小分子，透析袋中的溶液即为高分子涂层液。
利用聚二甲基硅氧烷材料，制造出孔板，首先通过氧等离子体使孔板的表面产生羟基，然后将上述高分子涂层液浸泡在孔内1个小时，然后将高分子涂层液到掉，去离子水清洗三次，75℃烘干1个小时。修饰后，孔板的结构如图3所示。
首先，对孔板底部进行原子力显微镜表征。从图4可以明显的看出，修饰之后，孔底表面有一层高分子聚合物，而且高分子聚合物在表面上形成了纳米沟壑结构。
然后，对孔板进行防蛋白吸附表征。将荧光标记的二抗溶液分别注入修饰和未修饰的孔板中，可以明显看出，未修饰的孔板中，荧光强度很高，说明蛋白吸附很严重；而在修饰后的孔板中，几乎没有检测到荧光，说明涂层很好的抑制了蛋白的吸附(图5)。
最后，对孔板进行了防细胞粘附表征。混合培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和人肺腺癌细胞(NCI-H1792)，培养基为RPMI 1640+10％ FBS。成纤维细胞与癌细胞的培养比例为1:1，培养环境为37℃，5％ CO2。培养3天后，细胞并未贴壁，而是形成了肿瘤球(图6)，证实了涂层防止细胞粘附的能力。同一个孔，连续进行5次肿瘤成球实验，均获得了成功，证明了低粘附孔的耐用性。
实施例2：基于聚二甲基硅氧烷高分子涂层孔板的药物筛选微流控芯片
细胞球具有很好的仿生性，是非常重要药物筛选细胞模型。微流控芯片具有自动化，智能化的特点，也是药物筛选的很好的载体。许多研究是将细胞球装载在微流控芯片上，进行自动化的药物评价。但是这类研究通常是通过传统商品化低粘附孔板产生细胞球后，再将细胞球转移到微流控芯片上，然后进行药物的评价，操作很繁琐。
本实施例设计了一种集成化的细胞球芯片，芯片设计如图7所示，实物图如图8。下方是一个三孔的高分子涂层孔板，孔的边长均为4mm，深4mm。将ips诱导的心肌细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞按2:1:1的比例混合，加入孔中，培养基为基础培养基+酶解酪蛋白+氢化可的松+左旋谷氨酸+表皮生长因子等添加因子，培养环境为37℃，5％ CO2，培养4天后成功诱导出心脏细胞球(图9)。将ips诱导的肝实质细胞和星状细胞按3:1的比例混合，加入另一个孔中，培养基为基础培养基+酶解酪蛋白+氢化可的松+左旋谷氨酸等添加因子，培养3天后成功诱导出肝细胞球(图10)。最后将神经干细胞加入剩下的一个孔中，培养基为D-MEM/F12加B27补充剂+抗生素-抗真菌剂、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等，培养7天后成功诱导出神经细胞球(图11)。
将每个孔的上方盖上一张多孔膜，将带有通道的PDMS板压在多孔膜上，通道的位置对准孔的位置，然后在通道中以1μl/min的流速流通包含阿霉素的培养液，对肝细胞球、心脏细胞球和神经细胞球进行培养，阿霉素便会穿过多孔膜与孔内的细胞球作用，显示出毒性。可以看到，阿霉素作用三天后，心脏细胞球上的细胞几乎全部凋亡，而肝细胞球和神经细胞球上的细胞大部分还存活(图12)，说明阿霉素显示出明显的心脏毒性。
实施例3:基于PDMS器官芯片的组织培养
利用高分子微纳表面低粘附PDMS和普通的PDMS材料分别制作了两个器官芯片，芯片设计如图13所示。然后往两个器官芯片中分别加入肾脏微组织，进行培养，模拟肾器官。结果显示，三天之内，在普通PDMS芯片上培养的肾脏组织完全崩解(图14)，在高分子微纳表面低粘附PDMS芯片上培养的肾脏组织生长正常(图15)。
实施例4：基于高分子微纳表面的多器官芯片及在顺铂毒性评价中的应用
构建了一个包含15种原代微组织的多器官芯片，芯片剖视图和俯视图分别如图16和17所示。实物图如图18所示。
具体的，芯片中每个孔的直径为5mm，深为5mm。15个孔中装的组织分别是脑、眼、耳、舌、气管、心、肺、肝、肾、胰、脾、脂肪、骨髓、肌肉和睾丸微组织。孔内每种组织的培养基如下表所示：
每种组织的明场照片如图19所示。将这些组织装入孔中，在微通道中以1μl/min的流速流通包含顺铂的培养液，顺铂会逐渐扩散进入组织培养腔室中，与各种组织进行相互作用。3天后，每种组织的活死荧光照片如图20，可以看出阿霉素对各种组织的差异化毒性。因此，本实施例构建的基于高分子微纳表面的多器官芯片可用于顺铂的毒性评价。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，其特征在于，所述低粘附孔板上具有一个或多个培养孔，所述培养孔的底面修饰有微纳米形貌的高分子涂层，所述高分子涂层与水相溶液之间的接触角小于90°。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，其特征在于，制作所述低粘附孔板的材料包括高分子聚合物、金属、陶瓷、玻璃、硅中的一种或多种，所述高分子聚合物包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，其特征在于，所述高分子涂层的制备方法包括以下步骤：
S1.将甲基丙烯酸缩水甘油酯和其他聚合单体于水中混合，加入四甲基乙二胺和引发剂，进行共聚反应；反应结束后，将共聚物溶液进行透析，除去未聚合的单体和引发剂，得到高分子涂层液；
S2.对孔板进行预处理，使培养孔底面产生极性基团，再将预处理后的孔板置于所述高分子涂层液中进行浸泡处理；接着取出孔板，清洗掉表面的高分子涂层液，干燥后，即在所述孔板的底面形成高分子涂层；
