CN115960257A - 靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体，其包含：(1)经优化的抗IL13Rα2scFv序列；(2)经优化的铰链区/间隔区；(3)跨膜区(TM)；(4)CD28共刺激结构域和4‑1BB共刺激结构域；和(5)CD3ζ信号传导结构域。本发明还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、经工程化以表达所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)以及所述经工程化的免疫效应细胞的用途，用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病，例如，胶质瘤。

Description

靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。具体地，本发明涉及经优化的靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体、经工程化以表达本发明的所述经优化的嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、以及所述经工程化的免疫效应细胞的用途，用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病。
背景技术
神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成年人中恶性程度最高的原发性脑肿瘤。目前的标准治疗包括手术切除、放疗和化疗(例如，使用替莫唑胺(temozolomide))，但是，五年总体生存率小于10％。
免疫治疗是一种非常有吸引力的治疗方法，它能改善GBM患者的预后，而且没有化疗或放疗辐射产生的细胞毒性反应。使用抗体或T细胞的过继免疫疗法是目前临床中及实验中最有效的免疫疗法。虽然以树突状细胞疫苗为主的免疫治疗在临床治疗复发和治疗新诊断的GBM患者中已显示出令人鼓舞的结果，能让患者疾病稳定并且增加患者的生存期，但这些临床结果有待进一步的随机临床试验证实，而且已发表的研究文章也表明，它很难在患者体内诱导胶质瘤特异性T细胞。因此迫切需要研究和发展新的免疫治疗方法。
大多数的人类癌症缺乏可预测的、并且充当有效靶标以被T细胞根除的特异性抗原。每一癌细胞类型具有产生不同肿瘤特异性抗原的独特的突变集合。尽管抗原鉴定技术取得了巨大进展，但仍难以鉴别有效独特的抗原，也难以分离合适的TCR用于自体T细胞的转导而实施过继免疫疗法。
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-T cell,CAR-T)免疫疗法是通过转基因技术，使能够特异性识别靶抗原的单克隆抗体单链可变区(scFv)等表达在T细胞表面，同时激活T细胞的胞内活化增殖信号域(CD3ζ链和共刺激分子CD28/4-1BB)，从而使T细胞产生高效的特异性抗肿瘤反应。
CAR-T作为目前最为瞩目的细胞免疫疗法，在美国已有5款药物成功上市(诺华公司的Kymriah、Kite公司的Yescarta和Tecartus、BMS公司的Breyanzi和Abecma)，其最早的受试者Emily Whitedhead(急性淋巴细胞白血病患者)已无瘤生存8年，这重燃起无数肿瘤患者对生的希望。
当前，随着CAR-T技术的快速发展，CAR分子结构已从第一代发展到了第三代，但CAR分子中所包含的特异性识别靶抗原的单克隆抗体单链可变区(scFv)大部分均为鼠源的scFv序列，尤其在治疗GBM方面，尚未出现有效的第三代CAR-T细胞，这使在临床治疗过程中，CAR-T细胞存在发生排斥反应或脱靶现象。另外目前CAR-T研究多以治疗血液系统疾病为主，对于实体瘤的研究较少。
高亲和力白介素-13受体α2(IL13Rα2)由胶质母细胞瘤(GBM)以及若干其它肿瘤类型以高频率选择性地表达。靶向这种肿瘤特异性受体的一种方法是利用缀合到细胞毒性分子的相应配体IL-13。然而，这种方法缺乏特异性，因为结合IL-13的较低亲和力受体IL13Rα1由正常组织广泛地表达。
因此，本领域仍然需要高选择性地特异性靶向IL13Rα2的抗IL13Rα2CAR，以降低CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤的副作用并提高其疗效。
发明概述
本发明的目的是提供一种特异性靶向IL13Rα2的经优化第三代嵌合抗原受体以及经工程化以表达所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病，例如，神经胶质母细胞瘤(GBM)以解决上述现有技术存在的问题。
因此，在第一方面，本发明提供了一种靶向IL13Rα2的经优化嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含：
(1)经优化的抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列KYGVH(SEQ ID NO:15)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDRH1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列VKWAGGSTDTDSALMS(SEQ ID NO:16)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列DHRDAMDY(SEQ ID NO:17)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列TASLSVSSTYLH(SEQ ID NO:18)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:19)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列HQYHRSPLT(SEQ ID NO:20)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
(2)经优化的铰链区/间隔区，其选自
(i)IgG4铰链区(SEQ ID NO 7)，或其具有至少80％的序列同一性的IgG4铰链区；
(ii)CD8铰链区(SEQ ID NO 8)，或其具有至少80％的序列同一性的CD8铰链区。
(3)跨膜区(TM)，其选自
(i)CD28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:9所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(ii)CD4跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:10所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(iii)CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:12所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；和
(ii)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:13所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:14所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体。
在一些实施方案中，本发明的靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体(CAR)多肽包含：
(1)经优化的抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的序列；
(2)经优化的铰链区/间隔区，其选自
(i)IgG4铰链区(SEQ ID NO 7)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的IgG4铰链区；
(ii)CD8铰链区(SEQ ID NO 8)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的CD8铰链区。
(3)跨膜区(TM)，其选自
(i)SEQ ID NO:9所示的CD28跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(ii)SEQ ID NO:10所示的CD4跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(iii)SEQ ID NO:11所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)SEQ ID NO:12所示的CD28共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；和
(ii)SEQ ID NO:13所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为SEQ ID NO:14所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中，本发明的靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体(CAR)多肽包含：
