CN115943307A - 用于免疫调节的mr1配体和药物组合物 - Google Patents

用于免疫调节的mr1配体和药物组合物 Download PDF

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CN115943307A CN202180009423.8A CN202180009423A CN115943307A CN 115943307 A CN115943307 A CN 115943307A CN 202180009423 A CN202180009423 A CN 202180009423A CN 115943307 A CN115943307 A CN 115943307A
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Abstract

本发明涉及一种调节MR1多肽与MR1特异性T细胞受体分子之间的相互作用的方法，借此使MR1多肽与MR1配体化合物接触，MR1配体化合物是反映细胞代谢窘迫状态的核碱基加合物产物。本发明进一步涉及鉴定为MR1配体的化合物在疫苗接种或调节MR1‑受限的免疫应答中的用途。

Description

用于免疫调节的MR1配体和药物组合物
本申请要求2020年1月16日提交的欧洲专利申请EP20152326.3、2020年3月30日提交的欧洲专利申请EP20166918.1和2020年3月30日提交的欧洲专利申请EP20166919.9的利益，所有这些都通过引用并入本文。
本发明涉及由MR1分子特异性呈递至MR1特异性T细胞的配体。这些配体是形成核酸的碱基的衍生物或类似物，特别是在某些条件下出现在真核细胞中的核糖核苷和脱氧核糖核苷加合物。本发明进一步涉及在治疗和研究中使用此类配体的药物制剂和方法。本发明进一步涉及为在临床情况下增加MR1配体的呈递的目的而提供的药物制剂，其中这种增加MR1配体的呈递具有临床益处。
背景技术
MR1(Uniprot ID 95460)是一种非多态性MHC I类蛋白，其在大多数细胞类型的表面上以低水平表达。MR1在多个物种中高度保守，人类和小鼠的MR1在蛋白质水平上有90％以上的序列同源性。
发明人最近发表了他们的工作，证实存在识别由MR1呈递的肿瘤相关抗原(TAA)的人类T细胞(Lepore等人，ELIFE 6，DOI：10.7554/eLife.24476)。这些新型的T细胞参与肿瘤免疫监视，因此代表癌症免疫治疗的新型工具。然而，这些MR1特异性T细胞所识别的抗原仍然是未知的。
使用经过工程改造以表达对选定TAA特异的T细胞受体(TCR)的捐赠者或患者来源的T细胞的过继治疗代表了一种在癌症患者中诱导临床相关抗肿瘤免疫应答的有前途且安全的策略。靶向与MR1非多态性抗原呈递分子结合的TAA可能会克服这一限制，并且原则上适用于所有患有表达MR1的肿瘤的患者。使用识别MR1呈递的抗原的肿瘤反应性TCR可能还具有补充由MHC呈递的肽抗原介导的抗肿瘤应答的优势，不包括TAA为了与相同类型呈递分子结合的交叉竞争。此外，该策略可提供将不同性质的抗原靶向同一肿瘤细胞的可能性，从而使在选择性免疫压力下肿瘤逃逸变体的潜在发生减少到最低限度。
缺乏关于呈递的抗原性质的信息，以及缺乏可用于探测、分析和调节MR1呈递、其与抗原和同源TCR的相互作用的工具，阻碍了改进的以MR1为中心的免疫肿瘤治疗的发展。
因此，鉴定MR1呈递的TAA以及鉴定和分离识别这些抗原的MR1限制性TCR可能对癌症免疫治疗有重要意义。
基于上述技术现状，本发明的目的是提供调节MR1-TCR相互作用的手段和方法，以实现和改善基于MR1的免疫疗法的临床应用。这一目标通过本说明书的独立权利要求的主题实现。
发明内容
据发明人所知，本发明首次鉴定了在对真核细胞代谢状态产生的细胞内抗原的MR1限制性免疫应答背景下呈递至MR1 T细胞的MR1特异性真核抗原化合物，从而促进这些化合物用于治疗/预防和诊断或研究目的。
因此，本发明提供了核碱基-加合物的MR1配体化合物，在许多实施方案中，核苷加合物或类似物，用于利用MR1-TCR相互作用的特异性的方法(MR1分子向T细胞呈递特异性MR1配体化合物)：
i)刺激MR1配体化合物特异性T细胞并诱导预防性或治疗性免疫应答的方法，
ii)鉴定和分离对MR1上呈递的化合物有反应性的T细胞或抗体的方法，
iii)根据化合物的存在对代谢改变的细胞(包括但不限于肿瘤细胞)进行分类的方法。
当应用于患者样本时，对代谢改变的细胞进行分类的方法可作为根据患者对MR1特异性T细胞疗法的可能应答对其进行分层的诊断方法，并可指导额外的组合疗法如本文提供的MR1配体化合物的给药，或已知的以有利于生成本文提供的MR1配体的方式干扰细胞内代谢的药物的给药，或两者。
用于根据本发明的方法的供使用的MR1配体化合物在权利要求1至9和表1中提供。
本发明还涉及一种方法，其通过药物干预导致细胞中MR1配体化合物的积累或处置，从而调节(增加或减少)细胞中或由细胞呈递的MR1配体化合物的量。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的MR1配体化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步涉及能够特异性识别本文所公开的与MR1分子相关(由MR1分子呈递)的MR1配体的TCR分子，以及编码这种MR1配体特异性TCR分子的多核苷酸序列。
本发明进一步提供了8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛，本文首次鉴定和合成的一种新型MR1配体化合物。
发明详述
术语和定义
为了解释本说明书，以下定义将适用，并且在任何适当的时候，单数使用的术语也包括复数，反之亦然。如果下面列出的任何定义与通过参考而并入本文的任何文件相冲突，则应以所列出的定义为准。
术语“包括”、“具有”、“包含”和“包括”以及其它类似的形式，以及它们的语法等价物，如本文使用，旨在其含义是等同的，并且是开放式的，因为这些词中的任何一个后面的一个项目或多个项目并不意味着是对该一个项目或多个项目的详尽列举，或意味着只限于所列出的一个项目或多个项目。例如，“包括”成分A、B和C的物品可以由(即只包含)成分A、B和C组成，或者不仅包含成分A、B和C，还包含一个或多个其它成分。因此，旨在并理解“包括”及其类似的形式，以及其语法上的等价物，包括公开“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方案。
在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限与在该所述范围中的任何其它规定或中间值之间的每个中间值至下限单位的十分之一包括在本公开内，但遭受所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括限制之一或两者的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。
本文提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
正如本文所使用的，包括在所附的权利要求书中，单数形式的“一”、“或”和“该”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学方面)的普通技术人员通常理解的含义相同。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(一般见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第4版(2012)冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，美国纽约冷泉港；和Ausubel等人，《分子生物学的简短协议(Short Protocols in Molecular Biology)》(2002)第5版，约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.))和化学方法。
本说明书的上下文中的术语MR1是指MR1基因(Entrez 3140)或MR1基因产物(Uniprot Q95460)，本文也被称为“MR1多肽”或“MR1分子”。作为非限制性的实例，MR1多肽可以作为分离的MR1多肽存在于本文公开的方面或实施方案中，例如在MR1多肽四聚体(Gherardin，《免疫细胞生物学(Immunol Cell Biol.)》，2018年5月；96(5):507-525)的背景下，或者在患者的细胞上自然地或应答于MR1编码基因构建体的转移而表达。
本说明书上下文中的术语MR1T细胞是指表达T细胞受体的T细胞，该T细胞受体能够特异性结合呈递本文所述抗原分子的MR1分子。
本说明书上下文中的术语MR1T细胞受体是指能够与例如由癌细胞呈递的与MR1分子相关的抗原特异性结合的T细胞受体。
标记物如MR1的表达可以通过诸如荧光显微镜、流式细胞仪、ELISPOT、ELISA或多重分析的技术进行检测。
本文所述的TCR序列或TCR分子包括TCRα和TCRβ多肽链，或TCRγ和TCRδ多肽链，以发挥全部功能。如果提到具有特异性序列的TCRα或β多肽，则应理解为了使其在本文所述的方法和细胞中充分发挥功能，它需要有互补的(分别为β或α)多肽链的存在。经适当修改后，同样的情况也适用于γδ配对。提到特异性TCRα、β、γ或δ序列意味着这样的可能性，即它与本文所述的原始克隆中与之配对的TCR序列，或与本文规定的原始配对序列有一定的同一性的序列配对。提到特异性TCRα、β、γ或δ序列也意味着它有可能与另一个配对的TCR序列配对。
对MR1呈递的癌症抗原的识别主要是通过CDR3序列实现的。凡是本文提到的仅以特异性CDR3序列为特征的TCR序列，都意味着该TCR序列是本文提供的完整的α、β、γ或δTCR序列，并且所产生的TCR分子与适当的第二序列配对。
在本说明书的上下文中，术语与MR1结合的化合物指的是被MR1分子非共价结合的化合物。可以通过例如范德华力和静电相互作用，包括氢键，发生结合。
该化合物和MR1分子形成复合物，其可以被特异性T细胞受体识别。特异性T细胞受体的识别意味着T细胞受体可以区分不与化合物结合的MR1分子和MR1配体化合物-MR1复合物。
在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比指的是单一的定量参数，代表通过逐个位置比较两个对齐的序列而确定的序列比较结果。用于比较的序列对齐方法是本领域众所周知的。用于比较的序列对齐可以通过Smith和Waterman的局部同源算法，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)，通过Needleman和Wunsch的全局对齐算法，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443(1970)，通过Pearson和Lipman的搜索相似性方法，《美国国家科学院汇刊(Proc.Nat.Acad.Sci.)》85:2444(1988)，或通过这些算法的计算机化实现，包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。执行BLAST分析的软件是公开可得的，例如，通过国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
比较氨基酸序列的一个实例是BLASTP算法，该算法使用默认设置：期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配度：0；矩阵：BLOSUM62；差距成本：存在11，扩展1；成分调整：条件成分得分矩阵调整。一个用于核酸序列比较的实例是使用默认设置的BLASTN算法：期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配度：0；匹配/错配分数：1.-2；差距成本：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用BLAST程序套件(Altschul等人，《分子生物学杂志》215：403-410(1990))，分别使用上述鉴定的默认参数进行蛋白质和核酸的比较。
提到相同的序列而不说明百分比值，意味着100％相同的序列(即相同的序列)。
在本说明书中，术语阳性，当用于标记物的表达的上下文时，是指用荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中荧光的中值荧光强度与用不特异性结合相同靶的同种型匹配的抗体染色相比至少高出5％(≥5％)。标记物的这种表达用上标“+”(+)表示，跟在标记物的名称后面，例如MR1+。
在本说明书中，术语阴性，当用于标记物的表达的上下文时，是指用荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中中值荧光强度比不特异性结合相同靶的同种型匹配抗体的中值荧光强度高不到5％。标记物的这种表达用上标减号(-)表示，跟在标记物的名称后面，例如MR1-。在本说明书的上下文中，术语检查点调节剂包括检查点抑制剂(特别是检查点抑制性抗体)和检查点激动剂(特别是检查点激动剂抗体)。在本说明书的上下文中，当用于定义能够识别与MR1分子结合的MR1配体的TCR分子时，术语具有基本相同的生物活性涉及识别(或有助于识别)其同族配体(与MR1结合的MR1配体)的能力有关。本文描述了确定这种相互作用的测定和方法。
在本说明书的上下文中，术语核酸表达载体涉及多核苷酸，例如质粒、病毒基因组或合成的RNA分子，它被用来用某种感兴趣的基因转染(在质粒或RNA的情况下)或转导(在病毒基因组的情况下)靶细胞。在DNA表达构建体的情况下，感兴趣的基因在启动子序列的控制下，启动子序列在靶细胞内运行，因此，感兴趣的基因在组成上、或在刺激下或取决于细胞的状态转录。在RNA表达构建体的情况下，可以理解为该术语涉及RNA的翻译，该构建体可以被靶细胞作为m-RNA使用。在某些实施方案中，病毒基因组被包装成外壳，成为病毒载体，其能够转导靶细胞。
在本发明的上下文中，术语转基因MR1反应性T细胞涉及表达T细胞受体(TCR)的自体或异体T细胞，该受体能特异性地识别患者细胞上表达的MR1分子。在某些实施方案中，TCR在没有添加任何外来抗原的情况下，以MR1依赖性的方式识别表达MR1的肿瘤细胞。MR-1限制性TCR序列在PCT/EP2019/074284和US20190389926 A1中公开，这两份文件通过引用并入本文。
在本说明书的上下文中，术语检查点抑制剂或检查点抑制性抗体是指包括一种药剂，特别是能够破坏T细胞激活后导致T细胞抑制的信号级联的抗体(或抗体样分子)，这是本领域已知的免疫检查点机制的一部分。检查点抑制剂或检查点抑制性抗体的非限制性实例包括针对CTLA-4(Uniprot P16410)、PD-1(Uniprot Q15116)、TMIGD2(Uniprot Q96BF3)、BTLA(Uniprot Q7Z6A9)、CD160(Uniprot O95971)、Lag-3(Uniprot P18627)、TIGIT(Uniprot Q495A1)、CD96(Uniprot P40200)、TIM-3(Uniprot Q8TDQ0)、CEACAM1(UniprotP13688)、SIRPα(Uniprot P78324)、CD200R(Uniprot Q8TD46)、KIR家族(包括Uniprot蛋白Q99706、P43628、P43626、Q8NHK3、P43627、Q8N109、B0L652、Q86U48、B0L653、A0A191URI1、Q6H2H3)、ILT家族，或针对PD-L1(Uniprot Q9NZQ7)、PD-L2(Uniprot Q9BQ51)、VISTA(Uniprot Q9H7M9)、B7H3(CD276；Uniprot Q5ZPR3)、CD80(Uniprot P33681)、CD86(UniprotP42081)、B7-H4(Uniprot P42081)、TNFRSF14(HVEM，CD270，Uniprot Q92956)、CD155(Uniprot P15151)、Galectin9(Uniprot O00182)、CD200(Uniprot Q8TD46)的抗体。
在本说明书的上下文中，术语检查点激动剂或检查点激动剂抗体是指包括一种药剂，特别是但不限于能够参与导致T细胞激活的信号级联的抗体(或类似抗体的分子)，这是本领域已知的免疫检查点机制的一部分。已知在T细胞激活时变得上调的受体的非限制性实例包括CD25(Uniprot P01589)、CD122(Uniprot P14784)和CD137(4-1BB；UniprotQ07011)。术语检查点激动剂或检查点激动剂抗体包括针对CD28(P10747)、ICOS(Q9Y6W8)、CD137(4-1BB；Uniprot Q07011)、Light(HVEM，Uniprot O43557)、OX40(P23510)、GITR(Q9Y5U5)、DNAM-1(CD226，UniprotQ15762)、2B4(CD244，Uniprot Q9BZW8)、DR3(Q93038)、NKp80(KLRF1，Uniprot Q9NZS2)的激动剂抗体。在本说明书上下文中，术语C1-C4烷基涉及具有1、2、3或4个碳原子的饱和直链或支链烃，其中在某些实施方案中，一个碳-碳键可以是不饱和的，一个CH2部分可以交换为氧(醚桥)或氮(NH或NR，其中R为甲基、乙基或丙基；氨基桥)。C1-C4烷基的非限制性实例是甲基、乙基、丙基、丙-2-烯基、正丁基、2-甲基丙基、叔丁基、丁-3-烯基、丙-2-烯基和丁-3-烯基。在某些实施方案中，C1-C4烷基是甲基、乙基、丙基或丁基的部分。
术语未取代的Cn烷基在这里用于最狭义的情况下，如果用作分子部分之间的桥梁，则涉及到-CnH2n-部分，或在用于终端部分的上下文中，则涉及到-CnH2n+1。
术语未取代的Cn烷基和取代的Cn烷基包括直链烷基，该直链烷基包含环状结构，例如环丙烷、环丁烷、环戊烷或环己烷分子，或与之连接，根据注释或涉及的上下文未取代或取代，具有直链烷基取代。直链或环状结构中的碳和--适当时--N、O或其它杂原子的总数加起来为n。
术语取代的烷基最广义是指上述最广义的烷基，其与非碳或氢的原子共价接触，特别是与选自N、O、F、B、Si、P、S、Cl、Br和I的原子共价连接，其本身可以-如果适用-连接到该基团的一个或几个其它原子，或连接到氢，或连接到不饱和或饱和烃(最广义的烷基或芳基)。在狭义上，取代的烷基是指上述最广义的烷基，其在一个或几个碳原子上被选自胺NH2、烷基胺NHR、酰亚胺NH、烷基酰亚胺NR、氨基(羧基)NHCOR或NRCOR、羟基OH、氧烷基OR、氧(羧基)OCOR、羰基O及其缩酮或缩醛(OR)2、腈CN、异腈NC、氰酸盐CNO、异氰酸盐NCO、硫氰酸盐CNS、异硫氰酸盐NCS、氟化物F、氯化物Cl、溴化物Br、碘化物I、膦酸盐PO3H2、PO3R2、磷酸盐OPO3H2和OPO3R2、巯基SH、苏烷基SR、亚砜SOR、磺酰SO2R、磺酰酰胺SO2NHR、硫酸盐SO3H和硫酸盐SO3R的基团取代，其中在本段中使用的R取代基与说明书正文中分配给R的其它用途不同，在最广义上，其本身是未取代或取代的C1至C12烷基，在较狭义上，R是甲基、乙基或丙基，除非另有说明。
术语氨基取代的烷基或羟基取代的烷基是指根据上述定义被一个或几个胺或羟基基团NH2、NHR、NR2或OH修饰的烷基，其中在本段中使用的R取代基与说明书正文中分配给R的其它用途不同，在最广义上，其本身是未取代的或取代的C1至C12烷基，在较狭义上，R是甲基、乙基或丙基，除非另有说明。具有一个以上碳的烷基可以包括一个以上的胺或羟基，除非另有说明，术语“取代的烷基”是指除了与烷基链、末端甲基或氢的键合外，每个C仅被最多一个胺或羟基取代的烷基。
术语羧基取代的烷基是指根据上述定义被一个或几个羧基COOH或其衍生物，特别是羧基酰胺CONH2、CONHR和CONR2，或羧酸酯COOR修饰的烷基，其中R的含义如前段所述，与本说明书正文中分配R的其它含义不同。
术语卤素取代的烷基是指根据上述定义被一个或几个选自(独立地)F、Cl、Br、I的卤素原子修饰的烷基。
羧酸酯是基团-CO2R，其中R在说明书中进一步定义。羧酰胺是指-CONHR，其中R在说明书中进一步定义。
如本文所用，术语药物组合物是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方案，根据发明中的药物组合物以适合局部、肠外或注射给药的形式提供。
如本文所用，术语药学上可接受的载体包括任何溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，如本领域技术人员所知(见例如《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:the Science and Practiceof Pharmacy)》，ISBN 0857110624)。
如本文所用，术语治疗或治疗任何疾病或病症(如癌症)在一个实施方案中是指改善疾病或病症(如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”或“治疗”是指缓解或改善至少一个物理参数，包括那些可能无法被患者察觉的参数。在另一个实施方案中，“治疗”或“治疗”是指对疾病或病症进行调节，可以是身体上的，(例如，稳定可察觉的症状)、生理上的(例如，稳定物理参数)，或两者都是。评估治疗和/或预防疾病的方法在本领域一般是已知的，除非下文特别描述。
在本说明书中，使用了以下的缩写：APC，抗原呈递的细胞；β2m，β2微球蛋白；DC，树突状细胞；HLA，人类白细胞抗原；HPLC，高压液相色谱法；IFN-γ，干扰素-γ；IL-13，白细胞介素13；mAb，单克隆抗体；MAIT细胞，粘膜相关不变的T细胞；MFI，中值荧光强度；MHC，主要组织相容性复合体；MR1，MHC I类相关分子1；MR1T细胞，MR1限制性T细胞；MS，质谱分析；PBMC，外周血单核细胞；活性氧，ROS；TAA，肿瘤相关抗原；TCR，T细胞受体；TIL，肿瘤浸润性淋巴细胞。
在某些方面，本发明涉及一种MR1(主要组织相容性复合体I类相关基因蛋白1)配体化合物在包括调节MR1与MR1特异性T细胞的相互作用的方法中的用途。
根据本发明中的某些MR1配体化合物可通过下列通式的腺嘌呤衍生物描述：
Figure GDA0003806018750000041
本发明的其它MR1配体化合物可以通过下列通式的鸟嘌呤衍生物描述：
Figure GDA0003806018750000042
Figure GDA0003806018750000051
根据本发明中的其它MR1配体化合物可以通过下列通式的嘧啶核苷酸衍生物描述：
Figure GDA0003806018750000052
上述通式所示的取代基可以具有下列含义：
-R1A是H或甲基，R1G是H或甲基；
-RN3是H或甲基；
-R2选自H、甲基和-S-甲基；
-R3U和R5U选自H和甲基；R5C选自H和甲基；
-RN1和RN2都是H或C1至C3烷基，
或者RN1是H或C1至C3烷基(特别地RN1是H或甲基)并且RN2选自C1-C6烷基、C2-C6亚烷基和C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，其中该烷基或亚烷基未被取代或被羰基、羧基和/或羟基取代，
特别地RN1是H，且RN2选自甲基、2-羟基-乙基、1-羧乙基、1,2-二羧基-乙基、苏氨酰基氨基甲酰基、异戊-2-烯基、顺式-羟基异戊-2-烯基、3-氧代-1-丙烯基和己-1,3,5-三烯-1，1，3-三甲醛；
或者RN1、RN2和氮共同形成2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛双环系统；
或者
-RN3和R1A共同，或RN2和R3C共同，或RN1和R1G共同形成未取代的或C4至C16-2-氧代-烷基取代的或-羧基-2-氧代-烷基取代的咪唑环，或
RN3和R1A共同，或RN2和R3C共同，或RN1和R1G共同是-C(CH3)OH-CHOH-或C(R′)OH-CH2-CHOH-或氧-亚环丙基-丙二醛-取代的丙-2-烯，且R′选自H、CH3、CH(OH)C2H5、C2H5和C4H9；
或者RN1和R1G形成嘧啶，或RN1和R1G或RN3和R1A形成12-氧代-5,6,10,12-四氢-3H-6,10-桥亚甲基[1,3,5]氧杂二氮芳辛环系统，或RN1和R1G形成2-氧杂-6,8-di氮杂双环[3.3.1]壬-3-烯-4-甲醛双环系统；
和
-RO选自H、未取代的或羟基取代的C1-C5烷基或C2-C5亚烷基，
-RX选自SH、C1-C5烷基、C2-C5亚烷基和C1-C5 S-烷基；
-RR选自H、1′-核糖基、2′-脱氧-1′-核糖基、5′-磷酰-1′-核糖基、5′-甲硫基-1′-核糖基、1′-(2′-O-核糖基-5″-磷酸)核糖基、1′-(2′-O-核糖基)-核糖基、1′-(2′-O-甲基)核糖基。
发明人目前的理解是通过构成加合物和母体核苷之间的结构差异的部分R1A、R2′、RN1、RN2、RN3所代表的“核苷的修饰”促进了与MR1口袋的相互作用，因此与MR1产生稳定的复合物。尚未获得结构信息来提供不同加合物如何插入MR1口袋的基本原理。不同加合物可以呈递正交位置。例如，当含腺苷的加合物可能具有平行于MR1的α螺旋的两个环，鸟苷加合物可能以垂直方式定位两个环。这可能解释了当腺苷和鸟苷的伯胺的两个不同位置的残基的添加都和结合一致。从MR1结合细菌MR1配体的晶体结构中获得的数据支持这一观点。
天然核碱基和其核糖基或脱氧核糖基衍生物，例如腺嘌呤、腺苷、脱氧腺苷、鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、尿嘧啶、尿苷、脱氧尿苷、胸腺嘧啶、胸苷、脱氧胸苷、胞嘧啶和胞苷和脱氧胞苷不被认为包括在如上预期的通式I、II、III和IV及其衍生物的范围内，并且被认为对本文公开的方法和用途没有用处。
此外，发明人已经发现化合物3-甲基腺嘌呤、7-甲基-7-脱氮-2′-脱氧鸟苷、喹啉、怀丁苷、羟基怀丁苷、假尿苷和(2R,3S,4R,5R)-2-(羟甲基)-5-(6-(甲硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3,4-二醇可用于本发明的实践，如本文所公开的在本发明的精神内可对其进行修改。
在本文公开的作为MR1配体的任何核苷衍生化合物的某些实施方案中，RR由通式(V)描述：
Figure GDA0003806018750000061
其中RB是将部分连接至上述鉴定的基团I式(腺嘌呤核碱基衍生物)的N9氮或连接至上述基团II、III或IV式的N1氮的键。
在某些实施方案，V的R2′是H，且R5′是H。在某些实施方案，V的R2′是H，且R5′是PO3 2-。在某些实施方案，V的R2′是H，且R5′是OH。在某些实施方案，V的R2′是OH，且R5′是PO3 2-。在某些实施方案，V的R2′是OCH3，且R5′是H。在某些实施方案，V的R2′是OCH3，且R5′是PO3 2-。
在某些实施方案，V的R2′是O-核糖基或O-核糖基-5″-磷酸，且R5′选自H和PO3 2-。
在本文公开的作为MR1配体的任何核苷衍生化合物的一些特别的实施方案中，RR由通式(Va)描述：
Figure GDA0003806018750000062
其中R2′选自H、OH、O-甲基、O-1-核糖基和O-1-(5-磷酰)-核糖基。R2'为OH的Va显示为Vb；；R2′为O-1-(5-磷酰)-核糖基的Va显示为Vc。
在本文公开的作为MR1配体的任何核苷衍生化合物的一些更特别的实施方案中，RR由通式(Vb)或(Vc)描述：
Figure GDA0003806018750000063
已知Vc的5″核糖基氧上的磷酸盐可以是酸形式(OPO3H2)或磷酸氢盐或磷酸盐以及合适的阴离子。
在本文公开的作为MR1配体的任何核苷衍生化合物的某些实施方案中，所述MR1配体化合物由任一下列通式描述：
Figure GDA0003806018750000071
-其中RN1、RN2、R1A、R1G、R2′和R5′可以具有上述含义，
-且其中R2′选自H、OH、O-甲基、核糖基和5″磷酰核糖基，且R5′选自H、PO3 2-和甲基，
-特别地R2′是H或OH，且R5′是H。
在一些特别的实施方案中，所述MR1配体化合物由式I描述，且RN1、RN2和氮共同形成2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛双环系统，且R选自H、核糖基和脱氧核糖基。
在本文公开的作为MR1配体的任何核苷衍生化合物的某些实施方案中，所述MR1配体化合物由以下描述：
a.式(I)，其中R2是S-甲基，并且RN1和RN2都是H；
b.式(I)，其中R2是甲基，且RN1和RN2都是H；或
c.式(I-1)，其中R1A是甲基，R2是H，且RN3是H；或
d.式(I-1)，其中R1A是甲基，R2是甲基，并且RN3是H；或
e.式(I-1)，其中R1A是甲基，R2是S-甲基和RN3是H；或
f.式(I)，其中R2是H，RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
g.式(I)，其中R2是S-甲基，并且RN1和0RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、乙-2-醇、1,2-二羧基-乙基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
h.式(I)，其中R2是甲基，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
i.式(II)，其中R1G是甲基，且RN1和RN2都为H；或
j.式(II+)，其中R1G是甲基，且RN1和RN2都为H；或
k.式(II+)，其中R1G是H，且RN1和RN2都为H；或
l.式(II)，其中R1G是甲基，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、乙基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
m.式(II+)，其中R1G是甲基、和RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2另一者选自选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
n.式(II+)，其中R1G是H，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
o.式(I-IM或II-IM)，当中RIM选自H、CH2COCnH(2n+1)，其中n为3至7(特别地n＝5)，和CH2CO(CH2)mCOO-，其中m为3至9(特别地n＝7)
Figure GDA0003806018750000072
p.式(II-c)，(II-d)，(II-e)(II-f)
Figure GDA0003806018750000081
q.式(II-g)或(II-h)，其中R2选自H、甲基和S-甲基：
Figure GDA0003806018750000082
r.式(II-i)(II-j)，其中RN1选自H和甲基，且其中R2选自H、甲基和S-甲基：
Figure GDA0003806018750000083
s.式(III)，其中R3U是H，且R5U是甲基，
t.式(III)，其中R3U是甲基，并且R5U是H，
u.式(III)，其中R3U和R5U都是甲基，
v.式(IV)，其中R5C是H，RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
w.式(IV-1)，其中RN2选自甲基、3-甲基丁(2)烯基，3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
x.式(IV)，其中R5C是甲基，RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
y.式(Ix)，其中R2是H，且RX选自甲基和S-甲基；
z.式(I)，其中R2是H，RN1是H，RN2是3-氧代-1-丙烯基；
aa.式(I-a)，
Figure GDA0003806018750000091
bb.式(II-k)，
Figure GDA0003806018750000092
cc.式(I-2)，其中R1A，RN1和R2是H，且RN2是异戊-2-烯基或顺式-羟基异戊-2-烯基，
dd.式(I)，其中RN1和R2都是H，且RN2是异戊-2-烯基或顺式-羟基异戊-2-烯基，
ee.式(II-1)，其中RO是甲基或乙-2-醇，且RN1和R2都是H；
ff.式(I-b)，
Figure GDA0003806018750000093
且其中，在每个式中，RR选自H、1′-核糖基、2′-脱氧-1′-核糖基、5′-磷酰-1′-核糖基、5′-甲硫基-1′-核糖基、1′-(2′-O-核糖基-5″-磷酸)核糖基、1′-(2′-O-核糖基)-核糖基、1′-(2′-O-甲基)核糖基。
在概括为a.、b.、…ff.、gg的上述实施方案的一些特别的实施方案中.，RR是H。
在概括为a.、b.、…ff.、gg.的上述实施方案的一些特别的实施方案中，RR是(1)-核糖基(Vb)。
在概括为a.、b.、…ff.、gg.的上述实施方案的一些特别的实施方案中，RR是(1)-脱氧核糖基(Vd)。
通过完整结构定义MR1配体化合物
在本文公开的作为MR1配体的任何核苷衍生化合物的一些非常特别的实施方案中，MR1配体化合物选自：
a.1-甲基腺苷(1)
b.2-甲基腺苷(2)
c.2′-O-甲基腺苷(3)
d.N6,N6-二甲基腺苷(4)
e.N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(5)
f.N6-异戊-2-烯基腺苷(6)
g.N6-(顺式-羟基异戊-2-烯基)腺苷(7)
h.2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊-2-烯基)腺苷(8)
i.2-甲硫基-N6-异戊-2-烯基腺苷(9)
j.N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(10)
k.2′-O-核糖基腺苷磷酸(11)
l.N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧腺苷(12)
m.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(13)
n.1-(3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑[2,1-i]嘌呤-7-基)庚-2-酮(14)
o.1-甲基鸟苷(15)
p.N2-甲基鸟苷(16)
q.7-甲基鸟苷(17)
r.2′-O-甲基鸟苷(18)
s.N2,N2-二甲基鸟苷(19)
t.2'-O-核糖基鸟苷(20)
u.3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-6-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(21)、3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-7-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(22)，或两者的混合物
v.2-((6-氧代-6,7-二氢-1H-嘌呤-2-基)氨基)丙酸酯(23)
w.嘧啶并[1,2-α]嘌呤-10(3H)-酮(M1G)(24)。
x.3-((2R,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7-(2-氧代庚基)-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(25)
y.3-(2-脱氧-β-D-赤式-呋喃戊糖基)嘧啶并[1,2-α]嘌呤-10(3H)-酮(26)
z.N2-氧代丙烯基-脱氧鸟苷(27)
aa.3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-12-氧代-5,6,10,12-四氢-3H-6,10-桥亚甲基[1,3,5]氧杂二氮芳辛并[5,4-a]嘌呤-9-甲醛(28)
bb.2′-O-甲基胞苷(29)
cc.3-甲基尿苷(30)
dd.5-甲基尿苷(31)
ee.3,2′-O-二甲基尿苷(32)
ff.6-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3-(2-氧代庚基)-1,8a-二氢咪唑[1,2-c]嘧啶-5(6H)-酮(37)
gg.N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧胞苷(38)
hh.8-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6二甲醛(39)
ii.3-甲基腺嘌呤(41)
jj.N6-甲基腺苷(42)
kk.6-甲基嘌呤(43)
ll.6-(二甲基氨基)嘌呤(44)
mm.N6-(Δ2-异戊烯基)腺嘌呤(45)
nn.N1-甲基-2′-脱氧鸟苷(46)
oo.1-甲基鸟嘌呤(47)
pp.N2-甲基-2′-脱氧鸟苷(48)
qq.7-甲基-7-脱氮-2′-脱氧鸟苷(49)
rr.O6-甲基-2′-脱氧鸟苷(50)
ss.N2-乙基-2′-脱氧鸟苷(51)
tt.5′-脱氧-5′-(甲硫基)腺苷(52)
uu.N6-甲基-2′-脱氧腺苷(53)
vv.N6-(2-羟乙基)-2′-脱氧腺苷(54)
ww.O6-(2-羟乙基)-2′-脱氧鸟苷(55)
xx.N6-琥珀酰基腺苷(56)
yy.2-(2-((3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3,7-二氢嘧啶并[2,1-i]嘌呤-7-基)氧)环亚丙基)丙二醛(57)。
本发明进一步包括本文所示修饰的变体，其可通过添加胺官能团、羟基官能团、羧酸或羧酸酯部分或卤素来修饰附接至核苷核心结构的部分而获得。任何显示上述烷基部分的化合物可以被修饰以显示如上定义的氨基烷基、羟烷基或卤代烷基。混合修饰是可能的。本文所示的测定为测试此类修饰是否能够与MR1结合以及触发或抑制MR1T细胞应答提供了坚实的基础。
在一般方面，本发明涉及一种调节，特别是在体外，MR1多肽与MR1特异性TCR分子之间的相互作用的方法。根据该方面的方法包括将MR1多肽与如上所述的MR1配体化合物接触。
选择对MR1呈递的MR1配体有反应性的T细胞、TCR、B细胞或抗体的方法
在一组实施方案中，可以在体外实施调节MR1-配体相互作用的方法，例如搜索和鉴定新的结合物，特别是对MR1-配体复合物有反应性的T细胞、B细胞或抗体。此类结合分子或编码它们的多核苷酸序列可随后被开发为药剂或诊断试剂，或者可以从先前存在的库中选择特别有用的试剂。
这些序列随后提供了对各种工具的访问，这些工具将有助于它们在制药和诊断应用中的使用。
例如，在T细胞库或B细胞库(表达多种TCR或B细胞受体(BCR)序列的细胞)的存在下，将MR-1呈递的细胞与本文公开的配体接触，且通过本领域现有技术鉴定和分离携带有对MR1-配体复合物有反应性的TCR或BCR序列的细胞。
因此，本发明的一个方面涉及一种鉴定、分离或选择对如本文所述的，特别是根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物有反应性的T细胞的方法。该方法包括以下步骤：提供对MR1有反应性的/能够特异性识别MR1的T细胞制剂；在分离步骤中，将所述T细胞制剂与包括分离的MR1或MR1呈递的细胞上的MR1的复合物接触，所述复合物与所述MR1配体化合物结合，然后，在MR1呈递的情况下分离对所述MR1配体化合物特异性有反应性的T细胞。本领域技术人员有多种方法可用于检测TCR与MHC呈递的同源抗原的结合和识别。
根据本发明该方面的备选方案，用于调节MR1多肽和MR1特异性TCR分子之间相互作用的方法可以用作鉴定和分离B细胞或其受体、抗体的方法的一部分，所述B细胞或其受体、抗体对MR1多肽具有特异性和/或对MR1上呈递的MR1配体化合物具有反应性。本发明该方面的备选方案涉及一种鉴定、分离或选择对如本文所述的，特别是根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物有反应性的B细胞或抗体的方法。该方法包括以下步骤：提供对MR1有反应性/能够特异性识别MR1的B细胞制剂；在分离步骤中，将所述B细胞制剂与分离的MR1的复合物接触，所述复合物与所述MR1配体化合物结合，然后在MR1呈递的情况下分离对所述MR1配体化合物特异性有反应性的B细胞。本领域技术人员有多种方法可用于检测BCR与MHC呈递的同源抗原的结合和识别。
根据本发明中的另一方面，用于调节MR1多肽与MR1特异性TCR分子之间的相互作用的方法可以根据化合物的存在对代谢改变的细胞，包括但不限于肿瘤细胞，进行分类的诊断方法的一部分，其中分析从患者获得的样本是否存在本文鉴定的MR1配体化合物。该方面特别用于在患有疾病，特别是肿瘤的患者中，选择TCR分子或转基因T细胞或载体以从自体T细胞群(“MR1特异性T细胞试剂”)获得转基因T细胞，其以提示本文提供的某些MR1配体的代谢谱为特征。它甚至更适合为其肿瘤已被直接分析并发现存在本文公开的某些MR1配体化合物的患者选择MR1特异性T细胞试剂。从临床医生可用的一组MR1特异性T细胞试剂中选择最合适/最特异性的MR1特异性T细胞试剂将为患者提供最适合的治疗。
或者，该方法可以使用T细胞的无偏选择，从中可以鉴定出T细胞(小得多的T细胞群)，以增加MR1特异性T细胞试剂库。
MR1配体化合物在治疗或预防MR1相关疾病中的应用
本发明促进使用能够特异性识别由不变的MR1分子呈递的MHC呈递配体并对其有反应性的T细胞的使用，从而提供不受患者MHC基因型限制的治疗选项。
本发明的一个方面提供如上文所述的或根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物，其用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病，特别是用于治疗以表达MR1的肿瘤细胞为特征的癌症。
发明人首先发现了证据证明本文公开的化合物在癌症背景下被T细胞特异性呈递和识别。因此，本文公开的MR1配体化合物使其自身用作“癌症疫苗”，因为它们的存在将增强通过MR1-T细胞相互作用实现的治疗方法。
在某些实施方案，MR1配体化合物与抗癌药同时给药。如本文公开的，发明人已经能够证明公认的的抗肿瘤药物紫杉醇或阿霉素增加了如本文所公开的MR1配体化合物的呈递，可能是通过增加癌细胞内的代谢应激。这种组合有望提供协同效应，因为它增加了组织中MR1配体的负载。
在某些实施方案，MR1配体化合物与检查点调节剂或检查点抑制剂共同给药。这种组合有望提供协同效应，因为MR1配体与MR1特异性T细胞结合的下游免疫效应通过去除抑制信号预期会增加，其在生理上存在于患者体内或可能作为额外MR1特异性T细胞疗法的一部分给药。
在特别的实施方案，化合物与包含(转基因)MR1-反应性T细胞和/或(转基因)MR1-反应性T细胞受体多核苷酸构建体的制剂结合给药(在给药之前、同时或之后给药)(例如，编码MR1-TCR的DNA表达构建体或RNA构建体或具有相同功能的病毒载体)。
可选地，可以提供编码MR1的多核苷酸表达载体。如果发现受影响的疾病组织下调MR1表达，MR1的转基因表达是增加组织的MR1表达的一种方式。
MR1配体和/编码MR1 TCR或MR1的多核苷酸表达载体可以被给药到肿瘤中、肿瘤附近或引流肿瘤部位的淋巴结内。预计与全身给药相比任何一种药剂的局部增加都是有益的。
具体来说，本发明能够给药携带转基因TCR的重组(异体或自体)T细胞，该转基因TCR特异性地能够识别MR1呈递的疾病特异性MR1配体化合物并对其反应。
本发明进一步实现分析从患者获得的T细胞样本是否存在能够识别由MR1呈递的MR1配体化合物的T细胞，以为随后的治疗给药选择性地刺激和扩增或从头设计这种MR1患者的T细胞。
本发明进一步实现向患者靶向给药本文所述的MR1配体化合物，以促进或扩大MR1特异性T细胞应答或MR1靶向T细胞疗法。本文确定的化合物可用于与以下有关的方法：
-调节MR1(主要组织相容性复合体I类相关基因蛋白1)多肽与MR1特异性T细胞受体分子之间的相互作用，其中MR1多肽与MR1配体化合物接触；
-产生MR1多聚体试剂小组，以用于鉴定和分类对呈递在非多态性MHC I相关的MR1抗原呈递分子上的MR1配体化合物反应的T细胞；
-鉴定对所述化合物有特异反应性的TCR基因以用于个性化的细胞免疫疗法。这可以通过提供从患者身上分离出来的肿瘤细胞制剂，并将其提交给基于质谱法的测定以评估化合物的存在和身份来实现在某些实施方案鉴定对本文鉴定的化合物有特异反应性的TCR基因以用于个性化细胞免疫疗法可以通过以下的一般的过程的顺序来实现：1)在肿瘤活检中进行化合物检测(根据TAA的存在对肿瘤进行分类)，然后2)根据对与MR1复合物中鉴定的TAA发生最佳反应的TCR来指导TCR介导的细胞免疫疗法。
MR1疗法与药物的组合
MR1特异性T细胞应答或MR1靶向T细胞疗法可通过与增加本文所述的MR1配体化合物的产生的药物组合而进一步促进。
以下途径是在此背景下有用的药物的靶：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、醛还原酶和醛-酮还原酶(AKR)、醛脱氢酶(ALDH)、醛氧化酶(AOX)、黄嘌呤氧化酶(XO)、短链还原酶/氧化酶(SDR)。
以下化合物类别和鉴定为该化合物类别一部分的特定药物可能是MR1 TAA在疫苗-加-药物治疗方法或MR1-T细胞-转移-加-药物治疗方法中的组合伙伴：
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)抑制剂，特别地选自由以下组成的组的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)抑制剂中的任一种：依他尼酸、Terrapin 199、Terrapin 286、氯贝丁酯、棉子酚、吲哚美辛、吡前列素、米索硝唑及磺胺吡啶。
醛-酮还原酶1C3抑制剂，特别地选自由以下组成的组的醛-酮还原酶1C3抑制剂中的任一种：N-苯甲酰邻氨基苯甲酸酯、2,3-芳基丙烯酸、刺罂粟碱(stylopne)、2′-羟基黄酮、N-苯磺酰基吲哚、N-(苯并咪唑基羰基)-哌啶、N-(吲哚基羰基)-哌啶、N-吡啶吡咯基羰基)-哌啶、N-(苯并咪唑或吲哚)苯甲酸、N-(苯基氨基)-苯甲酸酯、N-(萘氨基)-苯甲酸酯、异喹诺酮类、吲哚美辛类似物、氮或硫取代的雌烯、β-萘乙酸、酒神菊素及酒神菊素类似物。
醛脱氢酶抑制剂，特别地选自由以下组成的组的醛脱氢酶抑制剂中的任一种Ampal、苯菌灵、柠檬醛、水合氯醛、氯丙酰胺类似物类似物(NPI-1和API-1)、鬼伞素、氨腈、黄豆苷、CVT-10216,4-(二乙基氨基)苯醛(DEAB)、双硫仑、棉子酚、禾草特、硝酸甘油、帕吉林。
醛氧化酶抑制剂，特别地选自由以下组成的组的醛氧化酶抑制剂中的任一种：阿莫地喹、氯丙嗪、多潘立酮、雌二醇、非洛地平(felodipine)、氯雷他定、马普替林、甲氧氯普胺、去甲氯米帕明、去甲替林、昂丹司琼、奋乃静、丙嗪、异丙嗪、雷洛昔芬、沙美特罗、他克林、他莫西芬及硫利达嗪。
黄嘌呤氧化酶抑制剂，特别地选自由以下组成的组的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的任一种：别嘌呤醇、非布索坦、氧嘌呤醇、巯异嘌呤、托匹司他、肌醇类(植酸和肌醇(myo-inositol))。
乙二醛酶I抑制剂，特别地丙酮酸乙酯、S-p-溴代苄基谷胱甘肽环戊二酯、S-乙基谷胱甘肽、2-(8-氯-2-(4-氯苯基)-3-羟基-4-氧代色满-6-基)乙酸中的任一种。
GAPDH抑制剂，特别地棉子酚、康宁酸(庚酸)、砷酸盐、三氧化二砷、3-溴丙酮酸盐、碘乙酸盐中的任一种。
因此，本发明中的另一方面是能够调节细胞内代谢的化合物的用途，例如通过抑制脱羰作用，以增加MR1依赖性免疫应答。发明人测试的示例性药物包括但不限于紫杉醇、阿霉素、双硫仑、黄豆苷、硝基苄基硫代肌苷、鞣花酸、齐墩果酸、赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)、喷司他丁、1-脱氮腺苷和霉酚酸的组。这些和相关药物可用于预防或治疗与异常或缺乏MR1表达相关的疾病，特别地治疗或预防与表达MR1的肿瘤细胞相关的癌症疾病的复发。
根据本发明的该方面，提供优势的药物的特别地有用的实例，是能够增加活性氧(ROS)的量的药物，这导致细胞内MR1配体的过量产生。它们是：紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素、圆皮海绵内酯、卡巴他赛、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素及伊达比星。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了紫杉醇用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体组合。紫杉醇(CAS：33069-62-4)是紫杉醇小分子化疗剂，具有抑制有丝分裂的特性。紫杉醇通过与微管蛋白的β亚单位结合干扰微管的生长。由此产生的微管/紫杉醇复合物不具备分解能力。紫杉醇使活性氧(ROS)水平明显增加(Z.Yu等人，《美国化学学会·纳米(ACS Nano)》2015，9，11064；M.Li等人，《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc)》2018，140，14851；C.Dai等人，《美国化学学会·纳米》2017，11，9467；P.Zhu，等人，《美国化学学会·纳米》2018，12，3780；Jiang，H.等人，《Small》2019，15，1901787)。紫杉醇通常以，但不限于静脉注射溶液的形式给药，其量高达每治疗单位600mg。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了多西他赛用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞相关的癌症疾病，或预防此类肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体组合。多西他赛(CAS：114977-28-5)是另一种紫杉醇，在临床上公认的和批准的的抗有丝分裂化疗剂，主要用于治疗乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌患者。多西他赛以1：1的计量比与微管蛋白以高亲和力可逆地结合。它促进微管蛋白二聚体的微管组装并通过防止解聚来稳定微管。
尽管多西他赛的抗肿瘤效率很高，但由于过量的ROS产生、Ca2+内流和炎症标志物如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β(β)，及IL-6引起的全身系统和不良副作用，其使用往往受到限制(Kütük，S.G等人，《生物微量元素研究(Biol Trace Elem Res)》196，184-194，2020)。给药形式包括，用于静脉注射和肠外注射的溶液以及用于制备此类药物的粉末，其量高达每治疗单位160mg。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了埃坡霉素用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体组合。埃博霉素是一类新的化合物，可从粘细菌中分离出来或半合成和/或完全合成并表现出抗微管效应。埃博霉素的作用机制与紫杉醇相似，但在几种不同的多药耐药性肿瘤中表现出强大的抗增殖活性。埃博霉素能稳定微管并诱导细胞凋亡。一些埃博霉素和其衍生物/类似物目前正在进行临床试验。这一组的成员包括埃坡霉素A(CAS：152044-53-6)；埃坡霉素B(CAS：152044-54-7)，也称为帕土匹龙或BMS-310705(帕土匹龙的水溶性衍生物)和伊沙匹隆(第二代半合成帕土匹龙；2007年被FDA批准)或沙戈匹隆(帕土匹龙的全合成第三代类似物)，是埃坡霉素A的衍生物，在C12原子处有甲基基团。最近的研究表明埃坡霉素B导致线粒体崩溃和ROS的释放，从而促进细胞凋亡。上述化合物目前正在进行临床试验研究，目标是抗癌和促进细胞凋亡的效应；埃坡霉素D(CAS：189453-10-9)也被称为KOS-862或脱氧埃坡霉素B和KOS-1584(第二代埃坡霉素D)，是一种小分子，目前正在研究用于治疗结直肠癌、肺癌、乳腺癌、实体瘤和前列腺癌。埃坡霉素D缺乏C12-13环氧化物，且显示出比埃坡霉素A更高的治疗效力。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了圆皮海绵内酯用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。圆皮海绵内酯(CAS：127943-53-7)是一种小分子，具有与其它紫杉醇类似的稳定微管的特性。圆皮海绵内酯在治疗后会诱导ROS增加。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了卡巴他赛用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。卡巴他赛(CAS：183133-96-2)是一种小分子抗肿瘤药。卡巴他赛被给药于患有进展期前列腺癌的人，尽管其已用多西他赛治疗。卡巴他赛通过与微管蛋白结合，并促进其组装成微管，同时抑制其分解，从而调节微管的抑制作用。这导致了微管的稳定，从而干扰了有丝分裂和间期的细胞功能，因此抑制了细胞周期的进一步发展，从而引发了细胞凋亡。最近的研究表明卡巴他赛通过抑制抗氧化剂-Sestrin 3的表达来诱导ROS的产生(Kosaka T.等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》2017；8(50)：87675-87683)。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了阿霉素用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。阿霉素(CAS：23214-92-8)是一种经过充分研究和广泛适用的小分子细胞毒性蒽环类抗生素。阿霉素通过平面的蒽环类核与DNA双螺旋的特异性插接与核酸结合。阿霉素被提供以为了使播散性肿瘤病症产生消退，如但不限于急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、威尔姆斯瘤、神经母细胞瘤、软组织和骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、过渡细胞膀胱癌、甲状腺癌、胃癌、霍奇金氏病、恶性淋巴瘤和支气管癌。阿霉素也适用于原发性乳腺癌切除后有腋窝淋巴结转移迹象的女性的辅助治疗。研究表明阿霉素诱导的ROS过量产生发生在线粒体内并受线粒体NADPH氧化酶(mitoNOX)活性的调节(Asensio-López MC等人，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》2017；12(2)：e0172803)。阿霉素的给药形式包括用于静脉注射的溶液和用于制备此类的粉末，其浓度约为2mg/mL。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了柔红霉素用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。柔红霉素(CAS：20830-81-3)是一种小分子毒性蒽环类氨基糖苷类抗肿瘤药物，被批准用于治疗白血病和其它肿瘤患者。柔红霉素具有抗有丝分裂和细胞毒性活性，其作用机制如下：通过柔红霉素插入DNA链来抑制大分子的合成，与分子氧相互作用产生ROS，所述ROS通过双链断裂和拓扑异构酶II抑制以及DNA加合物的形成进一步造成DNA损伤(Al-Aamri HM.等人，《BMC癌症(BMCCancer)》2019；19(1)：179)。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了表阿霉素用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。表阿霉素(CAS：56420-45-2)是一种小分子蒽环类药物，是阿霉素的4'-表异构体，由于其干扰DNA的合成和功能的特性而具有抗肿瘤效应。表阿霉素通过碱基对之间的插入与DNA形成复合物，它通过稳定DNA-拓扑异构酶II复合物来抑制拓扑异构酶II的活性，阻止拓扑异构酶II所催化的连接-再连接反应的再连接部分。此外，表阿霉素还通过抑制DNA解旋酶的活性来干扰DNA复制和转录。进一步的研究表明表阿霉素明显增加ROS和线粒体H2O2水平，导致线粒体介导的细胞凋亡，由氧化应激增加引发(Huang，TC.等人，《细胞凋亡(Apoptosis)》23，226-236，2018)。
在本发明该方面的一个备选方案中，提供了伊达比星用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。伊达比星(CAS：58957-92-9)是一种小分子蒽环类抗肿瘤剂，提供给患有，但不限于乳腺癌、淋巴瘤和白血病的患者。(Celik H，
Figure GDA0003806018750000141
E.等人，《药学杂志(J Pharm Pharm Sci)》2008；11(4)：68-82.PMID：19183515)。
研究表明伊达比星对DNA的损伤是涉及其与P450还原酶的氧化还原循环产生ROS的机制发生的。伊达比星被发现对DNA的损伤随着药物或酶浓度的增加以及孵化时间的延长而增加。
双硫仑：在本发明该方面的一个备选方案中，提供了双硫仑用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。双硫仑(CAS号97-77-8)是一种特征明显的小分子药物，用于治疗人类的酒精中毒已有50多年。研究表明，它对真菌(S.Khan等人，《医学真菌学杂志(Jp.J.Med.Mycol)》(2007)，48，109-113)，原生动物(T.Nash和W.G.Rice，《抗菌物和化学疗法(Antimicrob Agents Chemother)》(1998)42,1488-1492)和细菌(MRSA，M.Phillips等人，《抗菌物和化学疗法》(1991)，35，785-787)有一定程度的疗效。图7所示的结果支持该化合物作为MR1T靶向治疗(即预防或治疗与异常或缺乏MR1表达相关的疾病，特别是治疗或预防与表达MR1的肿瘤细胞相关的癌症疾病的复发)的一部分在给药中的有效性。
霉酚酸：在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了霉酚酸用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。霉酚酸(CAS号24280-93-1)是一种小分子化合物，用作免疫抑制剂药物和抗增殖剂。
黄豆苷：在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了黄豆苷用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。黄豆苷是一种异黄酮类植物化学物质(CAS号552-66-9)。图7所示的结果支持该化合物作为MR1T靶向治疗的一部分在给药中的有效性。
