CN115998783A - 一种可用于治疗化学性肝损伤的桦树汁分离液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桦树汁分离液及其在治疗化学性肝损伤中的应用。本发明中公开的桦树汁分离液由超滤‑纳滤复合分离浓缩工艺经制备，该桦树汁分离液由桦树汁中相对分子量在1kdal～3kdal范围内的物质组成，其中总糖含量不低于20%，多糖类物质在总糖中占比不低于80%，所制备的桦树汁分离液中含有丰富的多糖类物质，可有效提升葡萄糖等单糖在肝脏中的糖原转化，促进肝糖原合成，提升肝糖原含量，增强肝细胞的抵抗力，保护肝细胞、促进肝脏功能恢复，可有效用于化学性肝损伤疾病的治疗。

Description

一种可用于治疗化学性肝损伤的桦树汁分离液

技术领域

本发明涉及一种桦树汁分离液的制备及其在治疗化学性肝损伤疾病中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

天然桦树汁中富含单糖、多糖、氨基酸、五环三萜类化合物、脂肪酸皂甙、蛋白质等多种物质，其中白桦脂酸（相对分子量456dal）、白桦脂醇（相对分子量442dal）作为桦树汁中所含有的五环三萜类化合物，已有将其用于治疗化学性肝损伤的研究文献及专利报道，如专利CN105641227A（一种用于肝损伤术后预防并发症的护理药物及其制备方法）提供了一种含有白桦脂酸成分的组合物，用于肝损伤术后预防并发症的护理。CN112022857A（白桦脂酸衍生物在制备抗肝病变药物中的应用）公开了白桦脂酸衍生物作为活性成分在制备抗肝病变药物中的应用。但是当前现有研究及专利均集中在白桦脂酸或白桦脂醇作为单体化合物在治疗化学性肝损伤中的使用，但白桦脂酸、白桦脂醇二者在天然桦树汁中含量极低（＜0.02%），且不溶于水，人体生物利用度低，在桦树汁本身的开发、利用中难以发挥功效作用，而桦树汁中其他成分的治疗肝损伤作用却鲜有提及。

桦树汁中除含有极少量的五环三萜类化合物外，更含有大量的单糖、低聚糖、多糖、氨基酸及维生素等多种营养物质，其中多糖类物质作为桦树汁中含量最高的功能性成分，其相对分子量主要集中分布在1kdal～3kdal范围内，能够有效促进肝糖原合成，提升葡萄糖等单糖在肝脏中的糖原转化，增加肝糖原含量，保护肝细胞，促进肝功能恢复，同时多糖类物质可有效增强肝细胞的抵抗力，营养、修复受损的肝脏细胞。因此，除却桦树汁中白桦脂酸、白桦脂醇等含量极低的五环三萜类化合物外，桦树汁中的多糖类物质在治疗化学性肝损伤中具有更高效、广阔的使用前景。

超滤是一种利用多孔膜的拦截能力，通过物理截流的方式将溶液中不同分子量物质进行区分的膜分离技术，一般以0.1～5MPa的压力差为推动力，促使溶液通过具有不同孔径超滤膜，从而达到纯化和浓缩、筛分溶液中不同组分目的，适用于分子量3kdal～1000kdal的大分子物质；纳滤工艺则是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，相比较于超滤工艺，纳滤工艺通常更适用于相对分子质量较小的物质的分离及浓缩，如小分子无机物、有机盐、单糖、低聚糖等，针对相对分子量在1000dal～3500dal之间的小分子物质可进行良好的分离、浓缩效果。

桦树汁中多糖类物质的相对分子量集中分布在1kdal～3kdal，通过超滤-纳滤分离纯化技术，对桦树汁中该相对分子量范围内的成分进行有效的分离浓缩，使制备的桦树汁分离液具备更加有效的治疗化学性肝损伤作用及临床使用前景。