(1)经优化的抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)SEQ ID NO:2所示的重链可变区，和
(ii)SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；
(2)SEQ ID NO 7所示的经优化的铰链区；
(3)跨膜区(TM)，其是SEQ ID NO:9所示的CD28跨膜结构域；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)SEQ ID NO:12所示的CD28共刺激结构域；和
(ii)SEQ ID NO:13所示的4-1BB共刺激结构域；
(5)SEQ ID NO:14所示的CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，本发明的靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体(CAR)多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO:21所示的信号肽序列，
在一些实施方案中，本发明的靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体(CAR)多肽具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列。
在第二方面，本发明提供了编码如本文所述的嵌合抗原受体(CAR多肽)的核酸、包含编码本文所述CAR多肽的核酸的载体、和包含本文所述CAR核酸分子或载体的细胞、或表达本文所述CAR多肽的细胞，优选地，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
在第三方面，本发明提供了一种产生细胞、例如免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码本文所述CAR多肽的核酸分子(例如，RNA分子，例如mRNA分子)，或包含编码本文所述CAR多肽的核酸分子的载体引入(例如转导)免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。
在一些实施方案中，用逆转录病毒将编码本文所述CAR多肽的核酸分子导入原代T细胞中，获得了本发明的CAR-T细胞。
本发明的CAR-T细胞在体外对高表达IL13Rα2的胶质瘤U373细胞和对低表达IL13Rα2的胶质瘤U251细胞均具有显著的杀伤活性且产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子。
本发明的CAR-T细胞还具有体内杀伤肿瘤细胞的功能。在肿瘤细胞异种移植小鼠模型中，本发明的CAR-T细胞具有提高的抗肿瘤活性。
在第四方面，本发明提供了本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞的用途，用于制备在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)或提供抗肿瘤免疫的药物，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
在第五方面，本发明提供了本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞的用途，用于在受试者中治疗与表达IL13Rα2相关的疾病，包括向受试者施用治疗有效量的表达CAR多肽的免疫效应细胞，其中所述与表达IL13Rα2相关的疾病是例如胶质瘤，优选地胶质母细胞瘤。
本发明提供了治疗患有与表达IL13Rα2相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的本发明的表达CAR多肽的免疫效应细胞，例如，其中与表达IL13Rα2相关的疾病是胶质瘤，优选地，是胶质母细胞瘤。
由此，本发明首次采用抗IL13Rα2scFv序列构建第三代CAR-T细胞，证实了其能够通过特异性靶向IL13Rα2来治疗GBM，提高了CAR-T细胞治疗GBM的安全性与有效性，避免了发生排斥反应或脱靶现象，更利于CAR-T的推广与临床应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些优选的实施方案，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的技术方案。
图1为本发明构建的经优化的CAR结构示意图，图中SD表示剪接供体(Splicedonor)；SA表示剪接受体(splice acceptor)；LTR表示长末端重复序列(long terminalrepeat)。在所述构建体中，胞外域包含抗IL13Rα2的经优化的scFv序列和短的IgG4铰链区。
图2为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞单独培养时，对CD107a染色，通过流式细胞术检测CD107a的表达率结果。
图3为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与高表达IL13Rα2的U373细胞株共培养时，对CAR-T细胞实施CD107a染色，通过流式细胞术检测CD107a的表达率结果。
图4为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与低表达IL13Rα2的U251细胞株共培养时，对CAR-T细胞实施CD107a染色，通过流式细胞术检测CD107a的表达率结果。
图5为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U373细胞株或U251细胞株共培养后，对CD107a表达率差异的分析结果。
图6为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞杀伤靶细胞U373细胞株或U251细胞株的实验结果。
图7为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞杀伤靶细胞U373细胞株或U251细胞株的差异分析结果。
图8为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)与IL13Rα2阳性的人GBM细胞株(U373、U251、U87)共培养后，上清液中细胞因子IFN-γ的含量。
图9为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)与IL13Rα2阳性的人GBM细胞株(U373、U251、U87)共培养后，上清液中细胞因子TNF-α的含量。
图10为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U373细胞系共培养后，RTCA检测结果。
图11为靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2的经优化的scFv序列的CAR-T细胞与U251细胞系共培养后，RTCA检测结果。
图12为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)或靶向IL13Rα2的包含SEQ ID NO:24所示IL13的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13-CAR-T”)治疗U251原位动物模型的活体成像结果，其中，在第1天(也简写为D1)向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体注射2×105个U251细胞。在第6天(D6)通过尾静脉注射3×107个CAR-T细胞。
图13为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)或靶向IL13Rα2的包含SEQ ID NO:24所示IL13的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13-CAR-T”)治疗U251原位动物模型的生存周期。实验同图12。
图14为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)或靶向IL13Rα2的包含SEQ ID NO:24所示IL13的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13-CAR-T”)治疗U373原位动物模型的活体成像结果，其中，在第1天(也简写为D1)向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体注射2×105个U373细胞。在第6天(D6)通过尾静脉注射3×107个CAR-T细胞。
图15为经优化的靶向IL13Rα2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)或靶向IL13Rα2的包含SEQ ID NO:24所示IL13的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13-CAR-T”)治疗U373原位动物模型的生存周期。实验同图14。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“嵌合受体”、“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中可互换使用，是指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及胞内信号结构域的重组多肽。
