CN114946319B - 一种双浓度peg6000评价陆地棉萌发期抗旱性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物逆境胁迫技术领域，具体涉及一种双浓度PEG6000评价陆地棉萌发期抗旱性的方法。本发明首次提出采用浓度为12％和16％的PEG6000滤纸进行陆地棉萌发期抗旱性的评价。采用本发明提供的方法，能够在36份陆地棉中，获得品种间差异极显著的萌发期抗旱指数。通过在室内和田间进行实验验证，结果表明，采用本发明提供的双浓度PEG6000滤纸抗旱评价法鉴定筛选陆地棉萌发期抗旱性是可行的，并且本发明提供的方法可以筛选出强抗旱性的棉花，还可以筛选出抗旱性中等的材料。
Description
技术领域
本发明涉及植物逆境胁迫技术领域，具体涉及一种双浓度PEG6000评价陆地棉萌发期抗旱性的方法。
背景技术
干旱胁迫是棉花整个生育期均可能会遇到的非生物逆境。种子萌发是绝大多数种子植物生活史中最先表达的性状，影响植物各种萌发后性状的表型、遗传表达和自然选择，进而影响植物的生态适应性。植物种子萌发极易受到外界环境各种因子的影响，干旱胁迫是种子发芽过程中的一个主要的限制性因素。
因此，棉花萌发期的抗旱性是关系到棉田是否能一播全苗的关键。研究PEG6000对陆地棉萌发的影响，有利于挖掘水分胁迫条件下影响棉花萌发的关键因素，有利于深入了解棉花萌发期抗旱性的分子机理，为筛选萌发期抗旱性强的资源材料制定可行的鉴定方法，为创制抗旱性强的新材料新品种贮备有效的资源材料。
赵丽丽等(2015)采用聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫，以CaCl2浓度为外源钙离子，研究干旱条件下外源钙对二色胡枝子(Lespedeza bicolor)种子萌发的影响；覃章辉等(2019)利用不同水势的PEG6000溶液模拟干旱土壤环境，研究了喀斯特地区乡土植物全缘火棘种子萌发过程中对干旱的耐受能力；骆岩等(2019)甚至采用40％的高浓度PEG6000对甜菜种子进行处理，研究种子贮藏年限对不同甜菜种子萌发的影响。在棉花萌发期抗旱研究中，张雪妍等(2007)以PEG6000作为水分胁迫剂，筛选出17％(W/V)的PEG6000溶液浓度可以作物棉花幼苗的抗旱鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花萌发期抗旱性的鉴定方法，采用双浓度PEG进行棉花萌发期抗旱性的鉴定。
在本发明提供的鉴定方法中，所述双浓度PEG为12％-16％浓度PEG的任意2种。
在本发明提供的鉴定方法中，所述双浓度PEG为12-13％和16-16.5％浓度的PEG6000。
本发明提供的鉴定方法中，将棉花种子揉搓后，采用含有PEG溶液的滤纸包裹，竖直放入烧杯中，静置20-30分钟，在烧杯上套上黑色塑料袋保湿，恒温培养，测量发芽个数、芽全长、下胚轴长度和胚根长度，获得棉花萌发期抗旱指数。
本发明提供的鉴定方法中，恒温培养的温度为25-28℃，恒温培养的时间为3-5天。
本发明提供的方法，避免了单一浓度的缺点，使鉴定结果更准确。同时可以根据研究需要进行单粒抗旱性鉴定，且鉴定完种子仍可以进行种植保存或下一步研究基因表达和生理生化利用，同时制定了可靠的抗旱分级标准，供其他人有效参考。
在本发明提供的鉴定方法中，棉花萌发期抗旱指数的计算公式为：
清水条件下萌发率(％)＝清水条件下萌发个数(个)/总粒数；
PEG6000条件下萌发率(％)＝PEG6000条件下萌发个数(个)/总种子粒数(个)；
PEG6000萌发期抗旱指数(％)＝(PEG6000条件下萌发率/清水条件下萌发率)×(PEG6000条件下芽长/清水条件下芽长)；
双浓度滤纸法萌发抗旱指数＝第一浓度PEG6000萌发期抗旱指数+第二浓度PEG6000萌发期抗旱指数；
所述第一浓度或第二浓度的PEG6000为12％-16％PEG6000的任意一种。
在本发明提供的鉴定方法中，所用的评价标准为：
(1)萌发期抗旱指数≥70.00％，其抗旱性为1级；
(2)萌发期抗旱指数45.00.00％-69.99％，抗旱性为2级；
(3)萌发期抗旱指数20.00％-44.99％，抗旱性为3级；
(4)萌发期抗旱指数0％-19.99％，抗旱性为4级。
