CN115956502A - 玫瑰黄链霉菌ln33在促进烟草生长发育方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玫瑰黄链霉菌LN33在促进烟草生长发育方面的应用，属于农业微生物技术领域，本发明通过在烟草育苗基质中拌入所述菌株发酵液，使烟草种子快速萌发、烟苗长势一致、提高了烟苗的农艺性状和育苗效率，同时，LN33菌株发酵液能显著促进MS培养基培养下烟苗的生长发育，进一步说明LN33菌株对烟苗的促生作用，可为烟草生产中施用生防菌剂及生物菌肥提供理论依据。

Description

玫瑰黄链霉菌LN33在促进烟草生长发育方面的应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及玫瑰黄链霉菌LN33在促进烟草生长发育方面的应用。

背景技术

20世纪90年代以来，可持续发展逐渐成为世界大多数国家的基本发展战略，农业可持续发展也成为各国首先重视的课题。为克服传统农业生产力水平较低，集约化农业造成的环境污染、生态失衡等弊病，世界各国陆续开始了生态农业的研究和探索，以保护现有的生态环境，修复以前被破坏的生态环境，为人类提供健康的农产品。

化肥是农业生产过程中作物增产的重要贡献因子，但随着化肥的持续多年施用，特别是过量施肥，土壤中养分配比不合理，同时土壤有机质得不到及时补充，导致了严重的土壤问题，其中土壤微生物菌群种类与数量的减少是一个不可忽视的问题。微生物菌肥是指含有特定微生物活体且能应用于农业生产的制品，其通过微生物的生命活动促使作物健康生长、抗逆性增强、产量提高，在改善土壤微观环境、提高化肥利用率等方面的作用日益受到人们的关注。

我国是一个烟草大国，烟草作为我国重要的经济作物之一，其种植面积和总产量位居世界第一位。自20世纪50年代末期，我国烟草品质有所下降，主要表现是烟叶薄、油润差、香气不足、劲头小等。链霉菌隶属于原核生物界、放线菌目（ Actinobacterales ）链霉菌科（ Streptomycetaceae），是具有非常复杂生命周期的革兰氏阳性菌。链霉菌以菌丝体的形式定殖于多种植物体的根、茎、叶等部位而发挥功能。链霉菌属也是一类重要的生防菌，其次级代谢产物不仅能产生各种抗生素，而且能产生植物激素类物质。相关研究表明链霉菌可抑制烟草上的多种病原菌，如炭疽病原菌、赤星病菌、花叶病毒等，其次生代谢产物也对烟草的生长具有一定的促进作用。烟草种子萌发和幼苗生长是烟草优质高产栽培的基础，提高种子萌发率，增强幼苗生长能力对提高烟叶质量意义重大。

发明内容

育苗是烟草生产中的关键环节之一，培育壮苗是生产优质烟叶的基础。但在育苗的过程中往往存在着种子萌发缓慢、萌发后烟苗长势不整齐，烟苗素质相对较弱，移栽大田之后缓苗期长等问题。针对上述问题，本发明的目的一在于玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces  roseoflavus ）LN33在促进烟草生长发育方面的应用，目的二在于提供一种烟草育苗促进剂，目的三在于提供一种烟草育苗基质的拌菌方法，目的四在于提供一种促进烟草生长发育的方法。本发明通过在烟草育苗基质中拌入LN33菌株发酵液，使烟草种子快速萌发、烟苗长势一致、提高了烟苗的农艺性状和育苗效率，同时，LN33菌株发酵液能显著促进MS培养基培养下烟苗的生长发育，进一步说明LN33菌株对烟苗的促生作用。

为实现上述目的，本发明采用的具体方案如下：

本发明的第一方面是请求保护玫瑰黄链霉菌LN33在促进烟草生长发育方面的应用。

本发明的第二方面是请求保护一种烟草育苗促生剂，所述烟草育苗促生剂包含所述玫瑰黄链霉菌LN33。

本发明的第三方面是请求保护一种烟草育苗基质的拌菌方法，包括以下步骤：

步骤一、拌菌：制备玫瑰黄链霉菌LN33的发酵液；在装盘播种前3至7天前，将所述发酵液拌入烟草育苗基质中，拌菌量为所述烟草育苗基质重量的5‰～6‰，拌菌后基质整体含水量保持在30%；