在本发明该方面中的另一备选方案中涉及硝基苄基硫代肌苷(CAS号38048-32-7)用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防此类肿瘤细胞的复发。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了鞣花酸(CAS号476-66-4)和/或齐墩果酸(CAS号508-02-1)用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体组合。图7所示的结果支持这些化合物作为MR1T靶向治疗的一部分在给药中的有效性。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了依他尼酸用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。依他尼酸(CAS号58-54-8)是一种商品药(商品名：依地克林)被批准用于治疗由充血性心力衰竭、肝衰竭和肾衰竭等疾病引起的高血压和/或水肿。依他尼酸被发现能抑制Wnt/β-连环蛋白途径的成分，抑制对CLL细胞的选择性细胞毒性，同时也是一种谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂。药物中包含的小分子由不同的制造商以不同的给药形式提供，如口服片剂和注射溶液，剂量范围从25mg(片剂)至50mg(在50mL注射溶液中)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了Terrapin 199用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。Terrapin 199(CAS号168682-53-9)，也被称为依他司他，是一种小分子药物，在治疗骨髓增生异常综合征患者方面具有良好的活性。Terrapin 199旨在抑制谷胱甘肽S-转移酶并提高c-JunNH2末端激酶(JNK1)和ERK1/ERK2的活性，使细胞在诱导高水平凋亡的应激条件下增殖。该药物通过口服吸收(Hamilton等人《IDrugs》.2005年8月；8(8)：662-9.PMID：16044376)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了Terrapin 286用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。Terrapin 286(CAS号158382-37-7)也被称为TLK-286或Canfosamide，是一种小分子，包含在药物中，并显示出有前景作为对抗各种癌症形式的药剂的活性(Rosen LS等人，《临床癌症研究(ClinCancer Res.)》2004年6月1日；10(11)：3689-98.doi：10.1158/1078-0432.CCR-03-0687.PMID：15173075)。TLK-286被激活时，分裂成两个片段，一个与细胞成分如RNA和DNA反应导致细胞死亡，另一个是谷胱甘肽类似物，从而阻断谷胱甘肽S-转移酶(Kavanagh JJ等人，《国际妇科癌症杂志(Int J Gynecol Cancer)》2005年7至8月；15(4)：593-600.doi：10.1111/j.1525-1438.2005.00114.x.PMID：16014111)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了氯贝丁酯用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。氯贝丁酯(CAS号637-07-0)是一种纤维酸衍生物，用于市售药物，这些药物被提供用于治疗III型高脂蛋白血症和高甘油三酯血症。它抑制谷胱甘肽S-转移酶的活性，另外还能激动软组织中的PPAR-α受体。这种激动最终导致基因表达的改变，从而增加β-氧化。该化合物以胶囊(500-1000mg)形式供口服。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了棉子酚用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。棉子酚(CAS号303-45-7)是一种小分子药剂，具有谷胱甘肽-S-转移酶的抑制特性，在治疗非小细胞肺癌患者方面具有很大潜力。此外，棉子酚可诱导细胞周期停滞在G0/G1期并抑制细胞信号酶，从而抑制DNA复制导致细胞凋亡并抑制细胞生长。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了吲哚美辛用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。吲哚美辛(CAS号53-86-1)是一种经过充分研究的具有抗炎作用的小分子药物。吲哚美辛是环氧化酶(COX)或前列腺素G/H合成酶的两种异构体的非特异性和可逆性抑制剂。化学批量合成由几个制造商进行的，大多数市售的产品是口服给药，但不限于此，每次治疗的剂量的范围从25mg至75mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了米索硝唑用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。米索硝唑(CAS号13551-87-6)是药物中的一种小分子化合物，具有谷胱甘肽-S-转移酶的抑制特性，并在治疗患有不同肿瘤缺氧的患者方面显示出很大的潜力。米索硝唑使缺氧细胞对电离辐射的细胞毒性作用敏感，导致DNA合成受到抑制。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了磺胺吡啶用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。磺胺吡啶(CAS号599-79-1)是一种小分子药剂，具有谷胱甘肽-S-转移酶抑制和抗炎作用。该药物以片剂形式和直肠途径给药，剂量为每片约500mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了N-苯甲酰邻氨基苯甲酸酯用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。N-苯甲酰邻氨基苯甲酸酯，例如，但不限于市售的甲氯芬那酸，包括一组抑制AKR1C3的化合物，AKR1C3已知会催化刺激肿瘤生长的反应。这些药物以片剂形式提供，供口服，但不限于此。剂量，特别是甲氯芬那酸的剂量范围为每个治疗单位50mg至100mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了芳基异丙酸用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。芳基异丙酸，例如，但不限于市售的布洛芬、萘普生和氟比洛芬，包括另一组对AKR1C3有抑制作用的化合物。这些药物主要通过口服给药，但不限于此，其剂量范围为每个治疗单位50mg至1500mg(Gazvoda M等人，《欧洲药物化学杂志(Eur J Med Chem.)》2013年4月；62：89-97.doi：10.1016/j.ejmech.2012.12.045。电子出版，2013年1月3日，PMID：23353746)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了2′-羟基黄酮用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。2′-羟基黄酮(2-(2-羟基苯基)色烯-4-酮；CAS号号35244-11-2)是一种具有AKR1C3抑制性的小分子化合物，与抑制肿瘤生长和/或肿瘤复发有关。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了N-苯磺酰基吲哚、N-(苯并咪唑基羰基)-哌啶、N-(吲哚基羰基)-哌啶、N-吡啶吡咯基羰基)-哌啶、N-吡啶吡咯基羰基)-哌啶用于治疗与肿瘤细胞表达MR1有关的癌症疾病，或预防此类肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。N-苯磺酰基吲哚、N-(苯并咪唑基羰基)-哌啶、N-(吲哚基羰基)-哌啶、N-吡啶吡咯基羰基)-哌啶、N-吡啶吡咯基羰基)-哌啶是化合物，其衍生物是非甾体化合物AKR1C3抑制剂(TrevorM.Penning，《治疗性专利专家意见(Expert Opin Ther Pat)》2017年12月；27(12)：1329-1340.doi：10.1080/13543776.2017.1379503)。在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了β-萘乙酸用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。β-萘乙酸包括一组化合物，对AKR1C3显示出选择性的抑制特性(Adeniji等人，《药物化学杂志》2016；59(16)：7431-7444.doi：10.1021/acs.jmedchem.6b00160)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了酒神菊素用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。酒神菊素衍生物显示出抑制AKR1C3的很高的潜力(Kshitij V.等人，《药物化学杂志》2019，62，3590-3616)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了AMPAL用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。4-氨基-4-甲基-2-戊炔-1-醛(AMPAL；CAS号121188-32-7)，是一种已知抑制醛脱氢酶活性并显示抗肿瘤活性的小分子化合物。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了苯菌灵和多菌灵用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。苯菌灵(N-[1-[(丁基氨基)羰基]-1H-苯并咪唑-2-基]-，甲酯；CAS号17804-35-2)和其代谢物多菌灵(N-1H-苯并咪唑l-2-基-，甲酯；CAS号10605-21-7)是已知抑制醛脱氢酶活性的小分子化合物。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了柠檬醛用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。柠檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯；CAS号5392-40-5)是一种天然存在的化合物，存在于草药和柑橘类水果中，具有抑制醛脱氢酶的特性。柠檬醛已经被用于膳食补充剂。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了水合氯醛用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。水合氯醛(2,2,2-三氯乙烷-1,1-二醇；CAS号302-17-0)是抑制醛脱氢酶的小分子化合物，被提供用于治疗失眠。已知有多个制造商；给药形式包括口服的胶囊和糖浆剂，剂量约为每粒500mg和100mg/mL。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了氯丙酰胺类似物用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。氯丙酰胺类似物(1-(4-氯苯磺酰基)-3-丙基脲；94-20-2)及其类似物是已知的不可逆地抑制醛脱氢酶的小分子化合物，并提供用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了氨腈用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。氨腈(钙(氮杂亚甲基亚甲基)氮杂化物，CAS号420-04-2)以柠檬酸钙盐的形式是药物中含有的小分子，在市场上可以买到并提供给酒精中毒的治疗。给药形式主要是，但不限于此，用于口服的片剂，每单位剂量为50mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了CVT-10216用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。CVT-10216(3-[[[3-[4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基]-4-氧代-4H-1-苯并吡喃-7-基]氧代]甲基]-苯甲酸；CAS号1005334-57-5)是一种小分子和黄豆苷的类似物，具有醛脱氢酶抑制特性。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了DEAB用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。DEAB(4-(二乙基氨基)苯醛；CAS号120-21-8)是癌症干细胞生物学中常用的醛脱氢酶的选择性抑制剂。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了硝酸甘油用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。硝化甘油(1,3-双(硝氧基)丙-2-基硝酸盐；CAS号55-63-0)是一种具有醛脱氢酶抑制特性的小分子，用于治疗患有疼痛和高血压等疾病的患者。硝化甘油是一种特征明显的化合物，于2000年首次获得批准。大量的化学合成程序是已知的；关于该化合物的大量药理学和毒理学数据是存在的(Ignarro LJ等人，《美国国家科学院汇刊》，2002年6月11日；99(12)：7816-7.doi：10.1073/pnas.132271799，PMID：12060725；PMCID：PMC122975)。硝酸甘油有多种给药形式，包括但不限于喷雾形式、舌下片剂形式、静脉注射形式、缓释片剂形式、透皮形式和胶囊。剂量取决于给药形式，并且可从200μg至160mg之间变化。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了帕吉林用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。帕吉林(苯基(甲基)(2-丙炔-1-基)胺；CAS号555-57-7)是一种具有醛脱氢酶抑制性的小分子药物。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了阿莫地喹用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。阿莫地喹(4-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]-2-[(二乙基氨基)甲基]苯酚；CAS号86-42-0)是一种具有醛氧化酶抑制特性的小分子。阿莫地喹是一种特征明显的化合物，其合成过程已超过70年。阿莫地喹被用作抗疟疾和抗炎药物，通过口服给药，剂量约为每个治疗单位100mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了氯丙嗪，丙嗪和奋乃静用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。氯丙嗪([3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)丙基]二甲胺；CAS号50-53-3)，丙嗪(二甲基[3-(10H-吩噻嗪-10-基)丙基]胺；CAS号58-40-2)，且奋乃静(2-{4-[3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)丙基]哌嗪-1-基}-1-乙醇；CAS号58-39-9)是药物中含有的小分子，相似地表现出醛氧化酶抑制特性，且被提供用于治疗精神病性疾病。氯丙嗪，丙嗪和奋乃静由各种已知的制造商以不同的给药形式生产和销售，例如，但不限于，口服的片剂、静脉注射的溶液以及糖浆剂，剂量范围为每个治疗单位2mg至200mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了多潘立酮用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。多潘立酮(5-氯-1-{1-[3-(2-氧代-2,3-二氢-1H-1,3-苯二唑-1-基)丙基]哌啶-4-基}-2,3-二氢-1H-1,3-苯二唑-2-酮；CAS号57808-66-9)是一种药物中含有的小分子，作为多巴胺受体的特异性阻断剂，并具有醛氧化酶抑制特性。多潘立酮的合成是专家已知的(美国专利：4,066,772；4,110,333；4,126,687；4,126,688；4,160,836和4,175,129；杨森制药公司(JanssenPharmaceutica NV))。给药形式包括口服的片剂，剂量约为每个治疗单位10mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了雌二醇用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。雌二醇((1S,3aS,3bR,9bS,11aS)-1-羟基-11a-甲基-1H,2H,3H,3aH,3bH,4H,5H,9bH,10H,11H,11aH-环戊烯[a]菲-7-基基苯甲酸酯；CAS号50-28-2)是一种天然存在的小分子，也包含在用于控制雌激素减少的疾病的几种激素疗法中提供的药物中。此外，雌二醇还具有醛氧化酶抑制特性。提供了多种给药形式：用于口服的片剂、喷雾剂、凝胶剂和乳膏，以及注射剂和阴道环或透皮贴剂。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了异丙嗪用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。异丙嗪(二甲基[1-(10H-吩噻嗪-10-基)丙-2-基]胺；CAS号60-87-7)是指包含在用于治疗各种疾病，但不限于此的药物中的小分子，如急性过敏反应、上呼吸道症状、过敏性休克、疼痛、恶心和呕吐，且对醛氧化酶有抑制效应。这种化合物为专家所熟知，在近70年前就被美国食品和药物给药局批准。大量的化学合成是有据可查的，各种制造商以不同的给药形式提供该化合物，如口服片剂、静脉注射的溶液或直肠给药的栓剂，剂量范围为每治疗单位0.6mg/mL至50mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了沙美特罗用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。沙美特罗(CAS号89365-50-4)是一种小分子化合物，对醛氧化酶有抑制效应。该化合物包含在为治疗哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)而提供的药物中。患有上述疾病的患者通常会吸入这种药物。给药形式包括片剂，剂量为每个治疗单位20μg至50μg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了雷洛昔芬用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。雷洛昔芬(CAS号84449-90-1)是一种有据可查的小分子，具有醛氧化酶抑制特性，可介导对乳腺癌和子宫组织的抗雌激素效应以及对骨骼的雌激素效应，即保持骨矿物质密度，并降低乳腺癌的风险。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了他克林用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。他克林(1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺；CAS号321-64-2)是一种小分子药物，作为呼吸兴奋剂提供，用于治疗阿尔茨海默氏病以及其它中枢神经系统疾病。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了他莫西芬用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。他莫西芬(CAS号10540-29-1)是一种小分子药物，用于治疗各种类型的癌症疾病，例如，但不限于，乳腺癌、卵巢癌和硬纤维瘤。他莫西芬通过口服给药患者，的剂量范围从每个治疗单位10mg至40mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了别嘌呤醇用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。别嘌呤醇(CAS号315-30-0)是一种特征明显的小分子药物，最初被批准用于治疗痛风。别嘌呤醇是次黄嘌呤的结构类似物，在口服和随后的摄入中会代谢成其活性代谢物氧嘌呤醇(别黄嘌呤)(CAS号2465-59-0)然后作为黄嘌呤氧化酶抑制剂导致核苷酸浓度增加。剂量可以根据提供药物的制造商而变化，范围从每个治疗单位100mg至300mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了非布索坦用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。非布索坦(CAS号144060-53-7)是一种小分子药物，提供给高尿酸血症患者。非布索坦是一种黄嘌呤氧化酶/脱氢酶抑制剂，在患者口服和摄入后会降低血清尿酸(Stamp LK等人，《内科杂志(InternMed J)》2007年4月；37(4)：258-66)。给药形式包括用于口服片剂，剂量范围从每个治疗单位40mg至120mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了巯异嘌呤用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。巯异嘌呤(CAS号5334-23-6)是别嘌呤醇的备选方案。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了托匹司他用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。托匹司他(CAS号577778-58-6)为治疗高尿酸血症和痛风而开发。该小分子药物自2013年起在日本获得批准，并以Topiloric和Uriadec为名进行销售。该药物通过口服被吸收。托匹司他通过竞争性抑制黄嘌呤氧化酶而发挥其效应。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了肌醇类用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。肌醇类，特别地植酸(CAS号83-86-3)和肌醇(myo-inositol)(环己烷-1,2,3,4,5,6-六醇；CAS号87-89-8)是包含在药物中的小分子，在治疗各种疾病如抑郁症、精神障碍、预防癌症和心血管钙化以及提高生育能力方面显示出很大的潜力。以肌醇为基础或由肌醇组成的各种药物已经获得了FDA的批准，这些药物以上述基本结构表示。剂量可以根据制造商的不同而变化，通常范围从每治疗单位200mg至500mg。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了丙酮酸乙酯用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。丙酮酸乙酯(乙基2-氧代丙酸酯；CAS号617-35-6)是一种小分子和新型抗炎剂，用于治疗患有严重炎症的患者。丙酮酸乙酯是乙二醛酶I抑制剂，并且此外还能抑制细胞因子，如TNF-α和HMGB1的释放。研究表明，它具有良好的抗炎和组织保护活性(Kou,Q.Y.等人，《中国急救医学(ChineseCritical Care medicine)》20(1)，34-36)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了S-p-溴代苄基谷胱甘肽环戊二酯用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。S-对-溴代苄基谷胱甘肽环戊二酯(N-[S-[(4-溴苯基)甲基]-N-L-γ-谷胱甘肽-L-半胱氨酰]-甘氨酸二环戊基酯；CAS号166038-00-2)是一种对乙二醛酶I有抑制效应的小分子，并能进一步诱导细胞凋亡(Thornalley PJ等人，《生物化学药理学(Biochem Pharmacol)》1996年5月17日；51(10)：1365-72.doi：10.1016/0006-2952(96)00059-7.PMID：8787553)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了三氧化二砷用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。三氧化二砷(二砷氧烷；CAS号1327-53-3)，是一种小分子化疗剂，通过静脉注射给黄油癌症，特别是APL的患者，其剂量浓度的范围从1mg/mL至2mg/mL，三氧化二砷通过靶向和抑制硫氧还蛋白和谷胱甘肽体系，引起形态学变化以及DNA片段化，导致癌细胞凋亡(Lu J.等人，《美国国家科学院汇刊》，2007年7月24日；104(30)：12288-93.doi：10.1073/pnas.0701549104.电子出版，2007年7月18日.PMID：17640917；PMCID：PMC1940330)。
在本发明该方面中的另一备选方案中，提供了3-溴丙酮酸盐用于治疗与表达MR1的肿瘤细胞有关的癌症疾病，或预防这种肿瘤细胞的复发，特别是与MR1反应性T细胞、MR1反应性T细胞受体多核苷酸构建体和/或编码MR1的多核苷酸表达载体联合。3-溴丙酮酸盐(3-溴-2-氧代丙酸；CAS号1113-59-3)是一种选择性吸收的癌细胞糖酵解抑制剂，且另外触发细胞凋亡诱导因子的释放(Cal M.等人《细胞(Cells)》2020；9(5)：1161，2020年5月8日出版，doi：10.3390/cells9051161)。
本发明中的另一方面涉及到促进核碱基积累从而增加抗原的可用性的药物的用途。这些药物包括但不限于腺苷脱氨酶1(ADA1)、赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)的抑制剂，以及ADA1和ADA2、喷司他丁(CAS号53910-25-1)和1-脱氮腺苷的抑制剂。它们还包括脱氢酶1(IMPDH1)的抑制剂，如但不限于霉酚酸(CAS号24280-93-1)。图7所示的结果支持这些化合物作为MR1T靶向治疗的一部分在给药中的有效性。
本发明中的另一方面涉及根据本发明第一方面本文鉴定的MR1配体化合物，特别由权利要求1的任一式或其在从属权利要求和表1中给出的具体实施方案鉴定的MR1配体，其用作引起或促进MR1T细胞应答的疫苗，特别是用于治疗或预防癌症复发。在特定的实施方案中，本文鉴定的MR1配体化合物可被用作组合药物，以刺激和增强用于细胞治疗的MR1T细胞的抗肿瘤活性，及/或可与免疫刺激化合物和/或检查点调节剂组合使用。
本文鉴定的MR1配体化合物也可作为疫苗用于没有明显疾病，但有发展这种疾病的倾向的受试者。例如人类受试者可以在本文所述的每一种恶性疾病发生之前用预防性疫苗进行治疗。
同样，本发明该方面的替代方案涉及根据本发明第一方面本文鉴定的MR1配体化合物，特别由权利要求1的任一式或其在从属权利要求和表1中给出的具体实施方案鉴定的MR1配体，用于与肿瘤治疗剂组合的组合药物中。
本文提供的方法和化合物的一个重要优势涉及测试和向患者提供TAA的能力而不论MHC单倍型如何。TAA是癌症患者的临床相关抗肿瘤免疫应答的靶。然而，迄今为止大多数鉴定的TAA由多态的MHC分子呈递的肽。MHC基因的极端多态性限制了TAA靶向那些表达某些MHC等位基因的患者。靶向与MR1非多态性抗原呈递分子结合的TAA克服了这一限制，并适用于所有携带表达MR1的肿瘤的患者。此外，由于肿瘤细胞可能表达不同的非肽类TAA，这种策略提供了靶向同一肿瘤细胞显示的多种抗原的可能性，从而最大限度地减少了选择性免疫压力下肿瘤逃逸变体的潜在发生。因此，鉴定MR1呈递的TAA，与识别这些抗原的特异性MR1限制性TCR相匹配，对癌症免疫治疗有重要意义。
在某些实施方案中，本文鉴定的MR1配体化合物被提供用于与免疫检查点调节剂联合使用，特别是与免疫检查点抑制剂联合使用。
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是易普利姆玛(Yervoy；CAS号：477202-00-9)。
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)与其受体PD-L1相互作用的抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自临床可用的抗体药物纳武单抗(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)；CAS号946414-94-4)、派姆单抗(默克(Merck)公司；CAS号1374853-91-4)、匹地利珠单抗(CAS号1036730-42-3)、阿特珠单抗(罗氏制药公司(Roche AG)；CAS号1380723-44-3)和阿维单抗(德国默克基团(MerckKGaA)；CAS号1537032-82-8)。
在某些实施方案中，本文鉴定的MR1配体化合物被提供用于组合使用，其中本文鉴定的任何MR1配体化合物是第一组合伙伴，并且
a)对呈递MR1配体化合物的MR1分子有反应性的修饰T细胞和/或编码MR1的核酸表达载体是第二组合伙伴，以及
b)免疫检查点调节剂，特别地免疫检查点抑制剂是第三组合伙伴。
这样的组合很可能是在治疗过程中在不同时间和不同给药形式下应用组合伙伴的形式。
本文鉴定的化合物由每个肿瘤患者的肿瘤细胞呈递，它代表了一种对肿瘤进行分类的新方法。这种分类对于选择适当的MR1T衍生的TCR用于个性化TCR基因疗法是有意义的。
肿瘤患者也可以用先前在同一患者的肿瘤细胞中检测到的选定化合物进行接种。这种治疗的目的是激发和/或刺激对该化合物有特异性的MR1T细胞，从而能够识别和杀死肿瘤细胞。
本文所述的一些MR1配体化合物也存在于自身免疫和代谢疾病的患者的组织中，所述疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、动脉硬化、炎症性肠病和多发性硬化症。一般来说，具有活性氧(ROS)异常生成的疾病的特征在于以下描述的MR1结合化合物的积累。在这些情况下，在这些疾病期间受到刺激的自反应性MR1T细胞代表了在治疗环境中可能被抑制的大量的T细胞群。本发明人预测，以所述的肿瘤免疫疗法为模板可以找到适当的治疗干预形式。因此由于相同类型的MR1配体的积累而可以进行类似治疗的疾病类型可以扩大。
本发明中的另一方面涉及检测本文鉴定的作为疾病分类方法的一部分的MR1配体化合物，其中根据本发明的至少一种MR1配体化合物的存在在来自患者的样本中被鉴定。就癌症患者而言，从新鲜肿瘤样本中提取的这些化合物的鉴定被认为是一种诊断标志物。在某些实施方案中，本文鉴定的TAA MR1配体化合物可用于指导细胞免疫疗法和与其它治疗干预措施相组合的疫苗接种，换言之，一旦鉴定肿瘤中存在MR1配体，可以用个性化的免疫治疗干预措施治疗患者，包括i)给药能够促进本文鉴定的MR1T细胞刺激化合物积累的药物，ii)给药选定的TAA MR1配体化合物，iii)单独或与其它肿瘤治疗剂组合的MR1 TCR介导的细胞疗法。
本发明还涉及一种研究方法，旨在鉴定对MR1表达细胞有反应性的T细胞。这包括一种从正常捐赠者或患有癌症、代谢或自身免疫性疾病的患者的外周血中分离出MR1限制性T细胞的方法，该方法通过使用负载到MR1多聚体分子上的化合物进行分选。该细胞来源包括但不限于从组织活检中分离的T细胞。
本发明还涉及到迅速鉴定上述T细胞所表达的所述TCR基因和蛋白质序列的可能性。
在某些方面，本发明的核心是鉴定与非多态性MR1分子结合的新型化合物类别。本文鉴定的一些化合物调节MR1的表面表达。本文鉴定的一些化合物(不一定与发现的调节MR1表面表达的化合物相同)是抗原，刺激限于MR1的特异性人类T细胞。本文鉴定的一些化合物是从肿瘤细胞中分离出来的，它们被纯化、鉴定并生产出合成类似物。显示抗原活性的化合物，当与MR1分子联合呈递时，会刺激本发明人发现的人类T细胞群，并称之为MR1T细胞。本发明的应用包括，但不限于以下方法。
i)刺激化合物-特异性T细胞，以诱导预防性免疫应答的方法，
ii)刺激化合物-特异性T细胞，以诱导治疗性免疫应答的方法，
iii)鉴定和分离对化合物有反应性的T细胞的方法，
iv)调节(增加或减少)细胞内或由细胞呈递的特定化合物的量的方法，
v)根据化合物的存在对代谢改变的细胞进行分类的方法，包括但不限于肿瘤细胞。
因此，在某些方面和实施方案中，本发明涉及本文鉴定的MR1相关化合物的用途，用于指导免疫疗法的个性化干预、细胞免疫疗法、高危人群的疫苗接种策略以及用于包括癌症在内的几种疾病的诊断测试。
新型的T细胞受体
本发明中的另一方面涉及新型的分离的T细胞受体。
根据本发明的分离的T细胞受体(TCR)由T细胞受体(TCR)的α链和TCR的β链，或γ和δ链构成。TCR特异性地结合至并识别本文所述的，特别是根据权利要求1至9中任一项所述的与MR1多肽结合的MR1配体化合物。
发明人先前已公开了MR1特异性T细胞受体序列(PCT/EP2019/074284，作为WO2020053312A1公布，并入本文作为参考)，在这些先前公布的TCR特异性识别MR1-配体复合物的范围内，可将其视为包含在前述定义中。因此，WO2020053312A1中公开的、由SEQ IDNO 1和2、3和4、5和6、13和25、14和26、15和27、16和28、17和29、18和30、19和31、20和32、21和33、22和34、23和35、24和36以及61和62的关联形成的TCR被放弃。
发明人发现，在MR1呈递的情况下，本文公开的TCR可能能够与一个以上的MR1配体化合物结合。在该方面，术语“特异性结合”包括MR1特异性TCR，该TCR不仅与一种结合而且可能与本文公开的若干配体结合。
如果在与MR1和配体化合物相互作用后，这种TCR诱导的T细胞的激活程度高于在不存在所述MR1配体的情况下测得的激活程度，就可以确定所述TCR是否特异性结合并识别MR1配体化合物。这种差异将具有统计学意义，其P值小于或等于0.05(P≤0.05)。T细胞激活可以用以下任何一种测量方法进行评估：细胞因子释放、趋化因子释放、增殖、激活标志物的表达、靶细胞杀伤、转录因子或报告基因的诱导。
为了提供由本文声称的其与MR1-MR1配体复合物结合的定义而提供的TCR的定义，用于确定激活阈值以及TCR对MR1配体复合物的特异性，应按照下面的方法部分(激活测定)中的规定确定，如果发现对MR1配体有统计学意义上的积极效应，特别是如果差异至少为2倍，更特别是如果差异至少为10倍，则确定为积极。
在某些实施方案中，本文提供的分离的TCR能识别与MR1结合的下列化合物：
a.1-甲基腺苷(1)；
b.2-甲基腺苷(2)；
c.2′-O-甲基腺苷(3)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
d.N6,N6-二甲基腺苷(4)，条件是由SEQ ID NO 1和2以及由22和34构成的TCR被放弃；
e.N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(5)，条件是所述由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
f.N6-异戊烯基腺苷(6)，条件是由SEQ ID NO 1和2、16和28及22和34构成的TCR被放弃；
g.N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(7)；
h.2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(8)，条件是由SEQ ID NO 1和2、16和28以及22和34构成的TCR被放弃；
i.2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷(9)；
j.N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(10)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
k.2′-O-核糖基腺苷(磷酸)(11)；
l.N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧腺苷(12)，条件是由SEQ ID NO 1和2、16和28及22和34构成的TCR被放弃；
m.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(13)，条件是由SEQ ID NO 16和28构成的TCR被放弃；
n.1-(3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑[2,1-i]嘌呤-7-基)庚-2-酮(14)；
o.N2-甲基鸟苷(16)；
p.7-甲基鸟苷(17)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
q.2′-O-甲基鸟苷(18)；
r.N2,N2-二甲基鸟苷(19)，条件是由SEQ ID NO 1和2构成的TCR被放弃；
s.2′-O-核糖基鸟苷磷酸(20)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
t.3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-6-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(21)，条件是由SEQ ID NO 16和28构成的TCR被放弃；
u.3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-7-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(22)，条件是由SEQ ID NO 16和28构成的TCR被放弃；
v.1-甲基鸟苷(24)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
w.3-((2R,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7-(2-氧代庚基)-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(25)；
x.2′-O-甲基胞苷(29)；
y.3-甲基尿苷(30)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
z.5-甲基尿苷(31)；
aa.3,2′-O-二甲基尿苷(32)；
bb.辫苷(33)；
cc.怀丁苷(34)；
dd.羟基怀丁苷(35)；
ee.假尿苷(36)；
ff.6-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3-(2-氧代庚基)-1,8a-二氢咪唑[1,2-c]嘧啶-5(6H)-酮(37)；
gg.N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧胞苷(38)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
hh.6-甲基巯基嘌呤(40)，条件是由SEQ ID NO 16和28、22和34以及24和36构成的TCR被放弃；
ii.N6-甲基腺苷(42)；
jj.6-甲基嘌呤(43)；
kk.6-(二甲基氨基)嘌呤(44)；
ll.N6-(Δ2-异戊烯基)腺嘌呤(45)；
mm.1-甲基鸟嘌呤(47)；
nn.N2-甲基-2′-脱氧鸟苷(48)；
oo.5′-脱氧-5′-(甲硫基)腺苷(52)；
pp.N6-甲基-2′-脱氧腺苷(53)，条件是由SEQ ID NO 3和4构成的TCR被放弃；
qq.N6-(2-羟乙基)-2′-脱氧腺苷(54)，条件是由SEQ ID NO 3和4构成的TCR被放弃。
在某些实施方案，本发明提供的T细胞受体(TCR)识别下列与MR1结合的化合物：
a.N6-异戊烯基腺苷(6)，特别地，其中TCR包括由SEQ ID 99和100构成的CDR，特别地，其中TCR包括以SEQ ID 97和98为特征的多肽链；
b.N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧腺苷(12)，特别地，其中TCR包括由SEQ ID 99和100，或103和104，或108和108，或111和112，或123和124构成的CDR，特别地，其中TCR包括以SEQ ID 97和98，或101和102，或105和106，或109和110，或121和122为特征的多肽链；
c.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(13)，特别地，其中TCR包括由SEQ ID 99和100，或103和104，或107和108，或111和112，或123和124构成的CDR，特别地，其中TCR包括以SEQ ID 97和98，或101和102，或105和106，或109和110，或121和122为特征的多肽链；
d.嘧啶并[1,2-a]嘌呤-10(3H)-酮(24)，特别地，其中TCR包括由SEQ ID 99和100，或103和104，或111和112构成的CDR，特别地，其中TCR包括以SEQ ID 97和98，或101和102，或109和110为特征的多肽链；
e.N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧胞苷(38)，特别地，其中TCR包括由SEQ ID 111和112，或123和124构成的CDR，特别地，其中TCR包括以SEQ ID 109和110，或121和122为特征的多肽链；
f.6-甲基巯基嘌呤(40)，特别地，其中TCR包括由SEQ ID 107和108构成的CDR，特别地，其中TCR包括以SEQ ID 105和106为特征的多肽链。
发明人成功地提供了对MR1和MR1-MR1-配体复合物有特异反应性的新型的TCR。本发明提供了一种分离的T细胞受体(TCR)蛋白异二聚体，包括TCRα链和TCRβ链，TCRα链和TCRβ链各自以CDR3序列为特征，TCR蛋白异二聚体以一对α链和β链序列为特征，这些序列选自SEQ ID No 99和100、103和104、107和108、111和112、115和116、119和120、123和124、127和128、131和132。
在其特定的实施方案中，TCRα链和TCRβ链选自SEQ ID No 97和98、101和102、105和106、109和110、113和114、117和118、121和122、125和126及129和130的一对α链和β链氨基酸序列。的(见表3B)，或与所述一对α链和β链氨基酸序列至少85％(≥90％，95％，98％)相同并且具有与原始TCR相同的生物活性的序列。
本发明进一步提供了编码如前所述的新型的TCR的核苷酸序列。在特定的实施方案中，该多核苷酸是DNA表达载体。在另一特定的实施方案中，编码TCR的多核苷酸是RNA分子，特别是稳定的信使RNA分子。在另一特定的实施方案中，编码TCR的多核苷酸是病毒载体。
本发明中的另一方面涉及表达上述结合特性定义的TCR的分离的T细胞，或其序列，或两者，或编码它们的多核苷酸，用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病，特别是用于治疗癌症。
该方面的一个特别的应用是其在以MR1表达为特征的癌症中的用途。
在特定的实施方案中，将根据本发明使用的分离的T细胞和/或多核苷酸与本文所述的，特别是根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物共同施用。
可替代地，提供用于治疗癌症的本文所述的，特别地根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物，与PCT/EP2019/074284中所述的表达MR1特异性TCR的分离的T细胞共同给药(在给药之前、同时或之后给药)，该TCR包括由表3中的同一行鉴定的一对α和βCDR3序列。特别由SEQ ID NO 1和2，3和4，5和6，13和25，14和26，15和27，16和28，17和29，18和30，19和31，20和32，21和33，22和34，23和35，24和36以及61和62构成的MR1特异性TCR和/或编码所述MR1特异性TCR的多核苷酸，或与所述一对α链和β链氨基酸序列至少85％(≥90％，95％，98％)相同并具有与原始TCR相同的生物活性的序列。
本发明进一步提供了分离的T细胞和/或用于前段所述的用途的多核苷酸，其中表达所述TCR的所述分离的T细胞和/或多核苷酸与药物化合物同时给药，该药物化合物选自紫杉醇，阿霉素，多西他赛，卡巴他赛，柔红霉素，表阿霉素，伊达比星，双硫仑，鞣花酸，喷司他丁和霉酚酸(MPA)阿莫地喹，氯丙嗪，多潘立酮，雌二醇，非洛地平，氯雷他定，马普替林，甲氧氯普胺，去甲替林，昂丹司琼，奋乃静，丙嗪，异丙嗪，雷洛昔芬，沙美特罗，他克林，他莫西芬和硫利达嗪，别嘌呤醇，非布索坦，巯异嘌呤，托匹司他，肌醇类(植酸和肌醇(myo-inositol))。
在特定的实施方案中，表达所述TCR的所述分离的T细胞和/或多核苷酸与药物化合物同时给药，该药物化合物选自紫杉醇，阿霉素，双硫仑，及MPA，用于与异常或缺乏MR1表达相关的疾病的治疗或预防，特别地与表达MR1的肿瘤细胞相关的癌症疾病的复发的治疗或预防。
在更特定的实施方案中，表达所述TCR的所述分离的T细胞和/或多核苷酸与药物化合物同时给药，该药物化合物选自紫杉醇和阿霉素，用于与异常或缺乏MR1表达相关的疾病的治疗或预防，特别地与表达MR1的肿瘤细胞相关的癌症疾病的复发的治疗或预防。
本发明进一步提供了化合物8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛，由发明人首次合成并显示为MR1配体。
医学治疗、剂型和盐类
同样，在本发明的范围内，是一种在需要的患者中治疗与缺乏MR1特异性T细胞应答或与MR1特异性T细胞应答过多相关的病症的方法，包括向患者施用如上详细说明的化合物。
同样，提供一种用于预防或治疗与缺乏MR1特异性T细胞应答或与MR1特异性T细胞应答过多相关的病症的剂型，包括根据本发明的上述任何方面或实施方案中任一项的非拮抗剂配体或反义分子。
本领域技术人员知道，任何特别提到的药物都可以作为所述药物的药学上可接受的盐存在。药学上可接受的盐包括电离的药物和一个带相反电荷的反离子。药学上可接受的阴离子盐形式的非限制性实例包括乙酸盐、苯甲酸盐、贝斯特酸盐、比特率、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、依地酸盐、依地酸盐、栓酸盐、酯酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐碘化物、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、曼德勒盐、甲磺酸盐、甲基溴、甲基硫酸盐、粘液酸盐、硝酸盐、帕莫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、水杨酸盐、双水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、对苯二甲酸盐、三硫酸盐和戊酸盐。药学上可接受的阳离子盐形式的非限制性实例包括铝、苄胺、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、麦卢姆、钾、普鲁卡因、钠、色胺酸和锌。
剂型可用于肠道给药，如鼻腔、口腔、直肠、透皮或口服给药，或作为吸入形式或栓剂。或者，也可以使用肠外给药，如皮下、静脉、肝内或肌肉注射形式。可选的是，可以存在一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
局部给药也在本发明的有利用途范围内。本领域技术人员知道提供局部制剂的广泛的可能配方，以Benson和Watkinson(编辑)，《局部和透皮给药：原理和实践(Topical andTransdermal Drug Delivery:Principles and Practice)》(第一版，Wiley 2011，ISBN-13：978-0470450291)；和《Guy和Handcraft：经皮给药系统：修订和扩展(Guy andHandcraft:Transdermal Drug Delivery Systems:Revised and Expanded)》(第二版，CRC出版社2002，ISBN-13：978-0824708610)；Osborne和Amann(编辑)：局部给药制剂(TopicalDrug Delivery Formulations)(第1版，CRC出版社1989；ISBN-13：978-0824781835)的内容为例。
药物组合物和给药
本发明中的另一方面涉及一种药物组合物，该组合物包括本发明的上下文下所述的化合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。在进一步的实施方案中，该组合物包括至少两种药学上可接受的载体，如本文所述的载体。
在本发明的某些实施方案中，本发明的化合物通常被配制成药物剂型，以提供易于控制的药物剂量，并给患者提供易于处理的精美产品。
在涉及本发明化合物的局部用途的本发明实施方案中，药物组合物以适合局部给药的方式配制，如水溶液、悬浮液、软膏、霜剂、凝胶或可喷雾制剂，例如，用于通过气溶胶或类似方式给药，包括活性成分与本领域技术人员已知的一种或多种增溶剂、稳定剂、补强剂、缓冲剂和防腐剂。
药物组合物可以配制为口服给药、肠外给药或直肠给药。此外，本发明的药物组合物可以以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、粒剂、粉剂或栓剂)，或液体形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)配制。
本发明化合物的剂量方案将根据已知因素而变化，如特定药剂的药效学特性及其给药方式和途径；受试者的种类、年龄、性别、健康状况、医疗条件和体重；症状的性质和程度；同时治疗的种类；治疗的频率；给药途径、患者的肾脏和肝脏功能以及所期望的效果。在某些实施方案中，本发明的化合物可按每日单一剂量给药，或者每日总剂量可按每日两次、三次或四次的分剂量给药。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物或组合物对于约50-70kg的受试者来说，其单位剂量可以是约1-1000mg的活性成分。化合物、药物组合物或其组合物的治疗有效剂量取决于受试者的种类、体重、年龄和个体状况、所治疗的病症或疾病或其严重程度。具有普通技能的医生、临床医生或兽医可以很容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病的进展所需的每种活性成分的有效量。
本发明的药物组合物可以进行常规的制药操作，如灭菌和/或可以包含常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂，以及佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。它们可以通过标准工艺生产，例如通过传统的混合、制粒、溶解或冻干工艺。许多用于制备药物组合物的此类程序和方法在本领域是已知的，见例如L.Lachman等人的《工业药学的理论和实践(The Theory and Practice of Industrial Pharmacy)》，第4版，2013(ISBN8123922892)。
“瑞士式”的制造方法：本发明中的另一方面涉及如表1所述的MR1配体化合物在制备用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病的药物中的用途，特别是在治疗以表达MR1的肿瘤细胞为特征的癌症中的用途，可选择与根据权利要求27所述的药物组合。另一实施方案涉及根据权利要求16至20所述的分离的T细胞受体在制备用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病的药物中的用途，特别是在治疗以表达MR1的肿瘤细胞为特征的癌症中的用途，可选择与根据权利要求27所述的药物组合。另一实施方案涉及根据权利要求22所述的分离的T细胞在制备用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病的药物中的用途，特别是在治疗以表达MR1的肿瘤细胞为特征的癌症中的用途，可选择与根据权利要求27所述的药物组合。另一实施方案涉及编码根据权利要求21所述TCR的多核苷酸在制备用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病的药物中的用途，特别是在治疗以表达MR1的肿瘤细胞为特征的癌症中的用途，可选择与根据权利要求27所述的药物组合。
凡是单一可分离特征的备选方案在此被列为“实施方案”，应理解为这些备选方案可以自由组合以形成本文公开的本发明的离散的实施方案。
本发明通过以下实施例和附图，从中可以得出进一步的实施方案和优点。这些实施例是为了说明本发明，但不是为了限制其范围。
SEQUENCE LISTING
<110> Universitaet Basel
<120> MR1 Ligands and Pharmaceutical Compositions for Immunomodulation
<130> uz415wo
<160> 167
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 280
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1               5                   10                  15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
            20                  25                  30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
        35                  40                  45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
    50                  55                  60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65                  70                  75                  80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
                85                  90                  95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
            100                 105                 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Gln Ile Tyr Asn Gln Gly Gly Lys Leu Ile
        115                 120                 125
Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro
    130                 135                 140
Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser
                165                 170                 175
Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg
            180                 185                 190
Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser
        195                 200                 205
Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp
    210                 215                 220
Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val
                245                 250                 255
Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu
            260                 265                 270
Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
        275                 280
<210> 2
<211> 309
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys
            20                  25                  30
Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His
        35                  40                  45
Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Phe Ser Ser Gly Lys Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
    130                 135                 140
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
145                 150                 155                 160
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
                165                 170                 175
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro
            180                 185                 190
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
    210                 215                 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
225                 230                 235                 240
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
                245                 250                 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
            260                 265                 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
        275                 280                 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
    290                 295                 300
Lys Asp Ser Arg Gly
305
<210> 3
<211> 269
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ile Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1               5                   10                  15
Trp Val Trp Ser Gln Arg Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Phe
            20                  25                  30
Asn Val Pro Glu Gly Ala Thr Val Ala Phe Asn Cys Thr Tyr Ser Asn
        35                  40                  45
Ser Ala Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Cys Arg Lys Glu
    50                  55                  60
Pro Lys Leu Leu Met Ser Val Tyr Ser Ser Gly Asn Glu Asp Gly Arg
65                  70                  75                  80
Phe Thr Ala Gln Leu Asn Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Leu Leu Ile
                85                  90                  95
Arg Asp Ser Lys Leu Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Val Val Thr
            100                 105                 110
Gly Asn Gln Phe Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro
        115                 120                 125
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
    130                 135                 140
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
145                 150                 155                 160
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