如本文所用的术语“抗IL13Rα2抗体”、“针对IL13Rα2的抗体”、“特异性结合IL13Rα2的抗体”、“特异性靶向IL13Rα2的抗体”、“特异性识别IL13Rα2的抗体”可互换地使用，意指能够与IL13Rα2特异性结合的抗体。特别地，在一些具体实施方案中，意指与人IL13Rα2特异性结合的抗体，特别是与人IL13Rα2特异性结合而不与人IL13Rα1特异性结合的抗体。
术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区任选地借助柔性短多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非另外指出，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。每个重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别由四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些实施方案中，本发明的CAR所包含的针对IL13Rα2的scFv序列是经优化的序列，例如，是对构架区进行了优化的序列。在一些具体实施方案中，对构架区的氨基酸序列进行了优化，从而保留优化后的针对IL13Rα2的scFv序列对IL13Rα2的结合亲和力提高。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作CDR H1、CDR H2和CDR H3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作CDR L1、CDR L2和CDR L3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal ofMolecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(Universityof Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。在本发明中，当提及抗体可变区和具体CDR序列(包括重链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统的编号位置。
尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，6th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。
术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的T细胞表达的分子，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的初级信号传导序列。
术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物，并且“CD3ζ刺激信号结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD3ζ刺激信号结构域”是在SEQID NO:14中提供的序列或其变体。
术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是CD28、4-1BB(即CD137)。共刺激信号结构域是指共刺激分子的胞内部分。
可以通过“转染”、“转化”或“转导”将编码本发明的CAR的核酸序列引入细胞。本文使用的术语“转染”、“转化”或“转导”指通过利用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞。许多转染技术在本领域是已知的，并且其包括，例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如Murray E.J.(编著)，Methods in Molecular Biology，第7卷，Gene Transfer andExpression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。在感染性颗粒于合适的包装细胞(它们中的许多可商购获得)中生长之后，可将噬菌体载体或病毒载体引入宿主细胞。
术语“信号传导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生物化学关系。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括γ-干扰素。
如本文中所用，免疫细胞的“活化”或“激活”是指免疫细胞响应并在可测量的水平上表现出本领域技术人员已知的相应细胞的免疫功能的能力。测量免疫细胞活性的方法也是本领域技术人员已知的。
术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用，是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合，条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中，氨基酸的取代是非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)的取代。可以使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸变化。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过除基因工程化之外的方法(如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法可能是有用的。
术语“保守序列修饰”、“保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的CAR或其组成元件的特征的氨基酸修饰或变化。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的CAR或其组成元件中引入修饰。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR的功能。
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。
如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法，借助所述方法，供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置，所述装置分离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环，例如，通过再输血。因此，在“单采样品”的语境中，指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
“免疫效应功能”、“免疫效应应答”或“免疫效应反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。
术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
术语“T细胞激活”或“T细胞活化”可互换地使用，是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物的表达。本发明的嵌合抗原受体能够诱导T细胞激活。用于测量T细胞激活的合适测定法在实施例中描述，并是本领域中已知的。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0003872030310000111
基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“与表达IL13Rα2相关的疾病”是指由IL13Rα2增加的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何病症。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液肿瘤。
“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的CAR免疫效应细胞用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“有效量”指本发明的CAR免疫效应细胞的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体CAR免疫效应细胞；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。CAR免疫效应细胞的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和CAR免疫效应细胞在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中CAR免疫效应细胞的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价CAR免疫效应细胞抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
II.本发明的经优化的嵌合抗原受体(CAR)
