CN115960467A - 一种丝素蛋白液晶悬浮液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种所述丝素蛋白液晶悬浮液是由丝素蛋白纳米纤维和水混合而成；所述丝素蛋白纳米纤维具有完整的结晶区结构；所述丝素蛋白纳米纤维具有自发性形成向列相液晶并表现出溶致液晶的特性，具有自组装行为。采用本发明技术方案制备丝素蛋白纳米纤维悬浮液，将热处理和低的碱浓度相结合的方式，通过前期热处理，打开了蚕丝纤维之间部分分子间作用力，有效降低了后期碱处理的浓度，从而保留丝素蛋白的结晶区结构，通过水浴热处理后剥离得到的纳米纤维具有较完整的结晶区结构，在水溶液中可以自发形成向列相液晶，且在熵的驱动下，一定浓度的丝素蛋白纳米纤维悬浮液发生相分离的现象。
Description
技术领域
本发明涉及液晶新材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白液晶悬浮液及其制备方法和应用。
背景技术
液晶被认为是物质的第四种状态，它可以显示晶体和各向同性液体之间的特性。目前，液晶主要以生物质的材料为主，其中蛋白质以良好的生物相容性和降解产物为氨基酸小分子易被人体吸收的特点，近年来被广泛探究，淀粉样蛋白是一种新型的液晶材料。但是淀粉样蛋白液晶的较低产率和昂贵的价格限制其发展。
丝蛋白纤维就因其较高的抗拉强度、刚度和韧性而被用于纺织品，组织工程，生物医药和食品以及化妆品等。由于结晶区的存在，使得丝纤维具有良好的取向和力学性能。若成功将结晶区作为一种基本构筑单元来构建不同形式和不同功能的新型丝蛋白材料，这将推动丝蛋白材料的进一步发展。因此，最大程度保留丝纤维的结晶区，将其剥离成纳米单元成为目前探究的热点与难点。
目前已通过多种方法将丝纤维剥离成纳米纤维，例如Appl.Phys.Lett.2007，90(7)，073112073112.采用的高强度超声的方法，和溶剂溶解的方法，包括甲酸/溴化锂，甲酸/氯化钙，低共溶溶剂，六氟异丙醇，硫酸等，具体参见(Biomacromolecules，2016，17(9)，3000-3006；ACS AppLMater.Interfaces 2015，7(5)，3352-3361；ACS SustainableChem.Eng.2020，8(11)，4499-4510；Adv.Mater2016，28(35)，7783—7791.J.Mater.Chem.B2019，7(9)，1450—1459.)，或碱性试剂结合冷冻-解冻的方法，如ACSNano 2018，12(12)，11860—11870，等等。
中国发明专利CN114163684A公开的一种废弃蚕茧中直接提取丝素纳米纤维与回收水解丝蛋白及提取液的方法，该方法采取的方案都是如何将蚕丝纤维通过试剂去水解，而对丝的预处理上没有进一步的深入研究，另外采取的剥离条件非常苛刻，溶液破坏丝素蛋白的结晶区。除此之外，也有通过自下而上的方法(诱导丝蛋白溶液聚集成纳米纤维)来得到纳米纤维，但由于纳米纤维是从无序结构分子链聚集而成，因此得到的丝素蛋白纳米纤维的结晶度低，不具有双折射现象，例如中国发明专利CN106757447A公开的一种家蚕丝素蛋白纳米纤维及其制备方法。
中国发明专利CN 113818096 A公开了一种蚕丝蛋白纳米纤维的制备方法及用途，向碱性溶液中加入蚕丝，得到混合液，经冷冻-溶解或加热和搅拌，分离固体悬浮液中的水不溶物，经机械处理得到蚕丝蛋白纳米纤维。该发明虽然通过控制水解条件，有效调控碱对丝蛋白纤维结构的破坏程度，一定程度地保留了结晶区，使得纳米纤维分散液在偏光显微镜下具有双折射。但是，根据中国发明专利CN 106046133 A可知，蚕丝纤维在碱性条件下反复的冷冻-溶解过程中，冰晶的反复生长会破坏丝素蛋白分子内的氢键和打开结晶区，易得到丝素蛋白纳米条带。因此，中国发明专利CN 113818096 A得到的纳米纤维分散液90天后稳定分散，并未呈现出相分离现象和自组装的过程。
综上，现有公开的技术存在以下技术问题：(1)剥离或水解方法对纤维的水解程度较大，容易破坏纤维的结晶区，导致结晶区不完整，从而限制其在液晶中的应用；(2)剥离过程中使用了甲酸，六氟异丙醇和硫酸等对人体和环境有害的试剂，无法进行批量化和绿色生产；(3)剥离得到的纳米纤维的产率低，稳定性差。
发明内容
有鉴于此，为解决上述问题，本发明提供了一种丝素蛋白液晶悬浮液及其制备方法和应用，采取热处理等温和的方法，先破坏掉纤维之间的较弱的氢键，随后通过较低浓度的碱性试剂进一步对纤维进行水解，而得到具有较高结晶度的丝蛋白纳米纤维，进一步扩展了丝素蛋白液晶在多领域的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，所述丝素蛋白液晶悬浮液是由纳米纤维和水混合而成；所述丝素蛋白纳米纤维具有完整的结晶区结构；所述丝素蛋白纳米纤维具有自发性形成向列相液晶并表现出溶致液晶的特性，具有自组装行为。
