CN115991857B - 一种载紫杉醇荧光纳米胶束负载siRNA增强药物抗肿瘤作用的制备及应用 - Google Patents
一种载紫杉醇荧光纳米胶束负载siRNA增强药物抗肿瘤作用的制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种载紫杉醇荧光纳米胶束负载siRNA增强药物抗肿瘤作用的制备及应用。本发明提供的制备方法，包括以下步骤：将罗丹明B和还原试剂进行还原反应；将还原态罗丹明B和甲基丙烯酰氯改性；将得到的甲基丙烯基功能化罗丹明B和甲基丙烯酸甲酯进行RAFT反应；将得到的聚甲基丙烯酰罗丹明B‑聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合，得到所述两亲性嵌段荧光共聚物。本发明提供的制备方法能够得到同时兼具两亲性、荧光可视性、表面正电性、低毒性的两亲性嵌段聚合物，且能够自组装形成疏水‑亲水的纳米胶束，包载活性药物同时递送小干扰RNA。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种载紫杉醇荧光纳米胶束负载siRNA增强药物抗肿瘤作用的制备及应用。
背景技术
癌细胞对细胞毒性药物产生耐药性可能是细胞凋亡耐药的结果。细胞凋亡由Bcl-2家族调控，Bcl-2家族包括促凋亡的Bax和Bak以及抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1。上述蛋白的相对比例决定了细胞对各种凋亡刺激的敏感性或耐药性。一些研究已经证明，在细胞中成功下调Bcl-XL的表达，可以提高肿瘤细胞对药物的敏感性。反义寡核苷酸(AON)技术是一类通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制靶基因表达，在基因水平调控的分子药物，反义寡核苷酸下调Bcl-2表达已经处于临床试验的最后阶段，但反义寡核苷酸技术也面临着吸收率低、抑制作用不明显、有效剂量大、毒性大等问题。髓系细胞白血病1(myeloidcell leukemia1，简称Mcl-1)，Mcl-1是一种抗凋亡蛋白，参与调控许多细胞系的凋亡、分化和细胞周期，对细胞的生存和生长至关重要。Mcl-1的过表达与白血病、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤发生密切相关。
小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)可以在转录后水平上以序列特异性的方式识别并降解互补靶mRNA，从而有效地抑制靶基因的表达。RNA干扰(RNAi)技术的基本机制是双链RNA(极)分解成小干扰RNA(siRNA)，siRNA激活触发与信使RNA降解直接相关的RNA-cutting酶(核糖核酸酶)，而其他基因不受影响。
目前常用的递送表达siRNA的载体主要包括慢病毒载体，慢病毒载体多数需要依赖启动子(pol III)中的一种，通过启动子启动一段45～50nt的发夹结构RNA(smallhairpin RNA,shRNA)在组织细胞中的表达，shRNA在细胞内会自动被转录成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。
但是，慢病毒载体包装滴度较低，插入目的基因容量低，不足以满足应用需要；且慢病毒载体作为病毒载体仅能够实现shRNA递送以及整合到宿主染色体上，无法实现siRNA和抗癌药物的同时递送，从而抑制了siRNA在抗癌以及癌细胞耐药性方面中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载紫杉醇荧光纳米胶束负载siRNA增强药物抗肿瘤作用的制备及应用，本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物能够同时实现负载抗癌药物和直接递送siRNA，且包封率和载药量高，释放性能良好。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种两亲性嵌段荧光共聚物的制备方法，包括以下步骤：
在保护气体气氛中，将罗丹明B、还原试剂和有机溶剂混合进行还原反应，得到还原态罗丹明B；
将所述还原态罗丹明B、甲基丙烯酰氯、有机碱试剂和有机溶剂混合进行改性反应，得到甲基丙烯基功能化罗丹明B；
将所述甲基丙烯基功能化罗丹明B、甲基丙烯酸甲酯、链转移剂、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行可逆加成-断裂转移自由基聚合反应，得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物；
将所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行聚合反应，得到聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯即为所述两亲性嵌段荧光共聚物；
优选的，所述还原反应包括以下步骤：
在保护气体气氛中，将罗丹明B、第一还原试剂和有机溶剂混合进行第一还原反应，得到还原态中间产物；所述第一还原试剂为LiAlH4，所述第一还原试剂和所述罗丹明B的质量比为1:(6～6.5)；
在保护气体气氛中，将所述还原态中间产物、第二还原试剂和有机溶剂混合，进行第二还原反应，得到还原态罗丹明B；所述第二还原试剂为单质硫，所述第二还原试剂和所述还原态中间产物的质量比为1:(1.5～2)。
优选的，所述还原态罗丹明B和甲基丙烯酰氯的质量比为(2.5～3):1；
所述甲基丙烯基功能化罗丹明B的质量与所述甲基丙烯酸甲酯的体积之比为(1.5～2)mg:1mL；
所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯和所述N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的质量比为1:(1～1.5)。
本发明提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的两亲性嵌段荧光共聚物，具有疏水链段和亲水链段；所述疏水链段为聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯单元；所述亲水链端为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵单元。
本发明提供了一种载药荧光聚合物纳米胶束，包括纳米胶束载体和包载于所述纳米胶束载体中的活性药物；所述纳米胶束载体由上述技术方案所述的两亲性嵌段荧光共聚物自组装形成；所述活性药物包括抗癌药物和小干扰RNA。
优选的，所述小干扰RNA为Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA。
优选的，所述抗癌药物为紫杉醇。
优选的，所述纳米胶束载体的平均粒径为120～210nm；所述纳米胶束载体的PDI＜0.23。
优选的，所述纳米胶束载体与所述小干扰RNA的质量比为1:(5～30)。
本发明提供了上述技术方案所述的载药荧光聚合物纳米胶束在制备预防和/或治疗蛋白异常性表达导致的疾病的药物中的应用。
本发明提供了一种两亲性嵌段荧光共聚物的制备方法，包括以下步骤：在保护气体气氛中，将罗丹明B、还原试剂和有机溶剂混合进行还原反应，得到还原态罗丹明B；将所述还原态罗丹明B、甲基丙烯酰氯、有机碱试剂和有机溶剂混合进行改性反应，得到甲基丙烯基功能化罗丹明B；将所述甲基丙烯基功能化罗丹明B、甲基丙烯酸甲酯、链转移剂、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行可逆加成-断裂转移自由基聚合反应，得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物；将所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行聚合反应，得到所述两亲性嵌段荧光共聚物；所述两亲性嵌段荧光共聚物为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯。本发明提供的制备方法首先采用还原试剂还原罗丹明B，然后通过甲基丙烯酰氯改性将还原态罗丹明B结构中的羧替换为甲基丙烯基；再通过可逆加成-断裂转移自由基聚合反应(RAFT反应)得到甲基丙烯基功能化罗丹明B和甲基丙烯酸甲酯的嵌段聚合物，得到疏水性的聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物；最后将疏水的荧光聚合物和低毒、亲水性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合，同时利用甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵作为阳离子基团供体，得到表面具有阳离子基团的两亲性嵌段荧光聚合物。本发明提供的制备方法能够成功制备得到同时兼具两亲性、荧光可视性、表面正电性、低毒性的嵌段聚合物，制备方法简单，适宜工业化生产。