发明内容

本发明涉及一种桦树汁分离液，该分离液通过对天然桦树汁进行超滤-纳滤复合分离浓缩制备。

该桦树汁分离液由桦树汁中相对分子量在1kdal～3kdal范围的物质组成。

该桦树汁分离液中总糖的含量不低于20%，优选不低于40%。

同时，该桦树汁分离液中多糖类物质在总糖中占比不低于80%，优选不低于85%。

专利中所涉及的桦树汁分离液可用于治疗化学性肝损伤

进一步，该桦树汁分离液可单独或与其他功效性成分联合用于治疗化学性肝损伤食品、药品的开发。

本发明中涉及的桦树汁分离浓缩液通过以下技术途径实现

（1）在压力0.5～1.5MPa，25～45℃，流速1～4m/s条件下，利用3kdal截留分子量的超滤膜组件，对天然采取的桦树汁进行一级超滤分离纯化，循环超滤分离2h后，收集滤过液，得内含物相对分子量低于3kdal的桦树汁超滤液。

（2）以制备的桦树汁超滤液作为原料，在0.5～1.5MPa，25～45℃，流速1～4m/s条件下，利用1kdal截留分子量的纳滤膜组件对桦树汁超滤液进行二级的纳滤分离浓缩，经循环纳滤2h后，得内含物相对分子量范围在1kdal～3kdal的桦树汁分离液。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进行具体的描述，同时以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1桦树汁分离液的制备及相关成分的含量测定

取桦树汁约2000mL，在压力1.5MPa，45℃、流速4m/s条件下，利用3kdal截留分子量的超滤膜组件对桦树汁进行一级分离纯化，循环超滤分离2h后，收集滤过液，得内含物相对分子量低于3kdal的桦树汁超滤液。

以桦树汁超滤液作为原料，在压力0.5MPa，35℃、流速1.5m/s条件下，利用1kdal截留分子量的纳滤膜组件对制备得到的桦树汁超滤液进行二级分离浓缩，循环纳滤2h后，得内含物相对分子量范围在1kdal～3kdal的桦树汁分离液。

桦树汁分离液中总糖、多糖及总三萜化合物的含量测定

(1)桦树汁分离液中总糖含量的测定

对照液的配置：

将葡萄糖标准品置于60°C的干燥箱中干燥24h，冷却后称取葡萄糖标准品2.5mg置于25mL容量瓶中，加蒸馏水溶解稀释至刻度，摇匀后即得0.1mg/mL的葡萄糖对照溶液。

分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.2mL的葡萄糖对照液于试管中，用蒸馏水补足至2mL，分别加入1.5mL、9%的苯酚溶液和2.5mL浓硫酸，混合均匀后放至室温冷却，在490nm处测定其吸光度值，绘制标准曲。

吸取0.5mL制备得到的桦树汁分离液，加蒸馏水补足2mL，相同处理方法操作后，测样品液的吸光度值，参照标准曲线，测得总糖含量。

（2）桦树汁中多糖含量测定

桦树汁中总糖质量与还原糖质量之差即为桦树汁中多糖质量。

桦树汁中还原糖质量的测定

参照二硝基水杨酸法进行还原糖的测定

分别吸取0.1mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.2mL的1mg/mL的葡萄糖溶液于试管内，用蒸馏水补至2.0mL，然后每管加入DNS液2.0mL，置于90℃恒温水浴锅中30min，取出冷却后，用蒸馏水稀释至100mL，在550nm处分别进行吸光度测定。以葡萄糖标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。吸取0.5mL制备得到的桦树汁分离液，加蒸馏水补足2mL，相同方法处理后，测样品液的吸光度值，参照标准曲线，测得还原糖含量。

（3）桦树汁分离液中五环三萜类化合物含量的测定

采用冰醋酸-香草醛-高氯酸显色比色法测定桦树汁分离液中五环三萜类化合物的含量

将10mg熊果酸标准品移入小烧杯中，加95%乙醇溶解，转入100mL容量瓶中95%乙醇定容至刻度，摇匀，得0.100mg/mL的熊果酸标准液。分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的熊果酸标准液于6个试管中，置于85°C水浴条件下120min，挥发乙醇溶剂。向试管中分别加入0.5mL5%的香草醛-冰醋酸溶液，摇匀后，再分别加入2.0mL高氯酸，摇匀后，置于60°C水浴条件下45min，取出冷却至室温后。加入5.0mL4%冰醋酸，混合均匀后，在548nm处测定吸光度，建立标准曲线。

