CN115997680A - 耐低氮谷子种质鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种耐低氮谷子种质鉴定方法，旨在解决当前缺乏准确、可靠的谷子种质筛选及鉴定方法的问题；本申请以谷子地上和地下部分作为研究对象，利用水培方法，选取谷子苗期株高、根长、SPAD值，地下部干重、地上部干重、氮浓度为鉴定指标，筛选谷子耐低氮种质，利用谷子相对单株吸氮量和相对氮素利用效率的乘积鉴定不同谷子种质对低氮条件的耐受性。该方法较仅以氮含量或氮素利用效率单一指标进行谷子耐低氮性鉴定更为准确，筛选出的耐低氮种质在低氮条件下更容易获得高产，且对种质筛选的指导依据较传统方法更为合理，且该试验方法操作简单，易于实施，能够准确可靠的筛选鉴定谷子耐低氮种质，为培育耐低氮绿色谷子品种提供科学依据。
Description
技术领域
本申请涉及种质资源筛选技术领域，具体涉及一种耐低氮谷子种质鉴定方法。
背景技术
20世纪下半叶，为提高作物的生产效率，氮肥和其它营养的需求大幅提升，导致了全球氮肥用量提高了十倍。然而作物对氮肥的吸收利用小于其施用量的一半，大部分的氮肥由于N2和NH3等气体的挥发以及脱氮、淋溶后的含氮化合物经地表径流进入了江湖河海，造成了环境的严重污染。此外，氮肥已成为作物生产所需的最主要成本，世界上许多地区的粮食生产越来越注重优化产量、降低生产成本、减少环境污染和提高生产效率。因此，世界各地一致呼吁“第二次绿色革命”，即在促进农业生产及粮食增加的同时，确保环境可持续发展。
谷子（Setaria italica L.）是我国的原产作物，至今仍是旱作生态农业的主栽作物，在食物多样性和种植业结构调整中具有不可或缺的作用。由于基因组小、高效转化、生育期短、抗旱耐瘠性强，且易于实验室培养操作，正在快速发展成为禾本科黍亚科功能基因组和 C4光合作用的模式植物，通过选育优良品种及改良栽培制度，谷子的生产能力在一定程度上得到了提高，但是在产量、品质以及抗性等方面很难取得较大的突破，使得谷子的生产水平徘徊不前。因此通过开展谷子耐低氮研究，鉴定谷子耐低氮种质，为构建资源节约型、环境友好型“两型农业”培育耐低氮绿色谷子品种提供科学依据。
公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对当前缺乏准确、可靠的谷子种质筛选及鉴定方法的问题，本申请以谷子地上和地下部分作为研究对象，利用水培方法，选取谷子苗期株高、根长、SPAD值，地下部干重、地上部干重、氮浓度为鉴定指标，筛选谷子耐低氮种质，利用谷子相对单株吸氮量和相对氮素利用效率的乘积，可进一步鉴定不同谷子种质对低氮条件的耐受性，进而鉴定谷子种质的耐低氮能力。通过地下部干重、地上部干重及相对单株吸氮量和相对氮素利用效率的乘积来表征谷子的耐低氮性，较仅以氮含量或氮素利用效率单一指标进行谷子耐低氮性鉴定更为准确，通过该方法筛选出的耐低氮种质在低氮条件下更容易获得高产，且对种质筛选的指导依据较传统方法更为合理，且该试验方法操作简单，易于实施，能够准确可靠的筛选鉴定谷子耐低氮种质，为培育耐低氮绿色谷子品种提供科学依据，进而可有效的减少氮肥的施用量，降低种植成本，减轻环境污染，改善环境压力。
根据本公开的一个方面，提供一种耐低氮谷子种质鉴定方法，包括如下步骤：
（1）种子处理：从待鉴定谷子品种中挑选色泽鲜亮、籽粒饱满的种子，以5%次氯酸纳溶液消毒后，用无菌水冲洗3～5遍；
（2）水培：将上步所得种子浸种于无菌水中，于25～27℃下暗培养催芽3～4天，然后利用水培营养液进行正常光照培养至两叶一心期，培养条件为26～29℃下光照13～15小时，25～27℃黑暗9～11小时，整个培养过程中每隔1天更换一次营养液；水培营养液设正常营养液（氮浓度为2.5 mmol/L）和低氮营养液（氮浓度为0.5 mmol/L）2个处理；