优选地，所述丝素蛋白纳米纤维的含量为0.01～20wt％，直径为10～800nm，长度为50nm～200μm；通过化学交联的方法捕捉所述丝素蛋白纳米纤维的自组装行为；所述自发性形成向列相液晶的条件为温度2～80℃，湿度20～99％；和/或，所述结晶区结构的液晶相表现出双折射现象纹影织构，在正交偏振光下呈现了彩虹光。
优选地，所述丝素蛋白纳米纤维的表面整体带有负电荷；所述丝素蛋白纳米纤维的排列方向具有一致性，在磁场和/或电场作用下，具有均一的取向调控作用；和/或，所述丝素蛋白纳米纤维的蛋白质结构为β折叠结构；
优选地，所述丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液采用丝纤维热处理-碱性水解-离子去除-超声分散的方法制备而成；和/或，所述丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液用去水稀释并密封冷藏后，产生相分离；发生相分离的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液的浓度为2～5％。
为实现另一个目的，本发明还提供了另一个技术方案，上述丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液的制备方法，具体步骤包括：
S1.丝纤维热处理：将丝纤维进行水浴热处理；
S2.碱性水解：将S1处理后的丝纤维置于碱性溶液中搅拌直至分散成微纳米纤维；
S3.离子去除：将S2分散后的所述微纳米纤维经离心收集和纯水透析去除离子；
S4.超声分散：将S3透析之后的所述微纳米纤维进行超声分散即可得到丝素蛋白液晶悬浮液。
优选地，S1中，所述水浴热处理中的碱性溶液为弱碱溶液，包括碳酸钠、磷酸钠或碳酸氢钠溶液中的一种或多种的组合；所述生物酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或风味蛋白酶的一种或多种的组合；所述的丝纤维来源为蜘蛛和蚕；蜘蛛包括游猎蜘蛛、结网蜘蛛或洞穴蜘蛛任一种或多种的组合；蚕包括桑蚕、柞蚕、野蚕或转基因蚕任一种或多种的组合。
优选地，S2中，所述碱性水解包括将丝纤维置于碱性溶液中搅拌直至所述丝纤维分散为微纳米纤维，搅拌方式包括磁力搅拌、匀质搅拌或涡轮搅拌，搅拌的温度为2～100℃，搅拌时间为2～720h，碱性溶液的质量体积比浓度为0.5～10g/L，所述丝纤维与所述碱性溶液的浴比为0.1～100g/1L。
优选地，所述碱性溶液为氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化锂溶液中的任一种或多种的组合。
优选地，S3中，所述离心收集包括将所述为纳米纤维经过离心-纯水悬浮-离心的过程，重复纯水悬浮和离心3-5次后，密封于透析袋中经纯水透析去除离子；所述离心收集的转速为5000～20000rpm，离心时间为5～20min；透析的时间为1-5天，透析袋的截留分子量为3.5～100KDa。
S4中，所述超声分散的功率为50～1000W，超声分散的时间为5～800min。
在上述的技术方案提供的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液或上述方法制备的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液中，加入聚合单体、引发剂和交联剂，经搅拌、冷藏保存后，紫外光照射条件下诱导所述丝素丝素蛋白纳米纤维悬浮液反应生成聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶。也即，可以通过化学交联的方法来捕捉丝素蛋白纳米纤维的自组装行为，形成丝素蛋白液晶水凝胶；自发性形成向列相液晶的条件为温度2～80℃，湿度20～99％，优选地，温度为2-30℃，湿度50-95％。
进一步地，采用上述技术方案提供的丝素丝素蛋白纳米纤维悬浮液中加入聚合单体、引发剂和交联剂，经搅拌、冷藏保存后，紫外光照射条件下诱导所述丝素丝素蛋白纳米纤维悬浮液反应生成所述聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶。聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶具有相分离现象，上下两层具有不同的微观形貌，上层为各向同性，下层为各向异性结构，其中的纳米纤维在长程范围内的排列方向与相分离界面平行。
进一步地，将上述的技术方案提供的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液或上述方法制备的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，室温条件下风干成膜得到丝素蛋白液晶薄膜；所述丝素蛋白液晶薄膜为蚕丝各向异性薄膜；正交偏正光条件下具有彩虹色；所述丝素蛋白纳米纤维的排列具有手性结构特征的螺旋结构。