本发明提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的两亲性嵌段荧光共聚物，具有疏水链段和亲水链段；所述疏水链段为聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯单元；所述亲水链端为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵单元。本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物由于同时具有亲水端和疏水端，能够在水溶液中自组装形成疏水-亲水的纳米胶束，形成的疏水腔体能够用于包载活性药物；同时，本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物表面具有正电荷基团(甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵基团)，对带负电性的小干扰RNA能够通过静电吸附负载，由此，本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物能够同时实现抗癌药物的包载以及小干扰RNA的递送，活性药物的包封率和载药量高且稳定性好。此外，本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物中具有罗丹明结构，因此具有荧光可视性的特点，在递送活性药物的同时能够实现活性药物在体内分布情况的检测；同时本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物的亲水端结构为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺部分，毒性低，生物安全性好。
本发明提供了一种载药荧光聚合物纳米胶束，包括纳米胶束载体和负载于所述纳米胶束载体中的活性药物；所述纳米胶束载体由上述技术方案所述的两亲性嵌段荧光共聚物自组装形成；所述活性药物包括抗癌药物和小干扰RNA。本发明提供的载药荧光聚合物纳米胶束同时实现负载抗癌药物和直接递送siRNA，从而省略启动子从shRNA转录成siRNA的过程，实现了siRNA的直接递送，提高了siRNA的递送容量；同时，通过siRNA与抗癌药物的协同作用，能够显著提高癌细胞对抗癌药物的敏感性，降低抗癌药物的用量；而且本发明提供的载药荧光聚合物纳米胶束表面具有阳离子基团，基因转染率高、包覆表面负电荷的siRNA后结构稳定，细胞毒性低。
进一步的，本发明中，所述小干扰RNA为Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA；所述抗癌药物为紫杉醇。所述紫杉醇的包封率和载药量高，释放性能良好；同时，所述Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA递送效果良好；所述Bcl-xlsiRNA具有敲低抗凋亡蛋白Bcl-xl的效果，所述Mcl-1siRNA具有敲低抗凋亡蛋白Mcl-1的效果，所述紫杉醇和Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA协同作用，通过敲低抗凋亡蛋白Bcl-xl和/或Mcl-1，显著增加了细胞对药物PTX的敏感性。本发明提供的载药荧光聚合物纳米胶束能够应用于制备预防和/或治疗因Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白表达异常导致的疾病的药物中。
附图说明
图1为实施例1制备的Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)具体制备方程式；
图2为实施例1制备的Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)红外表征图谱；
图3为实施例3～5制备的装载PTX药物的两亲性荧光聚合物纳米胶束的粒径和表面电性的分析图；
图4为实施例6制备的空载PPEMMRA进行粒径分析以及透射电镜观察图；
图5为实施例2制备的PPEMMRA@PTX进行粒径分析图；
图6为HPLC法检测不同质量浓度紫杉醇的色谱峰图；
图7为不同质量浓度紫杉醇的质量浓度与色谱峰面积的对应标准曲线图；
图8为实施例2制备的载药胶束内含PTX不同保留时间的HPLC谱图以及计算得到的包封率及载药量；
图9为实施例6和实施例7制备的产品进行形态和粒径分析图；
图10为实施例7～11制备的产品进行琼脂糖凝胶电泳实验得到的不同粒径和电位结果图；
图11为实施例7～11制备的产品进行琼脂糖凝胶电泳实验显示的PPEMMRA和Bcl-xlsiRNA的组装能力测试结果；
图12为实施例7制备的产品进行MTT细胞实验结果；
图13为实施例7制备的产品进行细胞转染测试的测试结果图；
图14为实施例12制备的产品药物毒性以及IC50测试结果；
图15为实施例12制备的产品的凋亡情况检测结果；
图16为实施例12制备的产品的凋亡情况检测结果；
图17为实施例13制备的产品药物毒性以及IC50测试结果；
图18为实施例13制备的产品的凋亡情况检测结果；
图19为本发明实施例制备的Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)自组装载药流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种两亲性嵌段荧光共聚物的制备方法，包括以下步骤：
在保护气体气氛中，将罗丹明B、还原试剂和有机溶剂混合进行还原反应，得到还原态罗丹明B；
将所述还原态罗丹明B、甲基丙烯酰氯、有机碱试剂和有机溶剂混合进行改性反应，得到甲基丙烯基功能化罗丹明B；
将所述甲基丙烯基功能化罗丹明B、甲基丙烯酸甲酯、链转移剂、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行可逆加成-断裂转移自由基聚合反应，得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物；
将所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行聚合反应，得到所述两亲性嵌段荧光共聚物；述两亲性嵌段荧光共聚物为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明在保护气体气氛中，将罗丹明B、还原试剂和有机溶剂混合进行还原反应，得到还原态罗丹明B。
在本发明中，所述还原反应优选包括以下步骤：
在保护气体气氛中，将罗丹明B、第一还原试剂和有机溶剂(以下称为第一有机溶剂)混合(以下称为第一混合)进行第一还原反应，得到还原态中间产物；所述第一还原试剂为LiAlH4，所述第一还原试剂和所述罗丹明B的质量比为1:(6～6.5)；
在保护气体气氛中，将所述还原态中间产物、第二还原试剂和有机溶剂(以下称为第二有机溶剂)混合(以下称为第二混合)，进行第二还原反应，得到还原态罗丹明B；所述第二还原试剂为单质硫，所述第二还原试剂和所述还原态中间产物的质量比为1:(1.5～2)。
本发明在保护气体气氛中，将罗丹明B、第一还原试剂和有机溶剂(以下称为第一有机溶剂)混合(以下称为第一混合)进行第一还原反应，得到还原态中间产物；所述第一还原试剂为LiAlH4，所述第一还原试剂和所述罗丹明B的质量比为1:(6～6.5)；
在本发明中，所述第一有机溶剂具体优选为四氢呋喃(THF)。
在本发明中，所述第一还原试剂和所述罗丹明B的质量比优选为1:(6.1～6.4)。
本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊要求，能够确保所述第一还原反应顺利进行即可。
在本发明中，所述第一混合优选为：将所述罗丹明B和部分第一有机溶剂混合得到罗丹明B溶液；将所述第一还原试剂和剩余所述第一有机溶剂混合得到第一还原试剂溶液；将所述罗丹明B溶液和所述第一还原试剂溶液混合。
在本发明中，所述保护气体气氛优选为氮气气氛。
在本发明中，所述第一还原的温度优选为室温。
在本发明中，所述第一还原反应的保温时间优选为12h。
在本发明中，所述第一还原反应优选在搅拌的条件下进行，本发明对所述搅拌的具体实施过程没有特殊要求。