在本发明提供的鉴定方法中，所述棉花为陆地棉。
根据本领域技术人员，本发明还请求保护，上述棉花萌发期抗旱性的鉴定方法在提高棉花抗旱性育种效率中的应用。
以及上述棉花萌发期抗旱性的鉴定方法在提高中等抗旱陆地棉鉴定准确性中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的方法不仅能很好的区分不同陆地棉材料间萌发期的抗旱性，而且对F2代单粒种子也能很好鉴定出来(注：F2代是分离世代，具有丰富的遗传变异，每一粒种子代表不同的基因型，所以拥有不同的抗逆性)，不但为抗旱育种的早期选择提供了鉴定方法，而且为抗旱性的遗传性研究提供的有效方法，并且对于鉴定出的抗旱性强的单粒还可以种植于田间继续收获到种子，用于后期的深入研究，避免了优质后代材料的丢失。
(2)本发明提供的双浓度PEG，克服了由单一浓度PEG6000鉴定陆地棉萌发所造成一些材料不同抗旱性程度的缺失，不但可以筛选出强抗旱性的棉花，还可以筛选出抗旱性中等的材料，使得棉花萌发期抗旱性差异筛选更容易。并且，鉴定完种子仍可以进行种植保存或下一步研究基因表达和生理生化利用，同时制定了可靠的抗旱分级标准，供其他人有效参考。
附图说明
图1是本发明PEG6000竖直滤纸卷法操作流程。
图2是本发明4d清水萌发的陆地棉种子各组织器官示意图。
图3是本发明参试材料每种抗旱类型所含份数的正态分布图。
图4是本发明双浓度PEG滤纸法筛选陆地棉材料萌发期抗旱性的验证实验结果图。
图5是本发明双浓度PEG滤纸法筛选陆地棉材料萌发期抗旱性在田间的验证结果图。
图6是本发明双浓度PEG滤纸法对陆地棉杂交组合F2后代萌发期抗旱性的检测。
图7是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉萌发期下胚轴GABA含量的影响。
图8是本发明不同浓度PEG6000与棉花下胚轴GABA含量的相关性。
图9是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉萌发期胚根中GABA含量的影响。
图10是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉发芽率的影响。
图11是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉芽长影响的效果图。
图12是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉芽长的影响。
图13是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉下胚轴长度的影响。
图14是本发明不同浓度PEG6000对陆地棉胚根长度的影响。
图15是本发明利用PEG双浓度法评价部分棉花资源材料萌发期抗旱鉴定结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例中，所用植物材料来源于中国农业科学院棉花研究所和国家棉花种质中期库(安阳)和全国各地育种家培育的品种(系)，具体植物材料信息见表1。
表1 36份棉花种质资源来源
本发明所用仪器设备为：GZP-250B智能光照生长箱(中国，南京恒裕仪器)，SP-Max2300A光吸收型全波长酶标仪；Nanodrop2000核酸分析仪；ABI QuantStudio6Flex荧光定量PCR仪(美国，赛默飞ABI)。
本发明所用试剂为：PEG6000；植物γ-氨基丁酸(GABA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(mlbio，酶联生物)，用于测定γ-氨基丁酸(GABA)的含量；EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒，用于RNA的提取；PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)试剂盒(TaKaRa，China)，用于基因的荧光定量分析。
本发明采用进行数据处理的软件为EXCELL8.0；统计分析软件为SAS8.0。
实施例1双浓度PEG6000评价陆地棉萌发期抗旱性的方法