进一步地，将上述的技术方案提供的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液或上述方法制备的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，置于盐酸蒸汽中密封保存得到丝素蛋白液晶水凝胶。
将上述的丝素蛋白液晶水凝胶置于乙醇中进行溶剂交换，冷冻-干燥后得到丝素蛋白液晶气凝胶。
采用上述制备方法制备得到的丝素蛋白纳米纤维具有尺寸均一且可控的特点，通过选择不同的含有纤维素的材料来制备对尺寸不同要求的丝素蛋白纳米纤维。
采用本发明技术方案制备的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，纳米纤维的表面整体带有负电荷在磁场和/或电场作用下，具有均一的取向调控作用；同时，纳米纤维蛋白具有完整的结晶区，可以通过化学交联的方法来捕捉丝素蛋白纳米纤维的自组装行为，形成聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶，即，可自发性形成向列相液晶并表现出溶致液晶的特性，具有自组装行为。
本发明所获得的有益技术效果：
1.采用本发明技术方案制备丝素蛋白纳米纤维悬浮液，将热处理和低的碱浓度相结合的方式，通过前期热处理，打开了蚕丝纤维之间部分分子间作用力，有效降低了后期碱处理的浓度，从而保留丝素蛋白的结晶区结构，通过水浴热处理后剥离得到的纳米纤维具有较完整的结晶区结构，在水溶液中可以自发形成向列相液晶，且在稀释后在熵的驱动下，丝素蛋白纳米纤维悬浮液发生相分离的现象。
2.采用本发明技术方案制备丝素蛋白纳米纤维悬浮液经碱液剥离得到的纳米纤维表面具有丰富的羧基，使得纳米纤维悬浮液整体带负电荷，纳米纤维之间负电荷的排斥作用，有利于提高纤维分散液的稳定性。
3.采用本发明技术方案，选用较低浓度的碱性试剂，得到的丝素蛋白纳米纤维具有较高的产率；且整个制备过程中未使用有毒试剂和易挥发的药品，在绿色制备、加工和批量化生产中具有潜在的优势。
4.采用本发明技术方案得到的丝素蛋白纳米纤维可以制备聚丙烯酰胺/蚕丝复合成水凝胶，烘干并喷金处理后，水凝胶具有清晰的界面，且上下两层具有不同的微观形貌，上层为各向同性，下层为各向异性结构，纳米纤维的排列方向与相分离界面平行，可以应用于生物医药领域。
5.采用本发明技术方案得到的水凝胶经溶剂置换后冷冻工艺干燥得到丝素蛋白液晶气凝胶，在偏光显微镜下具有彩虹色，可以将之应用于光电学领域。
6.采用本发明技术方案制备丝素蛋白纳米纤维悬浮液风干成膜后，得到的薄膜中，纳米纤维的排列具有一定的螺旋结构，表明了丝素蛋白液晶薄膜具有一定的手性结构，在正交偏振片下观察其双折射现象，且薄膜具有显著的彩虹色，可以应用于光电学领域。
7.采用本发明技术方案制备得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液，制备工艺简单，具有广阔的应用前景，在生物、医药、复合材料、光学等领域中均可得到广泛的应用，易于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液中丝素蛋白纳米纤维的AFM形貌图。
图2a为本发明实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液在正交偏光条件下的显微镜照片。
图2b为本发明实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液在偏光片旋转45°后的显微镜照片。
图3为本发明实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液的圆二色(CD)图谱。
图4为本发明实施例1制备得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液的正交偏振光的偏光显微镜照片。
图5为本发明实施例5制备得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液第168h时的相分离试验结果照片。
图6为本发明实施例8制备得到的聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶的电子照片。
图7本发明实施例8制备得到的聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶的扫描电子显微镜下观察其相分离处的界面形貌图。
图8为本发明实施例8制备得到的聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶的相分离的SEM微观形貌图。
图9为本发明实施例9制备得到的丝素蛋白液晶薄膜和水解之前的蚕丝纤维的红外图谱。
图10为本发明实施例9制备得到的丝素蛋白液晶薄膜和水解之前的蚕丝纤维的XRD图谱。
图11为本发明实施例9制备得到的丝素蛋白液晶薄膜和对照例1的制备的丝素蛋白薄膜偏光照片对比图。
图12为本发明实施例9制备得到的丝素蛋白液晶薄膜的SEM微观形貌图。
图13为本发明对照例1制备得到的丝素蛋白薄膜的SEM微观形貌图。