准确移取1.0mL的桦树汁分离液于试管中，重复上述操作，在548nm处测定吸光度值。代入标准曲线换算，计算五环三萜类物质的含量。

经实验测定，每毫升该桦树汁分离浓缩液中的总糖含量为410.32mg，还原糖含量为51.73mg，多糖含量为358.59mg，多糖物质在桦树汁分离液的总糖中占比为87.39%，同时未检测到总三萜类化合物含量。

实施例2桦树汁分离液用于治疗小鼠化学性肝损伤实验

参照实施例 1 所述方法制备桦树汁分离液。

取120只SPF级昆明小鼠，随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性对照联苯双酯滴丸组、桦树汁分离液高、中、低剂量组，除空白组外，各组小鼠给予1次性腹腔注射0.1%的CCl4-豆油溶液10mL/kg，建立急性的肝脏损伤动物模型，空白组中小鼠的腹腔中注射进入同等量的生理盐水溶液。

建模完成后，桦树汁分离液高、中、低剂量组分别给予小鼠18ml/kg、9ml//kg、3ml//kg剂量桦树汁灌胃，联苯双酯滴丸组150mg/kg剂量灌胃，空白组及模型组大鼠等体积生理盐水灌胃，各组均连续干预14d。

14d后，对小鼠外周血液中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）浓度进行测定.

实验结果显示，与空白组比较，化学性肝损伤模型组小鼠的外周血ALT、AST活性均明显上调，与模型组比较，桦树汁分离液高、中、低剂量组小鼠血清中的ALT、AST活性显著降低，且呈剂量相关性，表明桦树汁分离液对化学性肝损伤具有较好的保护作用。

表1各组小鼠血ALT、AST活性变化

组别	ALT	AST
			空白组	47.93±14.92	60.26±7.50
模型组	153.81±7.46	112.56±8.91
			阳性对照组	73.21±10.50	76.83±9.07
桦树汁低剂量组	79.43±14.57	82.20±11.59
			桦树汁中剂量组	68.02±6.53	73.14±14.21
桦树汁高剂量组	57.44±9.12	65.43±10.40

实施例3桦树汁分离液、白桦脂酸、白桦脂醇治疗酒精性肝损伤大鼠对比实验

参照实施例 1 所述方法制备桦树汁分离液

将SD大鼠50只随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、酒精性肝病(ALD)模型组、桦树汁分离液组、白桦脂醇组及白桦脂酸组，空白对照组按9ml/kg^-1·d^-1的标准给予蒸馏水灌胃，其4组大鼠均以9ml/kg^-1·d^-1剂量50%浓度的乙醇溶液、进行灌胃。连续灌胃21d，建造小鼠酒精性肝损伤模型，建成ALD模型之后，空白组和模型组仍9ml/kg^-1·d^-1给予蒸馏水灌胃；桦树汁分离液组、白桦脂酸组、白桦脂醇组分别给予9ml/kg^-1·d^-1，连续灌胃14d。

末次给药结束后，大鼠禁食12h，对大鼠血清中ALT、AST、ALP、GCT的含量进行测定。

结果表明，相较于酒精性肝损伤模型组，白桦脂酸组、白桦脂醇组及桦树汁分离液组大鼠血清中的ALT、AST、ALP、GCT活性显著降低，其中白桦脂酸组降低水平优于白桦脂醇组，桦树汁分离液组中大鼠血清的各项指标活性下降最为明显。

表2对酒精性肝损伤大鼠血清中ALT、AST、ALP、GCT活性影响

组别	ALT	AST	ALP	GCT
					空白组	70.23±6.56	232.97±7.51	190.29±10.47	2.96±0.39
模型组	98.12±11.84	322.67±13.16	288.03±8.70	4.02±0.43
					白桦脂醇组	89.40±2.52	283.74±14.81	235.11±9.45	3.76±0.31
白桦脂酸组	81.54±2.19	246.70±10.22	211.08±9.74	3.52±0.15
					桦树汁分离液组	72.88±3.40	229.79±14.08	195.63±11.81	2.60±0.27