脑胶质瘤是在颅内发病率最高的一类实体肿瘤，其恶性程度高，疗效差，且容易复发，其发病诱因、发病机制及有效治疗方法一直是研究的难点。IL-13受体α链异构体2(IL13Rα2)是IL-13的受体多肽，几乎只在癌细胞中表达，在正常组织细胞中不表达(睾丸除外)，在脑胶质瘤细胞表面存在高表达，并在脑胶质瘤恶性增殖的过程中起着重要的作用。在GBM患者中，有50％以上的患者表达IL13Rα2，使其成为CAR-T治疗GBM的有效靶点(SharmaP,Debinski W.Receptor-Targeted Glial Brain Tumor Therapies.Internationaljournal of molecular sciences.2018；19(11))。
本发明涉及靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体(CAR)多肽。嵌合抗原受体(CAR)是一种重组多肽，其至少包含胞外识别域、跨膜区和胞内信号传导域。本发明CAR多肽的胞外识别域(也简称为“胞外域”)是特异性识别并结合靶细胞表面上的IL13Rα2的经优化的抗IL13Rα2scFv序列。由于所述CAR可以既结合抗原又转导T细胞激活，且所述T细胞激活是不依赖于MHC限制的，因此，CAR能够用于治疗抗原阳性的肿瘤患者，不论该肿瘤患者HLA基因型如何。使用CAR的淋巴细胞的过继性免疫疗法可以是用于治疗癌症的强大治疗策略。
本发明靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体(CAR)多肽包含：
(1)经优化的抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列KYGVH(SEQ ID NO:15)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDRH1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列VKWAGGSTDTDSALMS(SEQ ID NO:16)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列DHRDAMDY(SEQ ID NO:17)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列TASLSVSSTYLH(SEQ ID NO:18)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:19)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列HQYHRSPLT(SEQ ID NO:20)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
(2)经优化的铰链区/间隔区，其选自
(i)IgG4铰链区(SEQ ID NO 7)，或其具有至少80％的序列同一性的IgG4铰链区；
(ii)CD8铰链区(SEQ ID NO 8)，或其具有至少80％的序列同一性的CD8铰链区。
(3)跨膜区(TM)，其选自
(i)CD28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:9所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(ii)CD4跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:10所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(iii)CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:12所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；和
(ii)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:13所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:14所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体；
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代；
在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体的胞外域是特异性结合IL13Rα2的经优化的抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
当本发明的CAR在免疫效应细胞(如，T细胞、NK细胞)表面上表达时，CAR的胞外域(即，经优化的抗IL13Rα2scFv序列)使得其能够将免疫效应细胞(如，T细胞、NK细胞)特异性导向表达IL13Rα2的那些细胞，例如，所述表达IL13Rα2的细胞是肿瘤细胞(包括神经胶质瘤细胞)。
在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中包含的跨膜结构域是锚定的跨膜结构域，其是能够整合在细胞膜中的多肽链的组成部分。跨膜结构域可以与其他胞外和/或胞内多肽结构域融合，由此，这些胞外和/或胞内多肽结构域也将被限制在细胞膜上。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着。本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域，其可以衍生自天然来源或重组来源，包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在天然来源的情况下，跨膜结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白例如CD4、CD28、CD8(例如，CD8α，CD8β)的跨膜结构域。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的跨膜结构域是CD4跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。例如，所述CD4跨膜结构域是SEQ ID NO:10所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。例如，所述CD8跨膜结构域是SEQ ID NO:11所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。例如，所述CD28跨膜结构域是SEQ ID NO:9所示的序列。
在一个实施方案中，包含CD28跨膜结构域的特异性结合IL13Rα2的CAR-T细胞具有极好的体内抗GBM活性。
在一些实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区(即，抗IL13Rα2scFv序列)连接。可以使用多种不同的铰链区/间隔区。在一些实施方案中，铰链区/间隔区包含整个或部分的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区，即，落在免疫球蛋白的CH1和CH2结构域之间的序列，例如，IgG4 Fc铰链或CD8铰链。一些铰链区/间隔区包含免疫球蛋白CH3结构域或CH3结构域和CH2结构两者。免疫球蛋白来源的序列可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如，1、2、3、4或5个取代，例如，减少脱靶结合的取代。
在一个实施方案中，所述铰链区/间隔区是IgG铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体，例如，IgG4铰链区或其具有1-2个氨基酸修饰的变体。
在一些优选的实施方案中，为了使本发明的CAR-T细胞与表达IL13Rα2的靶细胞处于最佳的细胞间距离，从而有利于免疫突触形成，且增强CAR信号，对所述铰链区/间隔区的长度进行了优化，发现针对IL13Rα2而言，短的铰链区/间隔区(例如，SEQ ID NO:7所示的IgG4铰链区)比长的铰链区/间隔区更容易激活CAR-T。
另外，SEQ ID NO:7所示的IgG4铰链区没有保留IgG4的重链恒定区2，因此，不具有结合Fc受体(例如，FcγR)的能力，从而避免了CAR-T细胞的脱靶激活。
本发明的CAR中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个效应功能。
用于本发明CAR中的胞内信号结构域的例子包括协同发挥作用以在胞外结构域结合IL13Rα2后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
考虑到仅通过TCR生成的信号尚不足以完全活化T细胞，因此本发明的CAR还设计了能够产生共刺激信号的共刺激信号结构域(CSD)。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含初级胞内信号结构域，例如，CD3ζ的初级信号结构域，例如，SEQ ID NO:14所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体，其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