（3）耐低氮特性测评：各处理条件下的谷子幼苗在营养液中培养20～22d后，调查各处理的株高、根长、SPAD值，并测定其根干重、地上部干重、氮浓度；再将低氮胁迫处理的谷子幼苗与正常氮处理的谷子幼苗的株高、根长、SPAD值、根干重、地上部干重、氮浓度进行比较，以低氮处理和正常氮处理条件下根干重、地上部干重无显著差异的谷子品种作为耐低氮种质；
（4）耐低氮和低氮敏感性鉴定：测定待鉴定品种的相对单株吸氮量和相对氮素利用效率，并进行分析和比较，当相对单株吸氮量和相对氮素利用效率二者乘积大于0.7，鉴定为耐低氮品种，二者乘积小于0.3时，鉴定为低氮敏感品种。
在本公开的一些实施例中，在所述步骤（3）中，利用t检验来判断不同氮浓度处理下各性状的差异显著性，当P≤0.05时，表示二者差异显著，当P >0.05时，表示二者无显著差异。
在本公开的一些实施例中，所述水培营养液成分组成如下：
。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1. 本申请试验方法操作简单，易于实施，能够准确可靠的筛选鉴定谷子耐低氮种质，为培育耐低氮绿色谷子品种提供科学依据，进而可有效的减少氮肥的施用量，降低种植成本，减轻环境污染，改善环境压力。
2. 本方法筛选出的耐低氮种质在低氮条件下更容易获得高产，且对种质筛选的指导依据较传统方法更为合理。
附图说明
图1为本申请实施例中的耐低氮谷子品种鉴定流程图。
具体实施方式
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂及原料如无特别说明，均为市售常规原料；所涉及的试验、检测方法，如无特别说明，均为常规方法。
方法及试验设置：
1.1筛选方法
作物耐低氮种质的筛选方法主要包括两类：一类是田间筛选，另一类是介质培养筛选。其中介质筛选法可分为：水培、土培、沙培及组织培养法。田间筛选由于工作量大，耗时较长，不能有效的大批量快速筛选。土培法是采用盆栽的方法在土壤中进行筛选，虽然能反映出作物在土壤中的生长情况，但是土壤的成分及各营养元素的浓度难以控制，往往达不到理想的筛选结果。而且大田试验和土培法不利于一些观察或测量根系的研究。本申请采用水培法易于试验环境的控制，也利于各项指标的观测。
1.2筛选压力
筛选压力指对作物进行耐低氮种质筛选和氮效率评价时的适宜氮浓度。氮浓度过高或者过低均不利于作物耐低氮基因型的筛选。本申请选择低氮胁迫营养液中氮浓度为0.5 mmol/L，正常氮营养液中氮浓度为2.5 mmol/L。
1.3筛选时期
作物耐低氮基因型筛选时期一般分为苗期和全生育期。全生育期筛选需在田间进行，但全生育期试验耗时耗力，且影响因素和筛选条件难以控制。研究表明谷子氮营养敏感时期为生育前期（三到五叶期），氮元素缺少会抑制其正常生长，且后期难以弥补。
实施例一：
耐低氮谷子品种鉴定（参见图1）
1. 种子处理：挑选色泽鲜亮、籽粒饱满的谷子种子100粒左右，在无菌的培养皿中用5%次氯酸纳溶液消毒15分钟后，用灭过菌的去离子水冲洗3～5遍。
2. 水培：将灭菌后的种子浸种在装有无菌水的遮光培养盒中，放置恒温培养箱中（26℃）暗培养催芽3～4天，然后进行正常光照（28℃光照14h，26℃黑暗10h，整个培养过程中每隔1天更换一次营养液，每天补充去离子水至1L，并用1M HCl调节营养液pH值至6.0）培养至两叶一心期，利用营养液在培养盒中进行培养，每个培养盒中加营养液1L。营养液设正常营养液和低氮营养液2个处理，每个处理设置三个重复，其中低氮胁迫营养液中氮浓度为0.5 mmol/L，正常氮营养液中氮浓度为2.5 mmol/L，其它成分含量与浓度二者均相同。水培营养液配方如表1所示。
表1谷子苗期低氮和正常氮水培营养液配方
。
水培营养液母液中由于CaCl2溶液与MgSO4溶液在浓度较大时易产生沉淀，因此CaCl2溶液需单独配制成母液并稀释使用。
3. 耐低氮相关性状选择及检测