其中，所述其他聚合单体包括2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲氧基乙酯、二甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸六弗丁酯、甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种；所述极性基团包括羟基、氨基、羧基中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，其特征在于，步骤S1中，所述四甲基乙二胺的添加浓度为0.1％-3％，所述引发剂的添加浓度为0.1％-3％。
5.根据权利要求3所述的一种用于细胞三维培养的低粘附孔板，其特征在于，步骤S2中，所述浸泡处理的温度为30-70℃，浸泡处理的时间为30分钟-5天；所述干燥的温度为0-75℃，干燥的时间为30分钟-5天。
6.权利要求1-5任一项所述的低粘附孔板在细胞球、原代组织块、类器官三维培养中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的低粘附孔板在悬浮细胞培养中的应用，所述悬浮细胞包括血液细胞和免疫细胞。
8.一种多器官微流控芯片，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的低粘附孔板、多孔膜和上层基板；所述上层基板盖合于所述低粘附孔板上，所述多孔膜位于所述低粘附孔板与上层基板之间；所述上层基板上设置有微通道，所述微通道通过所述多孔膜与低粘附孔板上的培养孔连通，且所述上层基板上设有与所述微通道连通的进口与出口；
所述培养孔中用于培养悬浮细胞、细胞球、原代组织块或者类器官，所述微通道中用于添加药物或者外源性刺激物；微通道中的药物或者外源性刺激物可通过所述多孔膜进入到下方的培养孔中。
9.根据权利要求8所述的一种多器官微流控芯片，其特征在于，所述多孔膜上培养有细胞，所述细胞包括血管内皮细胞和/或免疫细胞。
10.权利要求8或9所述的多器官微流控芯片在药物成药性评价中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115895884A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-04-04 | 苏州大学 | 一种用于细胞三维培养的超疏水孔板，多器官微流控芯片及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004290111A (ja) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 細胞培養容器及びその製造方法 |
| US20130302885A1 (en) * | 2012-05-14 | 2013-11-14 | Jui-Yang Lai | Method of Forming Cell Spheroids Cultured in Serum-Free Manner on Nanoscale Coatings of Hyaluronic Acid with High Molecular Weight |
| CN112280678A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-01-29 | 苏州大学 | 一种可拆卸、可重复使用的疏水或超疏水微流控器官芯片 |
| CN113474446A (zh) * | 2019-02-27 | 2021-10-01 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 培养容器的制造方法及培养容器 |
-
2022
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004290111A (ja) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 細胞培養容器及びその製造方法 |
| US20130302885A1 (en) * | 2012-05-14 | 2013-11-14 | Jui-Yang Lai | Method of Forming Cell Spheroids Cultured in Serum-Free Manner on Nanoscale Coatings of Hyaluronic Acid with High Molecular Weight |
| CN113474446A (zh) * | 2019-02-27 | 2021-10-01 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 培养容器的制造方法及培养容器 |
| CN112280678A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-01-29 | 苏州大学 | 一种可拆卸、可重复使用的疏水或超疏水微流控器官芯片 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115895884A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-04-04 | 苏州大学 | 一种用于细胞三维培养的超疏水孔板，多器官微流控芯片及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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