本发明CAR中的胞内信号结构域还包含次级信号结构域(即，共刺激信号结构域)。共刺激信号结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外免疫效应细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。在一些实施方案中，共刺激分子包括但不限于CD28、4-1BB(CD137)、OX40，其引起的共刺激作用在体外增强人CAR T细胞的增殖、效应功能和存活并且在体内增进人T细胞的抗肿瘤活性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的共刺激信号结构域是CD28共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体中的共刺激信号结构域是4-1BB共刺激结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，其具有1-5个氨基酸修饰的变体。所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一个实施方案中，本发明CAR的胞内区包含与CD3ζ串联的多个共刺激结构域，如CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域，当所述CAR在免疫效应细胞(如，T细胞、NK细胞)表面上表达时，所述CAR使得T细胞能够接受共刺激信号。
在本发明CAR的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或按指定的顺序连接。任选地，短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。
在一个优选的实施方案中，本发明CAR的胞内信号结构域设计成包含CD28的共刺激信号结构域、4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。
本领域普通技术人员将理解，本发明的CAR多肽还可以进行修饰，从而在氨基酸序列上变动，但是在所需的活性方面不变动。例如，可以对CAR多肽进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸置换的额外氨基酸置换。例如，可以将分子中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以将一个氨基酸片段替换为结构上相似的片段，所述的片段在侧链家族成员的顺序和组成方面中不同，例如，可以进行保守性置换，其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。
本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一些实施方案中，本发明也构思了产生功能上等同的CAR多肽分子。
III.编码本发明的CAR的核酸分子、载体和表达本发明CAR的细胞
本发明提供了编码本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子作为DNA构建体提供。
可以使用本领域公知的重组方法获得编码本发明CAR的构建体。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非通过基因重组方法产生目的核酸。
本发明还提供了插入有本发明CAR构建体的载体。通过将编码CAR多肽的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将本发明CAR构建体插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。例如，将本发明CAR构建体的核酸序列克隆至慢病毒载体中，以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并用EF1α启动子用于表达。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。
在一些实施方案中，本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞(例如哺乳动物T细胞或哺乳动物NK细胞)中表达本发明的CAR构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。
从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如FicollTM分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。
可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如
Figure BDA0003872030310000181
M-450 CD3/CD28 T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一些实施方案中，该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。
可以用抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集，其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如经工程化，从而它在其表面上不表达任何功能性TCR；经工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如，经工程化，从而它不表达或显示出减少表达的TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)；或经工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达实现HLA的下调。
在一些实施方案中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA，例如，HLA I类和/或HLA II类。
在一个实施方案中，对编码本发明所述的CAR的核酸转导的细胞进行增殖，例如，将细胞在培养下增殖2小时至约14天。
对经体外增殖后获得的表达CAR的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。
在一些实施方案中，即使肿瘤细胞上的IL13Rα2肿瘤抗原密度非常低，本发明的CAR-T细胞也能维持对表达IL13Rα2的肿瘤的杀伤活性。
在一些实施方案中，本发明的靶向IL13Rα2的经优化的第三代嵌合抗原受体(CAR)多肽由于其高选择性地特异性靶向IL13Rα2而具有极佳的安全性和体内抗GBM活性。
IV.表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞的用途和使用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞的治疗方法
T细胞治疗首次应用于血液学B细胞恶性肿瘤的治疗，并显示出有效和令人鼓舞的结果。然而，CAR-T细胞治疗实体瘤的抗肿瘤活性有限，尚处于实验阶段。同时，在实体瘤中副作用的发生和低效性也逐渐成为一个挑战。本发明通过优化CAR构建体的结构，获得了表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞，其用于在受试者中治疗与表达IL13Rα2相关的实体瘤，例如，胶质瘤。
在一些实施方案中，工程化改造T细胞(例如患者特异的自体T细胞)以表达本发明的CAR多肽。通过扩增所述工程化改造的T细胞后，将其用于过继细胞治疗(ACT)。可以使用多种T细胞亚群表达本发明的CAR多肽。
在一些实施方案中，在利用表达本发明的CAR多肽的免疫效应细胞治疗患者时，所述免疫效应细胞可以是自体T细胞或同种异体T细胞。在一些实施方案中，所用的T细胞是CD4+和CD8+中央记忆型T细胞(TCM)，其是CD45RO+CD62L+，并且使用此类细胞相比于使用其他类型的患者特异性T细胞可以提高过继性转移后细胞的长期存活。
在一些实施方案中，工程化改造其他免疫细胞(例如，NK细胞)以表达本发明的CAR多肽。通过扩增所述工程化改造的其他免疫细胞(例如，NK细胞)后，将其用于过继细胞治疗(ACT)。
在一个实施方案中，表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞用于在受试者中治疗表达或过表达IL13Rα2的癌症，并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。
本发明提供了在受试者中治疗与表达IL13Rα2相关的疾病(例如，表达或过表达IL13Rα2的癌症)的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞。
本发明提供了前述表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞在制备用于治疗与表达IL13Rα2相关的疾病(例如，表达或过表达IL13Rα2的癌症)的药物中的用途。
表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞也可以施用于已经用一种或多种先前疗法治疗癌症但随后复发或转移的个体。
在一些实施方案中，表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)用于胃肠外、经皮、腔内、动脉内、静脉内、鞘内施用，或直接注入组织或肿瘤中。
表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体重、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、和待并行施用的其他药物。
在一些实施方案中，表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)以1×106个－1×1012个免疫效应细胞、优选地1×107个－1×1010个免疫效应细胞、例如5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个免疫效应细胞的剂量以单次或多次肠胃外施用，优选为静脉内施用。