图14a为本发明实施例10制备得到的丝素蛋白液晶气凝胶的电子照片。
图14b为本发明实施例10制备得到的丝素蛋白液晶气凝胶的SEM微观形貌图。
图14c为本发明实施例10制备得到的丝素蛋白液晶气凝胶的偏光显微镜图。
图15a和图15b分别为本发明实施例10制备得到的丝素蛋白液晶悬浮液在不同电场力作用下的偏光照片。
图16为本发明对照例1的丝素蛋白溶液的正交偏振光的偏光显微镜图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明提供了一种丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，由丝素蛋白纳米纤维和水混合而成；丝素蛋白纳米纤维具有完整的结晶区结构；丝素蛋白纳米纤维具有自发性形成向列相液晶并表现出溶致液晶的特性，具有自组装行为。可通过化学交联的方法来捕捉其自组装行为，得到的聚合物/蚕丝水凝胶，具有相分离的特性。
同时，采用丝素蛋白纳米纤维悬浮液制备的丝素蛋白纳米纤维薄膜中纳米纤维的排列具有一定的螺旋结构，丝素蛋白纳米纤维水凝胶和/或丝素蛋白纳米纤维气凝胶在偏振光下能够观察到彩虹色。
下面通过具体的实施例来进一步详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供了丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液的制备方法，并选择家蚕丝作为丝素蛋白的原料，家蚕丝是由两根并列丝蛋白纤维和外层的丝胶组成，丝胶对两根纤维起到封装的作用，更利于纤维的成型，起到了粘合剂的作用。为了得到丝素蛋白，需要去掉外层的丝胶，外层丝胶是水溶性蛋白，在热水、酶和弱碱溶液中易溶解。
本实施例提供了丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液的制备方法，具体步骤包括：
(1)配置1L浓度为0.05％(质量比体积)的碳酸钠溶液，将蚕丝浸入该溶液中，保持蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为0.5g/1L、2g/1L、5g/1L、10g/1L、15g/1L、20g/1L和50g/1L，分别加热煮沸，煮沸时间为30分钟，进行脱胶处理，处理的方法的目的除了去掉丝胶之外，同时破坏纤维间部分较弱作用力。
将脱胶处理后的蚕丝置于纯水中洗涤3-5次，置于45度烘箱中烘干至恒重，最后记录烘干之后的重量，计算蚕丝的脱胶损失率，结果参见表1。经计算，处理之后蚕丝质量的损失率为15％-42.5％。
表1不同浴比条件下处理蚕丝的脱胶损失率
| 浴比 | 0.5g/1L | 2g/1L | 5g/1L | 10g/1L | 15g/lL | 20g/lL | 50g/1L |
| 脱胶率 | 42.5％ | 26.3％ | 25.1％ | 24.7％ | 22.6％ | 21.3％ | 15％ |
本实施例中选用家蚕丝作为丝素蛋白的原料，其丝胶约占整个蚕丝的25％左右，因此，结合表1的结果可见，故优选浴比为10g/L、脱胶率为24.7％的热处理条件进行后续步骤的处理。选用其它蚕丝作为丝素蛋白原料时，可根据蚕丝的丝胶含量进行浴比的选择。
(2)配置浓度为5g/L的氢氧化钾溶液，将步骤(1)中蚕丝与碱溶液的浴比为10g：1L条件下热处理得到的纤维加入到碱溶液中，通过磁力搅拌直至纤维分散为微纳米纤维，搅拌的温度为25℃，搅拌时间为10天。
(3)步骤(2)得到的将蚕丝微纳米纤维与氢氧化钾溶液进行离心，离心条件为12000rpm，10min，剥离得到纳米纤维的直径约200nm～600nm，纤维的长度约1μm～20μm。
(4)离心结束后，收集沉淀转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，在去离子水中透析5天。
(5)将透析之后的纤维通过超声分散(Fisherbrand Ultrasonic disintegrator，660Hz，)即可得到具有良好分散性的丝素蛋白纳米纤维悬浮液，超声分散的功率为500W，超声分散的时间为20min。
将已知重量的纳米纤维悬浮液(记作w1)放置于60℃烘箱中，烘干至恒重后，称取其重量，记作w2，计算w2与w1的比值乘100％可得到纳米纤维的浓度。本实施例的丝素蛋白纳米纤维悬浮液浓度约4.5％。
形貌观察：将上述步骤制备得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液进行稀释至浓度为0.5％，并通过AFM进行形貌观察。参阅图1，为本实施例的丝素蛋白纳米纤维的AFM(仪器：Bruker AXS D8)形貌图，得到的纳米纤维的直径约40～60nm，长度为100～600nm的纤维。
偏正光观察：取少量浓度为3％纳米纤维悬浮液，在偏光显微镜(BM2100POL)下观察纳米纤维的液晶相。参阅图2a和图2b，其中，图2a为正交偏光条件下的显微镜照片，图2b为偏光片旋转45°后的显微镜照片，通过观察发现，本发明获得的纳米纤维具有明显的双折射现象和观察到清晰的纹影织构，液晶相在不同角度下具有不同的颜色，说明具有方向依赖性，也说明各向异性，具备液晶的基本特性。