本实施例提供一种陆地棉抗性评价方法，本实施例采用，12％和16％的PEG6000进行陆地棉萌发期抗旱性的评价。本实施例所采用的方法，步骤如下。
(1)PEG6000竖直滤纸卷法操作
根据种子多少裁剪合适大小的滤纸，不要太长，太长竖直后易弯曲，容易造成芽的弯曲，不容易量准芽的长度，太短可摆的种子太少，一张纸保证可以做一个重复；在滤纸的左上角做好标记；将滤纸放入合适的托盘中，用PEG6000溶液(对照用清水)将滤纸充分打湿，以不存水为准。
接着用PEG6000溶液(对照用清水)将棉花种子充分揉搓，利于充分吸水，脱过绒的种子不用揉搓，可直接摆放；将滤纸窄边折叠两次，形成一个拢，然后顺着拢摆放种子形成一个直线，让种子的大头统一朝左，即朝做标记的方向，小头朝右，两粒种子中间隔5公分左右，一行摆5-6粒，种子间隔开来摆放有利于种子萌发后芽充分伸展，然后卷起来，再摆，再卷；将所有参试种子摆进去，形成一个滤纸卷，其中靠边缘的地方不要再放种子了，如果种子放在滤纸边缘，生长过程容易脱落；如果参试种子较多，可将滤纸裁的稍宽一些，这样滤纸卷稍粗一些；将所有参试材料卷完后，竖直放进烧杯中，其中做标记的方向朝上，这样，胚根就方便向下生长。操作步骤见图1。
(2)下胚轴、芽全长、胚根的测定方法
将烧杯静置20-30分钟，倒掉烧杯下面渗透出来的PEG6000溶液(对照为清水)；烧杯上套上合适的黑色塑料袋避光，将塑料袋口扎紧保湿；放入28℃恒温培养箱中，4天后调查发芽个数并测量芽全长、下胚轴长度、胚根长度。
如图2所示，陆地棉种子萌发后下胚轴是指种子(子叶)下部到胚根中间那部分，胚轴与胚根之间有明显的交接处，容易分辩，主要依据是胚轴部分有小黑点状棉酚且较粗较脆；芽全长是指胚轴和胚根的总和，即子叶下部全部芽长；胚根是下面那部分细长的那部分。萌发期不同部位长度测量及取样均按以上所描述的进行，每处理选取发芽最长的10粒种子进行测量，而生化和RNA等取样部位为准确起见离下胚轴和胚根交接处稍远一些，每处理取3个生物学重复。
在12％和16％PEG6000胁迫条件下进行萌发期试验，清水为对照，每处理3个生物学重复，按上述方法进行试验和调查。同时按以下公式计算萌发抗旱指数，并进行抗性分类。
12％PEG6000萌发期抗旱指数(％)＝(PEG6000条件下萌发率/清水条件下萌发率)×(PEG6000条件下芽长/清水条件下芽长)。
16％PEG6000萌发期抗旱指数(％)＝(PEG6000条件下萌发率/清水条件下萌发率)×(PEG6000条件下芽长/清水条件下芽长)。
双浓度滤纸法萌发抗旱指数＝12％PEG6000萌发期抗旱指数+16％PEG6000萌发期抗旱指数。
实验结果显示，12％和16％的PEG6000处理后，不同棉花材料间的变异系数增大，PEG6000浓度越高，变异系数越大。清水条件下不同棉花材料萌发率和芽长的差异主要来自于种子的活力，与种子的年份、保存的条件有关，而PEG6000处理后它们的差异主要来自于他们萌发时的抗水份胁迫能力间的差异，是由不同材料基因型差异所决定的；本发明的公式中除以清水条件下的萌发率和芽长目的是消除种子本身的活力差异。双浓度PEG6000处理后，36份陆地棉材料萌发期抗旱指数见表2。
表2 36份陆地棉材料萌发期抗旱指数
实施例2陆地棉萌发期抗旱性评价方法的制定
由表2可知，36份陆地棉萌发期抗旱指数品种间差异极显著，从13.92％到76.97％均有分布，变异系数45.98，说明陆地棉萌发期抗旱性种质间存在比较大的异质性，同时说明本发明提供的12％和16％浓度PEG评价方法是有效的。
由于涉及两种PEG6000浓度，将此方法定义为双浓度PEG滤纸抗旱评价法。陆地棉萌发期抗旱性分为4个级别，其具体分类如表3，具体分级方法为，萌发期抗旱指数≥70.00％，其抗旱性为1级，萌发期抗旱指数45.00.00％-69.99％，抗旱性为2级；萌发期抗旱指数20.00％-44.99％，抗旱性为3级；萌发期抗旱指数0％-19.99％，抗旱性为4级。
36份陆地棉材料中萌发期抗旱性达1级的材料有4份，占总材料的11.11％，分别为中J1857、中JCM22、中棉所35、豫2067，达2级的材料有6份，达3级的有21份，2级和3级共27份，占总参试材料的一大半，说明棉花萌发期抗旱性大部分能达到中等程度的抗旱性；参试材料每种抗旱类型所含的份数基本呈正态分布，说明本发明提供的双浓度评价方法是可靠的(见图3)。