在本发明中，所述第一还原反应后得到第一还原反应液，本发明优选对所述第一还原反应液进行后处理，得到所述还原态中间产物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行加水猝灭反应、固液分离、收集滤液萃取，收集萃取有机相洗涤、干燥。在本发明中，所述猝灭反应时，所述水和所述第一有机溶剂的体积之比优选为12.5:55。在本发明中，所述固液分离具体优选为过滤。在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为二氯甲烷。在本发明中，所述洗涤用试剂优选为饱和氯化钠水溶液。在本发明中，所述干燥用试剂优选为无水硫酸钠。
本发明优选将所述干燥后的还原态中间产品的有机溶液直接进行所述第二还原反应。
得到还原态中间产品后，本发明在保护气体气氛中，将所述还原态中间产物、第二还原试剂和有机溶剂(以下称为第二有机溶剂)混合(以下称为第二混合)，进行第二还原反应，得到还原态罗丹明B；所述第二还原试剂为单质硫，所述第二还原试剂和所述还原态中间产物的质量比为1:(1.5～2)。
在本发明中，所述第二有机溶剂优选为二氯甲烷。
在本发明中，所述第二还原试剂和所述还原态中间产物的质量比优选为1:(1.55～1.8)。
本发明对所述第二有机溶剂的用量没有特殊要求，能够保护所述第二还原反应顺利进行即可。
在本发明中，所述第二混合优选为将所述还原态中间产品的有机溶液与所述第二还原试剂混合。
在本发明中，所述第二还原反应时的保护气体气氛优选为氮气气氛。
在本发明中，所述第二还原反应的温度优选为150～180℃，更优选为160℃。
在本发明中，所述第二还原反应的保温时间优选为30min。
在本发明中，所述第二还原反应得到第二还原反应液，本发明优选对所述第二还原反应液进行后处理，得到还原态罗丹明B。在本发明中，所述后处理优选包括：将所述第二还原反应液、无水乙醇、浓盐酸和水混合得到混合溶液；将所述混合溶液进行萃取；取萃取有机相依次进行洗涤和干燥，得到还原态罗丹明B粗品；将所述还原态罗丹明B粗品进行柱层析分离，得到所述还原态罗丹明B。在本发明中，所述水优选为蒸馏水，所述无水乙醇、浓盐酸和水的体积比优选为2.95:0.23:5.9。在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为二氯甲烷。所述洗涤用试剂优选为饱和氯化钠溶液。所述干燥优选包括依次进行加入无水硫酸钠干燥和真空干燥。本发明对所述真空干燥的具体实施过程没有特殊要求。在本发明中，所述柱层析分离使用的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为9:1。
得到还原态罗丹明B后，本发明将所述还原态罗丹明B、甲基丙烯酰氯、有机碱试剂和有机溶剂(以下称为第三有机溶剂)混合(以下称为第三混合)进行改性反应，得到甲基丙烯基功能化罗丹明B。
在本发明中，所述有机碱试剂具体优选为三乙胺。
在本发明中，所述第三有机溶剂优选为二氯甲烷。
在本发明中，所述还原态罗丹明B和甲基丙烯酰氯的质量比优选为(2.5～3):1，更优选为(2.55～2.7):1。
在本发明中，所述还原态罗丹明B和有机碱试剂的质量比优选为(1～1.8):1，更优选为(1.5～1.6):1。
在本发明中，所述第三混合优选为：将所述甲基丙烯酰氯、三乙胺、还原态罗丹明B、与第三有机溶剂依次混合。
在本发明中，所述改性反应的温度优选为室温。
在本发明中，所述改性反应的时间优选为12～24h。
在本发明中，所述改性反应得到改性反应液，本发明优选对所述改性反应液进行后处理，所述后处理优选为依次进行：水涤、干燥和柱层析分离。在本发明中，所述水洗优选为蒸馏水洗。在本发明中，所述干燥优选为依次进行无水硫酸钠干燥和真空干燥。在本发明中，所述柱层析分离使用的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为9:1。
得到甲基丙烯基功能化罗丹明B后，本发明将所述甲基丙烯基功能化罗丹明B、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、链转移剂、偶氮类引发剂和有机溶剂(以下称为第四有机溶剂)混合(以下称为第四混合)，进行可逆加成-断裂转移自由基聚合反应(RAFT反应)，得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物。
在本发明中，所述链转移剂具体优选为4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CPADB)。
在本发明中，所述偶氮类引发剂具体优选为偶氮二异丁腈(AIBN)。
在本发明中，所述第四有机溶剂具体优选为四氢呋喃(THF)。
在本发明中，所述甲基丙烯基功能化罗丹明B的质量与所述甲基丙烯酸甲酯的体积之比为(1.5～2)mg:1mL，更优选为(1.52～1.8)mg:1mL。
在本发明中，所述所述甲基丙烯基功能化罗丹明B和所述链转移剂的质量比优选为1:2.8。
在本发明中，所述所述甲基丙烯基功能化罗丹明B和所述偶氮类引发剂的质量比优选为1:0.164。
在本发明中，所述第四混合优选为：甲基丙烯酸甲酯、链转移剂、偶氮类引发剂、甲基丙烯基功能化罗丹明B和有机溶剂依次混合。
在本发明中，所述第四混合得的混合溶液，本发明优选对所述混合溶液进行冻融脱气三次后，进行所述RAFT反应。
在本发明中，所述RAFT反应优选在保护气体气氛中，进行，所述保护气体气氛优选为氮气气氛。
在本发明中，所述RAFT反应的温度优选为70℃。
在本发明中，所述RAFT反应的保温时间优选为6h。
在本发明中，所述RAFT反应后得到聚合反应液，本发明优选对所述聚合反应液进行后处理，得到所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行石油醚沉淀、固液分离、和干燥。在本发明中，所述固液分离优选为过滤，所述干燥优选为真空干燥。
得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物后，本发明将所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(TMAEMC)、偶氮类引发剂(以下称为第一偶氮类引发剂)和有机溶剂(以下称为第五有机溶剂)混合(以下称为第五混合)，进行聚合反应，得到所述两亲性嵌段荧光共聚物；所述两亲性嵌段荧光共聚物为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯。
在本发明中，所述偶氮类引发剂具体优选为AIBN。
在本发明中，第五有机溶剂具体优选为THF。
在本发明中，所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯和所述N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的质量比优选为1:(1～1.5)，更优选为1:(1.1～1.4)。
在本发明中，所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯和所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯的质量和所述N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的体积之比优选为36mg:10μL。
在本发明中，所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯和所述第一偶氮类引发剂的质量比优选为36:1.2。
本发明对所述第五有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述聚合反应顺利进行即可。
在本发明中，所述第五混合优选为：将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、第一偶氮类引发剂、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和第五有机溶剂顺次混合。
在本发明中，所述第五混合得的混合溶液，本发明优选对所述混合溶液进行冻融脱气三次后，进行所述聚合反应。
在本发明中，所聚合反应优选在保护气体气氛中，进行，所述保护气体气氛优选为氮气气氛。
在本发明中，所述聚合反应的温度优选为70℃。
在本发明中，所述聚合反应的保温时间优选为24h。