                165                 170                 175
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
            180                 185                 190
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
        195                 200                 205
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
225                 230                 235                 240
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
                245                 250                 255
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
            260                 265
<210> 4
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
        35                  40                  45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
            100                 105                 110
Ser Asp Val Gly Thr Gly Asp Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly
        115                 120                 125
Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
    130                 135                 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
            180                 185                 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
            260                 265                 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
    290                 295                 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 5
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val
1               5                   10                  15
Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser
            20                  25                  30
Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg
        35                  40                  45
Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn
                85                  90                  95
Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Ala Leu Ser Glu Glu Pro Ser Asn Thr Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln
        115                 120                 125
Gly Thr Thr Leu Gln Val Lys Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
    130                 135                 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
            180                 185                 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
        195                 200                 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
    210                 215                 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225                 230                 235                 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
                245                 250                 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
            260                 265                 270
Arg Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 6
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys
            20                  25                  30
Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His
        35                  40                  45
Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Arg Leu Leu Ala Gly Gly Gln Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly
        115                 120                 125
Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
    130                 135                 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
            180                 185                 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
            260                 265                 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
    290                 295                 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 7
<211> 840
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atggccatgc tcctgggggc atcagtgctg attctgtggc ttcagccaga ctgggtaaac 60
agtcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 120
gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 180
tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 240
gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 300
ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcccagatt 360
tataaccagg gaggaaagct tatcttcgga cagggaacgg agttatctgt gaaacccaat 420
atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct 480
gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat 540
gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt 600
gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt 660
attccagaag acaccttctt ccccagccca gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag 720
aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga 780
atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc 840
<210> 8
<211> 927
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
atgggaatca ggctcctgtg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60
gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120
gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180
gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240
gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300
agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagtt tttctagcgg aaagcagtac 360
ttcgggccgg gcaccaggct cacggtcaca gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag 420
gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg 480
tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 540
gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 600
gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc 660
cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc tacgggctct cggagaatga cgagtggacc 720
caggataggg ccaaacctgt cacccagatc gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac 780
tgtggcttca cctccgagtc ttaccagcaa ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag 840
atcttgctag ggaaggccac cttgtatgcc gtgctggtca gtgccctcgt gctgatggcc 900
atggtcaaga gaaaggattc cagaggc 927
<210> 9
<211> 807
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
atgatatcct tgagagtttt actggtgatc ctgtggcttc agttaagctg ggtttggagc 60
caacggaagg aggtggagca ggatcctgga cccttcaatg ttccagaggg agccactgtc 120
gctttcaact gtacttacag caacagtgct tctcagtctt tcttctggta cagacaggat 180
tgcaggaaag aacctaagtt gctgatgtcg gtatactcca gtggtaatga agatggaagg 240
tttacagcac agctcaatag agccagccag tatatttccc tgctcatcag agactccaag 300
ctcagtgatt cagccaccta cctctgtgtg gtgaccggta accagttcta ttttgggaca 360
gggacaagtt tgacggtcat tccaaatatc cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg 420
agagactcta aatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca 480
aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt gctagacatg 540
aggtctatgg acttcaagag caacagtgct gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca 600
tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt ccagaagaca ccttcttccc cagcccagaa 660
agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa agctttgaaa cagatacgaa cctaaacttt 720
caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc ctcctcctga aagtggccgg gtttaatctg 780
ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagc 807
<210> 10
<211> 939
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
atggcctccc tgctcttctt ctgtggggcc ttttatctcc tgggaacagg gtccatggat 60
gctgatgtta cccagacccc aaggaatagg atcacaaaga caggaaagag gattatgctg 120
gaatgttctc agactaaggg tcatgataga atgtactggt atcgacaaga cccaggactg 180
ggcctacggt tgatctatta ctcctttgat gtcaaagata taaacaaagg agagatctct 240
gatggataca gtgtctctcg acaggcacag gctaaattct ccctgtccct agagtctgcc 300
atccccaacc agacagctct ttacttctgt gccaccagtg atgtcgggac aggggacacc 360
ggggagctgt tttttggaga aggctctagg ctgaccgtac tggaggacct gaaaaacgtg 420
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480
gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 600
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tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720
gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780
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atcctctatg agatcttgct agggaaggcc accttgtatg ccgtgctggt cagtgccctc 900
gtgctgatgg ccatggtcaa gagaaaggat tccagaggc 939
<210> 11
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
atgctgactg ccagcctgtt gagggcagtc atagcctcca tctgtgttgt atccagcatg 60
gctcagaagg taactcaagc gcagactgaa atttctgtgg tggagaagga ggatgtgacc 120
ttggactgtg tgtatgaaac ccgtgatact acttattact tattctggta caagcaacca 180
ccaagtggag aattggtttt ccttattcgt cggaactctt ttgatgagca aaatgaaata 240
agtggtcggt attcttggaa cttccagaaa tccaccagtt ccttcaactt caccatcaca 300
gcctcacaag tcgtggactc agcagtatac ttctgtgctc tgagtgagga acctagcaac 360
acaggcaaac taatctttgg gcaagggaca actttacaag taaaaccaga tatccagaac 420
cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 480
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acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 600
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gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc 780
ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg acgctgcggc tgtggtccag c 831
<210> 12
<211> 939
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
atgggaatca ggctcctgtg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60
gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120
gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180
gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240
gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300
agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagtc gactactagc gggggggcag 360
aatgagcagt tcttcgggcc agggacacgg ctcaccgtgc tagaggacct gaaaaacgtg 420
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480
gccacactgg tatgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 600
cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720
gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780
ggtagagcag actgtggctt cacctccgag tcttaccagc aaggggtcct gtctgccacc 840
atcctctatg agatcttgct agggaaggcc accttgtatg ccgtgctggt cagtgccctc 900
gtgctgatgg ccatggtcaa gagaaaggat tccagaggc 939
<210> 13
<211> 267
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly
            20                  25                  30
Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly
        35                  40                  45
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
    50                  55                  60
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
                85                  90                  95
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr
            100                 105                 110
Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Arg Pro Asp Ile
        115                 120                 125
Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser
    130                 135                 140
Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu
                165                 170                 175
Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser
            180                 185                 190
Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile
        195                 200                 205
Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys
    210                 215                 220
Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn
225                 230                 235                 240
Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe
                245                 250                 255
Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
            260                 265
<210> 14
<211> 271
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Leu Leu Ile Thr Ser Met Leu Val Leu Trp Met Gln Leu Ser Gln
1               5                   10                  15
Val Asn Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr Leu Ser
        35                  40                  45
Asn Ile Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu
    50                  55                  60
Ile Gln Leu Val Lys Ser Gly Glu Val Lys Lys Gln Lys Arg Leu Thr
65                  70                  75                  80
Phe Gln Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Gln Thr Thr Asp Val Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Ala Ala Gly Gly
            100                 105                 110
Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val
        115                 120                 125
His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
    130                 135                 140
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
145                 150                 155                 160
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
                165                 170                 175
Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
            180                 185                 190
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
        195                 200                 205
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
225                 230                 235                 240
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
                245                 250                 255
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
            260                 265                 270
<210> 15
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Asp Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser
            20                  25                  30
Val Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu
    50                  55                  60
Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln
65                  70                  75                  80
Arg Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg
                85                  90                  95
Ile Ala Asp Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu
            100                 105                 110
Thr Trp Thr Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg
        115                 120                 125
Gly Thr Gln Leu Thr Val Trp Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
    130                 135                 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
            180                 185                 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
        195                 200                 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
    210                 215                 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225                 230                 235                 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
                245                 250                 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
            260                 265                 270
Arg Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 16
<211> 280
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Thr
1               5                   10                  15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
            20                  25                  30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
        35                  40                  45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
    50                  55                  60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65                  70                  75                  80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
                85                  90                  95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
            100                 105                 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Leu Tyr Asn Gln Gly Gly Lys Leu Ile
        115                 120                 125
Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro
    130                 135                 140
Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser
                165                 170                 175
Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg
            180                 185                 190
Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser
        195                 200                 205
Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp
    210                 215                 220
Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val
                245                 250                 255
Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu
            260                 265                 270
Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
        275                 280
<210> 17
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His
1               5                   10                  15
Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser
            20                  25                  30
Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro
        35                  40                  45
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys
    50                  55                  60
Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr
                85                  90                  95
Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys
            100                 105                 110
Ala Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser
        115                 120                 125
Leu Leu Val Thr Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
    130                 135                 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145                 150                 155                 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
                165                 170                 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
            180                 185                 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
        195                 200                 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
    210                 215                 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225                 230                 235                 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
                245                 250                 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
            260                 265                 270
Ser Ser
<210> 18
<211> 276
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Asn Tyr Ser Pro Gly Leu Val Ser Leu Ile Leu Leu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Arg Thr Arg Gly Asn Ser Val Thr Gln Met Glu Gly Pro Val Thr Leu
            20                  25                  30
Ser Glu Glu Ala Phe Leu Thr Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Ala Thr Gly
        35                  40                  45
Tyr Pro Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Leu Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys Gly Ser Asn Lys Gly
65                  70                  75                  80
Phe Glu Ala Thr Tyr Arg Lys Glu Thr Thr Ser Phe His Leu Glu Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Val Gln Val Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Thr
            100                 105                 110
Ile Trp Asp Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly
        115                 120                 125
Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
    130                 135                 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145                 150                 155                 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
                165                 170                 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
            180                 185                 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
        195                 200                 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
    210                 215                 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225                 230                 235                 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
                245                 250                 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
            260                 265                 270
Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 19
<211> 269
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Met Val Leu Lys Phe Ser Val Ser Ile Leu Trp Ile Gln Leu Ala Trp
1               5                   10                  15
Val Ser Thr Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser
        35                  40                  45
Ser Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu
    50                  55                  60
Val Thr Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr
65                  70                  75                  80
Phe Gln Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
                85                  90                  95
Ala Gln Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Glu Asn Ser
            100                 105                 110
Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro
        115                 120                 125
His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
    130                 135                 140
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
145                 150                 155                 160
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
                165                 170                 175
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
            180                 185                 190
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
        195                 200                 205
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
225                 230                 235                 240
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
                245                 250                 255
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
            260                 265
<210> 20
<211> 275
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro
            20                  25                  30
Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser
        35                  40                  45
Asn Ser Ala Phe Gln Tyr Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys
    50                  55                  60
Gly Pro Glu Leu Leu Met Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp
65                  70                  75                  80
Gly Arg Phe Thr Ala Gln Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu
                85                  90                  95
Phe Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala
            100                 105                 110
Met Ser Leu Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr
        115                 120                 125
Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr
    130                 135                 140
Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr
145                 150                 155                 160
Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val
                165                 170                 175
Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys
            180                 185                 190
Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala
        195                 200                 205
Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
    210                 215                 220
Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr
225                 230                 235                 240
Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile
                245                 250                 255
Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu
            260                 265                 270
Trp Ser Ser
        275
<210> 21
<211> 275
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn
        35                  40                  45
Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu
    50                  55                  60
Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala
                85                  90                  95
Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gln Leu Gly
            100                 105                 110
Gly Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Ile Leu Thr Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr
    130                 135                 140
Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr
145                 150                 155                 160
Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val
                165                 170                 175
Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys
            180                 185                 190
Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala
        195                 200                 205
Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
    210                 215                 220
Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr
225                 230                 235                 240
Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile
                245                 250                 255
Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu
            260                 265                 270
Trp Ser Ser
        275
<210> 22
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1               5                   10                  15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
            20                  25                  30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
        35                  40                  45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Gly Pro Gln
    50                  55                  60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65                  70                  75                  80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
                85                  90                  95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Asn
            100                 105                 110
Trp Ser Pro Gln Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
    130                 135                 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145                 150                 155                 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
                165                 170                 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
            180                 185                 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
        195                 200                 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
    210                 215                 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225                 230                 235                 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
                245                 250                 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
