CN115960938A - 一株基孔肯雅病毒感染性克隆的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明构建了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的CHIKV全长感染性克隆质粒，为开展CHIKV感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。

Description

一株基孔肯雅病毒感染性克隆的构建及其应用

技术领域

本发明属于病毒分子生物学和基因重组技术领域，具体涉及一株基孔肯雅病毒感染性克隆的构建及其应用。

背景技术

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是引起基孔肯雅热(Chikungunyafever)的病原体，其基因组是一种单股正链RNA，属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)成员。CHIKV是一类重要的虫媒病毒，伊蚊是其主要的传播媒介，人群普遍易感，除了引起发热和皮疹等症状以外，常可引起病程长达一年以上的慢性关节炎。近年来有报道CHIKV可引起更严重的疾病，包括脑炎和出血性疾病。目前CHIKV已传播至全球一百多个国家和地区，每年造成数百万人的感染，给人类生命健康带来巨大影响，是全球公共卫生的重大负担。针对CHIKV感染，目前无有效的治疗药物和疫苗。

CHIKV的基因组编码两个开放阅读框(ORF)。由5’端非编码区(NCR)、非结构基因ORF和3’端的结构基因ORF与NCR组成，在非结构基因ORF和结构基因ORF之间有调控结构基因表达的亚基因组启动子(SP)。非结构基因编码四种非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)，主要负责病毒基因组RNA的复制；结构基因编码四种结构蛋白(衣壳蛋白C、包膜蛋白E3、包膜蛋白E2、包膜蛋白E1)，负责病毒颗粒的形成。

病毒感染性克隆，即含有病毒全长基因组的质粒是用于基础病毒学研究与抗病毒科技开发的重要工具。大肠杆菌是最常用也是操作最方便用于扩增质粒的宿主细胞，但有些病毒基因组在大肠杆菌中极不稳定，这给利用大肠杆菌为宿主菌构建病毒感染性克隆造成很大困难。

发明内容

本发明利用基因重组技术，构建成功了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的基孔肯雅病毒全长感染性克隆，利用该克隆作为模板转录出RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可制备出基孔肯雅病毒，体外可感染Vero E6细胞，体内可感染I型干扰素受体基因敲除的小鼠，引起小鼠死亡。该感染性克隆为开展基孔肯雅病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。

本发明提供了一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：含有T7噬菌体启动子序列和一株基孔肯雅病毒全长基因组序列，并且在基孔肯雅病毒基因组中插入了一段哺乳动物细胞mRNA剪接序列。。

进一步地，本发明提供的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：能在大肠杆菌中高效扩增，稳定遗传。

进一步地，本发明提供的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：作为模板转录出病毒基因组RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可产生基孔肯雅病毒。

进一步地，本发明提供的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的基孔肯雅病毒，可感染Vero E6细胞，在细胞内表达病毒蛋白。

进一步地，本发明提供的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的基孔肯雅病毒，可感染I型干扰素受体敲除小鼠，并引起小鼠死亡。

进一步地，本发明提供的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，或基于该感染性克隆构建的各种突变株在基孔肯雅病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发中的应用。

附图说明

图1.CHIKV全长基因组的拼接方法；

根据CHIKV基因组中限制性内切酶位点的分布，将CHIKV基因组分为5段，用酶切、连接方式将5段基因连接为全长基因组；

图2.CHIKV感染性克隆质粒中的CHIKV基因表达结构

NCR：非编码区；SP：亚基因组启动子；

图3.空斑法测定BHK-21细胞培养液中的CHIKV滴度

从左至右1-5孔的稀释倍数分别为104、105、106、107、108；

图4.免疫荧光检测Vero E6细胞中的CHIKV包膜E1蛋白

左图：对照BHK-21培养液感染的Vero E6细胞；

右图.RNA转染BHK-21培养液感染的Vero E6细胞

图5：免疫荧光检测注射病毒小鼠肝组织匀浆液感染的Vero E6细胞中的CHIKV包膜E1蛋白；

左图：对照小鼠肝组织匀浆液感染的Vero E6细胞；右图：注射CHIKV的小鼠肝组织匀浆液感染的Vero E6细胞。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

一、CHIKV基因组限制性核酸内切酶位点分析：

根据序列一株CHIKV序列(GenBank:EU224270.1)，基因组全长11921nt(SEQ1)，分析基因组中限制性核酸内切酶位点的分布，利用位于第2942nt的SpeI酶切位点(A/CTAGT)、第5349nt的NheII酶切位点(G/CTAGC)、第7440nt的XbaI酶切位点(T/CTAGA)以及第9372nt的NsiII酶切位点(ATGCA/T)，将基因组分为五段(片段1-片段5)，长度分别为2942nt、2407nt、2091nt、2292nt、2189nt。