参阅图4，为丝素蛋白纳米纤维悬浮液的正交偏振光的偏光显微镜图，在正交偏振光下呈现了彩虹光。
纳米纤维悬浮液的电位测定：将纳米纤维悬浮液用去离子水稀释至0.01％后转移到电位测量池，在马尔文电位仪(Nano ZS ZEN3600)中测量纳米纤维悬浮液的电位。丝素蛋白纳米纤维的表面整体带负电荷(约-45mV)，进一步证明了丝素蛋白纳米纤维的表面含有大量的羧基。
晶体结构测定：将丝素蛋白纳米纤维分散液稀释至0.01％后转移到10毫米比色皿中，使用圆二色(CD)光谱仪(Chirascan-plus)采集丝素蛋白纤维分散液的CD光谱，采集的光谱范围为190-250nm，光谱扫描速度为100nm/min，分辨率为1nm，纯水作为对照组。
参阅图3，为丝素蛋白纳米纤维悬浮液的圆二色(CD)图谱，从图谱中可见，丝蛋白纳米纤维悬浮液在195.2nm和219.1nm附近出现特征峰，说明了纳米纤维中的蛋白质结构为β折叠结构，说明丝素蛋白纳米纤维保留了蚕丝β-折叠的结构。
实施例2
本实施例提供了丝素蛋白纳米纤维悬浮液的制备方法，采用氢氧化钠剥离蚕丝纤维，具体步骤包括：
(1)分别配置100mL浓度为0.5％、1％和2％的木瓜蛋白酶溶液，放入水浴锅中加热至85～90℃，然后将1g蚕丝浸入后上述溶液1h后取出用去离子水清洗5次后，置于45℃烘箱中烘干至恒重，最后记录烘干之后的重量。
经计算，木瓜蛋白酶溶液浓度分别为0.5％、1％和2％处理之后蚕丝质量的损失率分别为13.5％、19.9％和25.8％，通过苦味酸-胭脂红试剂评估丝胶的残留情况，结果发现0.5％的蛋白酶溶液处理蚕丝之后，表面残留丝胶，1％的几乎无丝胶残留，2％的没有丝胶残留。
为了尽可能保留蚕丝结构，后续的实验选取木瓜蛋白酶溶液浓度为1％进行处理的蚕丝纤维。
(2)配置浓度为3g/L(质量体积比浓度)的氢氧化钠溶液，将(1)中采用1％蛋白酶溶液脱胶得到的蚕丝纤维加入到碱溶液中，蚕丝与碱溶液的浴比为40g：1L，通过匀质搅拌直至纤维分散为微纳米纤维，搅拌的温度为45℃，搅拌时间为3天。随后将蚕丝纤维与碱的混合液进行离心，离心条件为11000rpm，10min，离心结束后，收集沉淀后，转移至截留分子量为14000Da的透析袋中，在去离子水中透析5天。
(3)将透析之后的纤维通过细胞粉碎机即可得到具有良好分散性的纳米纤维悬浮液，超声分散的功率为200W，超声分散的时间为50min，得到直径约20-80nm，长度为100-900nm的纤维。
实施例3
本实施例提供了丝素蛋白纳米纤维悬浮液的制备方法，采用碳酸氢钠剥离蚕丝纤维，具体步骤包括：
(1)称取5g蚕丝放入100mL的去离子水中，高温高压处理30min，处理温度120℃，压力为0.1MPa，处理之后的蚕丝纤维用去离子水清洗5次后，置于45度烘箱中烘干至恒重，最后记录烘干之后的重量。经计算，处理之后蚕丝质量的损失率为18.7％。
(2)配置浓度为0.8％(质量比体积)的碳酸氢钠溶液，将(1)中得到的纤维加入到碱溶液中，蚕丝与碱溶液的浴比为10g：1L，通过涡旋搅拌直至纤维分散为微纳米纤维，搅拌的温度为80℃，搅拌时间为6h。随后将蚕丝纤维与碱的混合液进行离心，离心条件为11000rpm，10min，离心结束后，收集沉淀后，转移至截留分子量为100KDa的透析袋中，在去离子水中透析5天。
(3)将透析之后的纤维通过超声分散即可得到具有良好分散性的纳米纤维悬浮液，超声分散的功率为650W，超声分散的时间为200min，得到直径5～40nm，长度为60～1200nm的纤维。
实施例4
本实施例提供了丝素蛋白纳米纤维悬浮液的制备方法，采用氢氧化钾剥离蚕丝纤维，具体步骤包括：
(1)配置浓度为0.05％(质量比体积)的1L碳酸钠溶液，将蚕丝纤维浸入碳酸钠溶液中，保持蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为10g/1L加热煮沸，煮沸时间为60分钟。然后置于纯水中洗涤3～5次，置于45度烘箱中烘干至恒重，最后记录烘干之后的重量。经计算，处理之后蚕丝质量的损失率为35.1％。
(2)配置浓度为5g/L(质量比体积)的氢氧化钾溶液，将(1)中得到的纤维加入到碱溶液中，蚕丝与碱溶液的浴比为5g：1L，通过磁力搅拌直至纤维分散为微纳米纤维，搅拌的温度为25℃，搅拌时间为7天。随后将蚕丝纤维与碱的混合液进行离心，离心条件为11000rpm，10min，离心结束后，收集沉淀后，转移至截留分子量为20000Da的透析袋中，在去离子水中透析5天。
(3)将透析之后的纤维通过超声分散即可得到具有良好分散性的纳米纤维悬浮液，超声分散的功率为400W，超声分散的时间为30min，得到超声后，纳米纤维的产率约在43.8％。
实施例5
本实施例为丝蛋白纳米纤维悬浮液的相分离实施例。