            260                 265                 270
Ser Ser
<210> 23
<211> 267
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly
            20                  25                  30
Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly
        35                  40                  45
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
    50                  55                  60
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
                85                  90                  95
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Met Asp Ser Asn Tyr
            100                 105                 110
Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro Asp Ile
        115                 120                 125
Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser
    130                 135                 140
Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu
                165                 170                 175
Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser
            180                 185                 190
Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile
        195                 200                 205
Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys
    210                 215                 220
Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn
225                 230                 235                 240
Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe
                245                 250                 255
Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
            260                 265
<210> 24
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Ile Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1               5                   10                  15
Trp Val Trp Ser Gln Arg Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Phe
            20                  25                  30
Asn Val Pro Glu Gly Ala Thr Val Ala Phe Asn Cys Thr Tyr Ser Asn
        35                  40                  45
Ser Ala Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Cys Arg Lys Glu
    50                  55                  60
Pro Lys Leu Leu Met Ser Val Tyr Ser Ser Gly Asn Glu Asp Gly Arg
65                  70                  75                  80
Phe Thr Ala Gln Leu Asn Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Leu Leu Ile
                85                  90                  95
Arg Asp Ser Lys Leu Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Val Val Asn
            100                 105                 110
Arg Phe Thr Arg Asp Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Leu Arg Val Lys Ser Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
    130                 135                 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145                 150                 155                 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
                165                 170                 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
            180                 185                 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
        195                 200                 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
    210                 215                 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225                 230                 235                 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
                245                 250                 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
            260                 265                 270
Ser Ser
<210> 25
<211> 312
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala
1               5                   10                  15
Ser Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
        35                  40                  45
Asn Ser Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Glu Gly Thr Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Leu Asn Lys Arg Glu Phe Ser Leu Arg
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Glu Val Thr Gly Gly Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr
        115                 120                 125
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
    130                 135                 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145                 150                 155                 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
                165                 170                 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
            180                 185                 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
    210                 215                 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
                245                 250                 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
            260                 265                 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
        275                 280                 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
    290                 295                 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 26
<211> 311
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Ser Val Phe Ser
1               5                   10                  15
Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly Thr
            20                  25                  30
Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met Phe
        35                  40                  45
Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ala
    50                  55                  60
Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys
65                  70                  75                  80
Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser
                85                  90                  95
Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly Ala
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Pro Tyr Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
    130                 135                 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145                 150                 155                 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
                165                 170                 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
            180                 185                 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
    210                 215                 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225                 230                 235                 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
                245                 250                 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
            260                 265                 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
        275                 280                 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
    290                 295                 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 27
<211> 311
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys
            20                  25                  30
Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His
        35                  40                  45
Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Leu Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Lys Leu Phe Phe Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Gln Leu Ser Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
    130                 135                 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
            180                 185                 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr
            260                 265                 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
    290                 295                 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305                 310
<210> 28
<211> 308
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1               5                   10                  15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
            20                  25                  30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
        35                  40                  45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
    50                  55                  60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
            100                 105                 110
Ser Ser Tyr Arg Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
        115                 120                 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
    130                 135                 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
                165                 170                 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
            180                 185                 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
    210                 215                 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225                 230                 235                 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
                245                 250                 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly
            260                 265                 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
        275                 280                 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
    290                 295                 300
Arg Lys Asp Phe
305
<210> 29
<211> 309
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Pro Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
            20                  25                  30
Thr Arg Gly Gln His Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ile Ser Gly His
        35                  40                  45
Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
    50                  55                  60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro
65                  70                  75                  80
Asp Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
                85                  90                  95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Phe Asp Val Gly Leu Pro Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
    130                 135                 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145                 150                 155                 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser
                165                 170                 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
            180                 185                 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
    210                 215                 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225                 230                 235                 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
                245                 250                 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln
            260                 265                 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
        275                 280                 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
    290                 295                 300
Lys Arg Lys Asp Phe
305
<210> 30
<211> 309
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Gly Pro Gly Leu Leu His Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly His Gly Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr
            20                  25                  30
Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His
        35                  40                  45
Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu
    50                  55                  60
Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asn Phe Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp
                85                  90                  95
Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr
            100                 105                 110
Ser Arg Glu Trp Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu
        115                 120                 125
Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
    130                 135                 140
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
145                 150                 155                 160
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
                165                 170                 175
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro
            180                 185                 190
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
    210                 215                 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
225                 230                 235                 240
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
                245                 250                 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
            260                 265                 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
        275                 280                 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
    290                 295                 300
Lys Asp Ser Arg Gly
305
<210> 31
<211> 315
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Thr Ile Arg Leu Leu Cys Tyr Met Gly Phe Tyr Phe Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Met Glu Ala Asp Ile Tyr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Ile
            20                  25                  30
Gly Thr Gly Lys Lys Ile Thr Leu Glu Cys Ser Gln Thr Met Gly His
        35                  40                  45
Asp Lys Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Met Glu Leu His Leu
    50                  55                  60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Asn Ser Thr Glu Lys Gly Asp Leu Ser
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Thr Val Ser Arg Ile Arg Thr Glu His Phe Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Arg Pro Ser His Thr Ser Gln Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Gln Leu Tyr Arg Asp Thr Ser Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly
        115                 120                 125
Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr
145                 150                 155                 160
Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His
                165                 170                 175
Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val
            180                 185                 190
Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser
        195                 200                 205
Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln
    210                 215                 220
Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser
225                 230                 235                 240
Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile
                245                 250                 255
Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu
            260                 265                 270
Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu
    290                 295                 300
Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310                 315
<210> 32
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1               5                   10                  15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
        35                  40                  45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Gly Ile Ser Gly Thr Ala Ser Ser Tyr Asn Ser Pro Leu His Phe Gly
        115                 120                 125
Asn Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr
145                 150                 155                 160
Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His
                165                 170                 175
Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val
            180                 185                 190
Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser
        195                 200                 205
Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln
    210                 215                 220
Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser
225                 230                 235                 240
Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile
                245                 250                 255
Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val
            260                 265                 270
Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu
    290                 295                 300
Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305                 310
<210> 33
<211> 312
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
            20                  25                  30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
    50                  55                  60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65                  70                  75                  80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
                85                  90                  95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Val Gly Gly Gly Leu Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
        115                 120                 125
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
    130                 135                 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145                 150                 155                 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
                165                 170                 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
            180                 185                 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
    210                 215                 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
                245                 250                 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
            260                 265                 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
        275                 280                 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
    290                 295                 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 34
<211> 311
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Thr Ile Arg Leu Leu Cys Tyr Met Gly Phe Tyr Phe Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Met Glu Ala Asp Ile Tyr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Ile
            20                  25                  30
Gly Thr Gly Lys Lys Ile Thr Leu Glu Cys Ser Gln Thr Met Gly His
        35                  40                  45
Asp Lys Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Asp Pro Gly Met Glu Leu His Leu
    50                  55                  60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Asn Ser Thr Glu Lys Gly Asp Leu Ser
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Thr Val Ser Arg Ile Arg Thr Glu His Phe Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Arg Pro Ser His Thr Ser Gln Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Glu Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly
        115                 120                 125
Ser Trp Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
    130                 135                 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
            180                 185                 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr
            260                 265                 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
    290                 295                 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305                 310
<210> 35
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser
            20                  25                  30
Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe
        35                  40                  45
Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr
                85                  90                  95
Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Lys Val
            100                 105                 110
Thr Ser Gly Gln His Gln Gly Thr Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145                 150                 155                 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
                165                 170                 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
            180                 185                 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
        195                 200                 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
    210                 215                 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225                 230                 235                 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
                245                 250                 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser
            260                 265                 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
        275                 280                 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
    290                 295                 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 36
<211> 307
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Ser Val Phe Ser
1               5                   10                  15
Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly Thr
            20                  25                  30
Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met Phe
        35                  40                  45
Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ala
    50                  55                  60
Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys
65                  70                  75                  80
Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser
                85                  90                  95
Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Glu Gly
            100                 105                 110
Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
        115                 120                 125
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
    130                 135                 140
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
                165                 170                 175
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
            180                 185                 190
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
        195                 200                 205
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
    210                 215                 220
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
225                 230                 235                 240
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
                245                 250                 255
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
            260                 265                 270
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
        275                 280                 285
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
    290                 295                 300
Ser Arg Gly
305
<210> 37
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
atgtggggag ttttccttct ttatgtttcc atgaagatgg gaggcactac aggacaaaac 60
attgaccagc ccactgagat gacagctacg gaaggtgcca ttgtccagat caactgcacg 120
taccagacat ctgggttcaa cgggctgttc tggtaccagc aacatgctgg cgaagcaccc 180
acatttctgt cttacaatgt tctggatggt ttggaggaga aaggtcgttt ttcttcattc 240
cttagtcggt ctaaagggta cagttacctc cttttgaagg agctccagat gaaagactct 300
gcctcttacc tctgtgctgt gatggatagc agctataaat tgatcttcgg gagtgggacc 360
agactgctgg tcaggcctga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac 420
tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg 480
tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct 540
atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca 600
aacgccttca acaacagcat tattccagaa gacaccttct tccccagccc agaaagttcc 660
tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac 720
ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg 780
acgctgcggc tgtggtccag c 801
<210> 38
<211> 813
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
atgctactca tcacatcaat gttggtctta tggatgcaat tgtcacaggt gaatggacaa 60
caggtaatgc aaattcctca gtaccagcat gtacaagaag gagaggactt caccacgtac 120
tgcaattcct caactacttt aagcaatata cagtggtata agcaaaggcc tggtggacat 180
cccgtttttt tgatacagtt agtgaagagt ggagaagtga agaagcagaa aagactgaca 240
tttcagtttg gagaagcaaa aaagaacagc tccctgcaca tcacagccac ccagactaca 300
gatgtaggaa cctacttctg tgcggctgct ggtggtacta gctatggaaa gctgacattt 360
ggacaaggga ccatcttgac tgtccatcca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 420
cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 480
caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 540
gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 600
tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 660
ccagaaagtt cctgtgatgt caagctggtc gagaaaagct ttgaaacaga tacgaaccta 720
aactttcaaa acctgtcagt gattgggttc cgaatcctcc tcctgaaagt ggccgggttt 780
aatctgctca tgacgctgcg gctgtggtcc agc 813
<210> 39
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt 60
agaggagagg atgtggagca gagtcttttc ctgagtgtcc gagagggaga cagctccgtt 120
ataaactgca cttacacaga cagctcctcc acctacttat actggtataa gcaagaacct 180
ggagcaggtc tccagttgct gacgtatatt ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa 240
agactcactg ttctattgaa taaaaaggat aaacatctgt ctctgcgcat tgcagacacc 300
cagactgggg actcagctat ctacttctgt gcagagacct ggaccgacag aggctcaacc 360
ctggggaggc tatactttgg aagaggaact cagttgactg tctggcctga tatccagaac 420
cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 480
ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc 540
acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 600
tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 660
gacaccttct tccccagccc agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt 720
gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc 780
ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg acgttgcggc tgtggtccag c 831
<210> 40
<211> 840
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
atggccatgc tcctgggggc atcagtgctg attctgtggc ttcagacaga ctgggtaaac 60
agtcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 120
gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 180
tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 240
gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 300
ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaagtctt 360
tataaccagg gaggaaagct tatcttcgga cagggaacgg agttatctgt gaaacccaat 420
atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct 480
gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat 540
gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt 600
gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt 660
attccagaag acaccttctt ccccagccca gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag 720
aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga 780
atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc 840
<210> 41
<211> 822
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
atggagaaga atcctttggc agccccatta ctaatcctct ggtttcatct tgactgcgtg 60
agcagcatac tgaacgtgga acaaagtcct cagtcactgc atgttcagga gggagacagc 120
accaatttca cctgcagctt cccttccagc aatttttatg ccttacactg gtacagatgg 180
gaaactgcaa aaagccccga ggccttgttt gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240
aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300
ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct cgggggattc cgggtatgca 360
ctcaacttcg gcaaaggcac ctcgctgttg gtcacacccc atatccagaa ccctgaccct 420
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gc 822
<210> 42
<211> 828
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
atgaactatt ctccaggctt agtatctctg atactcttac tgcttggaag aacccgtgga 60
aattcagtga cccagatgga agggccagtg actctctcag aagaggcctt cctgactata 120
aactgcacgt acacagccac aggataccct tcccttttct ggtatgtcca atatcctgga 180
gaaggtctac agctcctcct gaaagccacg aaggctgatg acaagggaag caacaaaggt 240
tttgaagcca cataccgtaa agaaaccact tctttccact tggagaaagg ctcagttcaa 300
gtgtcagact cagcggtgta cttctgtgct ctgacaatat gggattatgg aggaagccaa 360
ggaaatctca tctttggaaa aggcactaaa ctctctgtta aaccaaatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780
aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagc 828
<210> 43
<211> 807
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
atggtcctga aattctccgt gtccattctt tggattcagt tggcatgggt gagcacccag 60
ctgctggagc agagccctca gtttctaagc atccaagagg gagaaaatct cactgtgtac 120
tgcaactcct caagtgtttt ttccagctta caatggtaca gacaggagcc tggggaaggt 180
cctgtcctcc tggtgacagt agttacgggt ggagaagtga agaagctgaa gagactaacc 240
tttcagtttg gtgatgcaag aaaggacagt tctctccaca tcactgcagc ccagcctggt 300
gatacaggcc tctacctctg tgcaggagaa aattccgggt atgcactcaa cttcggcaaa 360
ggcacctcgc tgttggtcac accccatatc cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg 420
agagactcta aatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca 480
aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt gctagacatg 540
aggtctatgg acttcaagag caacagtgct gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca 600
tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt ccagaagaca ccttcttccc cagcccagaa 660
agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa agctttgaaa cagatacgaa cctaaacttt 720
caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc ctcctcctga aagtggccgg gtttaatctg 780
ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagc 807
<210> 44
<211> 825
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
atgatgaaat ccttgagagt tttactggtg atcctgtggc ttcagttaag ctgggtttgg 60
agccaacaga aggaggtgga gcaggatcct ggaccactca gtgttccaga gggagccatt 120
gtttctctca actgcactta cagcaacagt gcttttcaat acttcatgtg gtacagacag 180
tattccagaa aaggccctga gttgctgatg tacacatact ccagtggtaa caaagaagat 240
ggaaggttta cagcacaggt cgataaatcc agcaagtata tctccttgtt catcagagac 300
tcacagccca gtgattcagc cacctacctc tgtgcaatga gcctatcagg aggaagctac 360
atacctacat ttggaagagg aaccagcctt attgttcatc cgtatatcca gaaccctgac 420
cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc 480
gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac 540
aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc 600
aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc 660
ttcttcccca gcccagaaag ttcctgtgat gtcaagctgg tcgagaaaag ctttgaaaca 720
gatacgaacc taaactttca aaacctgtca gtgattgggt tccgaatcct cctcctgaaa 780
gtggccgggt ttaatctgct catgacgctg cggctgtggt ccagc 825
<210> 45
<211> 825
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
atgctccttg aacatttatt aataatcttg tggatgcagc tgacatgggt cagtggtcaa 60
cagctgaatc agagtcctca atctatgttt atccaggaag gagaagatgt ctccatgaac 120
tgcacttctt caagcatatt taacacctgg ctatggtaca agcaggaccc tggggaaggt 180
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gctcagtttg gtataaccag aaaggacagc ttcctgaata tctcagcatc catacctagt 300
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cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc 480
gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac 540
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aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc 660
ttcttcccca gcccagaaag ttcctgtgat gtcaagctgg tcgagaaaag ctttgaaaca 720
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gtggccgggt ttaatctgct catgacgctg cggctgtggt ccagc 825
<210> 46
<211> 822
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
atgacatcca ttcgagctgt atttatattc ctgtggctgc agctggactt ggtgaatgga 60
gagaatgtgg agcagcatcc ttcaaccctg agtgtccagg agggagacag cgctgttatc 120
aagtgtactt attcagacag tgcctcaaac tacttccctt ggtataagca agaacttgga 180
aaaggacctc agcttattat agacattcgt tcaaatgtgg gcgaaaagaa agaccaacga 240
attgctgtta cattgaacaa gacagccaaa catttctccc tgcacatcac agagacccaa 300
cctgaagact cggctgtcta cttctgtgca gcaaactgga gcccgcaagg aaatgagaaa 360
ttaacctttg ggactggaac aagactcacc atcataccca atatccagaa ccctgaccct 420
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gc 822
<210> 47
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
atgtggggag ttttccttct ttatgtttcc atgaagatgg gaggcactac aggacaaaac 60
attgaccagc ccactgagat gacagctacg gaaggtgcca ttgtccagat caactgcacg 120
taccagacat ctgggttcaa cgggctgttc tggtaccagc aacatgctgg cgaagcaccc 180
acatttctgt cttacaatgt tctggatggt ttggaggaga aaggtcgttt ttcttcattc 240
cttagtcggt ctaaagggta cagttacctc cttttgaagg agctccagat gaaagactct 300
gcctcttacc tctgtgcttc catggatagc aactatcagt taatctgggg cgctgggacc 360
aagctaatta taaagccaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac 420
tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg 480
tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct 540
atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca 600
aacgccttca acaacagcat tattccagaa gacaccttct tccccagccc agaaagttcc 660
tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac 720
ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg 780
acgctgcggc tgtggtccag c 801
<210> 48
<211> 822
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
atgatatcct tgagagtttt actggtgatc ctgtggcttc agttaagctg ggtttggagc 60
caacggaagg aggtggagca ggatcctgga cccttcaatg ttccagaggg agccactgtc 120
gctttcaact gtacttacag caacagtgct tctcagtctt tcttctggta cagacaggat 180
tgcaggaaag aacctaagtt gctgatgtcc gtatactcca gtggtaatga agatggaagg 240
tttacagcac agctcaatag agccagccag tatatttccc tgctcatcag agactccaag 300
ctcagtgatt cagccaccta cctctgtgtg gtgaacagat tcacaaggga tggaaacaaa 360
ctggtctttg gcgcaggaac cattctgaga gtcaagtcct atatccagaa ccctgaccct 420
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gc 822
<210> 49
<211> 936
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
atgagcatcg gcctcctgtg ctgtgtggcc ttttctctcc tgtgggcaag tccagtgaat 60
gctggtgtca ctcagacccc aaaattccag gtcctgaaga caggacagag catgacactg 120
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ggactgaggc tgatttatta ctcagcttct gagggtacca ctgacaaagg agaagtcccc 240
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<210> 50
<211> 933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
atgctgagtc ttctgctcct tctcctggga ctaggctctg tgttcagtgc tgtcatctct 60
caaaagccaa gcagggatat ctgtcaacgt ggaacctccc tgacgatcca gtgtcaagtc 120
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<210> 51
<211> 933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
atgggaatca ggctcctgtg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
atgggctcct ggaccctctg ctgtgtgtcc ctttgcatcc tggtagcaaa gcacacagat 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
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<211> 927
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
atgggtcctg ggcttctcca ctggatggcc ctttgtctcc ttggaacagg tcatggggat 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
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<211> 939
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
atgggcttca ggctcctctg ctgtgtggcc ttttgtctcc tgggagcagg cccagtggat 60
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<210> 58
<211> 933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
atgactatca ggctcctctg ctacatgggc ttttattttc tgggggcagg cctcatggaa 60
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<211> 942
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
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tttctcatca accatgcaag cctgaccttg tccactctga cagtgaccag tgcccatcct 300
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<210> 60
<211> 921
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
atgctgagtc ttctgctcct tctcctggga ctaggctctg tgttcagtgc tgtcatctct 60
caaaagccaa gcagggatat ctgtcaacgt ggaacctccc tgacgatcca gtgtcaagtc 120
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tttcccatca gccgcccaaa cctaacattc tcaactctga ctgtgagcaa catgagccct 300
gaagacagca gcatatatct ctgcagcgtt gaaggcaggg gttacgagca gtacttcggg 360
ccgggcacca ggctcacggt cacagaggac ctgaaaaacg tgttcccacc cgaggtcgct 420
gtgtttgagc catcagaagc agagatctcc cacacccaaa aggccacact ggtgtgcctg 480
gccacaggct tctaccccga ccacgtggag ctgagctggt gggtgaatgg gaaggaggtg 540
cacagtgggg tcagcacaga cccgcagccc ctcaaggagc agcccgccct caatgactcc 600
agatactgcc tgagcagccg cctgagggtc tcggccacct tctggcagaa cccccgcaac 660
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agggccaaac ctgtcaccca gatcgtcagc gccgaggcct ggggtagagc agactgtggc 780
ttcacctccg agtcttacca gcaaggggtc ctgtctgcca ccatcctcta tgagatcttg 840
ctagggaagg ccaccttgta tgccgtgctg gtcagtgccc tcgtgctgat ggccatggtc 900
aagagaaagg attccagagg c 921
<210> 61
<211> 310
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Met Gln Trp Ala Leu Ala Val Leu Leu Ala Phe Leu Ser Pro Ala Ser
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln
            20                  25                  30
Thr Gly Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg
    50                  55                  60
Leu Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly
65                  70                  75                  80
Ile Ser Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu
                85                  90                  95
Arg Met Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Ala Thr Trp Glu Thr Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe
        115                 120                 125
Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp
    130                 135                 140
Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys
145                 150                 155                 160
Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro
                165                 170                 175
Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu
            180                 185                 190
Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys
        195                 200                 205
Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys Ser Leu Asp Lys Glu His Arg
    210                 215                 220
Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile
225                 230                 235                 240
Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp
                245                 250                 255
Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn
            260                 265                 270
Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val
        275                 280                 285
Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys
    290                 295                 300
Cys Asn Gly Glu Lys Ser
305                 310
<210> 62
<211> 295
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met Leu Phe Ser Ser Leu Leu Cys Val Phe Val Ala Phe Ser Tyr Ser
1               5                   10                  15
Gly Ser Ser Val Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser
            20                  25                  30
Met Pro Val Arg Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser
        35                  40                  45
Trp Trp Ser Tyr Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu
    50                  55                  60
Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser
65                  70                  75                  80
Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Val Lys Ser Val Ala Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala
            100                 105                 110
Leu Gly Val Gln Ala Leu Leu Pro Ile Leu Gly Asp Thr Thr Asp Lys
        115                 120                 125
Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln
    130                 135                 140
Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val
145                 150                 155                 160
Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu
                165                 170                 175
Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser
            180                 185                 190
Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser
        195                 200                 205
Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser
    210                 215                 220
Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys
225                 230                 235                 240
Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu
            260                 265                 270
Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu
        275                 280                 285
Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
    290                 295
<210> 63
<211> 930
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
atgcagtggg ccctagcggt gcttctagct ttcctgtctc ctgccagtca gaaatcttcc 60
aacttggaag ggagaacgaa gtcagtcatc aggcagactg ggtcatctgc tgaaatcact 120
tgtgatcttg ctgaaggaag taccggctac atccactggt acctacacca ggaggggaag 180
gccccacagc gtcttctgta ctatgactcc tacacctcca gcgttgtgtt ggaatcagga 240
atcagcccag ggaagtatga tacttatgga agcacaagga agaacttgag aatgatactg 300
cgaaatctta ttgaaaatga ctctggagtc tattactgtg ccacctggga aactcaagag 360
ttgggcaaaa aaatcaaggt atttggtccc ggaacaaagc ttatcattac agataaacaa 420
cttgatgcag atgtttcccc caagcccact atttttcttc cttcaattgc tgaaacaaag 480
ctccagaagg ctggaacata cctttgtctt cttgagaaat ttttccctga tgttattaag 540
atacattggc aagaaaagaa gagcaacacg attctgggat cccaggaggg gaacaccatg 600
aagactaacg acacatacat gaaatttagc tggttaacgg tgccagaaaa gtcactggac 660
aaagaacaca gatgtatcgt cagacatgag aataataaaa acggagttga tcaagaaatt 720
atctttcctc caataaagac agatgtcatc acaatggatc ccaaagacaa ttgttcaaaa 780
gatgcaaatg atacactact gctgcagctc acaaacacct ctgcatatta catgtacctc 840
ctcctgctcc tcaagagtgt ggtctatttt gccatcatca cctgctgtct gcttagaaga 900
acggctttct gctgcaatgg agagaaatca 930
<210> 64
<211> 885
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
atgctgttct ccagcctgct gtgtgtattt gtggccttca gctactctgg atcaagtgtg 60
gcccagaagg ttactcaagc ccagtcatca gtatccatgc cagtgaggaa agcagtcacc 120
ctgaactgcc tgtatgaaac aagttggtgg tcatattata ttttttggta caagcaactt 180
cccagcaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 240
ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gtgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 300
ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg gggtccaagc cctcctaccc 360
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ccaagaagtc agcctcatac caaaccatcc gtttttgtca tgaaaaatgg aacaaatgtc 480
gcttgtctgg tgaaggaatt ctaccccaag gatataagaa taaatctcgt gtcatccaag 540
aagataacag agtttgatcc tgctattgtc atctctccca gtgggaagta caatgctgtc 600
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actgtgcact ccactgactt tgaagtgaag acagattcta cagatcacgt aaaaccaaag 720
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accgagaagg tgaacatgat gtccctcaca gtgcttgggc tacgaatgct gtttgcaaag 840
actgttgccg tcaattttct cttgactgcc aagttatttt tcttg 885
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Cys Ala Ala Gln Ile Tyr Asn Gln Gly Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Cys Val Val Thr Gly Asn Gln Phe Tyr Phe Gly Thr Gly
1               5                   10
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Cys Ala Leu Ser Glu Glu Pro Ser Asn Thr Gly Lys Leu Ile Phe Gly
1               5                   10                  15
Gln Gly
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 70
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Cys Ala Glu Thr Trp Thr Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr
1               5                   10                  15
Phe Gly Arg Gly
            20
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Cys Ala Ala Ser Leu Tyr Asn Gln Gly Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Cys Ala Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Cys Ala Leu Thr Ile Trp Asp Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile
1               5                   10                  15
Phe Gly Lys Gly
            20
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Cys Ala Gly Glu Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Cys Ala Met Ser Leu Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210> 76
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Cys Ala Gly Gln Leu Gly Gly Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Gln Gly
            20
<210> 77
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Cys Ala Ala Asn Trp Ser Pro Gln Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Gly
1               5                   10                  15
Thr Gly
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Cys Ala Ser Met Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly
1               5                   10                  15
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Cys Val Val Asn Arg Phe Thr Arg Asp Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Cys Ala Ser Ser Phe Ser Ser Gly Lys Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
<210> 81
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Cys Ala Thr Ser Asp Val Gly Thr Gly Asp Thr Gly Glu Leu Phe Phe
1               5                   10                  15
Gly Glu Gly
<210> 82
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Cys Ala Ser Ser Arg Leu Leu Ala Gly Gly Gln Asn Glu Gln Phe Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly
<210> 83
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Cys Ala Ser Ser Glu Val Thr Gly Gly Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210> 84
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Cys Ser Val Gly Ala Gly Gln Gly Pro Tyr Thr Asp Thr Gln Tyr Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly
<210> 85
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Lys Leu Phe Phe
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Cys Ala Ser Ser Tyr Arg Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly
1               5                   10                  15
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Cys Ala Ser Ser Phe Asp Val Gly Leu Pro Pro Leu His Phe Gly Asn
1               5                   10                  15
Gly
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Cys Ala Thr Ser Arg Glu Trp Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
<210> 89
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Cys Ala Ser Ser Gln Leu Tyr Arg Asp Thr Ser Asn Thr Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
Phe Phe Gly Glu Gly
            20
<210> 90
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Cys Ala Ser Gly Ile Ser Gly Thr Ala Ser Ser Tyr Asn Ser Pro Leu
1               5                   10                  15
His Phe Gly Asn Gly
            20
<210> 91
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Cys Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Leu Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210> 92
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Cys Ala Ser Ser Glu Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1               5                   10                  15
Gly Glu Gly
<210> 93
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Cys Ser Ala Lys Val Thr Ser Gly Gln His Gln Gly Thr Thr Asp Thr
1               5                   10                  15
Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
            20
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Cys Ser Val Glu Gly Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
<210> 95
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Cys Ala Thr Trp Glu Thr Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly
<210> 96
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Cys Ala Leu Gly Val Gln Ala Leu Leu Pro Ile Leu Gly Asp Thr Thr
1               5                   10                  15
Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly
            20
<210> 97
<211> 276
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Met Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Leu Glu Val Ile Phe Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Leu Asp Ser His Val Ser Val
            20                  25                  30
Ser Glu Gly Thr Pro Val Leu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Tyr
        35                  40                  45
Ser Pro Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln His Pro Asn Lys Gly Leu Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val Lys Gly Ile Asn
65                  70                  75                  80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Lys Lys Ser Glu Thr Ser Phe His Leu Thr
                85                  90                  95
Lys Pro Ser Ala His Met Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Val Val
            100                 105                 110
Ser Asp Asp Pro Leu Ser Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly
        115                 120                 125
Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
    130                 135                 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145                 150                 155                 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
                165                 170                 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
            180                 185                 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
        195                 200                 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
    210                 215                 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225                 230                 235                 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
                245                 250                 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
            260                 265                 270
Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 98
<211> 315
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
            20                  25                  30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
        35                  40                  45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
    50                  55                  60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65                  70                  75                  80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
                85                  90                  95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Phe Ser Gly Gly Ile Ser Ser Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly
        115                 120                 125
Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr
145                 150                 155                 160
Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His
                165                 170                 175
Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val
            180                 185                 190
Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser
        195                 200                 205
Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln
    210                 215                 220
Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser
225                 230                 235                 240
Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile
                245                 250                 255
Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu
            260                 265                 270
Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu
    290                 295                 300
Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310                 315
<210> 99
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Ser Asp Asp Pro Leu Ser Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe
1               5                   10
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Ser Phe Ser Gly Gly Ile Ser Ser Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe
1               5                   10                  15
<210> 101
<211> 280
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1               5                   10                  15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
            20                  25                  30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
        35                  40                  45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
    50                  55                  60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65                  70                  75                  80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
                85                  90                  95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
            100                 105                 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Tyr Tyr Asn Gln Gly Gly Lys Leu Ile
        115                 120                 125
Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro
    130                 135                 140
Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser
                165                 170                 175
Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg
            180                 185                 190
Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser
        195                 200                 205
Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp
    210                 215                 220
Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val
                245                 250                 255
Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu
            260                 265                 270
Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
        275                 280
<210> 102
<211> 310
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys
            20                  25                  30
Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His
        35                  40                  45
Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Pro Gly Tyr Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
        115                 120                 125
Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
    130                 135                 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
                165                 170                 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
            180                 185                 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
    210                 215                 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225                 230                 235                 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
                245                 250                 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
            260                 265                 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
        275                 280                 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
    290                 295                 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Ser Tyr Tyr Asn Gln Gly Gly Lys Leu Ile Phe
1               5                   10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Ser Pro Gly Tyr Gln Glu Thr Gln Tyr Phe
1               5                   10
<210> 105
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val
1               5                   10                  15
Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser
            20                  25                  30
Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg
        35                  40                  45
Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn
                85                  90                  95
Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Ala Leu Ser Glu Trp Asn Gln Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln
        115                 120                 125
Gly Thr Arg Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
    130                 135                 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
            180                 185                 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
        195                 200                 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
    210                 215                 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225                 230                 235                 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
                245                 250                 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
            260                 265                 270
Arg Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 106
<211> 315
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1               5                   10                  15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
            20                  25                  30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
        35                  40                  45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
    50                  55                  60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
            100                 105                 110
Ser Ser Leu Met Ser Val Gly Gly Ser Ala Gly Glu Leu Phe Phe Gly
        115                 120                 125
Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr
145                 150                 155                 160
Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His
                165                 170                 175
Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val
            180                 185                 190
Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser
        195                 200                 205
Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln
    210                 215                 220
Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser
225                 230                 235                 240
Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile
                245                 250                 255
Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu
            260                 265                 270
Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu
    290                 295                 300
Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310                 315
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Trp Asn Gln Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe
1               5                   10
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ser Leu Met Ser Val Gly Gly Ser Ala Gly Glu Leu Phe Phe
1               5                   10
<210> 109
<211> 273
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
            20                  25                  30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
        35                  40                  45
Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
    50                  55                  60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr
65                  70                  75                  80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
                85                  90                  95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
            100                 105                 110
Ala Met Arg Glu Ala Leu Gly Phe Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
        115                 120                 125
Ser Val Leu Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
    130                 135                 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145                 150                 155                 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
                165                 170                 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
            180                 185                 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
        195                 200                 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
    210                 215                 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225                 230                 235                 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
            260                 265                 270
Ser
<210> 110
<211> 312
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Met Ser Leu Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1               5                   10                  15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
        35                  40                  45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Pro Leu Glu Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr
        115                 120                 125
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
    130                 135                 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145                 150                 155                 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
                165                 170                 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
            180                 185                 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
    210                 215                 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
                245                 250                 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
            260                 265                 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
        275                 280                 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
    290                 295                 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Arg Glu Ala Leu Gly Phe Val Phe
1               5
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Ser Pro Leu Glu Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe
1               5                   10
<210> 113
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Met Ala Ser Ala Pro Ile Ser Met Leu Ala Met Leu Phe Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly Leu Arg Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val
            20                  25                  30
Ala Glu Gly Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly
        35                  40                  45
Asn Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln
    50                  55                  60
Phe Leu Leu Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys
                85                  90                  95
Lys Pro Ser Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val
            100                 105                 110
Ser Asp Ala Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg
        115                 120                 125
Gly Thr Gln Leu Thr Val Trp Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
    130                 135                 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
            180                 185                 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
        195                 200                 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
    210                 215                 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225                 230                 235                 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
                245                 250                 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
            260                 265                 270
Arg Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 114
<211> 309
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
        35                  40                  45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Gln Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
            100                 105                 110
Ser Asp Arg Gly Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
    130                 135                 140
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
145                 150                 155                 160
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
                165                 170                 175
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro
            180                 185                 190
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
    210                 215                 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
225                 230                 235                 240
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
                245                 250                 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
            260                 265                 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
        275                 280                 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
    290                 295                 300
Lys Asp Ser Arg Gly
305
<210> 115
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Ser Asp Ala Asp Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe
1               5                   10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Ser Asp Arg Gly Asn Glu Gln Phe Phe
1               5
<210> 117
<211> 273
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Met Lys Lys His Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe
1               5                   10                  15
Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu
            20                  25                  30
Ile Ile Leu Glu Gly Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val
        35                  40                  45
Ser Pro Phe Ser Asn Leu Arg Trp Tyr Lys Gln Asp Thr Gly Arg Gly
    50                  55                  60
Pro Val Ser Leu Thr Ile Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr Lys Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Tyr Thr Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu
                85                  90                  95
His Ile Thr Ala Ser Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val
            100                 105                 110
Val Gly Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Thr Leu
        115                 120                 125
Ser Val Ser Ser Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
    130                 135                 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145                 150                 155                 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
                165                 170                 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
            180                 185                 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
        195                 200                 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
    210                 215                 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225                 230                 235                 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
            260                 265                 270
Ser
<210> 118
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met
            20                  25                  30
Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Leu Gly His
        35                  40                  45
Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu
    50                  55                  60
Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Val Pro
65                  70                  75                  80
Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser His Leu Phe Leu His
                85                  90                  95
Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Gln Asp Arg Asn Asp Arg Gly Tyr Val Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe
        115                 120                 125
Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe
    130                 135                 140
Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His
145                 150                 155                 160
Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp
                165                 170                 175
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
            180                 185                 190
Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp
        195                 200                 205
Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp
    210                 215                 220
Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu
225                 230                 235                 240
Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln
                245                 250                 255
Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser
            260                 265                 270
Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile
        275                 280                 285
Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val
    290                 295                 300
Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305                 310
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Gly Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe
1               5
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ser Gln Asp Arg Asn Asp Arg Gly Tyr Val Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe
1               5                   10                  15
<210> 121
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Met Asn Tyr Ser Pro Gly Leu Val Ser Leu Ile Leu Leu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Arg Thr Arg Gly Asn Ser Val Thr Gln Met Glu Gly Pro Val Thr Leu
            20                  25                  30
Ser Glu Glu Ala Phe Leu Thr Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Ala Thr Gly
        35                  40                  45
Tyr Pro Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Leu Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys Gly Ser Asn Lys Gly
65                  70                  75                  80
Phe Glu Ala Thr Tyr Arg Lys Glu Thr Thr Ser Phe His Leu Glu Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Val Gln Val Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Asn
            100                 105                 110
Leu Phe Ile Thr Trp Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys
        115                 120                 125
Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
    130                 135                 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
            180                 185                 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
        195                 200                 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
    210                 215                 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225                 230                 235                 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
                245                 250                 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
            260                 265                 270
Arg Leu Trp Ser Ser
        275
<210> 122
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1               5                   10                  15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
        35                  40                  45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
    50                  55                  60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
            100                 105                 110
Cys Ala Asp Leu Ala Thr Val Gly Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
        115                 120                 125
Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
    130                 135                 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
            180                 185                 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
            260                 265                 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
    290                 295                 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 123
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Asn Leu Phe Ile Thr Trp Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe
1               5                   10                  15
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Cys Ala Asp Leu Ala Thr Val Gly Glu Thr Gln Tyr Phe
1               5                   10
<210> 125
<211> 268
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Met Leu Leu Ile Thr Ser Met Leu Val Leu Trp Met Gln Leu Ser Gln
1               5                   10                  15
Val Asn Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr Leu Ser
        35                  40                  45
Asn Ile Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu
    50                  55                  60
Ile Gln Leu Val Lys Ser Gly Glu Val Lys Lys Gln Lys Arg Leu Thr
65                  70                  75                  80
Phe Gln Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Gln Thr Thr Asp Val Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Thr Asn Asp
            100                 105                 110
Tyr Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Arg Ala Asn
        115                 120                 125
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
    130                 135                 140
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
145                 150                 155                 160
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
                165                 170                 175
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
            180                 185                 190
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
        195                 200                 205
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
    210                 215                 220
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
225                 230                 235                 240
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
                245                 250                 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
            260                 265
<210> 126
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser
            20                  25                  30
Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe
        35                  40                  45
Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr
                85                  90                  95
Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Gly
            100                 105                 110
Asp Arg Gly Leu Ala Gly Ile Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly
        115                 120                 125
Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
    130                 135                 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
            180                 185                 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
            260                 265                 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
    290                 295                 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Thr Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe
1               5
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Arg Gly Asp Arg Gly Leu Ala Gly Ile Tyr Asn Glu Gln Phe Phe
1               5                   10                  15
<210> 129
<211> 273
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Met Val Leu Lys Phe Ser Val Ser Ile Leu Trp Ile Gln Leu Ala Trp
1               5                   10                  15
Val Ser Thr Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln
            20                  25                  30
Glu Gly Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser
        35                  40                  45
Ser Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu
    50                  55                  60
Val Thr Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr
65                  70                  75                  80
Phe Gln Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
                85                  90                  95
Ala Gln Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly His Asp Ser
            100                 105                 110
Leu Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu
        115                 120                 125
Leu Val Thr Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
    130                 135                 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145                 150                 155                 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
                165                 170                 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
            180                 185                 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
        195                 200                 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
    210                 215                 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225                 230                 235                 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
            260                 265                 270
Ser
<210> 130
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Met Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Ser Val Phe Ser
1               5                   10                  15
Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly Thr
            20                  25                  30
Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met Phe
        35                  40                  45
Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ala
    50                  55                  60
Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys
65                  70                  75                  80
Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser
                85                  90                  95
Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Gly Leu Leu Ala Gly Glu Gly Ala Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145                 150                 155                 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
                165                 170                 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
            180                 185                 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
        195                 200                 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
    210                 215                 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225                 230                 235                 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
                245                 250                 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser
            260                 265                 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
        275                 280                 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
    290                 295                 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305                 310
<210> 131
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
His Asp Ser Leu Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe
1               5                   10
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Ser Leu Gly Leu Leu Ala Gly Glu Gly Ala Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe
1               5                   10                  15
<210> 133
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 133
atgctcctgc tgctcgtccc agtgctcgag gtgattttta ccctgggagg aaccagagcc 60
cagtcggtga cccagcttga cagccacgtc tctgtctctg aaggaacccc ggtgctgctg 120
aggtgcaact actcatcttc ttattcaccg tctctcttct ggtatgtgca acaccccaac 180
aaaggactcc agcttctcct gaagtacaca tcagcggcca ccctggttaa aggtatcaac 240
ggttttgagg ctgaatttaa gaagagtgaa acctccttcc acctgacgaa accctcagcc 300
catatgagcg acgcggctga gtacttctgt gttgtgagtg atgacccctt gtccggaaat 360
gagaaattaa cctttgggac tggaacaaga ctcaccatca tacccaatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780
aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 134
<211> 948
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 134