实施例4桦树汁分离液对大鼠肝细胞存活影响实验

参照实施例 1 所述方法制备桦树汁分离液

含桦树汁分离液小鼠血清的制备：取18只SPF级昆明小鼠，随机分为3组，分别以18ml/kg、9ml/kg、3ml/kg剂量的桦树汁分离液灌服，连续灌胃21d，每天灌胃2次，于最后一次灌服2h后，取股动脉血，分离采集血清，同组血清混合，使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制备得到含有高、中、低不同桦树汁分离液含量的小鼠血清，置于-20℃冰箱内保存备用。

大鼠肝BRL细胞由中国科学院细胞生物学研究所提供。

细胞培养及分组

所有细胞均置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

取处于对数生长期的细胞的BRL细胞分为5组，分别为空白对照组、阳性对照水飞蓟素组与桦树汁（高、中、低桦树汁分离液含量血清）组。

将处于对数生长期的BRL细胞用细胞用培养液制成5×10⁴个/mL的细胞悬液，分别接种于96孔培养板中培养。向各给药组中添加20μl、浓度为20mmol/L的CCl4，在此基础上，桦树汁分离液高、中、低剂量组分别添加具有不同桦树汁分离液含量的血清20μl，阳性对照组添加20μl浓度为40mg/kg的水飞蓟素，另设空白对照组。

分别取各组处于生长对数期细胞置于24孔板中，培养48h后，吸弃上清液，每孔加入MTT试剂20μl，继续培养4h后，弃上清液，每孔加入150μlDMSO，电动振荡器上电动震荡15min，以自动酶标仪测定 570 nm 波长处各孔光吸收值，计算细胞存活率。

实验结果显示，相较于空白对照组，模型组的细胞存活率显著降低；与模型组相比，桦树汁分离液各剂量组细胞存活率均有明显提升，并呈剂量相关性，表明桦树汁分离液对化学性肝损伤细胞具有良好的保护作用。

表3 桦树汁分离液对大鼠肝细胞存活率的影响

组别	细胞存活率／%
		空白组	100.00±3.27
模型组	27.08±6.43
		阳性对照组	65.62±4.58
桦树汁低剂量组	61.87±2.34
		桦树汁中剂量组	74.48±3.52
桦树汁高剂量组	86.01±2.96

Claims (7)

1.一种桦树汁分离液，其特征在于：该桦树汁分离液经由超滤-纳滤复合分离浓缩工艺制备。

2.根据权利要求1所述的桦树汁分离液，其特征在于：该桦树汁分离液由桦树汁中相对分子量在1kdal～3kdal范围内的物质组成。

3.根据权利要求1所述的桦树汁分离液，其特征在于：该桦树汁分离液中总糖的含量不低于20%，优选不低于40%。

4.根据权利要求3所述的桦树汁分离液，其特征在于：该桦树汁分离液中多糖类物质在总糖中占比不低于80%，优选不低于85%。

5.根据权利要求1所述的桦树汁分离液，其特征在于：该桦树汁分离液通过包含如下步骤的方法制备得到：

（1）在压力0.5～1.5MPa，25～45℃，流速 1～4m/s条件下，利用3kdal截留分子量的超滤膜组件，对天然采取的桦树汁进行一级超滤分离纯化，循环超滤分离2h后，收集滤过液，得内含物相对分子量低于3kdal的桦树汁超滤液

（2）以制备的桦树汁超滤液作为原料，在0.5～1.5MPa，25～45℃，流速1～4m/s条件下，利用1kdal截留分子量的纳滤膜组件对桦树汁超滤液进行二级纳滤分离浓缩，经循环纳滤2h后，得内含物相对分子量范围在1kdal～3kdal的桦树汁分离液。

6.根据权利要求1所述的桦树汁分离液，该桦树汁分离液可用于治疗化学性肝损伤。

7.根据权利要求6所述的桦树汁分离液，该桦树汁分离液可单独或联合其他功效性成分用于治疗化学性肝损伤食品、药品的开发。