本发明提供的制备方法是以甲基丙烯基功能化后的罗丹明B和甲基丙烯酸甲酯(MMA)作为疏水端重复单元，利用RAFT反应合成疏水端(Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)))，再与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(TMAEMC)进行聚合反应合成一端亲水一端疏水的两亲性链状共嵌段高分子聚合物(Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)))利用其在水中可自组装成球的性质制备荧光高分子纳米胶束。
本发明提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的两亲性嵌段荧光共聚物，具有疏水链段和亲水链段；所述疏水链段为聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯单元；所述亲水链端为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵单元。
在本发明中，所述两亲性嵌段荧光共聚物为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯。
在本发明中，所述两亲性嵌段荧光共聚物的结构式如式1所示：
式1中，m为4～8的整数，n为7～15的整数。
本发明提供的两亲性嵌段荧光共聚物以N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)以及带有正电荷的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(TMAEMC)作为亲水端，以聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物作为疏水端，其中聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物中的罗丹明B作为荧光标记，利用其能在水中自组装成球的性质，包覆活性药物。
本发明提供了一种载药荧光聚合物纳米胶束，包括纳米胶束载体和负载于所述纳米胶束载体中的活性药物；所述纳米胶束载体由上述技术方案所述的两亲性嵌段荧光共聚物自组装形成；所述活性药物包括抗癌药物和小干扰RNA。
在本发明中，所述抗癌药物优选为紫杉醇。
在本发明中，所述小干扰RNA优选为Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA，更优选为Bcl-xlsiRNA和Mcl-1siRNA。
在本发明中，所述Bcl-xlsiRNA目的基因片段优选由上海生工生物股份有限公司合成。
在本发明中，所述Bcl-xlsiRNA序列的正义链(Sense)的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述Bcl-xlsiRNA序列的反义链(antisense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
所述SEQ ID NO.1为：(5'-3')5'-AAG GAU ACA GCU GGA GUC AGU-3'；
所述SEQ ID NO.2为：(5'-3')5'-ACU GAC UCC AGC UGU AUC CUU-3'。
在本发明中，所述Mcl-1siRNA目的基因片段优选由上海生工生物股份有限公司合成。
在本发明中，所述Mcl-1siRNA序列的正义链(Sense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Mcl-1siRNA序列的反义链(antisense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
所述SEQ ID NO.3为：(5'-3')5'-GCA GGA UUG UGA CUC UCA UTT-3'；
所述SEQ ID NO.4为：(5'-3')5'-AUG AGA GUC ACA AUC CUG CTT-3'。
在本发明中，所述Bcl-xlsiRNA序列的正义链和反义链的5'端分别优选修饰有荧光基团。所述荧光基团优选为FAM。
在本发明中，所述纳米胶束载体的平均粒径为120～210nm。
在本发明中，所述纳米胶束载体的PDI＜0.23。
在本发明中，所述纳米胶束载体与所述小干扰RNA的质量比优选为1:(5～30)，更优选为1:20。
本发明提供了上述技术方案所述的载药荧光聚合物纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
将所述上述技术方案所述的两亲性嵌段荧光共聚物、抗癌药物溶解于第六有机溶剂中，得到聚合物溶液；
将所述聚合物溶液滴加至水中混合后除去溶剂，得到载药中间产物；所述载药中间产物包括纳米胶束载体和包载与所述纳米胶束载体中的抗癌药物。
将所述载药中间产物、小干扰RNA和混合溶液混合孵育，得到所述载药荧光聚合物纳米胶束。
本发明将所述上述技术方案所述的两亲性嵌段荧光共聚物、抗癌药物溶解于第六有机溶剂中，得到聚合物溶液。
在本发明中，所述两亲性嵌段荧光共聚物和抗癌药物的质量比优选为1:(0.6～1.6)，更优选为1:1.2。
在本发明中，所述第六有机溶剂优选为四氢呋喃和乙腈的混合溶液。
本发明对所述第六有机溶剂的用量没有特殊要求。
得到聚合物溶液后，本发明将所述聚合物溶滴加至水中混合后除去溶剂，得到载药中间产物；所述载药中间产物包括纳米胶束载体和包载于所述纳米胶束载体中的抗癌药物。
在本发明中，所述滴加优选为逐滴加入。
在本发明中，所述滴加时，每滴的体积优选为10μL。
在本发明中，所述水优选为高纯水。
在本发明中，所述滴加优选在超声的条件下进行。
在本发明中，所述滴加完毕后，本发明优选继续超声混合10min。
在本发明中，所述去除溶剂的具体实施方式优选为旋转蒸发，在本发明中，所述旋转蒸发的温度优选为50℃。在本发明中，所述去除溶剂优选至旋蒸时无溶剂蒸出即可。
在本发明中，所述聚合物溶液中的两亲性嵌段荧光共聚物在水中自组装形成纳米胶束的过程中，将所述抗癌药物包载在疏水内核中。
得到载药中间产物后，本发明将所述载药中间产物、小干扰RNA和混合溶液混合孵育，得到所述载药荧光聚合物纳米胶束。
在本发明中，所述两亲性嵌段荧光共聚物与所述抗癌药物的质量比优选为1:(5～30)，更优选为1:20。
在本发明中，所述孵育的温度优选为室温。
在本发明中，所述孵育的时间优选为20min。
在本发明中，所述孵育时，所述载药中间产物带正电，所述小干扰ENA带正电，通过静电作用，所述小干扰RNA吸附在所述载药中间产物的纳米胶束载体中。
发明提供了上述技术方案所述的载药荧光聚合物纳米胶束在制备预防和/或治疗蛋白异常性表达导致的疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述小干扰RNA优选为Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA，所述载药荧光聚合物纳米胶束优选应用于制备预防和/或治疗因Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白异常性表达导致的疾病的药物。
在本发明中，所述因Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白异常性表达导致的疾病优选包括恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病；所述恶性肿瘤包括但不限于肺癌、恶性血液肿瘤疾病。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明中实施例使用的反应原料除靶向肽均来自于北京化工厂与美国sigma试剂公司。
实施例1
按照图1所示的合成路线图：将罗丹明B(1.25g)溶于37.5mL的四氢呋喃(THF)中得到罗丹明B溶液，将LiAlH4(0.2g)加入到37.5mL的THF中得到LiAlH4溶液，在N2保护条件下，将罗丹明B溶液和LiAlH4溶液室温混合搅拌12h，逐滴加入12.5mL水，猝灭反应，过滤，取滤液，用二氯甲烷萃取，取萃取有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，加入6g无水Na2SO4干燥后过滤得到还原态中间产物溶液。将单质硫(53.18mg)和还原态中间产物溶液(96.9mg)于圆底烧瓶中混合，在N2保护条件下，160℃反应30min，冷却至室温，加入2.95mL无水乙醇，0.23mL浓盐酸，5.9mL蒸馏水，混合混匀。用5.9mL二氯甲烷萃取，取萃取有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水Na2SO4干燥，真空干燥得还原产物粗品。将还原产物粗品经柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为9:1，得到还原态罗丹明B产物，记为Rhob。