SEQ1：11921nt

二、CHIKV基因组分段合成与拼接：

分别合成上述五个基因片段(由生物技术公司合成)，合成的基因插入在质粒载体pVRC-L中，该质粒由海军军医大学生物医学防护教研室在NIH质粒载体pVRC的多克隆位点上增加了若干酶切位点，多克隆位点5′端和3′端分别为EcoRI酶切位点和NotI酶切位点。在片段1的5′端引入T7启动子，即T7噬菌体RNA聚合酶结合位点(TAATACGACTCACTATAG)，片段5的3′端引入NotI酶切位点(GC/GGCCGC)，各片段连接处的酶切位点均保留。此外，各片段的5′和3′端均引入EcoRI酶切位点(G/AATTC)和NotI酶切位点(GC/GGCCGC)，插入在pVRC-L载体的EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之中，以方便于进行酶切、连接操作。

用酶切、连接等分子生物学技术，将各片段连连接为一CHIKV全长基因组。技术方案如图1所示。

片段1和片段2的拼接：用EcoRI和SpeI酶切片段1质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出片段1，回收片段1；用EcoRI和SpeI酶切片段2质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出线性化的片段2质粒，回收线性化的片段2质粒；将回收的片段1与线性化片段2质粒连接(用T4 DNA连接酶连接)，连接反应产物转化感受态大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用EcoRI和SpeI酶切，分析片段1是否插入片段2质粒中，如果酶切出片段1，则片段1和片段2连接成功，将质粒命名为片段1-2质粒。酶切、连接、大肠杆菌转化、质粒抽提等常规分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所述的方法进行。

片段1-2和片段3的拼接：用EcoRI和NheI酶切片段1-2质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出片段1-2，回收片段1-2；用EcoRI和NheI酶切片段3质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出线性化的片段3质粒，回收线性化的片段3质粒；将回收的片段1-2与线性化片段3质粒连接，得到质粒用EcoRI和NheI酶切鉴定，如果切出片段1-2，即连接成功片段1、片段2和片段3，将质粒命名为片段1-2-3质粒。连接、转化大肠杆菌、抽质粒、酶切鉴定操作同上。

片段4和片段5的拼接：用EcoRI和NsiI酶切片段4质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出片段4，回收片段4；用EcoRI和NsiI酶切片段5质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出线性化的片段5质粒，回收线性化的片段5质粒；将回收的片段4与线性化片段5质粒连接。

上述分段合成的片段4和片段5的连接操作多次均成功，将回收的片段4与线性化片段5质粒连接反应液转化大肠杆菌STBL3，未见到阳性菌落，重复连接和转化大肠杆菌操作3次，仍未见阳性菌落。分析原因，可能与病毒基因组在大肠杆菌中的不稳定性有关。其主要原因是病毒基因组中存在大肠杆菌启动子，导致病毒基因组在大肠杆菌中表达出对大肠杆菌具有毒性的异常蛋白质。

片段4和片段5在在大肠杆菌中均稳定复制，因此分析可能是片段4和片段5衔接处的基因序列影响了两段基因连接以后在大肠杆菌中的稳定性。我们尝试在片段4中插入一段哺乳动物细胞mRNA剪接序列，即内含子作为一段干扰基因，可能中止病毒基因在大肠杆菌中转录表达出毒性蛋白。哺乳动物细胞mRNA剪接序列理论上不影响CHIKV的产生，因为在哺乳动物细胞mRNA中，该序列可被切除。mRNA剪接具有序列选择性，如CAG/G就是一个优选的剪接位点，在CAG/G之间插入侧翼序列分别为5′-GTAAGT------CAG-3′的内含子，在哺乳动物细胞转录出的前体mRNA中，内含子被切除，前体mRNA再拼接为成熟mRNA。因此，我们选择位于基因组8210-8213nt的CAGA为mRNA剪接序列插入位点，将第8213nt的A变为G，密码子AGA随之变为AGG，编码的氨基酸均为精氨酸，即该突变不改变其编码的氨基酸残基，从而形成哺乳动物细胞mRNA剪接序列的优化位点CAG/G，在CAG/G之间插入一段哺乳动物细胞mRNA剪接序列SEQ2，参考哺乳动物细胞表达载体pCI-neo(Promega公司产品，Genbank：U47120.2)中的哺乳动物细胞mRNA剪接序列。将含有哺乳动物细胞mRNA剪接序列的片段4命名为片段4I。按上述方法将片段4I和片段5的连接，连接反应液转化大肠杆菌STBL3，含有卡那霉素的培养板上生长出阳性菌落，抽提质粒，用EcoRI和NsiI酶切质粒，琼脂糖凝胶电泳可见切出了含有哺乳动物细胞mRNA剪接序列的片段4，经基因测序，证实其序列中含有设计的A→G突变以及哺乳动物细胞mRNA剪接序列序列，表明片段4I-5连接成功。