将实施例1制备得到的纳米纤维悬浮液用去离子水稀释成质量百分比浓度为3.5％的悬浮液，密封后静置于4度冰箱，湿度约75％，在分别设定的时间点(12h，24h，36h，48h，96h，168h)，并对第168h时进行拍照观察纳米纤维悬浮液的相分离过程，参阅附图5。
由图5可见，在熵的驱动下，纳米纤维悬浮液逐渐分成两相。
实施例6
本实施例与实施例5的区别在于稀释浓度为2％的纳米纤维悬浮液静置于温度25℃、湿度为50％，观察相分离过程。
实施例7
本实施例与实施例5的区别在于稀释浓度为5％的纳米纤维悬浮液静置于温度4℃、湿度为95％，观察相分离过程。
在实施例6和实施例7中均观察到与实施例5相同的相分离现象。
实施例8
采用实施例1的制备方法得到的丝素蛋白纳米纤维悬浮液中加入准确称量的0.5g单体丙烯酰胺、50mg交联剂n-n′-亚甲基双(丙烯酰胺)和5mg 2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基丙苯酮和5mL 3％丝纳米纤维悬浮液混合，以500转/分连续搅拌60分钟，将混合液置于4℃冰箱，湿度为95％，1周后观察丝素蛋白纳米纤维悬浮液产生相分离，使用250W的紫外光源进行紫外光聚合30分钟，得到聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶。
参阅附图6，为本实施例的聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶电子照片。
参阅附图7，将复合水凝胶置于60℃烘箱烘干，喷金处理后，在扫描电子显微镜下观察其相分离处的界面形貌，可以观察到聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶具有一个清晰的界面。
参阅附图8，聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶的上下两层具有不同的微观形貌，上层为各向同性，下层为各向异性结构，纳米纤维在长程范围内的排列方向与相分离界面平行。
实施例9
将实施例1制备的丝素蛋白纳米纤维悬浮液，取3.5mL放入35mm的塑料盘中，室温下风干成膜，得到丝蛋白纳米纤维薄膜，为具有各向异性的薄膜。
对制备得到的丝蛋白纳米纤维薄膜进行形貌、结构表征。
1.双折射现象。利用傅立叶变换红外光谱光谱仪(FTIR，Nicolet 5700)，在反射模式下测定了蛋白薄膜的二级结构，测量范围为400～4000cm-1。
2.将丝蛋白液晶膜放于x射线衍射样品槽中，使用BrukerAXS D8Advance进行测量，衍射强度范围为2θ＝5～45。
3.扫描电子显微镜(S4800，日立)观察薄膜的表面和截面的形貌。
4.偏振光显微镜下观察薄膜的表面的颜色。
参阅图9，本实施例的丝素蛋白纳米纤维薄膜和水解之前的蚕丝纤维的红外图谱，在1620cm-1和1510.5cm-1处有共同红外特征峰，说明了丝素蛋白纳米纤维薄膜保持了谁借钱蚕丝纤维的β折叠结构。
参阅图10，为本实施例丝素蛋白纳米纤维薄膜和水解之前的蚕丝纤维的XRD图谱，通过图谱也可以进一步佐证丝素蛋白纳米纤维薄膜的β折叠结构，这进一步说明了本实施例的剥离方法能够保留水解前的蚕丝纤维的β折叠结构。
参阅图11，偏振光显微镜下本实施例的丝蛋白纳米纤维薄膜呈现彩虹色。
参阅图12，丝素蛋白纳米纤维薄膜截面中可以观察到纳米纤维的排列，而且纳米纤维的排列具有一定的螺旋结构，表明了丝素蛋白液晶薄膜具有一定的手性结构。
实施例10
将实施例1制备的蚕丝液晶悬浮液装入玻璃瓶中，放入具有盐酸蒸汽的密封环境中密封保存3天得到丝素蛋白液晶水凝胶。
将制备的丝素蛋白液晶水凝胶置于乙醇中进行溶剂交换2天后，置于-20℃冰箱中冷冻24h，采用冷冻工艺(仪器型号：FD-1A-50)干燥得到丝素蛋白液晶气凝胶，冷冻干燥的条件为：冷凝温度-40℃，真空度28Pa。
在偏光显微镜下观察丝素蛋白液晶气凝胶的颜色。
参阅附图14a，为丝素蛋白纳米纤维气凝胶的电子照片；附图14b为丝素蛋白纳米纤维气凝胶的SEM微观形貌；附图14c为丝素蛋白纳米纤维气凝胶的偏光显微镜图。
通过附图14b和14c可以发现，丝素蛋白液晶气凝胶在显微镜下具有显著的彩虹色。
实施例11
本实施例为实施例1制备的蚕丝液晶悬浮液的取向调控试验的实施例。
将实施例1制备的蚕丝液晶悬浮液装入玻璃瓶中，放入磁场中(磁场强度2T)进行磁场调控，给纳米纤维施加一个磁场力用来调控纳米纤维的运动方向，纳米纤维沿着磁场力的方向移动。
将石墨电极固定到玻璃方缸相对的两侧，然后将将实施例1制备的蚕丝液晶悬浮液装入玻璃方缸中，连接直流电源，对纳米纤维进行电场调控。
由于纳米纤维表面带负电荷，分别施加5V/cm和20V/cm的电压下，纳米纤维会在电场力的作用下，逐渐转移至正极。
参阅附图15a和15b，分别为5V/cm和20V/cm的电压下的测试纳米纤维的取向，可以发现两者均沿着电场的方向进行移动。最后在偏振光下，可观察到在正极附近呈现处均一的颜色。
上述试验结果表明，纳米纤维的在磁场和电场作用下的排列方向具有一致性，且在5V/cm的电压下，具有更加均一的取向。
对照例1
