CN115943958A - 氟啶酮在促进牡丹wd40、myb2、chs1基因表达中应用 - Google Patents
氟啶酮在促进牡丹wd40、myb2、chs1基因表达中应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种氟啶酮在促进牡丹WD40、MYB2、CHS1基因表达中应用，属于植物基因功能领域，所述应用方法为选取牡丹发育状况良好的牡丹花芽，注射配置好的50‑200mg/L氟啶酮溶液，注射部位应为花芽的中下部。从而能够改变牡丹叶子的颜色，使牡丹叶片颜色有3个变化期，分别为粉色、粉绿色和绿色。
Description
技术领域
本发明属于植物基因功能领域，具体地涉及氟啶酮在促进牡丹WD40、MYB2、CHS1基因表达中应用。
背景技术
彩叶植物丰富多彩的叶片颜色以及多变的景观效果可弥补城市园林在淡化季节色彩单一的不足。叶色变异虽然可能影响植物的光合作用，但其表现出来的非绿色叶色对观赏植物来说具有很高的审美价值。叶绿素(chlorophyll)、类胡萝卜素(carotenoid)、花青素(anthocyanin)等天然色素含量的改变是导致彩叶植物叶片颜色变化的首要因素。花青素是一类天然色素，可溶于水，分布于植物各类组织中，隶属于苯丙氨酸代谢途径，也是目前研究得比较清晰的次生代谢物途径之一，成为人们改良叶片颜色的一个很好的切入点。在植物的茎、叶、花和果实中表皮细胞及液泡中普遍存在着大量的花青素。花青素是观叶植物呈色的主要成分之一，赋予了植物不同程度的色彩，花青素的含量及类型是决定植物叶片颜色的直接物质，而影响色素物质形成的关键是位于花青苷合成途径中的基因。
花青素生物合成以及代谢就目前研究来看会受到两种基因的作用：其中一种是结构基因，其表达产物为类黄酮生物合成酶类物质，其主要基因种类有查耳酮合成酶基因(CHS)、查耳酮异构酶基因(CHI)、黄烷酮羟化酶基因(F3H)、二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)、花青素合成酶基因(ANS)等；另一种是调节基因其中包括MYB2、WD40、bHLH(又称转录因子基因)，主要调控类黄酮生物合成结构基因表达量以及色素的积累量在时间和空间方面的变化。
对植物本身来讲，花青素也有重要的功能。当大量的花青素积累在植物器官中的时候，可以让植物呈现多种多样的颜色，对提高植物的观赏价值有着很大的提升，并且昆虫会被植物本身鲜艳的颜色所吸引帮助植物进行播种和授粉，对植物繁殖后代起到十分关键的作用。花青素对提高植物的抗逆性有着很大的作用，对于很多来自外界的生物与非生物威胁起到一个很好的保护作用。花青素是植物天然的光保护剂，可以吸收多余的可见光和帮助植物抵当紫外线辐射，并且清除氧自由基保护其不遭受强光的影响。花青素具有珍贵的营养价值和丰富的医疗保健功能，并且花青素在抗氧化方面也具有重要作用，目前的研究中发现花青素对于控制细胞癌变、高血脂、心脑血管疾病以及细胞衰老等疾病方面有重要医学价值。
牡丹(Paeonia suffruticosa)是芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)的多年生木本植物，牡丹目前已知的有一千多个品种，在花卉中有着很高的知名度，具有中国国花的美誉，在学术研究以及园林应用方面，均具有较高的价值。牡丹最初为野生型品种，后来经过人类的长期驯化与改良而成为一种重要的园艺观赏性植物，受到国内外人民的热烈推崇和青睐。牡丹本身除了具有极高的观赏价值之外，它在医药保健及其饮食方面的经济价值也在很早的时候就受到人们的热切关注。牡丹最开始是因其自身的药用价值而被记录到本草纲目之中去的，牡丹的主要药用部位是根皮，也被称为“丹皮”，从现代的医学观点出发，牡丹根皮的有效药用成分主要是牡丹酚，它具有抗菌清热解毒的功效，主要应用来于清肝火和凉血散瘀。但对于改变牡丹叶片颜色的彩色叶子的牡丹还未有公开。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种氟啶酮在促进牡丹WD40、MYB2、CHS1基因表达中应用，所述应用方法为将氟啶酮注射到牡丹花芽中，能够提高牡丹WD40、MYB2、CHS1基因的表达水平，从而能够改变牡丹叶子的颜色。
本发明是通过如下技术方案来实现的