片段1-2-3和片段4I-5的连接：将片段1-2-3质粒用EcoRI和XbaI酶切，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出片段1-2-3，回收片段1-2-3；用EcoRI和XbaI酶切片段4I-5质粒，通过琼脂糖凝胶电泳，分离出线性化的片段4I-5质粒，回收线性化的片段4I-5质粒；将回收的片段1-2-3与线性化片段4I-5质粒连接，得到质粒用EcoRI和XbaI酶切鉴定，结果切出了片段1-2-3，即连接成功片段1、片段2、片段3、片段4I和片段5，将质粒命名为pCHIKVIFL。将质粒pCHIKVI FL进行基因测序，其中的CHIKV基因表达结构全长12086nt，序列见SEQ3，与预期一致，包括T7启动子和含一个核苷酸点突变以及哺乳动物细胞mRNA剪接序列的CHIKV全长基因组，其中1-6nt为EcoRI酶切位点，7-24nt为T7启动子，第8370nt的G为CHIKV基因组原始序列中第8213nt的A突变而来，8237-8369nt为哺乳动物细胞mRNA剪接序列，12079-12086nt为NotI酶切位点(图3)。

将质粒pCHIKVI FL转化大肠杆菌STBL3，抽提质粒，再转化大肠杆菌STBL3，连续10次，将每一次抽提的质粒送生物公司进行基因测序，结果未发现有核苷酸突变，表明该质粒能在大肠杆菌中稳定遗传。

SEQ2：133nt

SEQ3：12086nt

三、CHIKV基因组RNA的转录：

质粒pCHIKVI FL以限制性核酸内切酶NotI酶切，然后以酶切线性化的质粒pCHIKVI FL为模板，用T7 RNA体外转录试剂盒转录出CHIKV基因组RNA，所用试剂为HiScribe^TM T7 mRNA合成试剂盒(含

Reagent AG，NEB公司产品)，通过一步共转录加帽即可获得5’端带有7-甲基鸟苷(m7G)帽结构的mRNA。操作按照试剂说明书进行。转录反应液用磁珠mRNA纯化试剂纯化(Thermo Fisher公司产品)，纯化出的RNA用NanoDrop微量分光光度计(Thermo Fisher公司产品)测定浓度，用于细胞转染。

四、CHIKV基因组RNA转染BHK-21细胞：

将幼仓鼠肾细胞系BHK-21细胞接种于24孔板，培养基用含10％胎牛血清的DMEM(Thermo Fisher公司产品)，次日细胞密度约80-90％时，将制备的CHIKV基因组RNA转染细胞，转染试剂用Lipofectamine^TM 2000reagent(Thermo Fisher公司产品)，每孔用CHIKVRNA 2μg，Lipofectamine^TM 2000reagent 2μl。转染8小时以后，吸除细胞培养液，每孔加500μl含10％胎牛血清的DMEM，继续培养48小时，吸出细胞培养液，冻存于-80℃冰箱，用于细胞感染。

五、病毒测序：

对上述CHIKV RNA转染Vero E6细胞培养液中的病毒进行测序鉴定，用TrizolRegent(Thermo Fisher公司产品)抽提培养液中的RNA，进行二代测序，获得CHIKV基因组全序列，结果显示：除8213nt为G以外，其余与CHIKV原始序列相同，不含哺乳动物细胞mRNA剪接序列，表明该感染性克隆的构建方案达到其初始目的，即通过插入哺乳动物细胞mRNA剪接序列获得了含CHIKV全长基因组、能在大肠杆菌中稳定复制的质粒，用该质粒为模板能制备出CHIKV，且CHIKV基因组中的哺乳动物细胞mRNA剪接序列被剪切，CHIKV感染性克隆中第8370nt A→G突变不改变密码子编码的氨基酸。

六、Vero E6细胞空斑检测：

将非洲绿猴细胞系Vero E6细胞接种于24孔板，37℃孵箱培养。细胞100％汇合时，梯度稀释稀释收集的CHIKV RNA转染BHK-21细胞培养液，37℃孵箱培育2小时。吸除病毒上清，每孔加入1ml覆盖液(含2％羧甲基纤维素钠的DMEM培养基)，继续培养。显微镜下观察空斑大小，待有明显空斑形成时，完全吸尽覆盖液。每孔加入200μL结晶紫染色15分钟。染色后用水冲洗结晶紫，观察空斑大小和形状。选取噬斑单个分散、不汇合的孔进行计数，结果如图3，计算病毒滴度，达10⁷FFU/ml。