表3陆地棉萌发期抗旱性分级
实施例3陆地棉萌发期抗旱性室内验证
本实施例对双浓度PEG的评价效果进行室内验证，具体的，本实施例的步骤如下。
选取萌发期抗旱性差异极显著的两个棉花材料，抗旱性达1级的豫2067(抗旱指数为74.30％)和抗旱性4级的中远HM1(抗旱指数为18.04％)。播种于装有灭过菌沙土的发芽盒中，沙土的水分含量为22％-23％左右，发芽盒加盖保湿，28℃条件7天出苗，揭开发芽盒的盖子，子叶平展2d后开始进行断水处理，对照正常浇水。断水3d时观察叶片萎蔫程度并照相。
室内验证结果显示，正常浇水条件下两个材料无症状上的差异，断水3d后两个材料症状差异明显，豫2067叶片大部分植株叶片无明显萎蔫现象，而中远HM1大部分叶片明显萎蔫发软，下胚轴也发软弯曲，说明其受旱严重(图4)。该结果证明了利用我们的方法鉴定筛选陆地棉萌发期抗旱性是可行的。
实施例4陆地棉萌发期抗旱性田间验证
本实施例对双浓度滤纸法筛选出的部分材料在田间进行萌发期抗旱性验证。
本实施例随机取抗旱指数不同的4个材料，江苏棉1号、中棉所35、中远HM1和中远9116，它们PEG双浓度法萌发抗旱指数分别为：57.10％、72.79％、18.04％、44.26％。
本实施例在防雨棚中的有底水泥池中进行实验，池子长20米，宽2米，深30cm，设对照池和干旱池，播种前对池子里土壤控制浇水，翻地，使对照池土壤含水量为20％-23％，干旱池土壤含水量为13％-15％左右时播种，每个材料的每处理中，取健壮的、均匀的无破损的种子100料，取3个重复，10d后调查出苗率(见图5)。
图5结果显示，4个材料从左到右分别为中棉所35、中远9116、江苏棉1号、中远HM1，在对照池4个材料出苗均较好，苗比较大，出苗率分别为80.67％、82.35％、85.23％，84.78％，无显著差异，而在干旱池中，4个材料出苗率分别为67.57％、35.65％、45.83％，24.18％，材料间差异达极显著，且与双浓度PEG滤纸法鉴定结果呈成相关，抗旱材料不但出苗率高，且苗长势表现的比不抗旱材料较旺。该田间实验结果表明，采用双浓度PEG滤纸法鉴定陆地棉萌发期的抗旱性是可行的。
实施例5陆地棉F2代萌发期抗旱性鉴定
根据研究需要，F2代的萌发期抗旱性鉴定PEG6000浓度范围12％-16％均可以。以中棉所35为母本，其萌发期抗旱性达1级，以中棉所12为父本，其萌发期抗旱性达3级，配成杂交组合(中棉所35×中棉所12)。以12％PEG6000浓度对(中棉所35×中棉所12)杂交组合的F2后代进行单粒种子的萌发抗旱鉴定，随机取100粒种子进行，清水对照也取100粒种子，结果如图6和表4所示，F2后代单粒萌发期的抗旱性类型丰富，萌发抗旱指数分布范围为0-72.08％，4种萌发期抗旱性类型均有分布，F2后代中有与双亲抗旱性相似的，说明杂交后代的遗传作用，也有与双亲抗旱性不同的后代材料，充分说明了杂交后代的重组作用，由此本发明可以创制出所需要的后代材料。因为F2代是分离世代，每一粒种子的遗传信息都是唯一的，利用双浓度PEG进行萌发期鉴定(由于F2代每一粒种子的单一性，即1粒种子只能萌发1次，所以可以根据研究需要选12％PEG6000浓度或16％的PEG6000，表4选的是12％浓度PEG6000举例子，已经看出其后代萌发期抗旱性的规律；还可以另外选该组合的一批种子用16％浓度PEG6000进行F2代单粒种子进行萌发期抗旱性鉴定，可以筛选抗旱性差异更大的后代材料)，可以对遗传后代进行精确和早期的抗旱性筛选鉴定，鉴定完还可以进行田间种植，对后续的试验和繁种没有影响，对保留和选择优良抗逆后代可以起着提前筛选的作用，有效避免了优异后代的丢失。参照本发明的试验结果，研究人员可以根据研究需要配制不同组合，检验一些棉花抗旱性的遗传规律等。
表4(中棉所35×中棉所12)F2代单粒种子的抗旱萌发指数
实施例6 PEG6000对陆地棉萌发期不同部位GABA(γ氨基丁酸)含量的影响
PEG6000显著降低了陆地棉萌发率和芽长，使种子萌发后的下胚轴、胚根均变短变细，其中对胚轴长度抑制要大于胚根。为了探明PEG6000造成棉花下胚轴、胚根均变短变细的原因，本发明测定了清水条件下和PEG6000处理条件下的棉花下胚轴、胚根中GABA含量。由图7和图9可以看出，不同浓度PEG6000处理条件下棉花下胚轴、胚根中GABA含量均提高了。