在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞导致肿瘤的完全消失。在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞导致肿瘤细胞或肿瘤大小减少至少85％或更多。可以通过本领域已知的任何方法测量肿瘤的减少，例如X-线、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、细胞学、组织学或分子遗传分析。
本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例
一般方法：
除非另外说明，本发明的实施将利用本领域技术人员已知并可获得的细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学、动物学、病毒学和免疫学的常规技术。这类技术在如下文献中描述：Molecular Cloning:A laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,2001)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(P.Herdewijn编著,2004)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编著,1987)；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编著,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编著,1991)；和ShortProtols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)。除非另外规定，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
细胞系
人GBM细胞系U251、U373、U87及逆转录病毒包装细胞系PG13和Phoenix ECO购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。U251细胞和U373细胞通过逆转录病毒转导表达绿色荧光蛋白(GFP)基因和萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase，LUC)报告基因(有时也简写为“GL”))。GBM细胞系在含有10％胎牛血清(FBS，Biosera)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(EallBio Life Sciences)的DMEM培养基(Lonza)中良好培养。逆转录病毒产生细胞系在不含青霉素和链霉素的含10％FBS的DMEM培养基中培养。
流式细胞术分析
使用BD FacsCanto II Plus仪器(BD Biosciences)进行流式细胞术检测，利用FlowJo v.10软件(Tree star，Inc.Ashland，OR)对流式结果进行分析。所用抗体具体如下：anti-human CD3-APC-R700抗体(BD Bioscience)，anti-human-CD4-V450(BDBioscience)，anti-human-CD8-PE-Cy7(BD Bioscience)，anti-human IL13Ra-APC(BDBioscience)和羊抗鼠IgG-APC(Sigma)。
脱颗粒实验
CAR-T细胞与靶细胞按E:T＝10:1进行共培养，加入适量的anti-human CD107a-APC(BD Biosciences)和封闭剂(eBioscienceTMProtein Transport Inhibitor Cocktail,Invitrogen)，共培养6h后，收集细胞，制备单细胞悬液，加入anti-human-CD3-APC-R700抗体，避光孵育，用PBS洗涤细胞，然后用含有1％FBS的PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测T细胞的脱颗粒情况。
细胞杀伤实验
CAR-T细胞与靶细胞(例如，U251细胞系或U373细胞系)按E:T＝10:1共培养24h，流式细胞术检测对靶细胞的杀伤情况。
细胞因子产生的测定
CAR-T细胞与人GBM细胞系(U373、U251、U87)以E:T＝10:1的比例共培养24小时。使用商业化的流式细胞仪珠阵列(CBA)试剂盒(BD Biosciences)检测来自共培养细胞的上清液中人干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL17A、IL4、IL6和IL10的表达情况，具体操作步骤根据试剂盒的说明书进行。
实时细胞分析(RTCA)
使用xCELLigence RTCA系统(瑞士巴塞尔罗氏应用科学公司)评估CAR T细胞的增殖/细胞毒性。本系统基于一个电阻抗读数的金板传感器电极，位于细胞毒性板(E-16板)的底部。首先，将靶细胞U251-GL或靶细胞U373-GL按每孔1×104个细胞接种于E-16板中。24h后，在E-16平板上加入1×105个CAR-T细胞，与人GBM细胞共同孵育，每15min监测一次，得到48小时的细胞指数。每一个独立的实验分三次进行。利用RTCA软件自动计算区间斜率，评价细胞指数的变化率。为了证明处理的效果，在标准化时间点将细胞指数标准化为相等的值。
通过颅内注射胶质瘤细胞构建原位异种移植小鼠模型
实验所用小鼠为6-8周龄的NOD-SCID小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体分别注射2×105个U251-GL细胞和U373-GL细胞，构建原位异种移植小鼠模型，记为第1天。在第6天，通过尾静脉注射3×107个CAR-T细胞。使用小动物成像仪器(IVIS，Xenogen，Alameda，CA，USA)监测肿瘤的发展，当肿瘤直径达到20mm时处死小鼠。动物实验经北京世纪坛医院伦理委员会批准通过。
统计分析
使用GraphPadPrism7软件(GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行数据分析。数据以平均值±SEM表示，采用非配对t检验来评估差异。采用Kaplan-Meier法测定GBM异种移植小鼠的总存活率，并采用Cox比例风险回归分析进行组间比较。P<0.05为有统计学意义。
实施例1.IL13Rα2特异性CAR逆转录病毒载体的构建和逆转录病毒上清液的制备
使用逆转录病毒载体构建了图1所示的靶向IL13Rα2的包含针对IL13Rα2的经优化的scFv序列的CAR。
靶向IL13Rα2的CAR包含位于胞外结构域的经优化的抗IL13Rα2scFv序列、经优化的IgG4铰链区、CD28跨膜区、位于胞内部分的CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
采用Thermo公司的GeneArt基因合成技术，合成编码抗IL13Rα2scFv序列的核苷酸序列，其从N端至C端为SEQ ID NO:1所示的抗体重链可变区VH核苷酸序列、编码SEQ ID NO:5所示接头的核苷酸序列和SEQ ID NO:3所示的抗体轻链可变区VL核苷酸序列。
将编码SEQ ID NO:7所示的IgG4铰链区、SEQ ID NO:9所示的CD28跨膜结构域、SEQID NO:12所示的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO:13所示的4-1BB共刺激结构域和SEQ IDNO:14所示的CD3ζ信号传导结构域的核苷酸序列连接入逆转录病毒载体SFG(Addgene公司，也称为“载体pMSGV1”)，获得载体retro-SFG-IgG4-CD28-4-1BB-CD3ζ，用SmaⅠ/MluⅠ双酶切，然后利用克隆技术将编码抗IL13Rα2scFv序列的核苷酸序列连接至该载体，37℃连接1h后，转化涂于氨苄抗性LB平板上，通过挑选亚克隆、抽提质粒、酶切验证后测序鉴定重组载体，构建出第三代CAR-T的逆转录病毒载体retro-SFG-IL13Rα2scFv-IgG4-CD28-4-1BB-CD3ζ(如图1所示)。
使用所构建的IL13Rα2特异性CAR逆转录病毒载体，进行病毒包装。具体而言，将逆转录病毒载体retro-SFG-IL13Rα2scFv-IgG4-CD28-4-1BB-CD3ζ通过磷酸钙试剂共转染至PG13细胞，转染后48h换液，收取培养上清，72h后再次收取培养上清，过0.45μm 
Figure BDA0003872030310000231
针式滤器，获得逆转录病毒原液。
将病毒原液4℃、32000r/min超速离心2h，将逆转录病毒沉淀溶解在X-VIVO培养液中。获得逆转录病毒浓缩液，分装后-80℃冻存。
对逆转录病毒浓缩液进行了滴度检测。96孔尖底板每孔铺0.5×106个Jurkat细胞，200μL/孔，将逆转录病毒浓缩液稀释100倍，按1:50、1:500和1:2000的比例加入各孔400μL、40μL和10μL。32℃、1200×g离心90min。4h后用DPBS将细胞洗一次后铺于12孔板，转导48h后通过流式细胞术检测。结果表明，本实施例制备的逆转录病毒浓缩液稀释100倍后能够感染Jurkat细胞并表达CAR，因此，使用所述逆转录病毒浓缩液实施了CAR-T细胞的产生。
实施例2.包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞的产生
在本实施例中，使用实施例1收获的逆转录病毒浓缩液转导T细胞，由此制备CAR-T细胞。