步骤二、堆置发酵：在堆置场地事先铺设防渗膜，将经步骤一混拌均匀的基质堆制在防渗膜上，基质堆制高度在1.2～1.5 m、宽度在2～3 m、长度在3～4 m；其中，长型堆在上方每隔20～30 cm用木棒扎孔，锥形堆在堆高三分之二处斜向内扎孔。

优选地，步骤一所述发酵液的制备方法为：首先将玫瑰黄链霉菌LN33菌株进行活化，然后接种于大豆酵母液体培养基中，然后在温度28℃、转速170 rmp条件下震荡培养8～9 d。作为更进一步地优选，将玫瑰黄链霉菌LN33划线接种于高氏1号培养基中，28℃下培养5~7天，进行活化；用打孔器在已经活化号的培养基上打取菌饼接种于大豆酵母液体培养基中，接种量为：每150mL 大豆酵母液体培养基接种5~7块菌饼。

本发明的第四方面是请求保护一种促进烟草生长发育的方法，所述方法采用以下任意一种方式进行：

方式一：将烟草种子经灭菌后接种于MS培养基中进行萌发培养；将烟草黄链霉菌LN33发酵液稀释成10⁶ cfu/mL的菌体悬浮液，以每株烟草苗吸取500 μL菌体悬浮液进行烟苗根部接种，然后继续培养；

方式二：采用上述拌菌方法对烟草育苗基质进行拌菌处理，获得拌菌基质；将所述拌菌基质置于穴盘中，每穴点播1~2粒烟草种子，进行培养。

有益效果：本发明提供一种促生烟草玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces roseoflavus）LN33菌株及发酵液，用于促进烟苗生长的应用。将菌株发酵液拌入烟草漂浮育苗基质中，能明显提高烟草种子萌发速度，促进烟草幼苗根的发育，增强烟苗的叶宽、叶长、株高、使烟苗长势一致，同时，LN33菌株发酵液能显著促进MS培养基培养下烟苗的生长发育，进一步说明LN33菌株对烟苗的促生作用，实际应用中有助于提高烟草的农艺性状，减少化学肥料使用。

附图说明

图1为LN33菌株在高氏1号培养基上的菌落形态正面观；

图2为LN33菌株在高氏1号培养基上的菌落形态背面观；

图3为LN33菌株的系统发育树；

图4为LN33发酵液对MS培养基培养下烟苗生长28天的促生效果（a为不加菌液的对照组，b为加菌液处理组）；

图5为LN33发酵液拌入基质对烟苗生长35天的促生效果（c为不加菌液的对照组，b为基质拌菌处理组）。

具体实施方式

本发明提供了一种促进烟苗生长发育的玫瑰黄链霉菌LN33菌株及其应用方法，主要试验材料有：试验烟草品种：豫烟13；烟苗促生菌株：玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces  roseoflavus），该菌株的保藏编号为CGMCC No：4.7514，命名为：LN33。均由河南科技大学植物病害分子鉴定与绿色防控实验室提供。育苗基质：烟草漂浮育苗专用基质；聚氯乙烯泡沫育苗盘，规格：660 mm×340 mm×50 mm，穴数：20×10，孔径：25mm×25 mm×45mm，均为普通市售。

本申请所述的玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces roseoflavus）LN33已在现有文献中公开，公开文献为：陈奇园，丁钥琪，赵世民，李淑君，康业斌.洛阳烟区烟株根围抗烟草疫霉放线菌的筛选与鉴定.烟草科技,2019-01.

具体实施步骤如下：

①LN33菌株活化。将实验室内保存的玫瑰黄链霉菌LN33菌株用高氏1号培养基采用平板划线法进行活化。接种时用经火焰灭菌的接种针沾取保存于平板上的玫瑰黄链霉菌LN33菌落，然后在高氏1号培养基上用接种针进行划线接种，接种完成后将其放入28℃恒温培养箱中，培养5～7天。

②LN33菌落形态观察。在高氏1号培养基上接种培养LN33菌株，28℃，倒置培养7天后观察菌落形态，观察到气生菌丝为淡粉红或淡粉微黄，基内菌丝硫磺色，无可溶性色素（如图1、2）。

③LN33菌株发酵液的制备。用直径0.6 cm打孔器在已经活化好的培养基上打取菌饼若干，再用接种环将菌饼接种到装有大豆酵母液体培养基的锥形瓶中（每150 mL大豆酵母液体培养基接种5～7块菌饼），放入恒温震荡培养箱中进行震荡培养（培养条件为温度28℃，转速170 rmp，时间8～9 d）制备玫瑰黄链霉菌LN33菌株发酵液。