1、不同浓度PEG6000对陆地棉萌发期下胚轴GABA含量的影响
由图7可以看出，清水对照条件下中棉所35和GK50的下胚轴GABA含量已达到一定浓度；随着PEG6000浓度的提高，陆地棉萌发时下胚轴中GABA浓度也随之提高，不考虑清水对照下胚轴的GABA的浓度，两个品种下胚轴中平均GABA浓度与PEG6000浓度呈线性正相关，相关系数为0.9862，两者之间的关系如公式1(图8)；下胚轴中GABA浓度与下胚轴长度呈负相关；10％的PEG6000浓度处理下，下胚轴的浓度已显著高于清水对照，其它浓度条件也均极显著高于清水对照；清水对照条件下和10％的PEG6000浓度处理下中棉所35和GK50这两个品种之间的下胚轴GABA浓度无显著差异，其它浓度处理条件下两者差异达显著或极显著(图7)，随着PEG6000浓度的升高，中棉所35下胚轴中GABA浓度变化比较平稳定，GK50中上升的比较快，特别是大于15％PEG600浓度后GABA上升的更为明显。不同浓度PEG6000处理条件下两品种间下胚轴中平均GABA浓度达差异极显著(表5)，不抗旱品种材料GK50下胚轴中GABA浓度极显著高于抗旱品种中棉所35下胚轴中的GABA浓度，所以受大于12％浓度的PEG6000处理后的下胚轴GABA浓度可以作为鉴定棉花萌发期抗旱性鉴定的生化指标。
表5不同品种受PEG6000处理后下胚轴平均GABA浓度比较
| 名称 | 平均GABA浓度/(μM/g FW) |
| 中棉所35 | 49.85Bb |
| GK50 | 71.11Aa |
2、不同浓度PEG6000对陆地棉萌发期胚根GABA含量的影响
清水对照条件下，中棉所35和GK50胚根每克鲜重(其中克用g代表，鲜重用FW代表，是Fresh Weight的缩写)中GABA浓度分别达到了44.27μM和34.58μM，二者差异显著，说明抗旱材料自身胚根中GABA的含量较高，可能这是其抗旱性比较强的内在原因。不同浓度PEG6000处理条件下，两个品种中胚根中GABA浓度基本呈上升趋势(图9)，均极显著高于清水对照；12％-17％PEG6000处理条件下，中棉所35和GK50胚根中GABA浓度达差异极显著；随送PEG6000浓度的提高，中棉所35胚根中GABA浓度的变化比较平稳，升高幅度小，GK50胚根中GABA浓度的升高的则比较快。棉花胚根中GABA浓度随着PEG6000浓度的提高升高幅度大小与其受抑制程度呈正比，与萌发期抗旱性呈反比。中棉所35胚根中GABA浓度升高幅度小，受抑制程度小，而抗旱性较强，而GK50胚根中GABA浓度升高幅度较大，受抑制程度也较大，而抗旱性较弱。
实施例7不同浓度PEG6000处理后陆地棉下胚轴和胚根中抗逆基因表达情况
为了探明陆地棉萌发受PEG6000胁迫后下胚轴和胚根中相关基因表达情况，参考部分文献中关于抗逆基因的相关报道，本发明在棉花功能基因组网站筛选得查到与抗逆相关的基因19个，这19个基因的类型包括了钙离子信号转导、转录因子、激酶、结构功能蛋白以及诸如LEA和脱水素等一些功能蛋白，设计引物，选取清水对照、低浓度PEG6000(5％)、中高浓度PEG6000(15％)3个处理水平的萌发4d时的下胚轴、胚根进行基因荧光表达分析，清水对照基因表达量为1，5％和15％PEG6000条件下基因的表达量与清水对照条件下的基因表达量进行比较，计算出表达倍数，结果如表6。
表6陆地棉萌发期受PEG6000胁迫后下胚轴和胚根中抗逆相关基因表达倍数分析量
表6中19个抗旱相关基因的荧光定倍数表达结果表明，与清水对照相比，19个基因中在中棉所35的5％处理条件下胚轴中有6个基因上调表达，在GK50中7个基因上调表达；与清水对照相比，15％中高浓度PEG6000处理条件下，中棉所35下胚轴中有7个基因上调表达，GK50有12个基因上调表达；无论低浓度还是中高浓度度PEG6000胁迫处理，GK50下胚轴中基因上调表达的数量均高于中棉所35，其中在15％的浓度中上调表达的更多。不同浓度处理条件下两个品种下胚轴中上调表达的基因并不一致，且上调的幅度不是很大，除了编码胚胎蛋白DC-8基因(CotAD_23118)在15％PEG6000处理的GK50下胚轴中表达倍数高达16.51外，其它基因在下胚轴中上调倍数在1.11-3.51之间，说明PEG6000胁迫条件下，棉花萌发时下胚轴抵御水分胁迫时靠微效多基因控制的。