atgggccctg ggctcctctg ctgggcactg ctttgtctcc tgggagcagg cttagtggac 60
gctggagtca cccaaagtcc cacacacctg atcaaaacga gaggacagca agtgactctg 120
agatgctctc ctaagtctgg gcatgacact gtgtcctggt accaacaggc cctgggtcag 180
gggccccagt ttatctttca gtattatgag gaggaagaga gacagagagg caacttccct 240
gatcgattct caggtcacca gttccctaac tatagctctg agctgaatgt gaacgccttg 300
ttgctggggg actcggccct ctatctctgt gccagcagct tttcaggagg aatatctagc 360
tcctacaatg agcagttctt cgggccaggg acacggctca ccgtgctaga ggacctgaaa 420
aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 480
caaaaggcca cactggtatg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 540
tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 600
gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac tgcctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 660
accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 720
gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacccgtca cccagatcgt cagcgccgag 780
gcctggggta gagcagactg tggcttcacc tccgagtctt accagcaagg ggtcctgtct 840
gccaccatcc tctatgagat cttgctaggg aaggccacct tgtatgccgt gctggtcagt 900
gccctcgtgc tgatggccat ggtcaagaga aaggattcca gaggctag 948
<210> 135
<211> 843
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 135
atggccatgc tcctgggggc atcagtgctg attctgtggc ttcagccaga ctgggtaaac 60
agtcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 120
gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 180
tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 240
gataaaaatg aagatggaag attcactgtt ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 300
ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaagttat 360
tataaccagg gaggaaagct tatcttcgga cagggaacgg agttatctgt gaaacccaat 420
atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct 480
gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat 540
gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt 600
gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt 660
attccagaag acaccttctt ccccagccca gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag 720
aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga 780
atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat ctgctcatga cgctgcggtt gtggtccagc 840
tga 843
<210> 136
<211> 933
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 136
atgggaatca ggctcctgtg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60
gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120
gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180
gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240
gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300
agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagcc ccggatatca agagacccag 360
tacttcgggc caggcacgcg gctcctggtg ctcgaggacc tgaaaaacgt gttcccaccc 420
gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatctccc acacccaaaa ggccacactg 480
gtatgcctgg ccacaggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg 540
aaggaggtgc acagtggggt cagcacagac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 600
aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 660
ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 720
acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 780
gactgtggct tcacctccga gtcttaccag caaggggtcc tgtctgccac catcctctat 840
gagatcttgc tagggaaggc caccttgtat gccgtgctgg tcagtgccct cgtgctgatg 900
gccatggtca agagaaagga ttccagaggc tag 933
<210> 137
<211> 834
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 137
atgctgactg ccagcctgtt gagggcagtc atagcctcca tctgtgttgt atccagcatg 60
gctcagaagg taactcaagc gcagactgaa atttctgtgg tggagaagga ggatgtgacc 120
ttggactgtg tgtatgaaac ccgtgatact acttattact tattctggta caagcaacca 180
ccaagtggag aattggtttt ccttattcgt cggaactctt ttgatgagca aaatgaaata 240
agtggtcggt attcttggaa cttccagaaa tccaccagtt ccttcaactt caccatcaca 300
gcctcacaag tcgtggactc agcagtatac ttctgtgctc tgagtgagtg gaatcaggga 360
gcccagaagc tggtatttgg ccaaggaacc aggctgacta tcaacccaaa tatccagaac 420
cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 480
ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc 540
acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 600
tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 660
gacaccttct tccccagccc agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt 720
gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc 780
ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg acgctgcggc tgtggtccag ctga 834
<210> 138
<211> 948
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 138
atgggctcct ggaccctctg ctgtgtgtcc ctttgcatcc tggtagcaaa gcacacagat 60
gctggagtta tccagtcacc ccggcacgag gtgacagaga tgggacaaga agtgactctg 120
agatgtaaac caatttcagg acacgactac cttttctggt acagacagac catgatgcgg 180
ggactggagt tgctcattta ctttaacaac aacgttccga tagatgattc agggatgccc 240
gaggatcgat tctcagctaa gatgcctaat gcatcattct ccactctgaa gatccagccc 300
tcagaaccca gggactcagc tgtgtacttc tgtgccagca gtttaatgag cgtcgggggc 360
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<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA
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附图说明
图1显示了通过两种化合物令APC的细胞表面MR1上调的实施例。a)2-甲基腺苷和b)N6,N6-二甲基腺苷在三种指定浓度下使用。通过流式细胞仪评估MR1在THP1-MR1细胞上的表达，并显示为与只用载体孵育的细胞的基线表达相比的中值荧光强度(MFI)。
图2显示了刺激三个MR1T细胞克隆的竞争测定的实施例。2-甲基腺苷以3种指定浓度用于THP-1细胞，然后为每个图示的T细胞克隆(DGB129、MCAE7和TC5A87)添加最佳剂量的抗原。T细胞克隆的反应显示为IFN-γ释放的平均值±sd。仅有抗原、仅有化合物(圆圈)或仅有THP-1细胞(三角形)存在时的T细胞反应也被显示。
图3显示了化合物特异性MR1T细胞激活的实施例。三个MR1T细胞克隆DGB129(a)、MCAE7(b)和TC5A87(c)对用化合物N6,N6-二甲基腺苷(M6,2A)孵育的THP-1细胞的反应显示为过夜刺激后释放的IFN-γ的平均值±sd。T细胞对THP-1细胞和化合物载体的反应作为对照显示。
图4显示了负载M3ADE的MR1单体的产生：a)在M3ADE存在下重新折叠的MR1蛋白的凝胶过滤色谱纯化。在280nm处的吸收和保留时间(分钟)分别显示在y轴和x轴上。收集指示的峰1、2和3，b)用于在平板测定中激活DGB129细胞。T细胞释放的IL-13显示为重复实验的平均值±sd。
图5显示了MR1-M3ADE四聚体染色的验证。MR1T细胞克隆AVA34是通过对来自PBMC的CD3+和MR1-M3ADE四聚体+细胞进行两轮FACS分选，然后进行PHA刺激和通过限制性稀释M3ADE反应性T细胞进行克隆而产生的。a)直方图叠加显示在用Vβ8特异性的抗TCR mAb(JR2，1μg/ml)孵育后，用MR1-M3ADE、MR1-5-OP-RU四聚体以及用MR1-M3ADE四聚体对AVA34细胞进行染色的结果，这阻止了M3ADE四聚体的染色。
b)条形图显示在M3ADE存在下，AVA34细胞向THP-1细胞释放IL-13。在MGdA存在的情况下，IL-13的释放水平很低，但其它所示的化合物则不然。A375-MR1细胞作为阳性对照，T细胞单独作为阴性对照。
图6显示了健康捐赠者血液中MR1-M3ADE四聚体+MR1T细胞的体外频率。9位健康捐赠者的PBMC用MR1-M3ADE四聚体和抗CD3(UCHT1)共同染色的点阵图。每个图代表一个单独的捐赠者。细胞圈选为活的CD3+，CD14-，CD19-单个细胞，数字表示椭圆形门内MR1-M3ADE四聚体+MR1T细胞的百分比。
图7显示了用诱导含羰基分子积累的药物治疗APC刺激MR1T细胞。a)黄豆苷和b)双硫仑增加MCA2B9 MR1T克隆的反应。c)当外源脱氧胞苷联合给药时，双硫仑诱导MCA2B1MR1T克隆的刺激。d)齐墩果酸诱导TC5A87 MR1T克隆的刺激，e)鞣花酸诱导QY1A16 MR1T克隆的刺激，f)EHNA诱导TC5A87 MR1T克隆的刺激，和g)霉酚酸诱导TC5A87 MR1T克隆的刺激。APC(THP-1细胞)在加入MR1T细胞和脱氧胞苷(仅在小组c)之前，用单独的药物孵育18小时。在没有APC的情况下，药物不会诱导对MR1T细胞的刺激。T细胞克隆的反应以三组重复的IFN-γ释放量(平均值±sd)表示。
图8显示了参与MR1T抗原积累的嘌呤代谢情况。(A-F)MR1T克隆TC5A87(A-C)和DGB129(D-F)对A375-MR1细胞的反应性，这些细胞被靶向ADA(
Figure GDA0003806018750000235
A和D)、LACC1(
Figure GDA0003806018750000236
B和E)、ADSSL1(■，C和F)或乱序sgRNA对照(○，A-F)转导。(G)用250μM的所述分子或A375-MR1或载体预孵育的THP-1细胞激活MR1T克隆TC5A87(左)、DGB129(中)和MCA3C3(右)。释放的IFN-γ以三组重复的平均值±SD表示。显示的实验是至少三个独立进行的实验的代表。每个板块上显示了至少三个独立重复的代表性实验。与匹配的对照组相比(A-F，多重t检验)或与载体相比(G，带有Dunnett多重比较的单向Anova)，*p<0.05，**p≤0.01和***p≤0.001。
图9显示糖酵解和甲基乙二醛导致MR1T抗原的积累。甲基乙二醛的生成示意图。磷酸二羟丙酮(DHAP)，3-磷酸甘油醛(G3P)。(A和B)用靶向TPI1(●)的sgRNA或乱序对照(○)转导的A375-MR1细胞刺激MR1T细胞克隆TC5A87(A)和DGB129(B)。(C和D)MR1T细胞克隆TC5A87(C)和DGB129(D)对固定的A375-MR1细胞的刺激反应，A375-MR1细胞在固定前用不同浓度的D-(+)-葡萄糖(○)或2-脱氧-D-葡萄糖(■)孵育6小时。(E和F)用A375-MR1刺激MR1T细胞克隆TC5A87(E)和DGB129(F)，该细胞用针对GLO1的sgRNA(■)、乱序sgRNA对照(○)或过表达GLO1的载体
Figure GDA0003806018750000233
转导。(G和H)用25μM赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤盐酸盐(EHNA)、10μM霉酚酸(MPA)和20μM S-溴代苄基谷胱甘肽(BBG)单独或组合预处理的THP-1细胞刺激MR1T细胞克隆TC5A87(G)和DGB129(H)。(I-L)MR1T克隆DGB129在甲基乙二醛(I，J)或脱氧腺苷(K，L)存在下对THP-1细胞(○)、GLO1-过表达
Figure GDA0003806018750000234
和GLO1 ko(■)THP-1细胞的激活反应。释放的IFN-γ以重复三组培养的平均值±SD表示。显示的数据是至少三个独立实验的代表。(A，L)平均值±SD，n＝3，*p<0.05**p≤0.01和***p≤0.001。(A、B和I-L)多重t检验，(C和D)带有Dunnett多重比较的单向Anova，(E和F)带有Dunnett的多重比较的双向Anova，(G和H)带有Tukey多重比较的单向Anova。
图10显示了醛有助于和清除MR1T抗原的积累(A-C)在不存在或存在核苷(脱氧腺苷和尿苷，均为150μM)的情况下，用红霉素(75nM)或紫杉醇(5μM)预处理的THP-1细胞刺激MR1T细胞克隆TC5A87(A)、DGB129(B)和MCA3C3(C)。(D-F)用丁硫磺酰亚胺(400μM，BSO)、谷胱甘肽(4mM，GSH)、N-乙酰半胱氨酸(4mM，NAC)和阿朴辛(100μM，APO)处理后的固定的A375-MR1细胞刺激MR1T细胞克隆TC5A87(D)，MCA2B1(E)MCA3C3(F)。(G-I)用ML-210(6μM)、RSL-3(1μM)和巯基琥珀酸(3.3μM，MSA)处理后的固定的A375-MR1细胞刺激MR1T细胞克隆TC5A87(G)，DGB129(H)MCA2B1(I)。(J-L)用肼苯哒嗪(100μM)或氨基胍(5mM)处理固定的A375-MR1细胞刺激MR1T细胞克隆TC5A87(J)、DGB129(K)和MCA2B1(L)。IFN-γ的释放以三组重复培养的平均值±SD表示。所示数据至少是三个独立实验的代表。(A-L)平均值±SD，n＝3，*p<0.05，**p≤0.01和***p≤0.001。(A-C)带有Tukey多重比较的双向Anova，(D-L)带有Dunnett多重比较的单向Anova。也见图15和16。
图11显示了合成的MDA或MG核苷加合物能诱导MR1上调并刺激MR1T T细胞。(A-E)五个合成加合物M3ADE(A)，OPdA(B)，M1G(C)，MGG(D)和OPdC(E)被纯化，它们的结构在左图表示。(中)用各图所示的加合物孵育6小时后，THP-1MR1细胞上MR1表面表达上调。用抗-MR1mAb染色的MFI倍数变化±SD被绘制成图表。(右图)在存在加合物(○)或不存在加合物(●)的情况下，几个MR1T细胞克隆与THP-1细胞共同培养过夜后的IFN-γ释放反应。对于最高抗原(Ag)剂量
Figure GDA0003806018750000241
也显示了抗-MR1 mAb对T细胞有反应性的阻断。数据显示三组重复培养的平均值±SD。实验至少独立进行了三次，其中有一个代表实验。
图12显示了MR1T细胞克隆识别未修饰的核苷加合物和不同的肿瘤细胞。(A)MR1T克隆AVA34、QY1A16、AC1A4和TC5A87分别负载(○)M3ADE、OPdA、M1 G和OPdC的平板结合可溶性MR1(■)的识别。(B)14个MR1T细胞克隆在用每种所示抗原或载体处理的THP-1细胞的存在下的激活测定。在用M3ADE(100μM起)、OPdA(100μM)、M1G(300μM起)或OPdC(100μM)或载体处理的THP-1细胞存在下，刺激14个MR1T细胞克隆。热图报告平均IFN-γ浓度的立方根。(C)MR1T克隆识别不同的肿瘤细胞。黑条描述了在有抗-HLA-A,B,C mAb(克隆W6/32)、抗-HLA-DR mAb(克隆L243)的情况下与指定的肿瘤细胞系的共培养物，白条代表同时有抗HLA和抗-MR1 mAb的的共培养物。图表显示IFN-γ的释放(三组重复培养的平均值±SD)。数据是三组重复培养物的平均值±SD(A，C)和至少两个独立实验(A-C)的代表。(C)与抗-MR1阻断对照相比，**p≤0.01和***p≤0.001(多重t检验)。
图.13显示了在健康捐赠者的外周被检测到的M3ADE特异性细胞。(A)与MAIT细胞克隆MRC25相比，MR1T细胞克隆AC1A4的MR1-M3ADE四聚体染色的直方图。(B)使用负载有5-OP-RU(浅灰色)、6-FP(深灰色)和M3ADE(黑色)的MR1四聚体的AVA34细胞染色(来自MR1-M3ADE四聚体分选的代表性克隆)直方图。(C)用5种合成DNA加合物激活克隆AVA34，包括用抗-MR1 mAb进行相关阻断。柱显示IFN-γ释放(三组重复培养物的平均值±SD)。(D)，来自2个有代表性的捐赠者的PBMC的MR1-M3ADE四聚体染色与CD3表达的关系图。细胞是在活的单细胞上预圈选的，频率显示为CD3+T细胞的百分比。(E)9个健康捐赠者外周血中MR1-M3ADE四聚体+T细胞的体外频率汇总。横条代表中位数值。(F)点阵图显示CD4+/CD8-，CD4-/CD8+和CD4-/CD8-(DN)T细胞在MR1-M3ADE四聚体+T细胞中的比例。横条代表中位数值。(G)点阵图显示了MR1-M3ADE四聚体+T细胞部分中原始、中枢记忆、效应记忆和终末分化的效应记忆(TEMRA)T细胞的百分比。横条代表中位数值。(H)来自每个供体(D1-D9)的预圈选为M3ADE-MR1四聚体+、CD3+的T细胞上CD8、CD4、CD45RA和CCR7标记物的表面表达的直方图。T细胞克隆染色结果至少是两个独立实验的代表。
图14显示了M3ADE四聚体+T细胞存在于人类鳞状细胞肺癌中。(A和B)点阵图显示体外扩增后来自两名患者(捐赠者840和895)的TIL内的MR1-M3ADE四聚体+，CD3+T细胞。显示了MR1-M3ADE四聚体+，CD3+T细胞在总CD3+细胞中的百分比(左)。点阵图显示了CD4+/CD8-、CD4-/CD8+和CD4-/CD8-T细胞在MR1-M3ADE四聚体+T细胞中的比例。每个象限的数字表示每个群体根据总M3ADE-MR1四聚体+，CD3+T细胞计算的百分比(右)。(C)点阵图显示了FACS分选的富集M3ADE-四聚体的T细胞系，这些T细胞系来自于在A375-MR1-B2M KO细胞或过表达MR1的相同细胞存在下激活的每个捐赠者的TIL，用M3ADE处理或用M3ADE处理并用抗-MR1 mAb阻断。T细胞激活是通过TCR下调来测量的，显示为在每个图中表示的四聚体+细胞的百分比和MFI，。(D)在与C相对应的每个条件下，TIL系的激活。在每个条件下重复测量IFN-γ的释放(平均值±SD)。所示数据是至少两个独立实验的代表。(E)通过测量IFN-γ的释放，MR1依赖性地激活四聚体阳性T细胞。
图15显示了敲除细胞系的特征。(A，D，G，J，M)MAIT克隆MRC25对A375-MR1细胞和5-OP-RU响应的激活测定。(P和S)MRC25与THP-1细胞和5-OP-RU的激活测定。细胞为野生型(○)、敲除型(A
Figure GDA0003806018750000242
D■，G
Figure GDA0003806018750000243
J●，M
Figure GDA0003806018750000244
S
Figure GDA0003806018750000245
)或过表达(M■，P■)所述基因。IFN-γ表达为三组重复独立培养物的平均值±SD。(B，E，H，K，N，Q，T)基因工程细胞系的表面MR1表达。用抗-MR1mAb 26.5对野生型细胞(深灰色阴影)、ko系(黑线)和GLO1-过表达(GLO1++)A375-MR1(N，灰色粗虚线)进行MR1染色。野生型细胞(带有灰色虚线的浅灰色阴影)、ko细胞(黑色虚线)或GLO1++A375-MR1(N，黑色虚线)中描述了同型匹配的对照染色。(C，F，I，L，O，R，U)蛋白质印迹分析靶蛋白在所示细胞系的表达。微管蛋白或肌动蛋白被用作负载对照。实验至少重复两次，并显示了一个代表性的实验。
图16显示了用核碱基、抑制性药物和合成抗原刺激MAIT克隆MRC25。(A)在不同的核碱基(250μM)、甲基乙二醛(250μM)或5-OP-RU(30nM)存在下，用THP-1细胞刺激MAIT克隆MRC25。(B和D)用用指定药物处理的THP-1细胞刺激MRC25细胞。(C)用GSH、NAC、APO、BSO或GPX抑制剂处理的A375-MR1细胞刺激MRC25细胞并固定，或用5-OP-RU(10nM)脉冲的THP-1细胞刺激MRC25细胞。(E)用指定浓度的羰基清除剂处理的A375-MR1细胞刺激MRC25细胞并在加入T细胞前固定(空条)。作为对照，在有6,7-二甲基-8-核糖醇二氧四氢蝶啶(20μM，黑条)的情况下，用同样的羰基清道夫进行同样的实验。(F)在M3ADE、OPdA、OPdC(均为100μM)、M1 G(13μM)或5-OP-RU(10nM)存在的情况下，用THP-1细胞刺激MRC25细胞。n.d.＝未确定***p<0.001与使用带有Dunnett的多重比较的单向ANOVA(A、B、C、F)或双向ANOVA(D和E)的载体处理的细胞相比。IFN-γ表示为三组重复的培养物的平均值±SD。实验至少重复两次，并显示一个代表性的实验。
图17(A)阿霉素、紫杉醇或佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)处理的THP-1细胞中产生的ROS的量化。结果表示三组重复实验独立培养物的活细胞的中值荧光强度(MFI)±SD。(B)MR1(黑线)或HLA A，B，C(灰色虚线)在指定肿瘤细胞系中的表面表达。同型匹配的染色对照被描述为灰色阴影。(C)报告每个细胞系的组织来源和诊断疾病的表格。每个实验至少重复两次，并显示一个代表性的实验。**p 0.01和***p 0.001使用带有Dunnett多重比较的单向Anova。
图18显示了选定的化合物对APC的细胞表面MR1的上调。通过流式细胞仪评估MR1在肿瘤细胞上的表达，并显示为与只用载体孵育的细胞上的基线表达相比的中值荧光强度(MFI)。
图19显示了化合物诱导的MR1T细胞的激活。MR1T细胞克隆对用不同剂量的每种化合物或固定剂量的50μM(黑条)孵育的THP-1细胞反应显示为过夜刺激后释放的IFN-γ的平均值±sd。T细胞对THP-1细胞和化合物载体(白条)的反应作为对照被显示。
图20显示了不同化合物竞争刺激MR1T细胞的能力。在为特异性MR1T细胞添加最佳剂量的抗原之前，每种化合物都以3种指定的浓度用于THP-1细胞。T细胞反应显示为IFN-γ释放的平均值±sd。在有竞争者和抗原(方形)、单独的化合物(三角形)或只有THP-1细胞(圆圈)存在下的T细胞反应被显示。
表1.带有结构和参考文献的示例性活性化合物列表。
Figure GDA0003806018750000251
Figure GDA0003806018750000261
Figure GDA0003806018750000271
Figure GDA0003806018750000281
Figure GDA0003806018750000291
Figure GDA0003806018750000301
Figure GDA0003806018750000311
Figure GDA0003806018750000321
Figure GDA0003806018750000331
Figure GDA0003806018750000341
Figure GDA0003806018750000351
如实施例中所示的测定方法获得的结果所证明的，所有示例性化合物被显示与MR1、引起MR1限制性T细胞应答和/或稳定细胞上的MR1表达相互作用。
实施例
材料和方法
人类血液样本
用于T细胞克隆、FACS分析和抗原呈递测定的血液和组织标本从巴塞尔大学医院在被通知允许后获得，根据协议EKNZ 2017-01888，其获得了瑞士当局的伦理批准(EKNZ，瑞士西北和中部伦理委员会)，所有患者和健康捐赠者都书面同意对其样本进行分析。
细胞系
本研究中用作抗原呈递细胞(APC)的细胞系为A375(ATCC CRL-1619)、THP-1(ATCCTIB-202)、A375-MR1和THP1-MR1，以前已经产生并描述过(Lepore等人2017)。HEL、Me67、MelJUSO、H460、KMOE-2和TF-1肿瘤细胞系在补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1xMEM NEAA和50μg/ml卡那霉素(均来自Bioconcept)的RPMI-1640中培养。TF-1细胞的培养基额外补充有10ng/ml重组人GM-CSF(Peprotech)。所有人类T细胞克隆都按照之前的描述保持在培养物中。从健康捐赠者的血液中产生的代表性的MAIT克隆(MRC25)先前已被表征(Schmaler等人(2018)。《粘膜免疫学(Mucosal Immunology)》11：1060-1070)。通过对DNA样本的PCR分析评估，细胞不含支原体。如果可能，通过用mAb对特异性细胞表面标志物染色来验证细胞。
如之前所述进行慢病毒转导。通过基于EGFP或mCherry报告表达的FACS分选或通过2μg/mL嘌呤霉素抗性来选择转导细胞。
人类基因敲除库的筛选
使用先前描述的细胞系和Lenti Cas9-Blast质粒(Addgene)产生的A375-MR1-Cas9细胞通过汇集的人类GeCKO v2 CRISPR库(Addgene)的A和B部分以0.3MOI转导，随后通过2μg/mL嘌呤霉素(Calbiochem，目录号(Cat#)540411)选择96小时。所得APC的8个生物复制体，每个都是库中每个指导的64倍代表，经历了TC5A87细胞以2：1的E：T连续4轮的杀伤，之后将存活的细胞扩增24小时，用NucleoSpin组织试剂盒(Macherey-Nagel，目录号740952)提取DNA。类似地制备另外8个生物复制体，但没有经过TC5A87的杀伤，以作为对照。Illumina库的制备如前所述。简而言之，引物JScrispr1和JScrispr3用于从提取的gDNA中扩增基因组gRNA，并附接普通Illumina引物柄，用于附接测序库索引。此外，前一个引物在Illumina读数1起始点的下游插入了一个8nt的退化序列，减少了测序低复杂度库的问题。在Nextera DNA库制备协议(Illumina)中描述的第二步PCR中，每个复制体都由一对独特的Nextera索引(Illumina，目录号15055290)进行条形码化。高保真优势HF2 PCR试剂盒(Takara，目录号639123)被用于制备测序库的每个PCR步骤中。使用BioAnalyser高灵敏度DNA试剂盒(Agilent，目录号5067-4626)和Qubit高灵敏度dsDNA试剂盒(ThermoFisher，目录号Q32851)对库进行定量，并汇集以形成等摩尔测序库，用20％的PhiX v3对照库(Illumina，目录号FC-110-3001)变性并稀释至1.2pM，如Illumina变性和稀释协议(Illumina)所述，然后在NextSeq500上使用高输出150周期v2试剂盒(Illumina，已停产产品)进行测序。两套测序库都是使用双索引单端协议(131个循环在读数1上，8个循环在每个条形码上)进行测序，达到每个复制体的深度为2500万个读数，确保可以检测到T细胞介导的杀伤后耗竭的指导。
从人类血液和组织样本中分离和培养原始细胞
MR1T细胞是从健康个体的外周血中分离出来的。用密度梯度离心法进行PBMC分离后，用EasySep人类T细胞富集试剂盒通过阴性选择纯化T细胞，并用辐射的(80戈瑞)A375-MR1细胞(比例2：1)和抗原刺激，每周一次，持续三周。在每次刺激后的第+2天和+5天加入人类rIL-2(5U/mL)。最后一次刺激后12天，在有或没有抗原的情况下，清洗细胞并与A375-MR1细胞(比例2：1)共同培养过夜。
然后对CD3+CD69+CD137高细胞进行FACS分选，并在植物血凝素(1μg/mL，Remel，目录号30852801HA16)、人类rIL-2(100U/mL，)和辐射的PBMC(5×105细胞/mL)存在下通过限制性稀释进行克隆。在一些实验中，MR1T细胞克隆是通过限制性稀释FACS分选的CD3+，M3ADE-MR1四聚体+细胞从T细胞系中分离的，该T细胞系是通过用合成Ag脉冲的A375-β2mKO-MR1细胞扩增纯化的T细胞而产生的。T细胞克隆按照相同的协议定期进行再刺激。
通过密度梯度离心法从外周血中分离出PBMC，并在液体N2中冷冻，直到使用。
根据制造商的协议，使用关键资源表中指示的试剂盒从PBMC中用免疫磁力分离法纯化T细胞、B细胞、单核细胞、骨髓树突细胞(mDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)。
来自小细胞肺肿瘤的组织活检样本，用含有Accutase(Innovative Cell；目录号AT-104)、胶原酶IV 200U/mL(Worthington；目录号LS004189)、DNA酶I 0.5mg/mL(西格玛奥德里奇公司，目录号D5025)和透明质酸酶50mg/mL(Sigma；目录号H6254)的培养基在37℃下消化1小时。消化后的材料通过70μM的细胞滤网，红细胞被溶解，然后被冷冻并储存在液氮中。解冻后，TIL静置2天，然后与A375-β2mKO-MR1细胞以1：1的比例，在50μM M3ADE的存在下共同培养。在第5天，将人类rIL-2(5U/mL)加入培养物中，再培养5天，并以这种方式重复扩增3次。然后用MR1-M3ADE四聚体、抗CD3、抗CD4和抗CD8mAb对细胞进行染色，并在进行功能实验前将四聚体阳性细胞分选成大块细胞系。
CRISPR-Cas9介导的基因破坏
通过敲除用不同于库中存在的gRNA转导的A375-MR1-Cas9细胞中的选定基因，从而证实了筛查的结果(表4)。在慢病毒转导和选择之后，A375-MR1-Cas9细胞被维持有限的传代次数，并作为批量群体用于激活测定。通过限制性稀释法克隆THP-1细胞，并筛选出GLO1表达。通过蛋白质印迹评估靶蛋白的表达水平(图15)。用APC标记的小鼠抗MR1mAb26.5(Biolegend)和APC标记的小鼠IgG2a(克隆MOPC-173)作为同型对照，通过流式细胞仪评估MR1表面表达(图15)。
不同细胞系的抗原呈递能力是通过在37℃下用指定浓度的新鲜制备的5-OP-RU脉冲APC2小时后刺激MAIT克隆MRC25来测试的(图15)。
TCR基因转移
来自MR1T克隆的TCRα和β功能cDNA被克隆到Lenti表达载体(Addgene，目录号52962)的修饰版本中。内源性TCR缺陷的SKW-3或J76细胞(Lepore等人2017)用如前所述产生的含有病毒颗粒的上清液进行转导。必要时，通过基于CD3的表达的FACS分选选择转导的细胞。
合成抗原的制备和纯化
化合物M3ADE、OPdA、M1G、OPdC、M1dC、MGdA、MGG、m6、6A、io6A、m6t6A、Ar(p)、M1dA、M3dA、ONEdA、m2、2G、Gr、CEdG、ONEdG、M1dG、N2OPdG、M2dG、m3U、m3Um、yW、OHyW、Psi、ONEdC、M3dC被合成，随后在与细胞一起使用前进行纯化。所有其它化合物都是从不同的供应商处购买的，如表1所示。
8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧-8-氮杂双环[3.3.1]-壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(M3ADE)(13)的合成。
M3ADE如先前所述合成(Stone等人，《毒理学化学研究3(Chemical Research inToxicology 3)》，33-38(1990))，但作了一些修改。1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1.1g，5mmol，4.0当量)在盐酸水溶液(25mL，1M)中在40℃下搅拌1小时。随后，加入腺嘌呤(168.9mg，1.25mmol，1.0当量)的水溶液(25mL)。用NaOH水溶液(1M)将混合物调节至pH 4.0，并在37℃下搅拌5天。在Sep-Pak C18 2g柱(Waters公司，Milford，MA)上通过固相萃取纯化M3ADE。用10mL水和10mL乙腈对柱进行预处理。原始M3ADE用20mL水和20mL 10％乙腈洗涤，然后用20mL 20％乙腈洗脱。
M3ADE HPLC纯化是在配备有MD-4010光电二极管阵列检测器的JASCO RHPLC系统上进行。半制备HPLC纯化采用250x10mm 5μM NUCLEODUR C18锥形HPLC柱进行，温度为23℃，流动相A和B分别为水和95％甲醇水溶液。以6mL/分钟的流速进行分离，线性梯度为0-50％B从0到15分钟，50-100％B从15到38分钟，100％B从38到43分钟，100-0％B从43到44分钟，0％B直到50分钟。M3ADE产量为12.5mg(42μmol，3.4％)。收集了具有生物活性的HPLC峰进行质谱和NMR分析。
1H-NMR(600MHz，D2O，δ/ppm)：9.24(s，1H，H21)，9.11(s，1H，H19)，9.09(s，1H，H15)，8.61(s，1H，H2)，8.38(s，1H，H8)，7.64(s，1H，H17)，7.33-7.29(m，1H，H11)，4.09-4.07(m，1H，H13)，2.21(ddd，2JH12a-H12b＝13.7Hz，3JH12a-H11＝2.8Hz，3JH12a-H13＝2.8Hz，1H，H12a)，2.03(ddd，2JH12b-H12a＝13.7Hz，3JH12b-H11＝2.2Hz，3JH12b-H13＝2.2Hz，1H，H12b)。
13C-NMR(151MHz，D2O，从HSQC和HMBC中提取，δ/ppm)：193.2(C19)，192.2(C21)，166.5(C17)，154.3(C4)，152.7(C2)，150.3(C6)，149.3(C15)，144.8(C8)，126.2(C14)，125.7(C16)，121.8(C5)，79.9(C11)，25.0(C12)，17.4(C13)。
HR-ESI-MS：[M+Na]+C14H11N5NaO3的计算值m/z＝320.0754，实测值320.0758。
嘧啶并[1,2-α]嘌呤-10(3H)-酮(24)(M1G，CAS 103408-45-3)的合成
M1G如前所述合成(Seto等人，《日本化学学会公报58(Bulletin of the ChemicalSociety of Japan 58)》，3431-3435(1985).；Hadley和Draper，《Lipids 25》，82(1990).)，但作了一些修改。将1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1.4g，6.25mmol，5.0当量.)在盐酸水溶液(25mL，1M)中于40℃下搅拌1小时。随后，慢慢加入鸟嘌呤(188.9mg，1.25mmol，1.0当量.)在HCl水溶液(25mL，1M)。将混合物在40℃下搅拌1小时，然后在4℃下保持16小时。用2000x g的无水乙醇洗涤沉淀物洗涤3次，每次10分钟。用65℃的水从沉淀物中提取3次原始M1G。合并的提取物用0.22μm的过滤器过滤。用NaOH水溶液(1M)将混合物调节至pH 7.0。
M1G的HPLC分析是在JASCO RHPLC系统上进行的。使用250/10NUCLEODUR C18锥形HPLC柱进行半制备纯化，柱温为23℃。溶剂A是Milli-Q水，溶剂B由95％的甲醇和5％的Milli-Q水组成。总运行时间为55分钟，流速为6mL分钟。最初的流动相是100％的溶剂A，持续10分钟。溶剂B线性增加，直到梯度在40分钟时达到80％溶剂A和20％溶剂B。溶剂B再次线性增加，直到在41分钟时短暂达到100％。在100％的B下等度流动5分钟，线性梯度至100％的溶剂A1分钟，连续8分钟。收集生物活性HPLC峰进行质谱和NMR分析(12.5mg，66.8μmol，5.3％)。
1H-NMR(600MHz，D2O，δ/ppm)：9.31(d，3JH13-H12＝7.2Hz，1H，H13)，8.97(dd，3JH11-H12＝4.1Hz，4JH11-H13＝2.0Hz，1H，H11)，8.22(s，1H，H8)，7.30(dd，3JH12-H13＝7.2Hz，3JH12-H11＝4.2Hz，1H，H12)。
13C-NMR(151MHz，D2O，从HSQC和HMBC中提取，δ/ppm)：162.9(C11)，154.4(C4)，154.1(C6)，149.9(C2)，146.0(C8)，138.4(C13)，116.7(C5)，112.0(C12)。
HR-ESI-MS：[M+H]+C8 H6N5 O的计算值m/z＝188.0567，实测值188.0571。
N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2'-脱氧腺苷(12)(OPdA，CAS 178427-43-5)的合成
OPdA如前所述合成(Szekely等，《核苷、核苷酸和核酸27(Nucleoside S，Nucleotides and Nucleic Acids 27)》，103-109(2008))，但作了一些修改。在氩气环境下，将2′-脱氧腺苷一水合物(219mg，0.813mmol，1当量.)溶于2mL无水二甲基亚砜中。将丙炔醛(12μL，11.0mg，0.203mmol，0.25当量.)加入搅拌的溶液中，并在72小时内加入额外的丙炔醛(1.25当量.)。反应混合物经过滤后，在Shimadzu LC系统(LC-20AT突出型液相色谱仪，与SPD-20A突出型紫外/可见检测器(λ＝254和280Nm)上通过制备型HPLC纯化。HPLC纯化采用Reprosil-Pur 120ODS 3，5μM，150x 20mm柱进行，其中流动相A和B分别为水和90％乙腈水溶液。以9mL/分钟的流速进行分离，线性梯度为：1-30％B从5至15分钟，30-100％B从15至17分钟，100％B从17至21分钟，100-0％B从21至22分钟，1％B直到25分钟。分析性HPLC是用LC-20AD突出型液相色谱仪与岛津LCMS-2020液相色谱质谱仪相结合进行的。收集生物活性HPLC峰用于质谱和NMR分析。OPdA的产量为13.5mg(44.0μmol，5.4％)。
1H-NMR(500MHz，D2O，δ/ppm)：9.21(d，3JH13-H12＝8.7Hz，1H，H13)，8.49(d，3JH11-H12＝13.5Hz，1H，H11)，8.43(s，1H，H8)，8.38(s，1H，H2)，6.45(dd，3JH1′-H2′a＝6.8Hz，3JH1′-H2′b＝6.8Hz，1H，H1′)，5.89(dd，3JH12-H11＝13.5，3JH12-H13＝8.7Hz，1H，H12)，4.65(ddd，3JH3′-H2′a＝6.1Hz，3JH3′-H2′b＝3.5Hz，3JH3′-H4′＝3.5Hz，1H，H3′)，4.19(ddd，3JH4′-H5′b＝3.8Hz，3JH4′-H5′a＝3.5Hz，3JH4′-H3′＝3.5Hz，1H，H4′)，3.86(dd，2JH5′a-H5′b＝12.5Hz，3JH5′a-H4′＝3.4Hz，1H，H5′a)，3.80(dd，2JH5′b-H5′a＝12.6Hz，3JH5′b-H4′＝4.3Hz，1H，H5′b)，2.80(ddd，2JH2′a-H2′b＝13.7Hz，3JH2′a-H1′＝7.1Hz，3JH2′a-H3′＝6.4Hz，1H，H2′a)，2.58(ddd，2JH2′b-H2′a＝14.0Hz，3JH2′b-H1′＝6.3Hz，3JH2′b-H3′＝3.5Hz，1H，H2′b)。
13C-NMR(126MHz，D2O，从HSQC和HMBC中提取，δ/ppm)：195.7(C13)，151.9(C2)，151.1(C11)，150.6(C4)，148.9(C6)，142.6(C8)，120.8(C5)，111.1(C12)，87.5(C4′)，84.7(C1′)，71.1(C3′)，61.6(C5′)，39.1(C2′)。
HR-ESI-MS：[M+Na]+C13H15N5NaO4的计算值m/z＝328.1016，实测值328.1020。
N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2'-脱氧胞苷(38)(OPdC，CAS 129124-79-4)的合成
OPdC如前所述合成(Szekely等人，同上)，但作了一些修改。在氩气环境下，将2′-脱氧胞苷(185mg，0.813mmol，1当量.)溶解在2mL无水二甲基亚砜中。将丙炔醛(12.0μL，11.0mg，0.203mmol，0.25当量.)加入到搅拌的溶液中，并在72小时内加入额外的丙炔醛(1.25当量.)。反应混合物被过滤并通过预处理纯化。
按照OPdA的描述进行HPLC纯化。OPdC的产量为7.00mg(25.0μmol，3.1％)。收集生物活性HPLC峰用于质谱和NMR分析。
1H-NMR(500MHz，D2O，δ/ppm)：9.31(d，3JH10-H9＝8.6Hz，1H，H10)，8.29(d，3JH8-H9＝13.7Hz，1H，H8)，8.19(d，3JH6-H5＝7.4Hz，1H，H6)，6.28(d，3JH5-H6＝7.4Hz，1H，H5)，6.24(dd，3JH1′-H2′a＝6.1Hz，3JH1′-H2′b＝6.1Hz，1H，H1′)，5.91(dd，3JH9-H8＝13.7Hz，3JH9-H10＝8.6Hz，1H，H9)，4.43(ddd，3JH3′-H2′a＝6.4Hz，3JH3′-H2′b＝4.3Hz，3JH3′-H4′＝4.3Hz，1H，H3′)，4.12(ddd，3JH4′-H5′b＝4.8Hz，3JH4′-H5′a＝4.1Hz，3JH4′-H3′＝4.1Hz，1H，H4′)，3.87(dd，2JH5′a-H5′b＝12.5Hz，3JH5′a-H4′＝3.5Hz，1H，H5′a)，3.77(dd，2JH5′b-H5′a＝12.5Hz，3JH5′b-H4′＝5.3Hz，1H，H5′b)，2.55(ddd，2JH2′b-H2′a＝14.1Hz，3JH2′b-H1′＝6.3Hz，3JH2′b-H3′＝4.3Hz，1H，H2′b)，2.32(ddd，2JH2′a-H2′b＝14.2Hz，3JH2′a-H1′＝6.5Hz，3JH2′a-H3′＝6.5Hz，1H，H2′a)。
13C-NMR(126MHz，D2O，从HSQC和HMBC中提取，δ/ppm)：196.2(C10)，161.5(C4)，156.8(C2)，149.6(C8)，144.3(C6)，112.1(C9)，96.8(C5)，87.1(C1′)，87.1(C4′)，70.3(C3′)，61.1(C5′)，39.8(C2′)。
HR-ESI-MS：[M+Na]+C12H15N3NaO5的计算值m/z＝304.0904，实测值304.0902。
M1dC由2'-脱氧胞苷(25mM，Sigma，目录号D3897)和丙二醛四丁基铵盐(100mM)混合制成。混合物在70℃，400rpm摇动下孵育18小时。如上对M1dC粗化合物制剂进行固相萃取。M1dC用20％的乙腈洗脱。
如下通过使用C18锥形柱(Macherey-Nagel，目录号762204.40)的反相HPLC进行进一步的HPLC纯化。流动相A：去离子水；流动相B：去离子水中的95％甲醇。流速1.25mL/分钟。洗脱梯度：时间0分钟，A 100％；时间1分钟，A 98％；时间43分钟A 50％；时间46分钟A50％；时间47分钟A 100％；时间56分钟A 100％。收集生物活性HPLC分离的化合物用于质谱和NMR分析。
MGG是通过将鸟苷(100mM，Sigma，目录号G6752)和甲基乙二醛溶液(100mM)在DMSO(33.3％，在水中的v/v，Sigma目录号D4540)中混合而成。混合物在70℃、400rpm摇动下孵育2小时。如下通过具有C18锥形柱(Macherey-Nagel，目录号762272.100)的反相HPLC进行进一步的HPLC纯化。流动相A：去离子水；流动相B：去离子水中的95％甲醇。流速5mL/分钟。洗脱梯度：时间0分钟，A 97％；时间2.5分钟，A 97％；时间30分钟A 87％；时间32.5分钟A0％；时间37.5分钟A 0％；时间40分钟A 100％，时间52.5分钟A 100％。收集生物活性HPLC分离的化合物用于质谱和NMR分析。
MS和NMR分析
除非另有说明，化学品都是按原样使用的，没有进一步纯化。所有抗原的NMR分析都是在298K下配有BBFO探针头的在500MHz的质子频率下操作的Bruker Avance III NMR分光仪上或者在配有低温QCI-F探针的在600MHz质子频率下操作的Bruker Avance IIIHDNMR分光仪上进行。标准脉冲序列用于cosy、tocsy、noesy、hsqc、hmqc和hmbc 2D-NMR实验，并且使用topspin 4.0软件包处理光谱。所有的新化合物都通过2D-NMR和HiRes-ESI-MS进行了全面表征。对于所有的化合物，获得了1H-和1H-13C-HSQC光谱，以及实验和计算的HiRes-ESI-MS光谱(未显示)
HRMS光谱在Bruker MaXis 4G高分辨ESI质谱仪上使用含有0.1％v/v甲酸的甲醇以直接注射模式测量。
细胞表面MR1上调
在有或没有合成化合物：M3 ADE(1μM)、OPdA(100μM)、M1 G(13μM)和OPdC(100μM)在37℃下孵育6小时后，测试THP-1细胞(105细胞/孔)的MR1表面表达。Ac-6-FP(乙酰-6-甲酰蝶呤，100μM)(Schircks实验室，目录号11.418)被用作MR1表面上调的阳性对照。细胞用抗人类MR1-APC mAb(克隆26.5)或用APC标记的小鼠IgG2a，k同型对照抗体在4℃下染色20分钟，然后清洗并通过流式细胞仪进行分析。对于每个条件，计算净MFI，从抗MR1 MFI中减去同型MFI，并计算用合成分子处理的细胞相对于用载体处理的细胞的倍数变化。
用活体或固定的APC进行激活测定
MR1T细胞(5×104/孔，除非另有说明)与指定的APC(105细胞/孔，除非另有说明)在120μL体积中共培养18小时，一式三份。在一些实验中，抗MR1 mAb(克隆26.5，纯化且无内毒素的小鼠IgG2a，(Lepore等人，2014))或小鼠IgG2a同型对照mAb(LEAF，Biolegend，目录号401504)(均为30μg/mL)，并在加入T细胞前在37℃下孵育30分钟。
当使用核碱基、核苷或核苷酸(均为250μM)和合成化合物M3ADE、OPdA、M1G或OPdC刺激T细胞时，在加入T细胞前，THP-1细胞(105/孔)只用指定的分子或培养基培养2小时。当使用单一浓度的合成抗原时，所有克隆都使用了100μM OPdA、100μM OPdC和13μM M1G，而除DGB129、AC1A4、AC1B76和AVA46外，所有克隆都使用了100μM M3 ADE，后者使用了1μM。
在用霉酚酸(10μM)、EHNA(25μM)、S-对-溴苄基谷胱甘肽环戊二酯(BBG，20μM)(均来自西格玛奥德里奇公司)、THP-1细胞(1x106/mL)的实验中，在完全培养基中用指定浓度的药物在37℃下处理18小时，然后用PBS洗两次，计数并用于T细胞激活。在THP-1细胞(1x106/mL)被阿霉素(75NM)和紫杉醇(5μM)(均来自西格玛奥德里奇公司)处理的实验中，将细胞在37℃下孵育18小时，然后用PBS洗两次，计数，并在加入T细胞前用载体或150μMdAdo和150μM鸟苷(西格玛奥德里奇公司)孵育2小时。在使用固定A375-MR1细胞激活MR1T细胞的实验中，APC(4x105/mL)用阿朴辛(APO，100μM)、还原型L-谷胱甘肽(GSH，4mM)、N-乙酰半胱氨酸(NAC，4mM)、L-丁硫氨酸-亚磺酰亚胺(BSO，400μM)、巯基琥珀酸(MSA，3.3μM)、ML-210(6μM)或1S,3R-RSL3(RSL3，1μM)、盐酸海拉嗪(100μM)或氨基胍半硫酸盐(5mM)，在37℃下持续18小时，然后用PBS洗两次，用戊二醛固定，计数并用于MR1T细胞刺激。
在一些实验中，用如前所述的5-OP-RU或用30μM的6,7-二甲基-8-核糖醇二氧四氢蝶啶(开曼化工，目录号23370)脉冲3小时的APC刺激MAIT细胞。
为了证实减少MR1T刺激的药物不影响MR1呈递能力，在固定前收集用不同分子处理过的A375-MR1细胞，并用所示浓度的新鲜制备的5-OP-RU或6,7-二甲基-8-核糖醇二氧四氢蝶啶(开曼化工s)在37℃下脉冲2小时后，用来刺激MAIT克隆MRC25。
用平板结合的可溶性MR1进行激活测定
重组人β2m-MR1-Fc是在CHO-K1细胞中产生的，如前所述(Lepore等人，2017)并将4μg/mL涂在96孔板(Nunc，目录号439454)上，在4℃下放置18小时。然后用洗涤缓冲液(150mMNaCl，20mM Tris和2％甘油，pH 5.6)将平板结合的MR1洗涤两次以去除结合的抗原。然后，以指定的浓度加入合成抗原(M3ADE、OPdA、M1G和OPdC)，在室温(RT)下孵育6小时。在加入过量的PBS之前，用PBS洗涤未结合的抗原两次。在一些实验中，将细菌产生和重新折叠的MR1-M3ADE蛋白在PBS中连续稀释，并加入到高蛋白结合平板(Nunc，目录号439454)中，在37℃下进行2小时，然后洗涤两次并用于刺激测定。加入指定的MR1T细胞克隆(105/100μl/孔)，18小时后收集上清液。通过ELISA检测释放的细胞因子。重组人β2m-MR1-Fc在CHO-K1细胞中产生，如前所述，将4μg/mL涂在96孔板上。用洗涤缓冲液(150mMNaCl，20mM Tris和2％甘油，pH 5.6)洗涤两次，去除CHO-K1细胞产生的抗原。在洗涤缓冲液中稀释合成抗原，并在RT孵化3小时。在加入MR1T细胞克隆(105/孔)之前，用洗涤缓冲液洗掉抗原。18小时后收集上清液，通过ELISA进行细胞因子分析。
细胞因子分析
使用特异性mAb通过ELISA评估了以下人类细胞因子：GM-CSF(纯化的克隆BVD2-23B6和生物素化的克隆BVD2-21C11，分别为Biolegend目录号502202和502304)，IFN-γ(纯化的克隆MD-1和生物素化的克隆4S.B3，分别为Biolegend目录号507502和502504)，IL-13(纯化的克隆JES10-5A2和生物素化的克隆SB126d，分别为Southern Biotech目录号10125-01和15930-08)。
MR1蛋白产生和四聚体化
可溶性重组MR1单体如前所述产生(Kjer-Nielsen，L.等人(2012)《自然(Nature)》491(7426)：717-723)。简而言之，编码成熟的人类MR1(GenBank登录号NM_001531)和成熟的人类β2m(GenBank登录号NM_004048.3)的可溶性部分的核苷酸序列被克隆到细菌表达载体pET23d(Novagen，目录号69748-3)中。然后将转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS生长到OD600nm0.4-0.6，然后用0.6M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(西格玛奥德里奇公司，目录号10724815001)诱导。进一步培养4小时后，溶解细胞，清洗、纯化包涵体，并在8M尿素、10mMEDTA、0.1mM DTT中完全变性，以便随后在-80℃储存。
对于蛋白质重新折叠，将MR1重链(4mM)、β2m(2mM)和化合物(15mM)加入到含有0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.0、2mM EDTA的1L重新折叠缓冲液中，该缓冲液已冷却到4℃，并立即补充了5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽。3天后，重新折叠的混合物浓缩到1mL，使用Superdex 75 10/300GL(GE Healthcare，目录号17517401)和MonoQ 5/50(GE Healthcare，目录号17516601)柱，通过HPLC纯化重新折叠的携带化合物的MR1。
通过对MR1T细胞克隆DGB129进行平板结合激活，确认了正确的蛋白质构象。将重新折叠的MR1-化合物蛋白在PBS(1.5-100μg/mL)中连续稀释，并加入到高蛋白结合板(Nunc，目录号439454)中，在37℃下进行2小时。在加入5×104细胞之前，用PBS彻底洗涤孔，这些细胞在37℃下放置过夜。然后用IL-13ELISA作为激活读数。然后使用BirA-500生物素化试剂盒(Avidity，目录号BulkBirA)在4℃下将功能单体生物素化过夜。在与藻红蛋白(PE)-链霉蛋白(Prozyme，目录号PJRS25)以4：1的摩尔比进行四聚体化之前，使用S7510/30(GE Healthcare，29148721)凝胶过滤去除过量的生物素。
作为对照的MR1四聚体，使用了用APC、PE或AlexaFluor488标记的人类MR1-5-OP-RU和人类MR1-6-FP(MR1四聚体技术由James McCluskey博士、JamieRossjohn博士和DavidFairlie博士共同开发的，该材料由NIH四聚体核心设施生产，允许由墨尔本大学分发)。
免疫荧光染色
细胞表面标记使用标准方案进行。根据制造商的说明，使用True-NuclearTM转录因子缓冲液套件(Biolegend，目录号424401)进行细胞内标记。所有用于染色的mAb在使用前都在适当的细胞上滴定。生物素化的mAb用链霉亲和素-PE(Biolegend，目录号405204)、-Alexa Fluor 488(Biolegend，目录号405235)或-Brilliant Violet 421(Biolegend，目录号405226)显示，浓度均为2μg/mL。
用四聚体染色时，在首先加入抗CD8单克隆抗体(Biolegend，克隆RP8-TA BV711)之前，先用达沙替尼(Dasatinib)(50nM，西格玛奥德里奇公司，目录号CDS023389)在37℃下预处理细胞30分钟，然后在室温下加入2.5μg/mL的四聚体再进行20分钟，无需洗涤。然后在室温下加入所有剩余的mAb再进行20分钟，无需洗涤。然后在流式细胞仪上采集前用PBS洗涤细胞。
样本在LSR Fortessa流式细胞仪上用FACS Diva软件(Becton Dickinson)获取。细胞分选实验使用Influx或FACSaria(Becton Dickinson)进行。根据前向散射面积和宽度、侧向散射和DAPI(Sigma)或活/死(Thermo Fisher Scientific)染色排除死细胞和双胞，如图6所示。当分析PBMC时，通过用与活/死染色相同的通道中检测的荧光抗体染色排除CD14+和CD19+细胞。所有的数据都是用FlowJo(LLC)分析的。
ROS产生测量
CM-H2DCFDA(Thermo Fisher Scientific)用于评估用阿霉素和紫杉醇处理细胞时细胞中的ROS产生。THP-1细胞(107/mL)在黑暗中用10μM CM-H2DCFDA在37℃下标记30分钟，然后用PBS洗涤并重新悬浮于完全培养基中。每孔接种105个细胞，用75nM阿霉素、5μM紫杉醇或载体在37℃下处理18小时。佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA，50ng/mL)被用作阳性对照。
量化和统计分析
sgRNA-Seq数据处理和分析
使用bcl2fastq((v2.17.1.14)对原始测序数据进行解复用，并使用FastQC((v0.11.4)检查读数质量。然后使用Trimmomatic v0.36，使用选项HEADCROP：42CROP：20，对读数进行修整，以去除sgRNA序列侧翼的同源区域。这些修整过的读数再次通过FastQC，以检查sgRNA序列的平均phred33质量是否大于30。使用Bowtie2(v2.2.9)和选项-非常-敏感-本地，将这些读数与GeCKO v2 sgRNA参考索引进行对齐。然后用自定义的perl脚本map_count.pl(Cox，M.可应要求提供)从得到的SAM文件中提取读取计数，并导入R(R开发核心团队，2018)以便用edgeR进行分析。
GeCKO库中sgRNA活性的不平等阻碍了使用基于等级的方法进行命中选择，因此在去除针对已知重要基因的引导物后，使用GLM稳健方法，用edgeR软件包进行差异富集分析(Dai等人，2014)，以估计离散度。引导物的随机富集和耗竭水平是用GeCKO库中顶部和底部1％的阴性对照引导物中的log2倍数变化估计的。因此，FDR<0.05和log2的倍数变化分别大于或小于顶部和底部1％的阴性对照引导物被发明人筛选称为明显富集或耗竭。GO-术语和KEGG-途径富集分析是使用二项式检验对差异富集分析中鉴定的重要独特基因靶{Carlson，2016#2707}进行的。使用biomaRt 2.42.0版本对基因进行注释。
CRISPR筛选分析
在R和GraphPad Prism中进行了数据分析、统计测试和可视化。在去除靶向已知基本基因的引导物后，使用edgeR(v3.24)对CRISPR序列数据进行了差异富集分析，使用GLM稳健方法来估计离散度。引导物的随机富集和耗竭水平是使用GeCKO库中顶部和底部1％的阴性对照引导物中的log2倍数变化来估计的。因此，FDR<0.05和log2倍数变化分别大于或小于顶部和底部1％的阴性对照引导物被发明人筛选称为明显富集或耗竭。GO-术语和KEGG-途径富集分析使用二项式检验对差异富集分析中鉴定的重要独特基因靶进行。使用biomaRt2.42.0版本对基因进行注释。
用Prism(GraphPad Software公司)进行统计分析，使用多重t检验，单向因子或双向因子Anova，如图例中每个测定所示。
P值<0.05被认为具有统计学意义。*P<0.05，**P≤0.01，***P≤0.005。