④LN33菌株的DNA提取。取玫瑰黄链霉菌LN33菌株发酵液1 mL，10000转离心1分钟收集菌体。用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（编号：B518255，购自上海生物工程（上海）有限公司），进行放线菌DNA的提取。

⑤LN33菌株发酵液烟草育苗基质拌菌方法。在装盘播种前3至7天前，将制备好的玫瑰黄链霉菌LN33菌株发酵液拌入烟草育苗基质中（拌菌量为基质重量的5‰～6‰）。拌入前先将菌液加到水（每10 kg菌液兑水30～50 kg）中混合均匀，再添加到基质中混拌，使基质整体含水量保持在30%。

⑥LN33菌株对烟草的促生效果。将拌有LN33菌株发酵液的育苗基质装入育苗盘并进行烟草种子播种。分别于播种后第7天和第14天记录烟草种子的发芽势和发芽率。4～5周后记录烟苗的农艺性状和根的发育情况。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces roseoflavus）LN33菌株的鉴定：

1、菌株的形态学特征。菌株在高氏1号培养基上的气生菌丝淡粉红或淡粉微黄，基内菌丝硫磺色，无可溶性色素（如图1、2所示）。

2、菌株的分子学鉴定。放线菌DNA提取。取玫瑰黄链霉菌LN33菌株发酵液1 mL，10000转离心1分钟收集菌体。用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（编号：B518255，购自上海生物工程（上海）有限公司），进行放线菌DNA的提取。提取后对菌株16S rDNA基因序列进行扩增：采用通用引物27F：5^，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^，和1492r：5^，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3^，； PCR反应体系（50 µl ）为：模板DNA 1.0 µl ，10×Taq Buffer（NH₄ ⁺）5.0 µl ，dNTPMix （10.0 mmol/L）1.0 µl，Taq DNA Polymerase（5 U/µl）0.25 µl，MgCl₂（25.0 mmol/L）3.0 µl，上下游引物（10.0 µlmol/L）各1.0 µl，加dd H₂O补至50 µl；PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。凝胶电泳检测到条带后，将其所对应的原始扩增产物（未纯化，45 µl）由生工生物工程（上海）股份有限公司测序（序列如SEQ ID NO：01所示）。所得序列在GenBank数据库中进行比对结果表明，菌株LN33的16S rRNA序列与登录号为EU841631.1（ Streptomyces  fradiae）等序列同源性大于99%。利用MEGA.11软件中的邻接法构建系统发育树，系统发育树如图3所示。

实施例2

玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces roseoflavus）LN33菌株发酵液的制备：

1、LN33菌株活化。将实验室内保存的玫瑰黄链霉菌LN33菌株用高氏1号培养基采用平板划线法进行活化。接种时用经火焰灭菌的接种环粘取保存于平板上的玫瑰黄链霉菌菌落，然后在高氏1号培养基上用无菌牙签进行划线接种，接种完成后将其放入28℃恒温培养箱中，培养5～7天。

2、LN33菌株发酵液的制备。用直径0.6 cm打孔器将在已经活化好的培养基上打取菌饼若干，再用接种环将菌饼接种到大豆酵母液体培养基上（接种量为每150 mL大豆酵母液体培养基接种5～7块菌饼），放入恒温震荡培养箱中进行震荡培养（培养条件为温度28℃，转速170 rmp，震荡8～9 d）制备LN33菌株发酵液。

实施例3

玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces roseoflavus）LN33菌株发酵液的烟草育苗基质拌菌方法：

1、拌菌量。拌菌量为基质重量的5‰～6‰，即基质1000kg，加5～6L菌液（约等于5～6kg）。

2、拌菌方法。在装盘播种前3至7天前，将制备好的玫瑰黄链霉菌LN33菌株发酵液拌入烟草育苗基质中（拌菌量为基质重量的5‰～6‰）。菌液先与适量水（每10 kg菌液兑水30～50 kg）混合均匀，再添加到基质中混拌均匀，使基质整体含水量保持在30%（如果基质干燥可以适当增加用水量）。

3、堆置发酵。在堆置场地事先铺设防渗膜，将混拌均匀的基质堆制在防渗膜上，一般基质高度在1.2～1.5 m左右，宽度2～3 m左右，长度在3～4 m以上为宜。长型堆在上方每隔20～30 cm用木棒扎孔，锥形堆在堆高三分之二处斜向内扎孔，利于通风。（如果堆置时间超过3 d以上或堆体发酵温度超过40℃，需要对堆体进行翻堆通风，有利于微生物繁殖。）