与清水对照相比，19个基因中在中棉所35的5％处理条件胚根中10个基因上调表达，在GK50中也有11个基因上调表达；与清水对照相比，15％中高浓度PEG6000处理条件下，中棉所35胚根中有8个基因上调表达，GK50有11个基因上调表达，二个品种上调表达的基因不同，GK50胚根中基因上调表达的数量略高于中棉所35，除了中棉所35在15％PEG600处理条件下，编码叶绿体谷胱甘肽还原酶基因(CotAD_66447)表达倍数为6.06外，其余基因的上调倍数在1.07-4.38之间，说明棉花萌发时胚根抵御水分胁迫时是靠微效多基因控制的。
谷氨酸脱羧酶(GAD)，是将谷氨酸转化成γ氨基丁酸(GABA)的限速酶，在GABA的合成中起关键的作用。编码谷氨酸脱羧酶4基因(CotAD_24601)在5％低浓度的PEG6000处理条件下，两个品种中无论胚轴和胚根均为下调表达，只在15％高浓度的PEG6000处理条件下上调表达，在GK50中的表达量均高于中棉所35，这与GABA在GK50中受15％胁迫后下胚轴和胚根中平均GABA含量极显著高于中棉所35的结果是相一致的。说明PEG6000胁迫条件诱导了棉花种子的编码谷氨酸脱羧酶4基因的表达，从而促进GABA合成，从而抑制了芽的伸长。不抗旱材料中编码谷氨酸脱羧酶4基因的表达倍数高于抗旱材料，从而GABA的合成显著高于抗旱材料，受抑制程度更强。
5％和15％PEG6000处理条件下，两个品种中棉花胚根中上调基因表达数多于其在下胚轴中的上调基因数；在GK50中的下胚轴和和胚根中上调基因个数多于中棉所35对应的上调基因个数。两个品种在萌发期响应PEG6000胁迫时拥有相似的且各自独特的表达模式。
本发明经过长期的探究，获得了双浓度PEG评价方法，将本发明的探究过程，简要记载如下。
对比例1不同浓度PEG6000对陆地棉发芽率的影响
本对比例采用与实施例1相同的方法，使用不同浓度PEG6000对抗旱性品种中棉所35和不抗旱材料GK50的发芽率(萌发率)进行探究。
本对比例用纯净水分别配出浓度为0％(清水对照)、5％、10％、12％、13％、15％、16％、17％的PEG6000(W/V)，分别数出中棉所35和GK50若干份种子，毛籽或脱绒后的光籽均可，为了试验的准确性，同一批种子统一用毛籽或光籽，每份50粒，每个处理3个重复。利用竖直滤纸卷法，具体做法见图1，28℃条件下无光照进行萌发试验，4天后调查萌发个数，萌发标准，是以芽长大于等于种子长度的二分之一为发芽，同时计算萌发率，分别测量0％(清水对照)10％、12％、13％、15％、16％、17％的每处理发芽最好的前10粒的芽长、下胚轴长度、胚根长度。
萌发率(％)＝发芽数/个÷总粒数/个。
本对比例的结果见图10及表7，图10表明，清水对照条件下，抗旱性品种中棉所35和不抗旱材料GK50的萌发率并无显著差异。随着PEG6000浓度的提高，陆地棉萌发率随之下降。
10％浓度的PEG6000胁迫条件下，抗旱性品种中棉所35和不抗旱材料GK50的萌发率均呈现下降趋势，分别下降9.54％和7.69％，但两者的萌发率之间无显著差异，与清水对照无显著差异；12％-17％浓度的PEG6000胁迫条件下，两个材料的萌发率均比清水对照显著或极显著下降，与清水对照相比，抗旱品种中棉所35分别下降26.58％、40.63％、42.85％、44.94％、78.54％，不抗旱品处GK50的萌发率分别下降50.63％、49.75％、72.10％、84.81％、94.84％，且两者之间呈现极显著差异。
在13％、15％、16％浓度的PEG6000胁迫条件下，中棉所35萌发率比对照下降缓慢，而GK50的萌发率则下降迅速，且持续下降；在17％PEG6000浓度胁迫条件下，两个品种的萌发率不仅比清水对照相比极显著下降，而且比其它浓度相比萌发率同样均极显著下降，且两者萌发率达差异极显著；所以PEG6000对GK50萌发的抑制极显著大于中棉所35；12％-16％浓度胁迫条件下，中棉所35和GK50萌发率均差异显著或极显著，所以12％-16％浓度的PEG6000胁迫条件下的萌发率可以初步鉴定出陆地棉萌发期抗旱性；17％的PEG6000浓度胁迫条件下，中棉所35和GK50的萌发率比对照分别下降78.54％和94.84％，均受到极显著抑制，因为在该浓度条件下，抗旱材料中棉所35的萌发率受到的抑制程度已经很大，推测大部分材料受抑制程度会更大，将无法区分出材料间的抗旱性差异，所以萌发期棉花的抗旱性鉴定PEG6000的浓度不能大于或等于17％。