结果
刺激MR1T细胞的化合物
发明人以前的研究结果表明，MR1T细胞识别与肿瘤细胞中存在的配体复合的MR1分子。对THP-1细胞的细胞提取物的纯化，使他们鉴定出可以被定义为修饰的核碱基和核碱基加合物的化合物。
本发明人使用三种类型的生物测定对市售化合物进行筛选。所有这三种测定都是基于化合物与MR1结合的能力，以及i)调节MR1的表面表达水平，ii)以特定方式激活至少一个MR1T细胞克隆，或iii)与刺激性化合物竞争，从而影响MR1T细胞克隆的反应。表1中报告了生物活性化合物。
图1至20显示了上述三种功能性测定中每一种的化合物反应性实例。
通过MR1四聚体染色检测和分选MR1T细胞
作为这些新型化合物用于检测和捕获MR1T细胞的概念的证据，发明人选择了化合物M3ADE。含有M3ADE的MR1分子是通过体外重新折叠在细菌中产生的人类重组可溶性MR1而产生的。通过凝胶过滤色谱纯化负载M3ADE的正确重折叠的MR1单体(图4a)，并使用平板结合测定测试了它们在没有APC的情况下刺激MR1T细胞的能力(图4b)。然后，正确地重新折叠的MR1-M3ADE复合物被生物素化，并使用链霉菌素进行四聚体化。MR1-M3ADE四聚体特异性通过从PBMC中体外捕获反应性T细胞进行验证，随后对其进行扩增并产生T细胞克隆，该克隆保持了四聚体反应性的原始特征和预期的化合物特异性。例如，一个这样的克隆，名为AVA34，通过用MR1-M3ADE四聚体染色阳性，但MR1-5-OP-RU四聚体染色阴性来证实(图5a)。通过预孵化抗Vβ抗体(抗Vβ8mAb)来废除MR1-M3ADE四聚体的结合，进一步证实四聚体染色的TCR特异性(图5a)。克隆AVA34在再次暴露于M3ADE后也被特异性激活，但MR1+APC呈递的其它化合物则没有(图5b)。在这些验证实验后，MR1-M3ADE四聚体被用来检测来自健康捐赠者新鲜分离的PBMC的反应的MR1T细胞(图6)。MR1-M3ADE四聚体阳性细胞很容易被检测到，它们的频率范围在CD3+细胞的约0.005％到0.097％(平均0.027％)之间，类似于传统的HLA限制性T细胞和以前使用不同策略报告的MR1T细胞的频率。为了促进羰基化核苷的积累，在一些实验中，用增加细胞羰基量的药物处理THP-1细胞。这些药物(黄豆苷、双硫仑、齐墩果酸、鞣花酸)在MR1T细胞克隆中诱导了强烈的T细胞应答(图7，板块a、b、c、d、e)。在进一步的实验中，用腺苷脱氨酶抑制剂EHNA处理THP-1细胞以诱导含腺苷加合物的积累，或用霉酚酸处理，霉酚酸抑制肌苷-5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH)，从而诱导肌苷和含腺苷的核苷加合物增加。这两种药物都诱导了对MR1T细胞的强烈刺激(图9，板块g和h)。
代谢途径中的单基因基因敲除有助于T细胞介导的杀伤效率
在以前的研究中，发明人分离出了在无菌条件下识别表达低水平MR1的肿瘤细胞的人类T细胞。这些MR1T细胞，能识别体外或体内扩增的肿瘤细胞系，表明根据环境条件，刺激性抗原优先在肿瘤细胞中积累。此外，单个MR1T细胞克隆显示了肿瘤识别模式，表明肿瘤具有共享和独特的Ags，发明人认为这些Ags是代谢来源。使用了多种方法来识别这些Ags。
为了揭示全球代谢中有助于产生代谢物自身抗原的关键点，发明人进行了全基因组CRISPR敲除筛选。
本发明人先前用MR1和CAS9基因转染的A375黑色素瘤细胞系(A375-MR1细胞)，被用作细胞毒性MR1T细胞克隆TC5A87的靶。在用覆盖人类全基因组的sgRNA库转导并进行三轮连续杀伤后，对存活的A375-MR1细胞进行了深度测序，并对富集或耗竭的gRNA进行了评估。
在进行差异富集分析之前，从原始数据中去除了对A375-MR1细胞生长至关重要的基因，以避免将结果与可能以非T细胞依赖的方式被耗竭的基因靶的命中相混淆的。还预计，库中的许多导引物不会影响T细胞介导的杀伤效率，因此会显示随机富集和耗竭。GecKOv2库包含非靶向阴性对照引导物，它们在响应T细胞介导的杀伤时不应该显示任何明显的富集或耗竭，即它们应该显示丰度的随机变化。因此，基于顶部和底部1％的阴性对照引导物中的Log2倍数变化的Log2倍数变化的截止点来识别那些比背景富集或耗竭(即随机)明显富集或耗竭的引导物。GeCKO库中记录的gRNA活性的不平等，阻碍了使用基于等级的方法进行命中选择，因此使用edgeR软件包进行差异富集分析。本发明人假设，敲除参与抗原生物合成上游步骤的基因进行，将通过减少抗原化合物的产生来增强A375-MR1细胞逃避T细胞介导的杀伤的能力。相反，敲除参与抗原生物合成下游步骤的基因将增加抗原化合物的积累，导致T细胞介导的杀伤力增加。事实上，差异富集分析的结果显示，有一部分富集引导物(n＝243)靶向237个独特的基因，包括两个阳性对照基因，MR1和β-2-微球蛋白(B2M)，没有这些基因，抗原就不会被呈递至MR1限制性T细胞。在这些基因中，本发明人还发现富集了对粘附分子特异性的引导物，所述粘附分子包括CD58(LFA-3)和ICAM-1，它们分别是T细胞上CD2和CD11a的配体。后者的相互作用对T细胞识别目标细胞很重要，在以前的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的CRISPR筛选中也发现了这种相互作用。
在耗竭的命中中，靶向4705个独特基因的5331个引导物相对于用没有经过TC5A87杀伤的gRNA库转导的对照细胞而言，明显耗竭。由于基因的完整性取决于上下文，并对许多实验参数敏感，因此应该预计到，使用哈特A375-MR1基本基因集，并不是所有的基本基因都被成功去除。此外，肿瘤细胞生存所需的基因数量应远远超过允许逃避T细胞介导的杀伤的基因数量，因此，观察到比富集的引导物更明显耗竭的引导物，这并不令人惊讶。对重要命中注释的基因本体学(GO)术语进行二项式富集分析，发现代谢过程中大量被耗竭的基因靶共享富集的GO术语，这表明对MR1T细胞刺激重要的代谢过程需要几个基因的协调活性。这在富集的基因靶中不太明显。此外，这些重要的命中显示出在核碱基和核酸代谢过程中的富集，表明这些代谢途径在MR1T细胞刺激中的潜在作用。
为了探索在筛选中鉴定的明显富集和耗竭的基因靶对全局代谢的影响，发明人使用了结构敏感性分析，该分析最近从反应级扩展到基因级扰动，以预测对Recon3D，人类代谢的基因组尺度模型中单基因敲除的基因的代谢网络反应。该模型进行了适当的预处理。
然后使用每个建模敲除的基因组范围内的反应敏感性之间的Pearson相关性来鉴定对代谢反应有类似(Pearson得分≥0.6)整体效应的2个或更多的基因敲除组。这一分析导致在CRISPR筛选中发现的明显富集或耗竭的基因中选择了125个基因。当这些被选定的基因与它们相应的KEGG途径相关联时，很明显氧化磷酸化和嘌呤代谢可以被一些不同基因靶的单基因敲除所扰乱。此外，所有这些基因，除了2个，都是在筛选中鉴定明显耗竭的命中中。独立地，由CRISPR筛选中的4705个耗竭的基因靶或由从计算机代谢模型中选择的125个基因代表的KEGG途径的二项式富集分析，鉴定嘌呤代谢途径在CRISPR筛选的整体命中和相关Recon3D模型的子集中都明显富集(二项式p值＝2.00e-3和1.67e-4。虽然在CRISPR筛选的命中中没有被确定为明显富集的途径，但氧化磷酸化和甘油脂途径在代谢扰动模型中都明显富集(二项式p值＝6.58e-13和4.08e-4。
肿瘤细胞呈递的核碱基和核苷抗原可刺激MR1T细胞
发明人首先关注的是嘌呤途径。在这里，发明人鉴定了可能参与MR1T细胞抗原积累的几个基因：腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷琥珀酸合成酶1(ADSSL1)、含漆酶域1(LACC1)、cGMP特异性3',5'-环磷酸二酯酶(PDE5A)、醛脱氢酶16家族成员A1(ALDH16A1)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)。ADA将腺苷转化为肌苷，ADSSL1由单磷酸肌苷(IMP)重新生产单磷酸腺苷(AMP)所必需的；而LACC1使嘌呤核苷循环，PDE5A催化cGMP特异性水解为5'-GMP。最后，ALDH16A1和HPRT1蛋白形成一个复合物，通过嘌呤抢救途径产生嘌呤核苷酸。总之，这些发现进一步支持嘌呤作为分子可能参与MR1T细胞的靶识别。
为了验证这些基因的相关性，本发明人产生了基因敲除系，分别测试其刺激MR1T细胞的能力。通过IFN-γ释放测量，与亲代A375-MR1细胞相比，ADA-和LACC1缺陷的细胞诱导的刺激增加，(图8A、B和8D、E)，而ADSSL1缺陷的细胞诱导的刺激轻微但明显减少(图8C和8F)。这些实验是用两个不同的MR1T细胞克隆进行的，选择它们是因为在初步实验中它们显示了不同的肿瘤识别模式。在对照实验中，所有基因敲除细胞系在5-OP-RU抗原存在的情况下同样刺激MR1限制性MAIT细胞(图15)，并且在细胞表面显示类似的MR1表达，表明观察到的MR1T细胞刺激的改变不是由于抗原呈递能力的普遍改变。这些发现使发明人注意到了作为潜在抗原的嘌呤。为了研究嘌呤在MR1T细胞刺激中可能发挥的作用，本发明人在加入MR1T细胞克隆和测量IFN-γ产生之前，用合成的核苷酸、核苷或核碱基孵育人类急性单核细胞白血病THP-1细胞。THP-1细胞被选为靶，因为它们构成性地表达低表面水平的MR1，并诱导一些自发的MR1T细胞刺激，证明它们有能力适当地处理和呈递MR1T细胞抗原。表达非常高表面水平的MR1的A375-MR1细胞也被包括在内作为阳性对照，以刺激MR1T细胞细胞因子的产生。发明人发现，三种不同的MR1T细胞克隆对不同的化合物组有反应：TC5A87对测试的化合物没有明显反应(图8G，左)；DGB129对腺嘌呤、腺苷、脱氧腺苷(dAdo)和肌苷有反应(图8G，中)；MCA3C3被ADP、鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷和黄嘌呤激活(图8G，右)。用合成化合物孵育的THP-1细胞不刺激MAIT细胞(图16A)。有趣的是，尽管这些化合物以高浓度使用，但与A375-MR1刺激的MR1T相比，它们的刺激作用很小，这表明这些分子可能是抗原的中间前体。
总之，这些发现表明，人类MR1T细胞克隆可以识别由癌细胞系处理并呈递的核碱基/核苷抗原，而且不同的MR1T细胞克隆之间可能存在交叉反应性。
肿瘤细胞内的甲基乙二醛和嘌呤代谢途径协同刺激MR1T细胞
为了了解哪些代谢途径可能参与MR1T细胞识别肿瘤细胞上的核碱基/核苷抗原，发明人开始询问发明人的全基因组基因破坏筛选数据。本发明人观察到，一些被明显耗竭的sgRNA与参与糖酵解(TPI1)和甲基乙二醛(MG)降解的基因有关，包括乙二醛酶1(GLO1)和含有乙二醛酶域4(GLOD4)。TPI1编码的是糖酵解途径中的三糖磷酸酯异构酶，负责将二羟基丙酮磷酸(DHAP)酶促转化为3-磷酸甘油醛(G3P)--否则该反应会随着MG的产生自发产生(图9)。相反，GLO1缺陷的细胞在MG(一种高反应性羰基)的降解方面有障碍，因此会积累。由于MG与几个核碱基形成加合物，这些数据表明MG有可能参与产生MR1T细胞抗原。
然后，发明人通过产生单基因KO细胞系，剖析了糖酵解和MG降解在MR1T刺激中的可能作用。A375-MR1细胞中TPI1的缺失明显增加了两种MR1T细胞克隆的IFN-γ产生(图9A、B)。此外，用葡萄糖脉冲后固定的A375-MR1细胞显示出增加的MR1T细胞刺激能力(图9C、D)；当同一细胞用脱氧葡萄糖孵育时，这种效果被取消(图9C、D)，脱氧葡萄糖不进入糖酵解途径，所以不产生MG。本发明人还看到，GLO1缺陷和GLO1过表达的A375-MR1细胞分别显示出增加和减少了MR1T细胞刺激能力(图9E、F)。总的来说，这些结果表明，MG在靶细胞中的积累对刺激MR1T细胞克隆很重要。
为了研究肿瘤细胞的MR1T细胞刺激能力中MG和嘌呤代谢途径之间的潜在协同作用，发明人探索了对这些途径中关键酶的单独和组合药理学抑制的效应。本发明人使用S-对-溴苄基谷胱甘肽(BBG)来抑制GLO1；霉酚酸(MPA)来抑制单磷酸肌苷脱氢酶(IMPDH1,2)，导致IMP积累；以及赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤盐酸盐(EHNA)来抑制ADA和磷酸二酯酶2(PDE2)，诱导腺苷、dAdo和cGMP积累。为了敏感地检测抑制剂的效应，本发明人再次使用THP-1细胞作为靶细胞：本发明人发现BBG与其它两种药物中的每一种组合明显增强两种MR1T细胞克隆对THP-1细胞的IFN-γ释放(图9G、H)。DGB129克隆对这些处理更敏感，并且也对单独用EHNA、BBG或MPA处理的THP-1细胞有反应(图9H)。
本发明人测试了MR1T细胞对GLO1修饰的THP-1细胞和不同剂量的MG或dAdo的IFN-γ反应。本发明人发现，与野生型THP-1细胞相比，MG处理明显增加GLO1缺陷的MR1T细胞的刺激(图9I)。相反，当给药至GLO1-过表达细胞时，MG未能诱导MR1T细胞刺激(图9J)。同样，使用GLO1缺陷的THP-1细胞作为抗原呈递细胞(APC)时，MR1T对dAdo的反应性增加(图9K)，而使用GLO1过表达的THP-1细胞时，则减少(图9L)。总之，这些发现表明，核苷/核碱基和MG协同产生了潜在的MR1T细胞抗原。
多种与氧化应激有关的羰基物种在肿瘤细胞内累积并促进MR1T细胞刺激
除了嘌呤途径外，发明人基于模型的分析突出了与氧化磷酸化有关的基因，其蛋白产物参与线粒体内ATP的生成，其改变促进了活性氧(ROS)的积累。同时，分析指出了H+转运器亚基ATP6V1C2、TCIRG1和ATP6V0D2的相关性，它们参与了偶联质子转运和ATP水解，从而有助于维持细胞内的细胞器生理环境，包括线粒体。因此，发明人接下来研究了ROS在肿瘤细胞刺激MR1T细胞中的作用。首先，发明人把重点放在参与氧化磷酸化的基因上。本发明人在最初的MR1T细胞杀伤筛选中发现了对GSTM1、GSTA4、GSTA1、GSTM5、GSTA2、GSTA3、GSTM3和GSTO1特异性的sgRNA的明显耗竭；这些基因通过与谷胱甘肽(GSH)(一种ROS清除剂)结合，参与了亲电化合物和ROS的解毒。因此，本发明人假设，在没有GST的情况下，在ROS和亲电分子积累时，肿瘤细胞可能会积累MR1T细胞刺激性化合物。因此，发明人测试了紫杉醇和阿霉素的效应，这两种药物会诱导O2和H2O2的细胞积累。当与THP-1细胞和核苷化合物一起孵育时，这两种药物都明显增加了ROS积累(图17A)，并促进了所有三种MR1T细胞克隆的激活(图10A-C)，反映了当嘌呤修饰药物和羰基降解抑制剂组合使用时观察到的附加效应(图9G、H)。
接下来，本发明人用阿朴辛(一种O2清除剂和NADPH氧化酶抑制剂)或者GSH或N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理A375-MR1，其在固定和与三个不同的MR1T细胞克隆一起孵育之前防止H2O2的积累。本发明人发现，用任何一种抑制剂处理的A375-MR1细胞刺激MR1T细胞产生的IFN-γ明显减少，其中阿朴辛对一种T细胞克隆有效(图10D-F)。本发明人还用丁硫磺酰亚胺(BSO)，一种GSH合成酶抑制剂，处理A375-MR1细胞，观察到对所有测试的MR1T克隆的刺激都有明显增加(图10D-F)。总之，这些数据表明，ROS参与了MR1T抗原的积累，尽管需要同时改变核碱基代谢。
过氧化物在许多肿瘤类型中积累，并参与各种信号转导途径和细胞命运决定。过氧化物也是脂质过氧化的必要条件，这是产生丙二醛(MDA)和4-OH-壬烯醛(4-HNE)这两种高活性碳酰的途径。这两种化合物与蛋白质、脂质和核碱基形成稳定的加合物，并在肿瘤细胞内积累。除了发明人发现抑制ROS积累会阻碍肿瘤细胞对MR1T细胞的刺激外(图10D-F)，本发明人从发明人CRISPR/Cas9筛选的结果中推断出脂质过氧化的作用，该结果显示谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)sgRNA的明显耗竭。虽然GPX1蛋白催化谷胱甘肽还原有机氢过氧化物和H2O2，但GPX4对脂质氢过氧化物有高度偏好，并保护细胞免受膜脂质过氧化和死亡。因此，当本发明人用选择性GPX1抑制剂巯基琥珀酸(MSA)或两种GPX4抑制剂RSL3和ML-210预处理A375-MR1细胞时，它们显示出明显增加的MR1T细胞刺激活性(图10G-I)。在对照实验中，这些化合物都不影响MAIT细胞对微生物抗原的反应，只有紫杉醇在有核苷的情况下可以诱发少量但明显的刺激(图16C-D)。总之，这些发现表明，过氧化物和脂质过氧化有助于肿瘤细胞对MR1T细胞的刺激。为了进一步评估羰基参与MR1T抗原的产生，发明人测试了羰基清除剂防止MR1T细胞激活的能力。将A375-MR1细胞与氨基胍和海拉嗪一起孵育，它们对不同的羰基显示出优先的清除活性，然后在加入MR1T细胞克隆前进行固定和洗涤。本发明人发现，这两种清除剂对MR1T细胞克隆产生的IFN-γ有明显的抑制作用(图10J-L)，并且对MAIT细胞激活没有影响(图16E)。
总的来说，本发明人的数据表明，代谢改变后细胞中积累的多种氧化应激相关的反应性羰基物种与核碱基结合，产生刺激MR1T细胞的MR1呈递的抗原。
化合物的生物活性评估
在有或没有化合物(各3个剂量)的情况下，在37℃下孵育3小时后，在THP-1MR1细胞(105细胞/孔)上测量细胞表面MR1调节。Ac-6-FP(100μM，Schircks实验室，目录号11.418)被用作MR1表面上调的阳性对照化合物。MR1表达是通过用APC标记的小鼠mAb抗人类MR1(IgG2a,k克隆26.5，Biolegend目录号361108)进行染色并减去用APC标记的小鼠IgG2a,k同型对照抗体(Biolegend目录号400220)的背景染色来评估的，其总是低于300MFI。
竞争测定是通过将APC(105细胞/孔)与化合物(各3个剂量)在37℃下孵育2小时，然后以最佳浓度(≥EC50)为每个感兴趣的克隆加入抗原，并在加入T细胞(104细胞/孔)之前再孵育2小时。作为与抗原竞争的阳性对照，使用Ac-6-FP(100μM)。24小时后收集上清液，用于通过ELISA测量细胞因子分析。
核碱基加合物刺激MR1T细胞
羰基物种与核碱基的生化缩合是许多癌症细胞类型的独特特征，并导致加合物的产生。本发明人考虑了含核碱基加合物的化合物可能是MR1T细胞抗原的可能性。为了验证这一假设，本发明人合成了四种先前描述的加合物：嘌呤加合物8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(M3ADE)、N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2'-脱氧腺苷(OPdA)和嘧啶并[1,2-α]嘌呤-10(3H)-酮(M1G)以及嘧啶加合物，N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2'-脱氧胞苷(OPdC)，并研究了它们的抗原活性(图11)。本发明人通过高分辨率电喷雾电离质谱(HR-ESI-MS)和核磁共振(NMR)光谱学确认了这些加合物的身份。
最初的初步实验显示，这些化合物能够在脉冲APC上诱导MR1上调，但MGG除外(图11)。
使用表达低水平MR1的APC的T细胞激活实验显示，每种化合物对不同的MR1T细胞有刺激性((图11)。剂量反应研究揭示了，单个MR1T细胞不同程度的敏感性。在某些情况下，观察到极低的EC50(1-10nM)，而相同的抗原对其它MR1T克隆的刺激性很弱或根本没有刺激性。第二个重要发现是一些MR1T克隆的抗原交叉反应性。然而，这些克隆显示出对一种测试抗原的优先反应，这与对分别由MHC或CD1分子呈递的肽或脂质抗原特异性的T细胞所描述的抗原交叉反应类型一致。这些数据与图8G的实验中观察到的交叉反应性一致。用一系列剂量范围的加合物脉冲的THP-1细胞显示，单个化合物通过不同的MR1T细胞克隆不同程度地刺激IFN-γ产生，并显示一些克隆对多种化合物的交叉反应性(图11)。在所有情况下，通过加入阻断性抗MR1单克隆抗体(mAb)后，负载加合物的THP-1细胞的MR1T细胞激活被完全抑制，证实了加合物识别的MR1限制(图11)。
当本发明人用加合物孵育THP-1细胞时，本发明人发现它们都能诱导细胞上MR1的平均表达水平增加1.5-5倍，这与其它MR1结合的化合物一样(图11A-E)。用一定剂量范围的加合物脉冲的THP-1细胞显示，单个化合物通过不同的MR1T细胞克隆不同程度地刺激IFN-γ产生，并显示一些克隆对多种化合物的交叉反应性(图11A-E)。在所有情况下，通过加入阻断性抗MR1单克隆抗体(mAb)后，负载加合物的THP-1细胞的MR1T细胞激活被完全抑制，证实了加合物识别的MR1限制(图11A-E)。
接下来，发明人试图研究这些合成抗原是否在APC内没有修饰的情况下是否具有刺激性。负载有合成抗原的平板结合的重组MR1蛋白有效地刺激了特异性MR1T克隆，从而排除了细胞内处理的需求(图12A)。因此，羰基核碱基加合物直接与MR1结合，无需进一步修饰并刺激MR1T细胞。通过加入阻断性抗MR1 mAb来完全抑制所有这些刺激，证实了MR1蛋白的作用。
本发明人通过将激活测定扩大到包括表达不同TCR的其它MR1T细胞克隆，进一步证实了这些抗原的刺激能力：在测试的14个随机选择的MR1T克隆中，8个对至少一个配体有反应。M3ADE明显刺激了六个克隆，OPdA刺激了八个克隆，M1G和OPdC各刺激了三个克隆(图12B)。同样，不同的加合物识别模式导致MR1T细胞产生大范围的IFN-γ水平，以及MR1T克隆交叉反应性。本发明人还发现，当M1G或M3ADE分别被加入克隆QY1A16和QY1C3时，导致对THP-1细胞的反应明显下降，表明这两种加合物在THP-1细胞中与内源刺激分子竞争。这些发现还表明，一些MR1T克隆识别的抗原与测试的抗原不同。值得注意的是，用合成化合物脉冲的THP-1细胞并没有刺激MAIT细胞克隆MRC25(图16F)。
然后，本发明人使用负载有合成抗原的塑料结合的重组MR1分子评估加合物的THP-1细胞处理是否是MR1T细胞识别所需要的：本发明人发现不需要(图12A)。因此，羰基核碱基加合物直接与MR1结合，无需进一步修饰，并刺激MR1T-细胞。
接下来，本发明人询问了识别不同合成化合物的MR1T克隆对表达生理性低水平MR1的不同肿瘤细胞系的反应能力有何不同。这个问题是相关的，因为独特的羰基加合物在每个肿瘤细胞系中的优先积累可能导致对单个MR1T细胞的优先刺激。由M3ADE激活的克隆AVA34对KMOE-2和HEL肿瘤细胞系有特异性反应；由OPdA和OPdC刺激的克隆QY1A16对H460、Juso和KMOE-2肿瘤细胞系有选择性反应；由M3ADE、OPdA和M1G激活的克隆AC1A4对所有六个测试的肿瘤细胞系都有反应；由OPdA、MGG和OPdC激活的克隆TC5A87对所有肿瘤细胞系都有反应(图12C)。重要的是，通过加入抗MR1 mAb，所有的反应性都被抑制，从而证明了肿瘤识别的MR1限制(图12C)。同样值得注意的是，测试的肿瘤系来自不同的组织。测试的MR1T克隆对健康个体的白细胞没有反应，只有AVA34和TC5A87克隆例外，它们在与单核细胞一起孵育时释放了非常低但数量明显很多的IFN-γ(图12C)。
总之，MR1T细胞识别包含MR1分子上呈递的核碱基的完整羰基加合物的化合物。一些MR1T克隆似乎对一种或另一种加合物具有特异性；其它克隆显示出一定程度的交叉反应性。核碱基加合物在许多癌症中的广泛识别和广泛分布可能证明了MR1T细胞对来自不同组织的肿瘤的广泛反应性。
负载含核碱基加合物的代谢物的MR1四聚体检测MR1T细胞
为了鉴定和表征对含核碱基加合物的代谢物有反应性的体外MR1T细胞，发明人产生了负载合成的加合物的MR1四聚体。本发明人专注于M3ADE，因为它在增加MR1表面表达方面最有效，显示出最高的效力，并被6/14的测试的MR1T细胞克隆识别。发明人进行了几个实验，以证实适当的蛋白质重新折叠和MR1-M3ADE四聚体特异性MR1T细胞染色。MR1-M3ADE单体在平板结合测定中刺激克隆DGB129(图4A-B)，并且荧光标记的四聚化MR1-M3ADE单体染色MR1T细胞克隆AC1A4(图5A)，与其M3ADE反应性一致(图12A)；而四聚体未能结合典型MAIT克隆(MRC25；图13A)。
为了进一步验证，MR1-M3ADE四聚体被用来从外周血单核细胞(PBMC)中分离MR1T细胞，并建立一系列新的克隆。这些克隆能够结合MR1-M3ADE四聚体，但不能结合MR1-5-OP-RU或MR1-6-FP四聚体，这一点由代表性克隆AVA34证明(图13B)。使用抗TCRVβ单克隆抗体废除了结合，进一步证实了四聚体染色的TCR特异性(图13C)。此外，MAIT克隆MRC25用MR1-5-OP-RU四聚体标记，但不用MR1-M3ADE四聚体(图5)标记。重要的是，克隆AVA34对负载M3ADE的THP-1细胞有反应，而对其它测试的抗原则没有反应(图13C)。因此，这些实验验证了MR1-M3ADE四聚体与M3ADE特异性T细胞结合的能力。
发明人接下来的疑问是MR1-M3ADE四聚体是否能结合并识别体外健康捐赠者的血液中的特异性MR1T细胞。对九个健康个体的外周血单核细胞(PBMC)进行筛选，发现所有的人都有四聚体阳性细胞，其频率范围在总CD3+细胞的0.006％至0.077％之间(中位数＝0.01％)(图13D、E和图6)。
除了MR1-M3ADE四聚体结合的T细胞的频率存的明显的个体间差异外，发明人还发现了四聚体阳性群体中明显的表型变化。虽然大多数细胞表达CD8α(范围为38％-97％)，但一个捐赠者显示了独特的CD4+细胞群，占所有四聚体阳性细胞的57％(图13F)。在另一个捐赠者中，CD4-/CD8-群体占四聚体阳性细胞的33％(图13F)。根据CD45RA和CCR7的表达，本发明人还观察到四聚体阳性幼稚细胞(范围8％-55％，中位数29％)、中枢记忆(范围7％-48％，中位数22％)、效应记忆(范围5％-81％，中位数23％)和TEMRA(范围<1％-42％，中位数3.8％)的频率有很大的捐赠者特异性差异(图13G、H)。
因此，识别羰基-核苷-加合物的MR1T细胞存在于健康个体的血液中；它们显示出异质的表型，并有可能以捐赠者特异性方式进行表型分化。
对含核碱基加合物的代谢物有反应性的MR1T细胞浸润肿瘤组织
由于所有被测试个体的血液中都拥有潜在的M3ADE反应性T细胞，发明人接下来的疑问是否能在肿瘤样本中检测到M3ADE反应性T细胞。本发明人从两名患者的非小细胞肺癌活检组织中分离出TIL，并将其与负载M3ADE的A375-MR1细胞共同培养，以扩增MR1T细胞。扩增后，发明人能够在两名患者的TIL共培养物中检测到MR1-M3ADE四聚体结合的细胞(图14A、B)。在840号捐赠者中，这些细胞是CD4+(52.6％)或CD8+(42％)；而在895号捐赠者中，它们大部分是CD8+(93.5％)(图14A、B)。为了证实其抗原特异性，发明人通过分选MR1-M3ADE四聚体阳性细胞进行富集，并用A375-β2mKO细胞、A375-MR1或负载M3ADE的A375-MR1再次刺激它们。本发明人通过TCR下调测量了MR1T细胞激活的程度，这只在A375-MR1细胞和负载M3ADE的A375-MR1细胞存在的情况下才会发生，并被抗MR1阻断性mAb所阻止(图14C，捐赠者840，及图14D，捐赠者895)。发明人通过测量IFN-γ的释放进一步证实了MR1依赖性激活四聚体阳性T细胞(图14E)。来自捐赠者840号的细胞对A375-MR1细胞有反应，而不考虑M3ADE的存在(图14C、E)，而来自捐赠者895的细胞只对负载M3ADE的A375-MR1细胞有反应(图14D、E)；在这两种情况下，反应都被抗MR1 mAb所抑制(图14C-E)。这一数据证实了在肿瘤环境中存在M3ADE反应性T细胞，从而表明MR1T细胞在肿瘤免疫中的潜在作用。
讨论
在这项研究中，发明人已经鉴定含核碱基加合物的代谢物是能够刺激识别MR1表达的肿瘤细胞的人类T淋巴细胞的自我抗原。以前的研究表明MR1T细胞对从肿瘤细胞中分离的独特化合物有反应，这表明了不同的抗原特异性。在这里，发明人证实了这些数据并将其扩展到显示结构多样的含核碱基加合物与MR1结合并刺激单个MR1T细胞。嘌呤和嘧啶都会形成抗原加合物，不同的羰基参与其生成，证实MR1是具有多功能抗原结合能力的分子。
在生物胺、维生素和类固醇的代谢过程中，以及在环境剂和药物的生物转化过程中，羰基的积累是糖酵解和脂质过氧化的不同代谢变化的结果。有多少羰基参与其中值得进一步调查：这是一个重要的问题，因为参与生成MR1呈递的的核碱基加合物的羰基物类的数量和多样性可能决定MR1T细胞抗原库的大小和种类。值得注意的是，一些MR1T克隆对这里测试的任何抗原都没有反应，而对A375-MR1细胞仍有反应，这表明MR1T细胞的抗原库可能是相当异质的。
虽然羰基积累很重要，但它并不足以刺激MR1T细胞，因为在靶T细胞内必须同时存在游离的嘌呤和嘧啶。修饰过的核碱基的结构适合于MR1的结合，并且与其它MR1配体的结构相似，因为它们由不同的修饰过的杂环化合物组成。
产生免疫性核碱基加合物中起重要作用的是ROS--促进肿瘤诱导和肿瘤细胞增殖的氧化磷酸化的副产物。ROS还促进脂质过氧化，导致羰基生成，从而也对MR1T细胞抗原的积累产生间接影响。事实上，用ROS诱导药物治疗会增强MR1T-靶细胞的刺激能力，反之加入ROS清除剂又会被抑制。因此，MR1T细胞抗原是通过多种代谢途径的组合改变而产生的，导致核碱基、羰基和ROS的积累。该领域的一个重要的未解之谜是MR1T细胞识别肿瘤细胞的特异性的基础。本发明人的数据对此提供了一个合理的答案，因为大多数正常细胞在稳定状态下都会从生理上调节有助于核碱基加合物生成和积累的不同代谢途径。相比之下，肿瘤细胞经常在许多维持细胞增殖的这些途径中发生改变，包括葡萄糖和谷氨酰胺摄取的改变，以及细胞对还原氮的高需求。事实上，许多肿瘤增加了参与新嘌呤合成的关键基因的转录，这表明了嘌呤体的关键作用。此外，肿瘤细胞趋向于通过DNA氧化和与脂质过氧化的最终产物相互作用后形成的核酸加合物而导致DNA损伤。
重要的是，在正常细胞中，有几种机制参与清除高反应性的羰基，通过这些机制，羰基被氧化成碳酸，与谷胱甘肽共轭，或被还原成毒性较小的醇。在发明人的CRISPR/Cas9筛选中，发明人鉴定了参与这些过程的几个基因是保守的，这表明它们有助于逃避MR1T细胞的识别。羰基清除剂对肿瘤细胞的MR1T刺激能力的负面效应进一步支持了这些控制机制的相关性。
MR1T细胞对含核碱基加合物代谢物的识别提出了这些细胞的生理作用的问题。可以想象，在调查细胞异常地积累导致DNA改变的化合物，从而容易发生危险的基因突变时，它们可能会发挥潜在作用。MR1的无处不在的表达可能有助于这种细胞代谢完整性控制的功能。MR1T细胞的这些特性使它们成为癌症免疫治疗的诱人靶。本发明人设想有可能使用选定的MR1T TCR基因，将癌症患者T细胞的特异性重新导向这些新的肿瘤相关代谢物抗原，从而使它们具备肿瘤靶向能力。在两名肺癌患者的肿瘤微环境内检测到MR1T细胞是支持这一策略潜在价值的有希望的证据。另一个可能的应用是使用含核碱基加合物的代谢物作为创新抗肿瘤疫苗的成分。重要的是，MR1的单态性可能提供了规避HLA多态性的可能性，并在普遍的基础上设计适用于整个癌症患者群体的基于T细胞的免疫疗法，且不受遗传背景的影响。
总之，免疫系统继续以其检测广泛的结构多变抗原的能力让我们吃惊。T细胞对含核碱基加合物代谢物的识别是这种巨大灵活性的最新证据。
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表2.迄今确定的化合物功能活性的概要
Figure GDA0003806018750000471
Figure GDA0003806018750000481
ND，未确定
表3A：PCT/EP2019/074284的MR1特异性TCR的序列ID No的名称
Figure GDA0003806018750000491
表3B：本文首次公开的新的MR1特异性TCR的序列ID No的名称
Figure GDA0003806018750000492
表4.gRNA靶序列和克隆载体。
靶基因 gRNA序列 SEQ ID N 载体
ADA CAGGCTTGATGGATCCGTCT 151 pLV-mCherry-U6 gRNA
ADA TCACCGTACTGTCCACGCCG 152 lentiGuide-Puro
ADA GCGGTACAGTCCGCACCTGC 153 lentiGuide-Puro
ADSSL1 TTCCAGGGGGGCAACAACGC 154 lentiGuide-Puro
ADSSL1 GCTGATGATGTCGGCGTCCG 155 lentiGuide-Puro
ADSSL1 ACATACCGAAGTCAATGTCG 156 lentiGuide-Puro
LACC1 CGTAGGTTGGCGAATGCTGC 157 lentiGuide-Puro
LACC1 TACCTTGGGATCTCTCCGTT 158 lentiGuide-Puro
LACC1 TCAAGAAAATCTGCGTAGGT 159 lentiGuide-Puro
GLO1 GAACCGCAGCCCCCGTCCGG 160 pRP[gRNA]-EGFP：P2A：Puro-U6
GLO1 GTCCGGCGGCCTCACGGACG 161 pRP[gRNA]-EGFP：P2A：Puro-U6
TPI1 CGGCGAGGGCTTACCGGTGT 162 lentiGuide-Puro
TPI1 ACCGGTGTCGGCCGGCACCT 163 lentiGuide-Puro
TPI1 CGAAGTCGATATAGGCAGTA 164 lentiGuide-Puro
乱序序列 GTGTAGTTCGACCATTCGTG 165 lentiGuide-Puro
乱序序列 GTTCAGGATCACGTTACCGC 166 lentiGuide-Puro
乱序序列 AAATGTGAGATCAGAGTAAT 167 lentiGuide-Puro

Claims (28)

1.一种调节MR1多肽与MR1特异性T细胞受体分子之间的相互作用的方法，所述方法包括使所述MR1多肽与下列化合物接触：
a.MR1配体化合物，其由下列通式中任一种描述：
Figure FDA0003806018740000011
Figure FDA0003806018740000021
其中
-R1A是H或甲基，R1G是H或甲基；
-RN3是H或甲基；
-R2选自H、甲基和-S-甲基；
-R3U和R5U选自H和甲基；R5C选自H和甲基；
-RN1和RN2都是H或者C1至C3烷基，
或者RN1是H或C1至C3烷基(特别地RN1是H或甲基)且RN2选自C1-C6烷基、C2-C6亚烷基和C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，其中所述烷基或所述亚烷基未被取代或被羰基、羧基和/或羟基取代，
特别地，RN1是H，且RN2选自甲基、2-羟基-乙基、1-羧乙基、1,2-二羧基-乙基、苏氨酰基氨基甲酰基、异戊-2-烯基、顺式-羟基异戊-2-烯基、3-氧代-1-丙烯基和己-1,3,5-三烯-1,1,3-三甲醛；
或者RN1、RN2和氮共同形成2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛双环系统；
或者
-RN3和R1A共同，或RN2和R3C共同，或RN1和R1G共同形成未取代的或C4至C16-2-氧代-烷基取代的或ω-羧基-2-氧代-烷基取代的咪唑环，或
RN3和R1A共同，或RN2和R3C共同，或RN1和R1G共同是-C(CH3)OH-CHOH-或C(R′)OH-CH2-CHOH-或氧-亚环丙基-丙二醛取代的-丙-2-烯，其中R′选自H、CH3、CH(OH)C2H5、C2H5和C4H9；
或者RN1和R1G形成嘧啶，或者RN1和R1G或者RN3和R1A形成12-氧代-5,6,10,12-四氢-3H-6,10-桥亚甲基[1,3,5]氧杂二氮芳辛环系统，或者RN1和R1G形成2-氧杂-6,8-二氮杂双环[3.3.1]壬-3-烯-4-甲醛双环系统；
且
-RO选自H、未取代的或羟基取代的C1-C5烷基或C2-C5亚烷基，
-RX选自SH、C1-C5烷基、C2-C5亚烷基和C1-C5 S-烷基；
-RR选自H、1′-核糖基、2′-脱氧-1′-核糖基、5′-磷酰-1′-核糖基、5′-甲硫基-1′-核糖基、1′-(2′-O-核糖基-5″-磷酸)核糖基、1′-(2′-O-核糖基)-核糖基、1′-(2′-O-甲基)核糖基；
条件是，腺嘌呤、腺苷、脱氧腺苷、鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、尿嘧啶、尿苷、脱氧尿苷、胸腺嘧啶、胸苷、脱氧胸苷(5-甲基尿苷)、胞嘧啶和胞苷和脱氧胞苷未被通式I、II、III和IV包括在内，
b.或者MR1配体化合物，其选自3-甲基腺嘌呤(41)、7-甲基-7-脱氮-2′-脱氧鸟苷(49)、辫苷(33)、怀丁苷(34)、羟基怀丁苷(35)或假尿苷(36)，或者(2R,3S,4R,5R)-2-(羟甲基)-5-(6-(甲硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3,4-二醇(40)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中RR由通式(V)或(V-S)描述：
Figure FDA0003806018740000022
其中RB是将部分结合至I、I-1、II、II+、II-1、II-1+、Ix的N9氮或结合至III、IV或IV-1的N1氮的键，R2′选自H、OH、OCH3、O-核糖基和O-核糖基-5″-磷酸，且R5′选自H和PO3 2-；
特别地，其中RR由所述通式(V)描述，
更特别地，其中RR由通式(Va)描述：
Figure FDA0003806018740000031
更加特别地，其中RR由通式(Vb：R2′是OH)或(Vc：R2′是5′-磷酰核糖基)或(Vd：R2′是H)或(Ve：R2′是核糖基)描述：
Figure FDA0003806018740000032
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述MR1配体化合物由I-1或通式IIa描述
Figure FDA0003806018740000041
-其中RN1、RN2、R1A、R1G、R2′和R5′可以具有上述含义，
-且其中RR具有根据权利要求1或2所述的含义。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述MR1配体化合物由式I描述，且RN1、RN2和氮共同形成2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛双环系统。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述MR1配体化合物由下列描述：
a.式(I)，其中R2是S-甲基，并且RN1和RN2都是H；
b.式(I)，其中R2是甲基，且RN1和RN2都是H；或
c.式(I-1)，其中R1A是甲基，R2是H，且RN3是H；或
d.式(I-1)，其中R1A是甲基，R2是甲基，且RN3是H；或
e.式(I-1)，其中R1A是甲基，R2是S-甲基，并且RN3是H；或
f.式(I)，其中R2是H，RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
g.式(I)，其中R2是S-甲基，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、乙-2-醇、1,2-二羧基-乙基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
h.式(I)，其中R2是甲基，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
i.式(II)，其中R1G是甲基，且RN1和RN2都为H；或
j.式(II+)，其中R1G是甲基，且RN1和RN2都为H；或
k.式(II+)，其中R1G是H，且RN1和RN2都为H；或
l.式(II)，其中R1G是甲基，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、乙基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
m.式(II+)，其中R1G是甲基，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
n.式(II+)，其中R1G是H，并且RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
o.式(I-IM或II-IM)，当中RIM选自H、CH2COCnH(2n+1)，其中n为3至7(特别地n＝5)和CH2CO(CH2)mCOO-，其中m为3至9(特别地n＝7)
Figure FDA0003806018740000051
p.式(II-c)，(II-d)，(II-e)，(II-f)
Figure FDA0003806018740000052
q.式(II-g)或(II-h)，其中R2选自H、甲基和S-甲基：
Figure FDA0003806018740000053
r.式(II-i)(II-j)，其中RN1选自H和甲基，且其中R2选自H、甲基和S-甲基：
Figure FDA0003806018740000054
s.式(III)，其中R3U是H，且R5U是甲基，
t.式(III)，其中R3U是甲基，且R5U是H，
u.式(III)，其中R3U和R5U都是甲基，
v.式(IV)，其中R5C是H，RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
w.式(IV-1)，其中RN2选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；或
x.式(IV)，其中R5C是甲基，RN1和RN2中的一者选自H和甲基，且RN1和RN2中的另一者选自甲基、3-甲基丁(2)烯基、3-羟甲基丁(2)烯基和苏氨酰基氨基甲酰基；
y.式(Ix)，其中R2是H，且RX选自甲基和S-甲基；
z.式(I)，其中R2是H，RN1是H，RN2是3-氧代-1-丙烯基；
aa.式(I-a)，
Figure FDA0003806018740000061
bb.式(II-k)，
Figure FDA0003806018740000062
cc.式(I-2)，其中R1A、RN1和R2是H，且RN2是异戊-2-烯基或顺式-羟基异戊-2-烯基，
dd.式(I)，其中RN1和R2都是H，且RN2是异戊-2-烯基或顺式-羟基异戊-2-烯基，
ee.式(II-1)，其中RO是甲基或乙-2-醇，且RN1和R2都是氢；
ff.式(I-b)，
Figure FDA0003806018740000063
并且其中，在每个式中，RR具有根据权利要求1或2所述的含义。
6.根据权利要求1或3至5中任一项所述的方法，其中RR是H。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中RR是(1)-核糖基(Vb)。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中RR是(1)-脱氧核糖基(Vd)。
9.根据权利要求1中任一项所述的方法，其中所述MR1配体化合物选自：
a.1-甲基腺苷(1)
b.2-甲基腺苷(2)
c.2′-O-甲基腺苷(3)
d.N6,N6-二甲基腺苷(4)
e.N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(5)
f.N6-异戊-2-烯基腺苷(6)
g.N6-(顺式-羟基异戊-2-烯基)腺苷(7)
h.2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊-2-烯基)腺苷(8)
i.2-甲硫基-N6-异戊-2-烯基腺苷(9)
j.N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(10)
k.2′-O-核糖基腺苷磷酸盐(11)
l.N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧腺苷(12)
m.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(13)
n.1-(3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑[2,1-i]嘌呤-7-基)庚-2-酮(14)
o.1-甲基鸟苷(15)
p.N2-甲基鸟苷(16)
q.7-甲基鸟苷(17)
r.2′-O-甲基鸟苷(18)
s.N2,N2-二甲基鸟苷(19)
t.2'-O-核糖基鸟苷(20)
u.3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-6-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(21)、3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-7-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(22)，或两者的混合物；
v.2-((6-氧代-6,7-二氢-1H-嘌呤-2-基)氨基)丙酸酯(23)
w.3-((2R,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7-(2-氧代庚基)-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(25)
x.3-(2-脱氧-β-D-赤式-呋喃戊糖基)嘧啶并[1,2-α]嘌呤-10(3H)-酮(26)
y.N2-氧代丙烯基-脱氧鸟苷(27)
z.3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-12-氧代-5,6,10,12-四氢-3H-6,10-桥亚甲基[1,3,5]氧杂二氮芳辛并[5,4-a]嘌呤-9-甲醛(28)
aa.2′-O-甲基胞苷(29)
bb.3-甲基尿苷(30)
cc.5-甲基尿苷(31)
dd.3,2′-O-二甲基尿苷(32)
ee.6-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3-(2-氧代庚基)-1,8a-二氢咪唑[1,2-c]嘧啶-5(6H)-酮(37)
ff.N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧胞苷(38)
gg.8-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(39)
hh.3-甲基腺嘌呤(41)
ii.N6-甲基腺苷(42)
jj.6-甲基嘌呤(43)
kk.6-(二甲基氨基)嘌呤(44)
ll.N6-(Δ2-异戊烯基)腺嘌呤(45)
mm.N1-甲基-2′-脱氧鸟苷(46)
nn.1-甲基鸟嘌呤(47)
oo.N2-甲基-2′-脱氧鸟苷(48)
pp.7-甲基-7-脱氮-2′-脱氧鸟苷(49)
qq.O6-甲基-2′-脱氧鸟苷(50)
rr.N2-乙基-2′-脱氧鸟苷(51)
ss.5′-脱氧-5′-(甲硫基)腺苷(52)
tt.N6-甲基-2′-脱氧腺苷(53)
uu.N6-(2-羟乙基)-2′-脱氧腺苷(54)
vv.O6-(2-羟乙基)-2′-脱氧鸟苷(55)
ww.N6-琥珀酰基腺苷(56)
xx.2-(2-((3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3,7-二氢嘧啶并[2,1-i]嘌呤-7-基)氧)环亚丙基)丙二醛(57)；
yy.嘧啶并[1,2-α]嘌呤-10(3H)-酮(M1G)(24)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法选自
a.当所述MR1配体化合物由MR1分子呈递时，鉴定和分离对所述MR1配体化合物有反应性的T细胞或T细胞受体分子的方法，及
b.当所述MR1配体化合物由MR1分子呈递时，鉴定和分离对所述MR1配体化合物有反应性的抗体的方法，及
c.诊断方法，其中关于如本文鉴定的MR1配体化合物的存在对从患者获得的样本进行分析，特别地，其中所述MR1配体化合物由患者细胞上的MR1分子呈递或与之结合，更特别地，其中所述MR1配体化合物由患者癌细胞上的MR1分子呈递或与之结合，
d.诊断方法，其中关于对如本文鉴定的MR1配体化合物有反应性的T细胞的存在对从患者获得的样本进行分析，其中所述MR1配体化合物由细胞，特别是患者细胞上的MR1分子呈递或与之结合，更特别地，其中所述MR1配体化合物由患者癌细胞上的MR1分子呈递或与之结合。
11.一种供使用的根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物，其用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病，特别地用于治疗以表达MR1的肿瘤细胞为特征的癌症。
12.根据权利要求11所述的供使用的MR1配体化合物，其中所述化合物与抗癌药和/或检查点调节剂同时给药。
13.根据权利要求11或12所述的供使用的MR1配体化合物，其中所述化合物与包括(转基因)MR1反应性的T细胞和/或编码MR1的多核苷酸表达载体的制剂联合给药(在给药之前、同时或之后给药)。
14.根据权利要求13所述的供使用的MR1配体化合物，其中所述MR1配体和/或所述编码MR1的多核苷酸表达载体给药到肿瘤内、所述肿瘤附近或引流肿瘤部位的淋巴结内。
15.一种鉴定对权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物有反应性的T细胞的方法，所述方法包括下列步骤：
提供对MR1有反应性/能够特异性识别MR1的T细胞制剂；
a.使所述T细胞制剂与包括所述化合物结合的分离的MR1的复合物接触；
b.在分离步骤中分离出对所述MR1配体化合物有特异反应性的T细胞。
16.一种分离的T细胞受体(TCR)，特别是包括以下的TCR：
-TCR的α链和TCR的β链，
-或包括TCR的γ链和TCR的δ链的TCR，
特别地TCR的α链和TCR的β链；
其中所述TCR能够特异性结合至根据权利要求1至9中任一项所述的与MR1多肽结合的MR1配体化合物，
条件是，由SEQ ID NO 1和2、3和4、5和6、13和25、14和26、15和27、16和28、17和29、18和30、19和31、20和32、21和33、22和34、23和35、24和36以及61和62的结合形成的TCR被放弃。
17.根据权利要求16所述的分离的TCR，其中所述TCR是否特异性结合至MR1配体化合物的确定通过相对于在不存在MR1配体的相同设置下T细胞的IFNγ分泌，当存在所述MR1配体化合物的情况下与表达MR1的抗原呈递细胞接触时，确定携带所述TCR的所述T细胞的IFNγ分泌来进行的，
如果发现所述MR1配体有统计学意义上明显的积极效应，特别地如果差异是至少两倍，更特别地如果所述差异是至少10倍，则所述确定是阳性。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的分离的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR识别与MR1结合的MR1配体化合物，其中所述MR1配体化合物选自：
a.1-甲基腺苷(1)；
b.2-甲基腺苷(2)；
c.2′-O-甲基腺苷(3)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
d.N6,N6-二甲基腺苷(4)，条件是由SEQ ID NO 1和2及22和34构成的TCR被放弃；
e.N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(5)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
f.N6-异戊烯基腺苷(6)，条件是由SEQ ID NO 1和2、16和28及22和34构成的TCR被放弃；
g.N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(7)；
h.2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(8)，条件是由SEQ ID NO 1和2、16和28及22和34构成的TCR被放弃；
i.2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷(9)；
j.N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷(10)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
k.2′-O-核糖基腺苷(磷酸)(11)；
l.N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧腺苷(12)，条件是由SEQ ID NO 1和2、16和28及22和34构成的TCR被放弃；
m.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(13)，条件是由SEQ ID NO 16和28构成的TCR被放弃；
n.1-(3-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑[2,1-i]嘌呤-7-基)庚-2-酮(14)；
o.N2-甲基鸟苷(16)；
p.7-甲基鸟苷(17)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
q.2′-O-甲基鸟苷(18)；
r.N2,N2-二甲基鸟苷(19)，条件是由SEQ ID NO 1和2构成的TCR被放弃；
s.2′-O-核糖基鸟苷磷酸盐(20)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
t.3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-6-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(21)，条件是由SEQ ID NO 16和28构成的TCR被放弃；
u.3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6,7-二羟基-7-甲基-6,7-二氢-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(22)，条件是由SEQ ID NO 16和28构成的TCR被放弃；
v.1-甲基鸟苷(24)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
w.3-((2R,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7-(2-氧代庚基)-3H-咪唑[1,2-a]嘌呤-9(5H)-酮(25)；
x.2′-O-甲基胞苷(29)；
y.3-甲基尿苷(30)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
z.5-甲基尿苷(31)；
aa.3,2′-O-二甲基尿苷(32)；
bb.辫苷(33)；
cc.怀丁苷(34)；
dd.羟基怀丁苷(35)；
ee.假尿苷(36)；
ff.6-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3-(2-氧代庚基)-1,8a-二氢咪唑[1,2-c]嘧啶-5(6H)-酮(37)；
gg.N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧胞苷(38)，条件是由SEQ ID NO 22和34构成的TCR被放弃；
hh.6-甲基巯基嘌呤(40)，条件是由SEQ ID NO 16和28、22和34及24和36构成的TCR被放弃；
ii.N6-甲基腺苷(42)；
jj.6-甲基嘌呤(43)；
kk.6-(二甲基氨基)嘌呤(44)；
ll.N6-(Δ2-异戊烯基)腺嘌呤(45)；
mm.1-甲基鸟嘌呤(47)；
nn.N2-甲基-2′-脱氧鸟苷(48)；
oo.5′-脱氧-5′-(甲硫基)腺苷(52)；
pp.N6-甲基-2′-脱氧腺苷(53)，条件是由SEQ ID NO 3和4构成的TCR被放弃；
qq.N6-(2-羟乙基)-2′-脱氧腺苷(54)，条件是由SEQ ID NO 3和4构成的TCR被放弃。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的分离的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR识别下列与MR1缔合的化合物：
a.N6-异戊烯基腺苷(6)，特别地，其中所述TCR包括由SEQ ID 99和100构成的CDR，特别地，其中所述TCR包括以SEQ ID 97和98为特征的多肽链；
b.N6-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧腺苷(12)，特别地，其中所述TCR包括由SEQ ID 99和100、或103和104、或108和108、或111和112、或123和124构成的CDR、特别地、其中所述TCR包括以SEQ ID 97和98、或101和102、或105和106、或109和110、或121和122为特征的多肽链；
c.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛(13)，特别地，其中所述TCR包括由SEQ ID 99和100、或103和104、或107和108、或111和112、或123和124构成的CDR，特别地，其中所述TCR包括以SEQ ID 97和98、或101和102、或105和106、或109和110、或121和122为特征的多肽链；
d.嘧啶并[1,2-a]嘌呤-10(3H)-酮(24)，特别地，其中所述TCR包括由SEQ ID 99和100、或103和104、或111和112构成的CDR、特别地、其中所述TCR包括以SEQ ID 97和98、或101和102、或109和110为特征的多肽链；
e.N4-(3-氧代-1-丙烯基)-2′-脱氧胞苷(38)，特别地，其中所述TCR包括由SEQ ID 111和112、或123和124构成的CDR，特别地，其中所述TCR包括以SEQ ID 109和110、或121和122为特征的多肽链；
f.6-甲基巯基嘌呤(40)，特别地，其中所述TCR包括由SEQ ID 107和108构成的CDR，特别地，其中所述TCR包括以SEQ ID 105和106为特征的多肽链。
20.一种分离的T细胞受体(TCR)蛋白异二聚体，其包括TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链和所述TCRβ链各以CDR3序列为特征，且所述TCR蛋白异二聚体以选自SEQ ID No 99和100、103和104、107和108、111和112、115和116、119和120、123和124、127和128、131和132的一对α链和β链序列为特征；
特别地，其中所述TCRα链和所述TCRβ链选自SEQ ID No 97和98、101和102、105和106、109和110、113和114、117和118、121和122、125和126及129和130的一对α链和β链氨基酸序列，
或者是与所述一对α链和β链氨基酸序列至少85％(≥90％、95％、98％)相同且具有相同的生物活性的序列。
21.一种编码根据权利要求16至20中任一项所述的TCR的多核苷酸，特别地，其中所述多核苷酸选自：
a.DNA表达载体；
b.RNA分子，特别地，稳定的信使RNA分子
c.病毒载体。
22.一种分离的T细胞，其表达，特别地重组表达根据权利要求16至20中任一项所述的TCR。
23.一种供使用的根据权利要求22所述的分离的T细胞，或编码根据权利要求16至20中任一项所述的TCR的多核苷酸，其用于预防或治疗与异常或缺乏MR1特异性T细胞应答相关的疾病，特别地用于癌症的治疗。
24.根据权利要求23所述的供使用的分离的T细胞和/或所述多核苷酸，其中所述疾病是以MR1表达为特征的癌症。
25.根据权利要求23或24所述的供使用的分离的T细胞和/或所述多核苷酸，其中所述分离的T细胞和/或所述多核苷酸是与根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物同时给药。
26.一种供使用的根据权利要求1至9中任一项所述的MR1配体化合物，其用于癌症的治疗，其中所述MR1配体化合物是与表达MR1特异性TCR的分离的T细胞联合给药(在之前、同时或之后给药)，所述TCR包括由表3A的同一行鉴定的一对α和βCDR3序列，特别地由SEQ ID NO1和2、3和4、5和6、13和25、14和26、15和27、16和28、17和29、18和30、19和31、20和32、21和33、22和34、23和35、24和36及61和62构成的MR1特异性TCR和/或编码所述MR1特异性TCR的多核苷酸。
27.根据权利要求23至25所述的供使用的分离的T细胞和/或所述多核苷酸，其中表达所述TCR的所述分离的T细胞和/或所述多核苷酸与药物化合物同时给药，所述药物化合物选自紫杉醇、阿霉素、多西他赛、卡巴他赛、柔红霉素、表阿霉素、伊达比星、双硫仑、鞣花酸、喷司他丁和霉酚酸(MPA)、阿莫地喹、氯丙嗪、多潘立酮、雌二醇、非洛地平、氯雷他定、马普替林、甲氧氯普胺、去甲替林、昂丹司琼、奋乃静、丙嗪、异丙嗪、雷洛昔芬、沙美特罗、他克林、他莫西芬和硫利达嗪、别嘌呤醇、非布索坦、巯异嘌呤、托匹司他、肌醇类(植酸和肌醇)，
特别地，其中表达所述TCR的所述分离的T细胞和/或所述多核苷酸与选自紫杉醇、阿霉素、双硫仑和MPA的药物化合物共同给药，
更特别地，其中所述同时给药的药物化合物选自紫杉醇和阿霉素，
为治疗或预防与异常或缺乏MR1表达相关的疾病，特别地治疗或预防与表达MR1的肿瘤细胞相关的癌症疾病的复发。
28.8-(9H-嘌呤-6-基)-2-氧杂-8-氮杂双环[3.3.1]壬-3,6-二烯-4,6-二甲醛。
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