一种氟啶酮在促进牡丹WD40、MYB2、CHS1基因表达中应用，所述应用方法为选取牡丹发育状况良好的牡丹花芽，注射配置好的50-200mg/L氟啶酮溶液，注射部位应为花芽的中下部。
本发明方法与现有技术相比的有益效果：
本发明方法能够促进牡丹花青素调控基因WD40、MYB2、CHS1基因表达，同时牡丹叶片的颜色变为粉色，并有3个叶片颜色变化期，分别为粉色、粉绿色和绿色。
附图说明
图1氟啶酮处理后不同发育时期叶片颜色的变化图，a-d为处理组叶片颜色变化，图b、c中箭头所指实际为粉色，图d中的叶片为粉绿色；e-h为对照组同时期的叶片颜色变化从暗红色到绿色叶片；
图2为牡丹叶片的总RNA的电泳图；
图3为牡丹花芽经氟啶酮处理下花青素合成基因的相对表达量分析图。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的保护范围做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
1实验材料
4-5年生牡丹品种‘鲁菏红’(Paeonia suffruticosa Andrews cv‘Luhehong’)取自山东青岛农业大学牡丹园。
1.1材料处理
选取同株牡丹上发育状况良好且发育时期相近的牡丹花芽，将选取好的花芽分为两组，一组为实验组，另一组为对照组。实验组的花芽注射配置好的浓度为50mg/L氟啶酮溶液，对照组注射同等剂量的蒸馏水，注射部位为花芽的中下部。将注射完毕的牡丹花芽挂上标签，标签上应注明注射时间、注射物质及浓度。随后定期对牡丹花芽的形态进行观察，并用相机进行拍照，记录牡丹花芽的变化。
1.2实验仪器
-80℃超低温冰箱(SANYO)、高速冷冻台式离心机(Hettich Mikro 200)、荧光实时定量PCR仪(LightCycler480，Roche)、PCR仪(PTC200,Bio-RAD)、电泳仪、离心机(CENTRIFUGE 5810R，Eppendorf)、紫外分光光度计(HITACHI U-2900)、蛋白核酸定量测定仪(Smart SpecTM Plus Spectrophotometer，BioRad)、分析天平(精度0.0001g)、凝胶成像仪(Vilber Loumat)、移液枪(Eppendorf)等。
2实验方法
2.1类胡萝卜素的测定
牡丹叶片变粉的影响因素可能与类胡萝卜素和花青素有关，故设计定性实验，分析注射氟啶酮后的花芽上的类胡萝卜素和花青素含量的变化，以此确定真正影响导致牡丹叶片变粉的真正影响因素。
类胡萝卜素含量测定：
将新鲜牡丹叶片用剪成形态为宽度小于1mm、重量为0.2g的细丝，置于10mL试管中，加入5mL 80％丙酮溶液，用封口膜扎紧瓶口，密闭处理。处理完毕后室温下置于避光处提取4h。4h后将试管拿出，轻轻地振荡使其混匀，过滤，滤液作为待测溶液。
使用紫外分光光度计，分别在470nm、645nm、663nm波长处，吸取1mL待测液置于1cm比色皿，使用80％丙酮溶液作为参比溶液，测定叶绿素a、b的吸光度值。
叶绿素a、b和类胡萝卜素含量的计算公式如下:
叶绿素a＝(12.72D663-2.59D645)×V×N×(1000×W)-1
叶绿素b＝(22.88D645-4.67D663)×V×N×(1000×W)-1
类胡萝卜素＝[(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229]×V×N×(1000×W)
各类色素含量的单位为mg/g；D663、D645分别表示待测液在663nm、645nm处的吸光值；V为提取液体积(mL)；W为样品质量(g)；N为稀释倍数。
2.2花青素的测定
取三个不同时期经注射氟啶酮处理的新鲜牡丹叶片与同时期的空白对照进
行比较，以此比较随着牡丹生长发育花青素含量的变化。同时可以对比经氟啶酮处理后的和未经处理的空白对照的花青素含量的变化。测定时每一组设三个重复。
将新鲜的牡丹叶片用剪成1mm碎片，称取0.2g，置于试管中，加入10mL2％盐酸甲醇溶液，管口用封口膜扎紧。室温下，置于避光处提取4h，不时摇荡。4h后取出过滤，所得滤液作为待测溶液。
取1mL待测液加到1cm比色皿中，在紫外分光光度计上，于530nm处测定其吸光度(A)，以2％盐酸甲醇溶液作为空白对照。
计算时设每1g样品在2％盐酸甲醇溶液中的浸提液的吸光度A＝0.1为一个花青素单位，以此比较花青素的相对含量。