本对照例选用现有技术中常规的溴化锂方法溶解的方法制备丝素蛋白溶液，具体步骤包括：
(1)配置浓度为0.2％(质量比体积)的1L碳酸钠溶液，将蚕丝纤维浸入碳酸钠溶液中，保持蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为2.5g/1L加热煮沸，煮沸时间为30分钟。然后置于纯水中洗涤3—5次，置于45度烘箱中烘干至恒重。
(2)将干燥后的蚕丝加入到9.3M的溴化锂中，蚕丝与溴化锂的浴比为1g：4mL，转移至60℃的烘箱处理4小时，封装到截留分子量为3500Da的透析袋中，透析3天后，离心收集上清液，获得丝素蛋白溶液的浓度约5-7w.t％。
(3)在偏光显微镜下观察丝素蛋白溶液。
在本对照例中丝素蛋白溶液采用溴化锂方法溶解的方法属于本领域内常规方法之一。
取丝素蛋白溶液3.5mL放入35mm的塑料盘中，室温下风干成膜，得到丝素蛋白薄膜。
参阅图11，偏光显微镜下观察本对照例的制备方法得到的丝素蛋白溶液，没有双折射现象，为各向同性，不具有手性结构，且在偏振光下没有颜色。而实施例9制备的丝素蛋白液晶薄膜中的纳米纤维的排列具有一定的螺旋结构，且可以在偏振光下能够观察到彩虹色。
参阅图13，丝素蛋白薄膜的截面形貌结构致密，而实施例9制备的丝素蛋白液晶薄膜中的纳米纤维的排列具有一定的螺旋结构，两者在结构上具有显著的差异。
参阅图16，为丝素蛋白溶液的正交偏振光的偏光显微镜图，在正交偏振光下没有颜色，而与实施例1相比，参阅图4，实施例1制备的丝素蛋白悬浮液呈现了彩虹光。
对照例2
本对照例与实施例5的区别在于纳米纤维悬浮液的浓度为5.5％，其它条件相同。
对照例3
本对照例与实施例5的区别在于纳米纤维悬浮液的浓度为1％，其它条件相同。
分别观察对照例2和对照例3的纳米纤维悬浮液的相分离过程，并未出现如实施例5的相分离过程。
通过实施例5-7和对照例2-3对比可见，在纳米纤维悬浮液浓度为2-5％的范围内会发生相分离。当浓度高于5％和低于2％，较难发生相分离，浓度高时纳米纤维的空间位阻增加，局部纤维浓度高，双折射现象明显，但不易发生产生相分离；浓度太低了纳米纤维之间的距离较远，纳米纤维具有较高的自由能，不易分相，此时，双折射现象也不明显。通过上述分析，从侧面进一步佐证了该液晶是一种溶致液晶，即在一定浓度内具有液晶相。
综上所述，本发明提供了一种丝素蛋白手性液晶悬浮液一种由包含但不限于纳米纤维与水的混合体系，这种纳米纤维具有可控的长径比；悬浮液中的纳米纤维可以自发的形成向列相液晶，且表现出溶致液晶的特性。本发明将热处理和低的碱浓度相结合的方式，通过前期热处理，打开了纤维间部分分子间作用力，有效降低了后期碱处理的浓度，从而保留丝素蛋白的结晶区结构，而且剥离得到的纳米纤维具有较完整的结晶区结构，因此在水溶液中可以自发形成向列相液晶，丝素蛋白纳米纤维具有自发性形成向列相液晶并表现出溶致液晶的特性，具有自组装行为。且本发明通过化学交联的方法来捕捉丝素蛋白纳米纤维的自组装行为，能够形成具有各向异性的聚合物/蚕丝复合水凝胶，同时，本发明提供的丝素蛋白纳米纤维具有只有在溶质液晶体系中才有的相分离现象。
具有手性结构的液晶应用是极其广泛的，如光学、成像、显示、传感等领域。而相分离过程对手性的调节是极其重要的，也是大多数溶质液晶的一个基本特性，比如五氧化二钒、日落黄FCF、纤维素纳米晶体、氧化石墨烯、碳纳米管、羟基磷灰石纳米棒，甲壳素纳米晶体，淀粉样纳米纤维等都具有相分离的过程，而一般地，现有技术制备的丝素蛋白液晶相并未出现过上述的相分离现象。而采用本发明技术方案制备的丝素蛋白液晶呈现了相分离这个过程，就说明纳米纤维会自发的进行组装，组装之后往往具有各向异性，各向异性的材料在光的通路中会显示出不同的光学特性，可以应用于光栅和光学防伪材料等领域。
本发明提供的丝素蛋白纳米纤维由于纤维表面具有丰富的羧基，使得纳米纤维悬浮液整体带负电荷，纳米纤维之间负电荷的排斥作用，有利于提高纤维分散液的稳定性，同时在磁场和电场的作用下能够调控其排列方向，且纳米纤维对外场的作用下(磁场和电场)也具有高灵敏的响应性，这使得丝蛋白液晶在光学传感、生物医药、保健食品、化妆品和信息加密以及组织工程方面具有潜在的应用价值。
进一步，由于选用较低浓度的碱性试剂，得到的纳米纤维具有较高的产率；整个制备过程中未使用有毒试剂和易挥发的药品，在绿色制备、加工和批量化生产中具有明显的优势。
以上仅为本发明的优选实施例，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，其特征在于，所述丝素蛋白液晶悬浮液是由丝素蛋白纳米纤维和水混合而成；所述丝素蛋白纳米纤维具有完整的结晶区结构；所述丝素蛋白纳米纤维具有自发性形成向列相液晶并表现出溶致液晶的特性，具有自组装行为。
2.如权利要求1所述的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，其特征在于，所述丝素蛋白纳米纤维的含量为0.01～20wt％，直径为10～800nm，长度为50nm～200μm；所述自发性形成向列相液晶的条件为温度2～80℃，湿度20～99％；所述结晶区结构的液晶相表现出双折射现象纹影织构，在正交偏振光下呈现了彩虹光；和/或，通过化学交联的方法捕捉所述丝素蛋白纳米纤维的自组装行为。