首先，用淋巴细胞分离液(GE-healthcare)通过梯度离心法分离健康捐赠者外周血中的单个核细胞(PBMC)。用抗CD3/CD28 T细胞激活剂Dynabeads(Invitrogen)刺激PBMC中的T细胞。刺激48小时后，用实施例1的逆转录病毒浓缩液转染T细胞。逆转录病毒转染实验参照磷酸钙转染试剂盒(Sigma)的说明书进行。在第7天，使用流式细胞术检测转染的T细胞中CAR表达阳性率。在含有5％人AB血清(SIGMA)、100U/ml IL-2、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(EallBio Life Sciences)的X-VIVO-15培养基中培养CAR-T细胞。本研究由北京世纪坛医院机构评审委员会批准，并获得所有参与者的知情同意。
结果表明，用实施例1制备的逆转录病毒转导来自健康供体的并经CD3/CD28抗体活化的T细胞，7天后用FACS分析检测基因修饰的T细胞，T细胞表面稳定表达包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR。
实施例3.包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞的脱颗粒能力检测
CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果可以通过CAR-T细胞的脱颗粒能力，即，CD107a的表达来检测。
实施例2产生的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒，如穿孔素、颗粒酶等。溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)也称为CD107a是细胞脱颗粒的标志物，在肿瘤细胞的刺激下，CD107a的表达与实施例2产生的CAR-T细胞介导的靶细胞裂解相关。
将实施例2产生的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U373及U251两种神经胶质母细胞瘤(GBM)细胞株按E:T＝10:1进行共培养6h后，用流式细胞仪检测所述CAR-T细胞的CD107a的表达率，所述CD107a表达率与CAR-T细胞的杀伤活性呈正相关。
结果显示，包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞单独培养时CD107a的表达率为0％(图2)；包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U373细胞株共培养时CD107a表达率为3.7％(图3)；包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U251细胞株共培养时CD107a表达率为2％(图4)；所述CAR-T细胞与U373细胞株或U251细胞株共培养后CD107a的表达率均显著高于单独培养的所述CAR-T细胞，且所述CAR-T细胞与U373细胞株共培养组(图5中表示为“CAR-T+U373”)和所述CAR-T细胞与U251细胞株共培养组(图5中表示为“CAR-T+U251”)之间不具有显著性差异(图5中，“NS”表示“无显著性差异”；＊表示P<0.05，有显著性差异)。
实施例4.包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果
将实施例2的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U373、U251细胞株按E:T＝10:1共培养24h后，流式细胞术检测所述CAR-T细胞对U373细胞株、U251细胞株的杀伤情况。
结果如图6所示，与所述CAR-T细胞共培养24h后，U373细胞的细胞数由91.4％降到了5.1％，杀伤效率为94.42％；U251细胞的细胞数由48.3％降到了1.7％，杀伤效率为96.48％。
另外，由图7可见，所述CAR-T细胞对U373细胞株的杀伤效率与所述CAR-T细胞对U251细胞株的杀伤效率之间无显著性差异，杀伤效率均在90％以上(图7中，“NS”表示“无显著性差异”)。
实施例5.测定包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞产生的细胞因子
包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与IL13Rα2阳性的人GBM细胞株(U373、U251、U87细胞)以E:T＝10:1的比例分别共培养24小时后，采用CBA法对培养上清液中的干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行检测，其中所述IFN-γ、TNF-α与CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力呈正相关。
结果分别如图8和图9所示，表明了包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)与U373、U251、U87细胞株共培养后，上清液中IFN-γ、TNF-α均显著升高，且与对照组CD19-CAR-T细胞具有统计学显著性差异(P＜0.05)，其中所述对照CD19-CAR-T细胞的制备类似于实施例1和实施例2，不同之处仅在于用SEQ ID NO:23所示的抗CD19 scFv序列替换掉抗IL13Rα2scFv序列。
采用RTCA实时细胞分析仪(real-time cell analyzer)进行肿瘤细胞的细胞生长分析。检测板E-Plate 16的底部整合有微金电子传感器芯片，当生长在微电极表面的肿瘤细胞引起电极界面阻抗的改变时，该阻抗值的变化直接反映细胞的生长。
图10和图11显示了RTCA法检测的肿瘤细胞的细胞生长结果，体外评价了包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞的抗肿瘤能力。
如图10所示，U373肿瘤细胞对照组(△线)随着时间的延长，肿瘤细胞数显著升高；包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U373肿瘤细胞共培养组(○线)在共培养20h后，肿瘤细胞数显著下降，所述CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤显著。
如图11所示，U251肿瘤细胞对照组(△线)随着时间的延长，肿瘤细胞数显著升高；包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞与U251肿瘤细胞共培养组(○线)在共培养20h后，肿瘤其细胞数显著下降，所述CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤现象显著。
因此，本发明的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞均显著抑制U373和U251肿瘤细胞生长，具有明显的抗肿瘤活性。
实施例6.包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞的小鼠体内抗肿瘤作用
首先，通过颅内注射胶质瘤细胞构建了原位异种移植小鼠模型。
胶质瘤细胞系U373和U251细胞表面表达IL13Rα2。使用胶质瘤细胞系U373和U251细胞构建了原位异种移植小鼠模型。具体而言，实验所用小鼠为六到八周龄的NOD-SCID小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。向雌性NOD-SCID小鼠右脑纹状体分别注射2×105个U251-GL细胞或U373-GL细胞(记为第一天，也简写为D1)。在第六天(即，D6)通过尾静脉注射3×107个实施例2制备的包含抗IL13Rα2scFv序列的CAR-T细胞(图中缩写为“IL13Rα2-CAR-T”)。
实验设置了阳性对照组，使用的是IL13-CAR-T。所述阳性对照IL13-CAR-T细胞的制备类似于实施例1和实施例2，不同之处仅在于用SEQ ID NO:24所示的IL13序列替换掉抗IL13Rα2scFv序列。
使用小动物成像仪器(IVIS，Xenogen，Alameda，CA，USA)通过检测荧光信号观察肿瘤生长情况，由此监测肿瘤的发展，当肿瘤直径达到20mm时处死小鼠。动物实验经北京世纪坛医院伦理委员会批准通过。
i)对于U251-GL生成的异种移植模型小鼠
如图12和图13所示，阳性对照组IL13-CAR-T治疗U251原位动物模型的最长生存周期为34天，而经本发明的IL13Rα2-CAR-T治疗的小鼠最长生存周期为50天。
ii)对于U373-GL生成的异种移植模型小鼠
如图14和图15所示，阳性对照组IL13-CAR-T治疗U373原位动物模型的最长生存周期为60天，而经本发明的IL13Rα2-CAR-T治疗的小鼠最长生存周期为64天。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
序列表
Figure BDA0003872030310000261
Figure BDA0003872030310000271
Figure BDA0003872030310000281

Claims (11)

1.一种靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含：