对比例2不同浓度PEG6000对陆地棉芽长的影响
本对比例采用与实施例1相同的方法，使用不同浓度PEG6000对陆地棉的芽长进行探究。
由图11可以看出，与清水对照相比，PEG6000处理使棉花萌发时的芽变短、变细，其中下胚轴变细、变短，胚根变细、变短且发黄；PEG6000抑制陆地棉萌发期的芽长，随着浓度的提高，抑制加重。
PEG6000对不抗旱材料GK50的芽长的抑制高于抗旱材料中棉所35；两个品种所有浓度PEG6000处理均与清水对照处理间的芽长差异极显著；清水对照条件下，两个品种之间的芽长无差异；大于以及等于10％浓度的PEG6000均极显著抑制芽长，10％浓度条件下中棉所35和GK50对的芽长分别下降43.59％和46.9％，下降接近一半，但两个品种间无显著差异；12％-17％浓度下，中棉所35的芽长分别下降44.00％、53.32％、59.24％、57.08％、71.55％，而GK50分别下降57.29％、61.26％、77.14％、75.27％、87.25％，其中12％、13％浓度处理条件下两个品种间芽长的下降幅度达到差异显著，15％-17％浓度处理条件下两个品种间芽长的差异达到极显著(图12)。
从表7可以看出，10％-15％PEG6000的浓度处理对中棉所35陆地棉萌发期芽长的抑制远远大于对萌发率的抑制，PEG6000对抗旱性材料芽长的抑制远远小于对不抗旱材料的抑制，所以，评价陆地棉萌发期的抗旱性，不仅要考虑萌发率的影响，还要考虑芽长的影响。
表7不同浓度PEG6000对陆地棉萌发率及芽长影响比较
对比例3不同浓度PEG6000对陆地棉下胚轴和胚根长度的影响
由图13可以看出，在清水对照条件下，抗旱材料中棉所35与不抗旱材料GK50的下胚轴长度之间差异不显著；随着PEG6000浓度的提高，两个材料下胚轴长度均呈极显著下降趋势；说明PEG6000对下胚轴长度起抑制作用，浓度越高，抑制越强烈；在10％的浓度胁迫下，与对照相比均其下胚轴长度下降均达极显著，分别下降65.53％和61.11％，说明10％的PEG6000浓度已经对陆地棉的下胚轴有极显著的抑制作用，但两个品种间无显著差异；两个材料的下胚轴长度在12％PEG6000胁迫条件下，继续下降，中棉所35下降幅度小于GK50，两者达差异极显著；13％-16％PEG6000胁迫条件下两个材料的下胚轴保持稳定，中棉所35的下胚轴长度显著高于GK50；17％PEG6000胁迫条件下两个材料的下胚轴均极显著下降，且两者之间达差异极显著。
由图14可以看出，抗旱材料中棉所35与不抗旱材料GK50在清水对照条件下，两者胚根长度差异不显著；随着PEG6000浓度的提高，不抗旱材料GK50胚根受抑制程度大于抗旱材料中棉所35；两个材料在10％的浓度胁迫下，与对照相比，其下胚轴长度下降均达到极显著，分别下降28.60％和25.62％，但两个材料间的胚根长度差异不显著；12％的PEG6000浓度胁迫下，两个材料的胚根长度差异显著；另外13％、15％、16％、17％浓度的PEG6000条件下两个材料的胚根长度差异达显著或极显著。
由图13和图14可以看出，PEG6000对陆地棉萌发期下胚轴的抑制大于对胚根的抑制，浓度越高，抑制越强烈；12％-17％浓度的PEG6000对抗旱性较好的陆地棉材料下胚轴和胚根的抑制程度显著或极显著低于不抗旱材料。
对上述实验结果进行分析可以得知，12％-16％浓度的PEG6000胁迫条件下的萌发率可以初步鉴定出陆地棉萌发期抗旱性；12％-16％的PEG6000浓度均对陆地棉萌发期芽长的抑制在不同品种间存在差异显著性，所以评价陆地棉萌发期的抗旱性，不仅要考虑萌发率的影响，还要考虑芽长的影响，12％-16％浓度的PEG6000处理条件下的芽长可以作为评价棉花萌发期的抗旱性的条件之一，而17％浓度的PEG6000处理对两个品种间的萌发率和芽长抑制高达70％-95％，所以该浓度不作为萌发期抗旱性鉴定条件。
因此，本发明在12％-16％浓度范围内，选择浓度12％和16％两个条件对萌发期抗旱性未知的36个棉花资源材料进行萌发期抗旱性鉴定。同时计算出这36个材料的萌发期抗旱指数。