将甲基丙烯酰氯(23.83mg)，三乙胺(46.13mg)，Rhob(70mg)与二氯甲烷混合，室温反应过夜(12h)，取反应混合物用蒸馏水洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空干燥得甲基丙烯基功能化罗丹明B粗品，将甲基丙烯基功能化罗丹明B粗品经柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，其中二氯甲烷和甲醇的体积比为9:1，得到得到甲基丙烯基功能化罗丹明B，记为Rhob-MA。
甲基丙烯酸甲酯(MMA，5.3mL)，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CPADB，28mg)，偶氮二异丁腈(AIBN，1.64mg)，Rhob-MA(10mg)和THF混合得到混合液，将混合液冻融脱气三次后，在N2保护条件下，于70℃进行RAFT聚合反应6h，反应后得到的产物用石油醚沉淀，滤过得到的固体产物真空干燥得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，记为Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。
将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA，50mg)，AIBN(1.2mg)，TMAEMC(10μL)，Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))(36mg)和THF混合得到混合液，将混合液经冻融脱气三次后在N2保护条件下，于70℃聚合反应24h，反应后产物用乙醚沉淀，过滤得到的固体产物真空干燥得到聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯，记为Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，简称为：PPEMMRA。
对比例1
首先按照实施例1的Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))制备方法，制备得到Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))；
然后将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA，50mg)，AIBN(1.2mg)，Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))(36mg)和THF混合得到混合液，将混合液经冻融脱气三次后在N2保护条件下，于70℃聚合反应24h，反应后产物用乙醚沉淀，过滤得到的固体产物真空干燥得到无表面电性的聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯，记为PolyHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，简称为：PPMMRA。
测试例1
将对比例1得到的产物与实施例1得到的产物进行红外图谱表征，结果如图2所示。载体PolyHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))(PPMMRA)，位于2700-3000cm-1处的宽峰表征了载体上的-COOH，3375.17cm-1处的特征峰表现为宽峰，指代聚合物中HPMA单体中的-OH，将TMAEMC单体混聚于载体Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))上后，观察到1486cm-1处的峰强度变大，证明实施例1成功将TMAEMC聚合到载体上。
对比例2
甲基丙烯酸甲酯(MMA，5.3mL)，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CPADB，28mg)，偶氮二异丁腈(AIBN，1.64mg)和THF混合得到混合液，将混合液冻融脱气三次后，在N2保护条件下，于70℃进行RAFT聚合反应6h，反应后得到的产物用石油醚沉淀，滤过得到聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，记为PolyMMA。
将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA，50mg)，AIBN(1.2mg)，TMAEMC(10μL)，PolyMMA(30mg)和THF混合得到混合液，将混合液经冻融脱气三次后在N2保护条件下，于70℃聚合反应24h，反应后产物用乙醚沉淀，过滤得到的固体产物真空干燥得到聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酸甲酯，记为Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-PolyMMA，简称为PPEMMA。
实施例2
将实施例1制备的PPEMMRA干燥后称取2.5mg，取PTX(3mg)溶于1mL的四氢呋喃(THF)和乙腈的混合溶剂中，得到聚合物溶液，在超声条件下，逐滴(10μL/每滴)将聚合物溶液滴入到10mL高纯水中，滴加完成后继续超声10min。50℃条件下旋蒸至无溶剂蒸出，得到装载PTX药物的两亲性荧光聚合物纳米胶束，记为：PPEMMRA@PTX。
实施例3
与实施例2的制备方法相同，不同之处在于：PTX用量为1.5mg。
实施例4
与实施例2的制备方法相同，不同之处在于：PTX用量为2.0mg。
实施例5
与实施例2的制备方法相同，不同之处在于：PTX用量为4.0mg。
对比例2
将对比例2制备的PPEMMA干燥后称取2.5mg，PTX(3mg)溶于1mL的四氢呋喃(THF)和乙腈的混合溶剂中，得到聚合物溶液，在超声条件下，逐滴(10μL/每滴)将聚合物溶液滴入到10mL高纯水中，滴加完成后继续超声10min。50℃条件下旋蒸至无溶剂蒸出，得到装载PTX药物的无荧光的两亲性聚合物纳米胶束，记为Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-PolyMMA纳米胶束，简称为PPEMMA@PTX。
对比例3
将对比例2制备的Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-PolyMMA干燥后称取2.5mg溶于1mL的四氢呋喃(THF)和乙腈的混合溶剂中，得到聚合物溶液，在超声条件下，逐滴(10μL/每滴)将聚合物溶液滴入到10mL高纯水中，滴加完成后继续超声10min。50℃条件下旋蒸至无溶剂蒸出，得到空载两亲性聚合物纳米胶束，记为：空载无荧光的Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-PolyMMA纳米胶束。简称为空载无荧光的PPEMMA纳米胶束。
对比例4
将对比例1制备的表面无正电性的PolyHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))干燥后称取2.5mg溶于1mL的四氢呋喃(THF)和乙腈的混合溶剂中，得到聚合物溶液，在超声条件下，逐滴(10μL/每滴)将聚合物溶液滴入到10mL高纯水中，滴加完成后继续超声10min。50℃条件下旋蒸至无溶剂蒸出，得到空载表面无正电性的两亲性荧光聚合物纳米胶束，记为：空载表面无正电性的PolyHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))纳米胶束，简称为空载表面无正电性的PPMMRA纳米胶束。
测试例2
对实施例3～5制备的装载PTX药物的两亲性荧光聚合物纳米胶束，以及对比例4制备的空载表面无正电性的PPMMRA纳米胶束进行粒径和表面电性的分析，测试结果如图3所示：图3中的“No positive charged carrier”为对比例4制备的空载表面无正电性的PPMMRA纳米胶束，图3中的“1.5mg of positively charged carrier”为实施例3制备的装载PTX药物的两亲性荧光聚合物纳米胶束，图3中的“2.0mg of positively chargedcarrier”为实施例4制备的装载PTX药物的两亲性荧光聚合物纳米胶束，图3中的“4.0mg ofpositively charged carrier”为实施例5制备的装载PTX药物的两亲性荧光聚合物纳米胶束.