实施例4

玫瑰黄链霉菌（ Streptomyces roseoflavus）LN33菌株发酵液促生效果测定：

1、LN33发酵液对MS培养基培养下烟苗的促生效果测定：

将烟草种子先用75 % 乙醇浸泡30 s，再用10 % NaClO浸泡10 min，无菌水漂洗3次，每次1 min。然后将种子接种于MS培养基，于25 ℃、16 h：8 h（光照：黑暗）恒温光照培养箱中萌发两周。处理组将LN33菌株发酵液稀释成10⁶ cfu/mL的菌体悬浮液，每株吸取500 μL菌株发酵液进行烟苗根部接种，对照组接种等量无菌水处理。置于恒温光照培养箱中继续培养，定期观察，14 d后，拍照。从附图4 （a为对照组，b为处理组）可以看出LN33菌株发酵液显著促进了烟苗的生长。

2、LN33发酵液拌入基质对烟苗促生效果测定：

试验分为两组，试验组使用5‰～6‰育苗基质重量的LN33发酵液（LN33），对照组（CK）育苗基质使用等量无菌水，将对照组和处理组的基质置于穴盘中，每穴点播1～2粒烟草种子，喷撒清水，直至种子包衣充分裂解，用少量的覆盖料覆盖种子，于温室中18℃～25℃，相对湿度65%的环境下培养。分别于播种7 d、14 d 后记录发芽数，以胚根伸出与种子等长时为发芽标准，进行烟草种子发芽势和发芽率的测定。发芽势（%）=（7 d内发芽种子粒数/受检种子数）×100，发芽率（%）=（14 d 内全部发芽种子粒数/受检种子数）×100。在烟苗生长到约35天时，小心将烟苗挖出，洗去根部泥土，每个处理15株苗，3个重复，拍照和测其生长指标：根长、根活力、叶长、叶宽、叶面积、茎围。从表1和附图5（c为对照组，d为处理组） 可以看出，经过玫瑰黄链霉菌LN33菌株发酵液处理后烟苗长势优于对照组。

表1 LN33菌株发酵液对烟草的促生作用。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.玫瑰黄链霉菌LN33在促进烟草生长发育方面的应用。

2.一种烟草育苗促生剂，其特征在于：所述烟草育苗促生剂包含玫瑰黄链霉菌LN33。

3.一种烟草育苗基质的拌菌方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、拌菌：制备玫瑰黄链霉菌LN33的发酵液；在装盘播种前3至7天前，将所述发酵液拌入烟草育苗基质中，拌菌量为所述烟草育苗基质重量的5‰～6‰，拌菌后基质整体含水量保持在30%；

步骤二、堆置发酵：在堆置场地事先铺设防渗膜，将经步骤一混拌均匀的基质堆制在防渗膜上，基质堆制高度在1.2～1.5 m、宽度在2～3 m、长度在3～4 m；其中，长型堆在上方每隔20～30 cm用木棒扎孔，锥形堆在堆高三分之二处斜向内扎孔。

4.根据权利要求3所述的拌菌方法，其特征在于：步骤一所述发酵液的制备方法为：首先将玫瑰黄链霉菌LN33菌株进行活化，然后接种于大豆酵母液体培养基中，然后在温度28℃、转速170 rmp条件下震荡培养8～9 d。

5.根据权利要求4所述的拌菌方法，其特征在于：将玫瑰黄链霉菌LN33划线接种于高氏1号培养基中，28℃下培养5~7天，进行活化；用打孔器在已经活化号的培养基上打取菌饼接种于大豆酵母液体培养基中，接种量为：每150mL 大豆酵母液体培养基接种5~7块菌饼。

6.一种促进烟草生长发育的方法，其特征在于：所述方法采用以下任意一种方式进行：

方式一：将烟草种子经灭菌后接种于MS培养基中进行萌发培养；将烟草黄链霉菌LN33发酵液稀释成10⁶ cfu/mL的菌体悬浮液，以每株烟草苗吸取500 μL菌体悬浮液进行烟苗根部接种，然后继续培养；

方式二：采用上述拌菌方法对烟草育苗基质进行拌菌处理，获得拌菌基质；将所述拌菌基质置于穴盘中，每穴点播1~2粒烟草种子，进行培养。

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