综上所述，本发明提供的PEG双浓度法评价棉花萌发期的优点，不但可以筛选抗旱性中等的材料，还可以筛选出强抗旱性的棉花，使得棉花萌发期抗旱性差异筛选更容易。该方法不仅能很好的区分不同陆地棉材料间萌发期的抗旱性，而且对F2代单粒种子也能很好鉴定出来，不但为抗旱育种的早期选择提供了鉴定方法，而且为抗旱性的遗传性研究提供的有效方法，并且对于鉴定出的抗旱性强的单粒还可以种植于田间继续收获到种子，用于后期的深入研究。
现有技术的研究表明，17％的PEG6000可以作为鉴定棉花苗期的抗旱性，而本发明的研究结果表明，17％PEG6000无论对抗旱品种中棉所35还是对不抗旱材料GK50的萌发来说，均受到极显著抑制，是不适合作棉花萌发期抗旱鉴定的浓度，这可能是由于棉花不同生育时期对水分胁迫响应不同，所以对不同生育时期的抗旱鉴定所采用的PEG6000浓度也相应不同，不同生育时期应分别进行不同处理，这样才能达到各个时期理想的效果。
PEG双浓度法评价棉花萌发期的另一个优点是克服了由单一浓度PEG6000鉴定陆地棉萌发所造成一些材料不同抗旱性程度的缺失。比如图15所示，在12％浓度的PEG6000条件下，中JCM22和江苏棉1号之间的抗旱性是无差异的，当增加了16％的PEG6000浓度时，这两个材料萌发期的抗旱性显示差异极显著，说明江苏棉1号萌发期只达到中等抗旱性，即达2级抗旱水平，而中JCM22萌发期抗旱水平较高，达到1级抗旱性，如果只采用12％浓度的PEG6000鉴定萌发期抗旱性，无法将二者区分开来；相反，如果只采用16％PEG6000一种浓度处理，鉴定结果江苏棉1号是不抗旱的，对苏棉1号是这类萌发期达中等抗旱性的材料是不公平的，容易丢掉这类抗旱性中等的材料，生产上和研究中有时需要抗旱性强的资源材料，有时亦需要抗旱性中等的资源材料；在波棉2号和科遗181之间也存在同样的问题，波棉2号和科遗181在12％时是差异显著的，在16％时是差异不显著的，如果只采用16％的PEG6000鉴定时，两个材料萌发期抗旱性是无显著差异的，均为萌发期不抗旱，而采用双浓度PEG法，波棉2号在萌发期达到中等抗旱水平，而科遗181在萌发期中表现为不抗旱。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种棉花萌发期抗旱性的鉴定方法，其特征在于，将棉花种子揉搓后，采用含有浓度为12%和16%PEG6000的滤纸包裹，竖直放入烧杯中，静置20-30分钟，在烧杯上套上黑色塑料袋保湿，恒温培养3-5天后，测量发芽个数、芽全长、下胚轴长度和胚根长度，获得双浓度棉花萌发期抗旱指数；
PEG6000萌发期抗旱指数=[（PEG6000条件下萌发率/清水条件下萌发率）×（PEG6000条件下芽长/清水条件下芽长）]；
双浓度棉花萌发期抗旱指数=浓度为12%的PEG6000萌发期抗旱指数+浓度为16%的PEG6000萌发期抗旱指数。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，恒温培养的温度为25-28℃。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，棉花萌发期抗旱指数的计算公式中：
清水条件下萌发率=清水条件下萌发个数/总粒数；
PEG6000条件下萌发率=PEG6000条件下萌发个数/总种子粒数。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，在所述鉴定方法中，所用的评价标准为：
（1）萌发期抗旱指数≥70.00%，其抗旱性为1级；
（2）萌发期抗旱指数45.00.00%-69.99%，抗旱性为2级；
（3）萌发期抗旱指数20.00%-44.99%，抗旱性为3级；
（4）萌发期抗旱指数0%-19.99%，抗旱性为4级。
5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述棉花为陆地棉。
6.权利要求1-5任一项所述的鉴定方法，在提高棉花抗旱性育种效率中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的鉴定方法，在提高中等抗旱陆地棉鉴定准确性中的应用。
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