由图3可以得出：不含TMAEMC的纳米胶束(对比例4产品)电位为-20左右，粒径约为240nm，含有TMAEMC的纳米胶束(实施例3～5产品)电位在+30左右，粒径均小于200nm。由此可以证明本发明提供的两亲性荧光聚合物负载药物性的纳米胶束可以在水中自组装成球且具有一定的正电荷且粒径较为均一，分散性较好。
实施例6
将实施例1Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))干燥后称取2.5mg，溶于1mL的四氢呋喃(THF)和乙腈的混合溶剂中，得到聚合物溶液，在超声条件下，逐滴(10μL/每滴)将聚合物溶液滴入到10mL高纯水中，滴加完成后继续超声10min。50℃条件下旋蒸至无溶剂蒸出，得到空载两亲性荧光聚合物纳米胶束，记为：空载Poly(HPMA-alt-TMAEMC)-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))纳米胶束，简称为空载PPEMMRA纳米胶束。
测试例3
对实施例6制备的空载PPEMMRA纳米胶束进行粒径分析以及透射电镜观察，结果如图4所示，图4中的(a)～(d)为实施6制备的PPEMMRA产品的TEM照片，图4中的(a)放大倍数为10000的测试结果，图4中的(b)放大倍数为20000的测试结果，图4中的(c)放大倍数为40000的测试结果，图4中的(d)为单独的PPEMMRA放大倍数为20000的测试结果，由图4中的(d)可以的得出，单个的PPEMMRA粒径为85nm；图4中的(e)为PPEMMRA的马尔文粒径分析结果图，由图4中的(e)可以得出，PPEMMRA的平均粒径为206.9nm。由此，本发明制备的两亲性荧光聚合物在水中自组装形成分散性较好、粒径较为均一的纳米胶束。纳米胶束的平均粒径直径均在120～210nm之间，PDI均小于0.23。
测试例4
将实施例2制备的PPEMMRA@PTX进行粒径分析，结果如图5所示，平均粒径在309.7nm，PDI小于0.23，整体分散性较好。
采用HPLC法对纳米胶束的载药量以及包封率进行测定，色谱条件为C18色谱柱(5μ250×4.6mm)，柱温35℃，流动相为A：水，B：乙睛，流速为1.0mL/min，检测波长220nm，进样体积10μL。将PTX配置成1200μg/mL，900μg/mL，500μg/mL，300μg/mL，100μg/mL。采用上述色谱柱条件进行HPLC实验，结果如图6所示，出峰时间为8.5min，峰形为单峰。依据浓度以及峰面积进行标准曲线绘制，结果如图7所示，
药物释放选用实施例2制备的PPEMMRA@PTX作为样品。以pH＝7.2磷酸缓冲溶液作为释放介质，在37℃条件下，取实施例2制备的PPEMMRA@PTX水溶液10mL装入提前准备好的透析袋中(截留分子量5000D)，密封后放入到盛放释放介质的烧杯中，分别于0h、6h、12h、24h、48h、72h以上6个时间点进行取样，离心，利用HPLC检测6个样品在220nm波长下的吸收峰面积，以PTX标准曲线作为参比，计算得出PTX的释放量，根据每组数据的平均值绘制体外药物释放曲线，结果如图8所示。取1mL实施例2制备的纳米载药胶束于EP管中，分别加入200μL乙睛溶液破坏聚合物胶束结构，离心取上清，采用HPLC法测定样品释放出的药物在220nm波长处的吸收峰面积，并根据绘制得到的标准曲线，测定载药胶束的载药量。实施例2制备的载药胶束内含PTX的HPLC谱图以及计算得到的包封率及载药量结果如图8所示。载药胶束包封率及装载量均较好，实施例2制备的PPEMMRA@PTX的包封率以及载药量分别是6％和4％。
实施例7
目的基因片段合成：
Bcl-xlsiRNA目的基因片段由上海生工生物股份有限公司合成。
Bcl-xlsiRNA序列的正义链(Sense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Bcl-xlsiRNA序列的反义链(antisense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1为：(5'-3')5'-AAG GAU ACA GCU GGA GUC AGU-3'；
SEQ ID NO.2为：(5'-3')5'-ACU GAC UCC AGC UGU AUC CUU-3'；
当Bcl-xlsiRNA序列修饰荧光基团时，Bcl-xlsiRNA序列的正义链和反义链的5'端分别修饰有FAM基团。
将实施例6制备的空载体PPEMMRA纳米胶束(按照质量比为1:20)在缓冲溶液中在室温下孵育20min，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA/Bcl-xlsiRNA。
测试例5
对实施例6和实施例7制备的产品进行形态和粒径分析，如图9所示：图9中的(A)和图9中的(B)为实施例6制备的空载体产品的TEM图；图9中的(C)为实施例6制备的空载体产品的马尔文粒径分析结果图；图9中的(D)和图9中的(E)为实施例7制备的吸附负载Bcl-xlsiRNA的产品的TEM图；图9中的(F)为实施例7制备的吸附负载Bcl-xlsiRNA的产品的马尔文粒径分析结果图；由图9中的(A)、(B)和(C)可以得出：本发明实施例1制备的两亲性银光聚合物能够在水中自组装形成球形，粒径均匀，平均直径约为123.8nm。
比较实施例6制备的空载体和实施例7制备的吸附负载Bcl-xlsiRNA的纳米胶束的粒径，由图9中的(c)和(F)比较：实施例7制备的产品因静电压缩作用会导致粒径减小，实施例7制备的吸附负载Bcl-xlsiRNA的产品的粒径为104.2nm。
通过图9可以得出：吸附Bcl-xlsiRNA后的纳米胶束(实施例7产品，图9中的(F))粒径小于未吸附Bcl-xlsiRNA(实施例6产品，图9中的(c))的纳米胶束。
将纳米胶束实施例6得到的PPEMMRA以及对比例4得到的空载表面无正电性的PPMMRA纳米胶束静置于室温，分别于0h、24h、48h、72h进行马尔文粒径分析，得到纳米胶束稳定性，结果如图6所示，加入正电荷的PPEMMRA的纳米胶束稳定性较好，72h后粒径增大不明显，有一定的聚集现象。
实施例8
与实施例7的制备方法相同，不同之处在于：纳米胶束PPEMMRA和Bcl-xlsiRNA的质量比为1:5，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA。
实施例9
与实施例7的制备方法相同，不同之处在于：纳米胶束PPEMMRA和Bcl-xlsiRNA的质量比为1:10，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA/Bcl-xlsiRNA。
实施例10
与实施例7的制备方法相同，不同之处在于：纳米胶束PPEMMRA和Bcl-xlsiRNA的质量比为1:25，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA/Bcl-xlsiRNA。
实施例11
与实施例7的制备方法相同，不同之处在于：纳米胶束PPEMMRA和Bcl-xlsiRNA的质量比为1:30，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA/Bcl-xlsiRNA。
测试例6
将实施例7～11制备的产品进行琼脂糖凝胶电泳实验；
琼脂糖凝胶电泳步骤如下所示：
1、取5×TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。