谷子幼苗在营养液中培养21d后调查每个品种重复处理的株高、根长、SPAD值；调查完毕后放入80℃烘箱杀青40min，然后置于50℃烘箱中烘干至恒重，分别测定低氮处理下的植株干重（plant dry weight under low nitrogen condition, LPW）、根干重（rootdry weight under low nitrogen condition, LRW）、地上部干重（shoot dry weightunder low nitrogen condition, LSW）和根冠比（root -shoot ratio under lownitrogen condition, LRSR），正常氮处理下的植株干重（plant dry weight undernormal nitrogen condition, NPW）、根干重（root dry weight under normal nitrogencondition, NRW）、地上部干重（shoot dry weight under normal nitrogen condition,NSW）和根冠比（root -shoot ratio under normal nitrogen condition, NRSR）。待干重指标测定完成后，分别测定其氮浓度和含氮量。
以相对根干重、相对地上部干重、相对植株干重、相对根冠比、氮浓度和含氮量作为耐低氮特性的评价指标，当相对值越接近于1，表明该品种耐低氮能力越强；以株高、根长、SPAD值作为耐低氮特性的参考指标。
其中，
相对根干重（RRW）=LRW/NRW；
相对植株干重（RPW）=LPW/NPW；
相对地上部干重（RSW）=LSW/NSW；
相对根冠比（RRSR）=LRSR/NRSR。
将低氮胁迫处理的谷子幼苗与正常氮处理的谷子幼苗的株高、根长、SPAD值、根干重、地上部干重、氮浓度进行比较，利用t检验来判断不同氮浓度处理下各性状的差异显著性，当P≤0.05时，表示二者差异显著，当P>0.05时，表示二者无显著差异，以低氮处理和正常氮处理条件下各指标无显著差异的谷子品种作为耐低氮种质。
4. 试验结果分析
本例利用t检验来判断不同氮浓度处理下各性状的差异显著性，当P≤0.05时，表示二者差异显著，当P>0.05时，表示二者无显著差异，不同谷子品种在正常氮和低氮条件下株高、SPAD值、根长、地上部干重、地下部干重见表2，单株干重相对值、地上部干重相对值、地下部干重相对值及根冠比相对值见表3。表2中各性状均值后面的字母表示每个品种在正常氮和低氮处理下是否有显著差异，字母不同表示二者之间差异显著，反之则无显著差异。不涉及不同品种间的差异比较。
由表2和表3可知，各性状之间的统计分析表明，豫谷28和豫谷30这两个品种地上部干重和地下部干重在正常氮和低氮处理下无显著差异，即豫谷28和豫谷30耐低氮性较强，为耐低氮品种，且该两个品种RPW、RSW和RRW值较高，均达到了0.70以上，其中RRW为0.80以上。七叶黄和晋谷40各性状值在正常氮和低氮处理下均达到显著差异，为低氮敏感品种，该两个品种的RPW、RSW和RRW值较低，均低于0.4。其它为中度耐低氮品种。可见根据各性状值和其相对值可能会把部分低氮敏感品种和耐低氮品种分到中度耐低氮品种一类里面，如低氮敏感品种赤优金苗1号地下部干重相对值高于耐低氮品种济谷20，而RPW和RSW值则较低，表明某一个性状相对值较高不一定为耐低氮品种，因此各性状值之间的差异和相对值大小的比较难以准确分类耐低氮和低氮敏感品种。
表2不同谷子品种在正常氮和低氮处理下性状值比较
。
表3 不同谷子品种在正常氮和低氮处理下各性状相对值
。
为进一步验证以上鉴定结果的准确性，选取筛选出2份耐低氮品种豫谷28、豫谷30和2份低氮敏感品种七叶黄、晋谷40，利用杜马斯燃烧定氮法进行氮素相关指标的测定。样品烘干磨碎后，称取0.2g粉碎样品于无氮锡箔纸中，排出空气，置于自动进样器中。样品在氧化管中充分燃烧，生成的气体经过高温铜粉还原、多孔陶瓷吸附及干燥除水后，通过TCD检测器检测，由标准曲线计算、定量。反应条件：燃烧管温度为990℃，还原管温度为650℃。同时称取一定量的EDTA上机检测，绘制标准曲线，被测样品中的氮含量就自动的计算、打印和存储起来。每个处理每个样品3次生物学重复，每个重复样品平行测定3次，然后计算单株吸氮量和氮素利用效率。