3.如权利要求1所述的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，其特征在于，所述丝素蛋白纳米纤维的表面整体带有负电荷；所述丝素蛋白纳米纤维的排列在长程范围内的方向具有一致性，在磁场和/或电场作用下，具有均一的取向调控作用；和/或，所述丝素蛋白纳米纤维的蛋白质结构为β折叠结构。
4.如权利要求1-3任一项所述的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液，其特征在于，所述丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液采用丝纤维热处理-碱性水解-离子去除-超声分散的方法制备而成；和/或，所述丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液用去水稀释并密封冷藏后，产生相分离。
5.如权利要求1-3任一项所述的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1.丝纤维热处理：将丝纤维进行水浴热处理；
S2.碱性水解：将S1处理后的丝纤维置于碱性溶液中搅拌直至分散成微纳米纤维；
S3.离子去除：将S2分散后的所述微纳米纤维经离心收集和纯水透析去除离子；
S4.超声分散：将S3透析之后的所述微纳米纤维进行超声分散即可得到丝素蛋白液晶悬浮液。
6.根据权利要求5所述的丝素蛋白液晶悬浮液的制备方法，其特征在于，
S1中，所述水浴热处理中的碱性溶液为弱碱溶液，包括碳酸钠、磷酸钠或碳酸氢钠溶液中的一种或多种的组合；所述生物酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或风味蛋白酶的一种或多种的组合；所述的丝纤维来源为蜘蛛和蚕；蜘蛛包括游猎蜘蛛、结网蜘蛛或洞穴蜘蛛任一种或多种的组合；蚕包括桑蚕、柞蚕、野蚕或转基因蚕任一种或多种的组合；
S2中，所述碱性水解包括将丝纤维置于碱性溶液中搅拌直至所述丝纤维分散为微纳米纤维，搅拌方式包括磁力搅拌、匀质搅拌或涡轮搅拌，搅拌的温度为2～100℃，搅拌时间为2～720h，碱性溶液的质量体积比浓度为0.05～1％，所述丝纤维与所述碱性溶液的浴比为0.1～100g/1L；
所述碱性溶液为氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化锂溶液中的任一种或多种的组合；
S3中，所述离心收集包括将所述为纳米纤维经过离心-纯水悬浮-离心的过程，重复纯水悬浮和离心3-5次后，密封于透析袋中经纯水透析去除离子；所述离心收集的转速为5000～20000rpm，离心时间为5～20min；透析的时间为1-5天，透析袋的截留分子量为3.5～100KDa。
S4中，所述超声分散的功率为50～1000W，超声分散的时间为5～800min。
7.一种聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶，包括将权利要求1-3任一项所述的丝素丝素蛋白纳米纤维悬浮液中加入聚合单体、引发剂和交联剂，经搅拌、冷藏保存后，紫外光照射条件下诱导所述丝素丝素蛋白纳米纤维悬浮液反应生成所述聚丙烯酰胺/蚕丝复合水凝胶。
8.一种丝素蛋白液晶薄膜，将如权利要求1-4任一项所述的丝素蛋白纳米纤维液晶悬浮液室温条件下风干成膜；所述丝素蛋白液晶薄膜为蚕丝各向异性薄膜；正交偏振光下具有彩虹色；所述丝素蛋白纳米纤维的排列具有手性结构特征的螺旋结构。
9.一种丝素蛋白液晶水凝胶，将如权利要求1-4任一项所述的丝素蛋白液晶悬浮液置于盐酸蒸汽中密封保存得到丝素蛋白液晶水凝胶。
10.一种丝素蛋白液晶气凝胶，其特征在于，将如权利要求9所述的水凝胶置于乙醇中进行溶剂交换，冷冻-干燥后得到丝素蛋白液晶气凝胶。
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| US20160033861A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-04 | Tufts University | All water-based nanopatterning |
| CN110845815A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-28 | 厦门大学 | 基于聚丙烯酰胺-丝素蛋白导电水凝胶传感器的制备方法 |
| CN112064133A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-11 | 浙江理工大学 | 一种丝素蛋白纳米纤维晶须的制备方法 |
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