2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中,加入50mL0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
3、灌胶：将有机托盘放入制胶模具上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50～60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。将琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
4、加样：取10μL酶解液与2μL6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在140V，10min。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
6、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
结果如图10和图11所示，图10显示1:20时PPEMMRA与Bcl-xlsiRNA结合后，粒径最小，结合后电位最低，达到最适比例。图11显示质量比为1:20时PPEMMRA可以与Bcl-xlsiRNA完全结合，复合物条带在原地不动。由此可以判断在质量比为1:20时为最适结合比例且纳米胶束能完全结合Bcl-xlsiRNA。
采用PPEMMA/Bcl-xlsiRNA(对比例3制备的空载无荧光的PPEMMA纳米胶束，按照实施例7的方法包载PTX得到的产品)进行MTT细胞实验，采用空载无荧光的PPEMMA纳米胶束是为了避免荧光对实验结果的影响。结果如图12所示，在A549细胞中，纳米胶束PPEMMA的毒性较低，PPEMMA/Bcl-xlsiRNA结果表明，转染本身细胞毒性较低。
测试例7
将实施例7制备的产品进行细胞转染测试：
转染步骤为：首先进行不同比例Lipofectamine 2000和PPEMMRA的转染比例筛选，筛选步骤为：Lipofectamine 2000转染步骤，将其换成纳米胶束进行纳米胶束转染比例筛选。结果如图13所示，当Bcl-xlsiRNA和Lipofectamine 2000的比例为1:6时，转染效率最高。转染实验的具体步骤为：
(1)转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板6孔板在2mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中(每孔2×105)。使其在转染日能达到70％的融合。
(2)对于每孔细胞，使用50μL无血清培养基稀释50nM Bcl-xlsiRNA，轻轻混匀。
(3)使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，每孔细胞用50μl无血清培养基稀释5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL Lipofectamine2000转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5min。
(4)Lipofectamine2000稀释后，在5min后同稀释的Bcl-xlsiRNA混合孵育20min使Bcl-xlsiRNA和Lipofectamine 2000复合物形成。
(5)将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入0.5ml/2mL无血清配养基。
(6)逐滴加入Bcl-xlsiRNA和Lipofectamine 2000混合物到每孔中(从培养孔一边到另一边)，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀。
(7)在37℃，5％CO2中孵育6小时。更换培养生长基。
(8)在细胞中加入复合物24h，荧光镜下观察转染效率。根据荧光强度确定转染效率，由图13所示在Bcl-xlsiRNA和Lipofectamine 2000的比例为1:6时转染效率最高，后续转染实验均以此比例进行转染。
实施例12
将PPEMMRA@PTX和Bcl-xlsiRNA(按照质量比为1:20)在缓冲溶液中在室温下孵育20min，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA@PTX/Bcl-xlsiRNA
测试例8
对实施例12制备的产品进行纳米胶束吸附Bcl-xlsiRNA联合给药PTX的增敏效果评价
使用MTT法进行联合给药的毒性实验。首先，将A549细胞以每孔8000个细胞的密度接种到96孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基在5％的CO2培养箱中培养过夜，随后在细胞中加入不同终浓度的PPEMMA@PTX(对比例2制备的PPEMMA按照实施例2～5的方法包载PTX得到的产品)，将PPEMMA@PTX与Bcl-xlsiRNA在室温下组装孵育30min，形成的纳米复合物PPEMMA@PTX/Bcl-xlsiRNA，培养48h。然后，在每个孔中加入20μLMTT溶液(5mg/mL)并在37℃条件下再培养4h。随后，吸弃每个孔中废旧的培养基，并加入200μL二甲亚飒(DMSO)用于溶解生成的甲攒晶体。最后，使用酶标仪检测96孔板492nm处的吸光度。并计算药物毒性以及IC50。结果如图14所示。联合给药组可以显著加强PTX对A549细胞的毒性效果。经图14通过柱形图计算得出的IC50显示，联合给药组可以将药物的IC50从14.824μg/mL降低到5.104μg/mL，具有显著的增敏效果。
在细胞毒性实验证明有效后进行凋亡情况检测，进一步确定纳米胶束联合给药Bcl-xlsiRNA对PTX的增敏效果，将A549细胞接种在6孔板中，并在含有10％FBS的DMEM中培养，直至细胞的汇合度达到90％以上。48h后，收集细胞，使用FITC凋亡检测试剂盒进行染色，在流式细胞仪检测。结果如图15和图16所示，单独给药PPEMMA@PTX后，细胞凋亡分别为13.37％和15.22％，同浓度的联合给药组细胞凋亡分别为21.99％和36.11％，细胞凋亡比例明显上调，与此同时单独转染Bcl-xlsiRNA并没有明显的促凋亡效果，说明引起细胞凋亡的主要途径为PTX。由此可见，联合给药能够显著增加A549细胞对PTX的敏感性，在一定程度上降低药物的用量，强化PTX的促凋亡效果。结果经过统计学检验，具有显著性差异***p<0.001。
实施例13
目的基因片段合成：
Mcl-1siRNA目的基因片段由上海生工生物股份有限公司合成。
Mcl-1siRNA序列的正义链(Sense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Mcl-1siRNA序列的反义链(antisense)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.3为：(5'-3')5'-GCA GGA UUG UGA CUC UCA UTT-3'；
SEQ ID NO.4为：(5'-3')5'-AUG AGA GUC ACA AUC CUG CTT-3'；
将实施例6制备的空载体纳米胶束PPEMMRA(按照质量比为1:20)在缓冲溶液中在室温下孵育20min，得到吸附负载Mcl-1siRNA的PPEMMRA/Mcl-1siRNA。