七、免疫荧光检测Vero E6细胞中的CHIKV包膜E1蛋白：

将非洲绿猴细胞系Vero E6细胞接种于96孔板，培养基用含10％胎牛血清的DMEM，体积100μl。次日细胞密度约80-90％时，将收集的WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液以10⁴倍稀释，加入Vero E6细胞培养孔中，每孔100μl。20小时以后，用免疫荧光法检测细胞内CHIKV E1蛋白的表达。

吸除Vero E6细胞培养板中的培养液，每孔加100μl甲醇，将培养板至于-20℃冰箱，20分钟后，取出培养板，吸除甲醇，每孔以磷酸盐缓冲液(PBS)洗孔一次，随后加入100μl含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下简称3％BSA-PBS)，置于水平摇床上，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的3％BSA-PBS，每孔加100μl含抗CHIKV包膜E1蛋白单克隆抗体(R&DSystems公司产品)的1％BSA-PBS(抗体1000倍稀释)，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的抗体工作液，每孔以PBS洗3次，随后加入100μl含荧光素Alexa Fluor 488-标记的抗小鼠IgG(Thermo Fisher公司产品)的1％BSA-PBS(荧光素抗体1500倍稀释)，室温避光缓慢摇1小时，吸除培养板中的荧光素抗体工作液，每孔加入DAPI细胞核染色液100μl，室温避光缓慢摇10分钟，吸除培养板中的DAPI细胞核染色液，每孔以PBS洗3次，用细胞成像及分析系统(BioTek Cytation 5Imaging Reader)对每孔细胞的荧光分布进行拍照。

在荧光显微镜下观察可见：CHIKV RNA转染的BHK-21细胞培养液感染的Vero E6细胞中可见绿色荧光分布(绿色荧光素标记的二抗)，而对照细胞内未见绿色荧光(图4)，表明RNA转染的BHK-21细胞培养液感染的Vero E6细胞可表达CHIKV包膜E1蛋白。

八、小鼠感染实验：

6周龄、雌性的I型干扰素受体基因敲除小鼠(A129小鼠，由海军军医大学生物医学防护教研室保种、繁殖)，共10只，分为两组，每组5只。病毒感染组小鼠腹腔注射CHIKV(即CHIKV RNA转染的BHK-21细胞培养液)，剂量1*10⁴FFU，体积200μl；对照组小鼠腹腔注射等体积对照BHK-21细胞(未用CHIKV RNA转染)培养培养液。随后每天观察小鼠的活动情况以及体重变化。结果显示：小鼠腹腔注射CHIKV以后的第三天，小鼠出现行动迟缓、弓背、竖毛等发病症状，第四天全部死亡。取病死小鼠的肝组织，研磨匀浆，将上清液感染Vero E6细胞，20小时以后，用免疫荧光检测CHIKV包膜E1蛋白，在荧光显微镜下可见Vero E6内的绿色荧光，表明细胞内表达有CHIKV包膜E1蛋白，而对照组小鼠肝组织匀浆液处理的Vero E6细胞未见绿色荧光(图5)。对照组小鼠无发病症状，除用于制备肝组织匀浆而处死1只小鼠外，全部存活。表明CHIKV感染A129小鼠，病毒在小鼠体内播散，引起小鼠死亡。

上述在细胞和小鼠的实验结果均表明，本发明利用基因重组技术，构建成功了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的基孔肯雅病毒全长感染性克隆，利用该克隆作为模板转录出RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可制备出基孔肯雅病毒，体外可感染Vero E6细胞，体内可感染A129小鼠，引起小鼠死亡。该感染性克隆为开展基孔肯雅病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。

以上显示和描述了本发明的主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：含有T7噬菌体启动子序列和一株基孔肯雅病毒全长基因组序列，并且在基孔肯雅病毒基因组中插入了一段哺乳动物细胞mRNA剪接序列。

2.如权利要求1所述的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：能在大肠杆菌中高效扩增，稳定遗传。

3.如权利要求1所述的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：作为模板转录出病毒基因组RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可产生基孔肯雅病毒。

4.如权利要求1所述的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的基孔肯雅病毒，可感染Vero E6细胞，在细胞内表达病毒蛋白。

5.如权利要求1所述的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的基孔肯雅病毒，可感染I型干扰素受体敲除小鼠，并引起小鼠死亡。

6.如权利要求1所述的一株基孔肯雅病毒感染性克隆，或基于该感染性克隆构建的各种突变株在基孔肯雅病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发中的应用。

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