花青素的相对含量(花青素单位/g·10mL 2％盐酸甲醇溶液)＝10AB，式中，
10——将吸光度换算成为花青素单位
A——测得的吸光度
B——稀释倍数
2.3荧光定量PCR分析
2.3.1测定总RNA的提取与检测
植物组织的裂解：
1)将置于-80℃冷冻储藏的牡丹叶片转移到研钵(实验前使用液氮预冷)，用研杵来研磨牡丹叶片(在研磨中不断的向研体中补充液氮)，直到叶片研磨至无明显可见颗粒的粉末。
2)将1.5mL离心管(RNase free)中加入500μL裂解液Butter PPS，再加入步骤1)所得粉末状的牡丹叶片100mg，然后立即用高速涡旋混匀直至样本无明显沉淀。
3)对上述所得裂解液进行5min的离心条件为12000rpm，4℃。舍弃沉淀，保留上清液，转移至新的1.5mL离心管(RNase free)中。取上清液体积1/10的Buffer PA-2加到离心管中，用涡旋振荡混匀约15s。再离心5min条件为12000rpm，4℃。随后取新的2.0mL离心管(RNase free)将上清液转移至此。再将已经提前加入50×DTT Solution的500μL裂解液Buffer RLS加入到离心管中，然后立即使用移液枪反复吹打至样本充分裂解。
RNA的纯化：
1)向上述裂解液中加入自身体积一半的无水乙醇，随后使用移液枪进行吹打、混匀，直至将产生的沉淀打散。
2)向Plant RNA Mini Column中加入上述混合液和沉淀，离心2min条件为室温，12000rpm，舍弃滤液。
3)取600μL的Buffer RWA加入到Plant RNA Mini Column中，离心1min条件为室温，12000rpm，丢弃滤液。
4)向Plant RNA Mini Column中加入750μL的Buffer RWB(已加入了规定体积的100％乙醇)，离心1min条件为室温，12000rpm，舍弃滤液。
5)DNase I消化：
(1)按表2.1配制并混匀DNaseI反应液。在Plant RNA Mini Column的膜中央位置加入50μL DNaseI反应液，置于室温下静置15min。
表2.1 DNaseI反应液
(2)在上述Plant RNA Mini Column膜的中央部位加入350μL Butter RWB，以12000rpm室温下离心1min，将滤液弃掉。
6)将750μL的Buffer RWB加入到Plant RNA Mini Column中，在室温以1 2000rpm离心1min，再将滤液丢弃掉。
7)取新的2mL的Colection Tube将Plant RNA Mini Column的吸附柱安装到上面，以12000rpm室温下离心2min(新的2.0mL Collection Tube对提取的RNA纯度有提高作用)。
8)取新的RNase Free Tube于上述Plant RNA Mini Column的吸附柱安装到一起，吸取70μL RNase Free Water加入到在上述吸附柱膜的中间处，放置于室温下5min，然后再12000rpm室温下离心2min，洗脱得到牡丹叶片的RNA，将其用于后续的反转录实验。
RNA检测：
定量：用蛋白核酸测定仪测定RNA的纯度及浓度，每次用移液枪吸取1μL RNA原液，每组实验重复3次。
定性：琼脂糖凝胶电泳
1)制备1％琼脂糖凝胶(20mL):向锥形瓶中依次加入称取好的0.2g琼脂糖和20mL1×TAE。随后置于微波炉加热直至琼脂糖全部融化，再将其摇匀，即制成了1.0％琼脂糖凝胶液。
2)胶板制备：洗净并晾干制胶槽，放入玻璃板。封好玻璃板与内槽两端边缘的空隙。调整内槽至水平，将梳子放入固定位置。等待琼脂糖凝胶液冷却至65℃左右后缓慢地倾倒在内槽的玻璃板上，保证其形成一个均匀的胶层。放置于室温下至其完全凝固，慢慢将梳子取出，将凝胶及内槽放到电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液至没过胶板。
3)加样：将1μL 6×RNA loading buffer与2μL RNA混合，吹打混匀后用移液器分别吸取样品加入胶板的小槽内，为了防止污染，应在加完一个样品后就更换枪头，加样时应注意不要将样品孔周围的凝胶面碰坏。
4)电泳：将加样完毕后，将电压调至80V对凝胶板进行电泳，时间为15min。