实施例14
将PPEMMRA@PTX和Bcl-xlsiRNA(按照质量比为1:20)在缓冲溶液中在室温下孵育20min，得到吸附负载Bcl-xlsiRNA的PPEMMRA@PTX/Bcl-xlsiRNA
测试例9
对实施例14制备的产品进行纳米胶束吸附Mcl-1siRNA联合给药PTX的增敏效果评价
使用MTT法进行联合给药的毒性实验。首先，将MDA-MB-231细胞以每孔8000个细胞的密度接种到96孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基在5％的CO2培养箱中培养过夜。随后在细胞中加入不同终浓度的PPEMMA@PTX(对比例2制备的PPEMMA按照实施例2～5的方法包载PTX得到的产品)以及，将PPEMMA@PTX与Mcl-1siRNA在室温下组装孵育30min，形成的纳米复合物PPEMMA@PTX/Mcl-1siRNA(实施例14的产品)，培养48h。然后，在每个孔中加入20μLMTT溶液(5mg/mL)并在37℃条件下再培养4h。随后，吸弃每个孔中废旧的培养基，并加入200μL二甲亚飒(DMSO)用于溶解生成的甲攒晶体。最后，使用酶标仪检测96孔板492nm处的吸光度。并计算药物毒性以及IC50。结果如图17所示。联合给药组可以显著加强PTX对MDA-MB-231细胞的毒性效果。经图17通过柱形图计算得出的IC50显示，联合给药组可以将药物的IC50从123.6ng/ml降低到25.03ng/ml，具有显著的增敏效果。
在细胞毒性实验证明有效后进行凋亡情况检测，进一步确定纳米胶束联合给药Mcl-1siRNA对PTX的增敏效果，将MDA-MB-231细胞接种在6孔板中，并在含有10％FBS的DMEM中培养，直至细胞的汇合度达到90％以上。24h后，收集细胞，使用FITC凋亡检测试剂盒进行染色，在流式细胞仪检测。结果如图18所示，单独给药PPEMMA@PTX后，细胞凋亡为20.35％，同浓度的联合给药组细胞凋亡为32.54％，细胞凋亡比例明显上调，与此同时单独转染Mcl-1siRNA并没有明显的促凋亡效果，说明引起细胞凋亡的主要途径为PTX。由此可见，联合给药能够显著增加MDA-MB-231细胞对PTX的敏感性，在一定程度上降低药物的用量，强化PTX的促凋亡效果。结果经过统计学检验，具有显著性差异***p<0.001。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种两亲性嵌段荧光共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在保护气体气氛中，将罗丹明B、还原试剂和有机溶剂混合进行还原反应，得到还原态罗丹明B；所述还原反应包括以下步骤：在保护气体气氛中，将罗丹明B、第一还原试剂和有机溶剂混合进行第一还原反应，得到还原态中间产物；所述第一还原试剂为LiAlH4，所述第一还原试剂和所述罗丹明B的质量比为1:(6～6.5)；在保护气体气氛中，将所述还原态中间产物、第二还原试剂和有机溶剂混合，进行第二还原反应，得到还原态罗丹明B；所述第二还原试剂为单质硫，所述第二还原试剂和所述还原态中间产物的质量比为1:(1.5～2)；
将所述还原态罗丹明B、甲基丙烯酰氯、有机碱试剂和有机溶剂混合进行改性反应，所述还原态罗丹明B和甲基丙烯酰氯的质量比为(2.5～3):1，得到甲基丙烯基功能化罗丹明B；
将所述甲基丙烯基功能化罗丹明B、甲基丙烯酸甲酯、链转移剂、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行可逆加成-断裂转移自由基聚合反应，所述甲基丙烯基功能化罗丹明B的质量与所述甲基丙烯酸甲酯的体积之比为(1.5～2)mg:1mL，得到聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物；
将所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、偶氮类引发剂和有机溶剂混合，进行聚合反应，所述聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯和所述N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的质量比为1:(1～1.5)，得到所述两亲性嵌段荧光共聚物；所述两亲性嵌段荧光共聚物为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯。
2.权利要求1所述的制备方法制备得到的两亲性嵌段荧光共聚物，其特征在于，具有疏水链段和亲水链段；所述疏水链段为聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯单元；所述亲水链端为聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵单元。
3.一种载药荧光聚合物纳米胶束，其特征在于，包括纳米胶束载体和负载于所述纳米胶束载体中的活性药物；所述纳米胶束载体由权利要求2所述的两亲性嵌段荧光共聚物自组装形成；所述活性药物包括抗癌药物和小干扰RNA；所述抗癌药物为紫杉醇，所述小干扰RNA为Bcl-xlsiRNA和/或Mcl-1siRNA。
4.根据权利要求3所述的载药荧光聚合物纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束载体的平均粒径为120～210nm；所述纳米胶束载体的PDI＜0.23。
5.根据权利要求3或4所述的载药荧光聚合物纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束载体与所述小干扰RNA的质量比为1:(5～30)。
6.权利要求3～5任一项所述的载药荧光聚合物纳米胶束在制备预防和/或治疗因Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白表达异常导致的疾病的药物中的应用。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN106519112A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-03-22 | 中国地质大学（武汉） | 一种高水溶性罗丹明基聚离子液体及其制备方法、应用 |
| CN113549143A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-10-26 | 吉林大学 | 一种抗肿瘤多肽Bax-BH3、荧光高分子纳米胶束及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Reversal of Lung Cancer Multidrug Resistance by pH-Responsive Micelleplexes Mediating Co-Delivery of siRNA and Paclitaxel;Haijun Yu et al.;Macromolecular Bioscience;20130821;第14卷(第1期);100-109 * |
| 紫杉醇自组装核壳型纳米胶束的制备与性能;余巧等;药学学报;-;20081231;第43卷(第4期);408-414 * |
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