单株吸氮量是指整株氮素总量，氮素利用效率指植株每克氮素所产生的干重克数。
单株吸氮量（mg）=氮含量（mg/g）×单株样品干重（g）；
氮素利用效率（g/g）=[单株样品干重（g）/单株吸氮量（mg）]×1000；
相对单株吸氮量=低氮单株吸氮量/正常氮单株吸氮量；
相对氮素利用效率=低氮氮素利用效率/正常氮氮素利用效率。
由表4可知，耐低氮品种氮含量在低氮和正常氮条件下均高于低氮敏感品种，而单株吸氮量和氮素利用效率则未呈现此趋势，相反在低氮和正常氮条件下低氮敏感品种氮素利用效率则高于耐低氮品种。耐低氮品种豫谷28和豫谷30相对单株吸氮量均大于低氮敏感品种七叶黄和晋谷40，而相对氮素利用效率则表现出相反的趋势；当相对单株吸氮量和相对氮素利用效率相乘时，其结果表现为耐低氮品种二者乘积均大于0.7，低氮敏感品种二者乘积小于0.3，表明鉴定耐低氮和低氮敏感品种时应将相对单株吸氮量和相对氮素利用效率同时进行分析和比较。
表4耐低氮品种和低氮敏感品种氮素含量及氮素利用率比较
。
尽管已描述了本申请的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请保护范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请之发明精神和范围。这样，倘若这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种耐低氮谷子种质鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）种子处理：从待鉴定谷子品种中挑选色泽鲜亮、籽粒饱满的种子，以次氯酸纳溶液消毒后，用无菌水冲洗3～5遍；
（2）水培：将上步所得种子浸种于无菌水中，于25～27℃下暗培养催芽3～4天，然后利用水培营养液进行正常光照培养至两叶一心期，培养条件为26～29℃下光照13～15小时，26℃黑暗9～11小时，整个培养过程中每隔1天更换一次营养液；水培营养液设正常营养液和低氮营养液两个处理；
（3）耐低氮特性测评：各处理条件下的谷子幼苗在营养液中培养20～22d后，调查各处理的株高、根长、SPAD值，并测定其根干重、地上部干重、氮浓度；再将低氮胁迫处理的谷子幼苗与正常氮处理的谷子幼苗的株高、根长、SPAD值、根干重、地上部干重、氮浓度进行比较，以低氮处理和正常氮处理条件下根干重、地上部干重无显著差异的谷子品种作为耐低氮种质；
（4）耐低氮和低氮敏感性鉴定：测定待鉴定谷子品种的相对单株吸氮量和相对氮素利用效率，并进行分析和比较，当相对单株吸氮量和相对氮素利用效率二者乘积大于0.7，鉴定为耐低氮品种，二者乘积小于0.3时，鉴定为低氮敏感品种。
2.根据权利要求1所述的耐低氮谷子种质鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，利用t检验来判断不同氮浓度处理下各性状的差异显著性，当P≤0.05时，表示二者差异显著，当P >0.05时，表示二者无显著差异。
3.根据权利要求1所述的耐低氮谷子种质鉴定方法，其特征在于，所述水培营养液成分组成如下：
。
4.根据权利要求1所述的耐低氮谷子种质鉴定方法，其特征在于，所述正常营养液的氮浓度为2.5 mmol/L，所述低氮营养液的氮浓度为0.5 mmol/L。
5.根据权利要求1所述的耐低氮谷子种质鉴定方法，其特征在于，所述相对单株吸氮量和相对氮素利用效率由以下式计算：
单株吸氮量（mg）=氮含量（mg/g）×单株样品干重（g）；
氮素利用效率（g/g）=[单株样品干重（g）/单株吸氮量（mg）]×1000；
相对单株吸氮量=低氮单株吸氮量/正常氮单株吸氮量；
相对氮素利用效率=低氮氮素利用效率/正常氮氮素利用效率。
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