(1)抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列KYGVH(SEQ ID NO:15)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列VKWAGGSTDTDSALMS(SEQ ID NO:16)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列DHRDAMDY(SEQ ID NO:17)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列TASLSVSSTYLH(SEQ ID NO:18)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:19)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列HQYHRSPLT(SEQ ID NO:20)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)IgG4铰链区(SEQ ID NO 7)，或其具有至少80％的序列同一性的IgG4铰链区；
(ii)CD8铰链区(SEQ ID NO 8)，或其具有至少80％的序列同一性的CD8铰链区；
(3)跨膜区(TM)，其选自
(i)CD28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:9所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(ii)CD4跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:10所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(iii)CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:12所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；和
(ii)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:13所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:14所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体。
2.根据权利要求1所述的CAR多肽，其从N端到C端包含：
(1)抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列KYGVH(SEQ ID NO:15)所示的CDR H1；
(b)氨基酸序列VKWAGGSTDTDSALMS(SEQ ID NO:16)所示的CDR H2；和
(c)氨基酸序列DHRDAMDY(SEQ ID NO:17)所示的CDR H3；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列TASLSVSSTYLH(SEQ ID NO:18)所示的CDR L1；
(e)氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:19)所示的CDR L2；和
(f)氨基酸序列HQYHRSPLT(SEQ ID NO:20)所示的CDR L3；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)IgG4铰链区(SEQ ID NO 7)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的IgG4铰链区；
(ii)CD8铰链区(SEQ ID NO 8)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的CD8铰链区；
(3)跨膜区(TM)，其选自
(i)SEQ ID NO:9所示的CD28跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(ii)SEQ ID NO:10所示的CD4跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(iii)SEQ ID NO:11所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)SEQ ID NO:12所示的CD28共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；和
(ii)SEQ ID NO:13所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为SEQ ID NO:14所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
3.根据权利要求2所述的CAR多肽，其包含：
(1)抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
例如，(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的序列，和
(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的序列；
(2)铰链区/间隔区，其选自
(i)IgG4铰链区(SEQ ID NO 7)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的IgG4铰链区；
(ii)CD8铰链区(SEQ ID NO 8)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的CD8铰链区；
(3)跨膜区(TM)，其选自
(i)SEQ ID NO:9所示的CD28跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(ii)SEQ ID NO:10所示的CD4跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(iii)SEQ ID NO:11所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)SEQ ID NO:12所示的CD28共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；和
(ii)SEQ ID NO:13所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为SEQ ID NO:14所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体；
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
4.根据权利要求3所述的CAR多肽，其包含：
(1)抗IL13Rα2scFv序列，其中所述scFv序列特异性结合IL13Rα2且包含：
(i)SEQ ID NO:2所示的重链可变区，和
(ii)SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；
(2)SEQ ID NO 7所示的铰链区；
(3)跨膜区(TM)，其是SEQ ID NO:9所示的CD28跨膜结构域；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其是：
(i)SEQ ID NO:12所示的CD28共刺激结构域；和
(ii)SEQ ID NO:13所示的4-1BB共刺激结构域；
(5)SEQ ID NO:14所示的CD3ζ信号传导结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CAR多肽，其还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO:21所示的信号肽序列，
优选地，所述CAR多肽具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列。
6.编码权利要求1-5中任一项所述的CAR多肽的核酸分子。
7.载体，其包含权利要求6所述的核酸分子，例如，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
8.细胞，其包含权利要求1-5中任一项所述的CAR多肽、权利要求6所述的核酸、或权利要求7所述的载体，所述细胞是例如免疫效应细胞，例如，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞、NK细胞是自体T细胞、NK细胞或同种异体T细胞、NK细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。
9.制备权利要求8的细胞的方法，包括用权利要求7所述的载体导入所述细胞，例如，自人PBMC分离T细胞、NK细胞，用权利要求7所述的载体转导所述分离的T细胞、NK细胞。
10.权利要求8所述的细胞的用途，用于制备在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)或提供抗肿瘤免疫的药物组合物，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
11.治疗患有与表达IL13Rα2相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的权利要求8所述的细胞，例如，其中与表达IL13Rα2相关的疾病是胶质瘤，优选地，是胶质母细胞瘤。
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