5)观察拍照：将凝胶板放到在紫外灯下进行观察，RNA若存在则会显示出条带，最后利用凝胶成像系统进行照相保存。
2.3.2将RNA反转录成cDNA
去除基因组DNA：
将反应液按照表2.2内容配制好，进行基因组DNA的去除：
表2.2去除DNA的反应体系
反应条件：42℃ 2min，4℃
反转录反应：
将反应溶液按照表2.3内容进行配制，进行RNA反转录反应。
表2.3反转录的反应体系
反应条件：37℃ 15min，85℃ 5sec，4℃
.2.3.3荧光定量PCR
PCR引物的设计：
设计实时定量引物时使用了DNAMAN和primer 5.0软件，使扩增产物大小的范围为100-250bp。依据Blast在线搜索的保守结构域结合目的基因的核苷酸序列，设计出来的引物Tm值应在55℃～65℃之间，且不存在错配现象、二聚体及发卡结构。本实施例定量引物序列如表2.4所示:
表2.4引物序列
PCR反应：
Real-time PCR反应的模板为上述稀释了3倍的cDNA，每个反应体系设定3个重复，每个反应的体系如表2.5：
表2.5 PCR反应体系
在Optical 96-well PCR plate white(0.1mL Full skirt)中分装上述的反应体系，设置PCR反应程序如表2.6所示：
表2.6 PCR反应程序
3、结果
3.1氟啶酮处理后的表型观察
对低温处理7d的牡丹花芽用200mg/L的氟啶酮的注射，然后定期观察拍照。通过对牡丹花芽的表型观察可以发现，与蒸馏水处理相比，氟啶酮处理能显著促进芽的萌动。在注射氟啶酮15d后，随着花芽萌动，新生的叶片颜色为粉色(图1,b)；随着发育的进行，粉色叶片不断长大，接着粉色叶片的末端处开始返绿(图1,c)，返绿的趋势不断向叶柄方向蔓延，直至叶片整体变为绿色(图1,d)。由此可以将牡丹叶片颜色的变化分为三个时期分别为粉叶期、粉绿叶期、绿叶期。对照组牡丹花芽，随着花芽的萌动，新生的幼叶为深红色(图1,f)，随着发育的进行叶片颜色逐渐变为绿色(图1,g,h)
3.2类胡萝卜素的测定
本次实验以注射氟啶酮后的牡丹叶片为实验组，蒸馏水处理的牡丹叶片对照，选取实验组的三个时期：粉叶期，粉绿叶期，绿叶期以及它们相应时期的对照组，经过叶绿素提取、含量测定后进行对比，如表3.1所示实验组的类胡萝卜素含量显著降低。
表3.1类胡萝卜素含量表
3.3花青素的测定
取新鲜牡丹叶片，按照颜色将叶片分为粉叶期、粉绿叶期、绿叶期三个时期，以注射过氟啶酮的牡丹叶片为实验组，水处理的牡丹叶片为对照组，每组设置三个重复，对花青素进行提取，测定其在536nm下的吸光度值，计算花青素在叶片中的含量。结果如表3.2所示我们发现随着发育的进行牡丹叶片中花青素的含量逐渐降低，而注射了氟啶酮的实验组的花青素含量虽然也在降低但是要远远大于同时期的空白对照组。
表3.2花青素的含量
*小写字母的不同表示在不同处理条件下在0.05水平差异有统计学意义。上表所列数据为平均值±标准差(N＝3)。
3.4总RNA提取、检测及基因的表达分析
提取实验组牡丹(粉叶期、粉绿叶期和绿叶期)叶片及对照组叶片中的RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，18S和28S条带十分清晰明显，RNA检测浓度符合反转录实验要求，可将其用于后续实验。
为进一步探究氟啶酮对牡丹叶片花青素合成关键基因表达量的影响，将牡丹Actin基因作为内参基因，以牡丹粉叶期、粉绿叶期、绿叶期的叶片为实验组，同时期的蒸馏水处理的叶片为对照组，以它们的cDNA作为模板，利用引物对三个基因WD40、MYB2、CHS1的表达量进行荧光定量PCR分析，结果如图3所示。由此表明三个基因WD40、MYB2、CHS1在不同时期牡丹叶片中均有表达，但表达量各不相同。从图3中可以看出，施加氟啶酮会增加三个基因MYB2、CHS1、WD40的表达量，从而使花青素含量上升，使叶片变粉，随着叶片从粉叶期到粉绿叶期再到绿叶期的过渡，基因的表达量逐渐降低。
Claims (1)
1.一种氟啶酮在促进牡丹WD40、MYB2、CHS1基因表达中应用，其特征在于，所述应用方法为选取牡丹发育状况良好的牡丹花芽，注射配置好的50-200mg/L氟啶酮溶液，注射部位应为花芽的中下部。
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