CN115943153A

CN115943153A - 用于治疗阿尔茨海默病的化合物和方法

Info

Publication number: CN115943153A
Application number: CN202180008401.XA
Authority: CN
Inventors: 扬·约翰逊
Original assignee: AlphaBeta AB
Current assignee: AlphaBeta AB
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2023-04-07
Also published as: JP2023509187A; EP4087860B1; WO2021140140A1; US20230002458A1; EP4087860C0; EP4087860A1

Abstract

披露了一种分离的蛋白质，其包含与Bri2 BRICHOS具有至少70％同一性的90‑200个氨基酸残基的部分，其中对应于全长Bri2 wt中位置221的Arg的氨基酸残基不是Arg、Lys或His。该蛋白质可用作用于在治疗阿尔茨海默病中使用的药物。

Description

用于治疗阿尔茨海默病的化合物和方法

技术领域

本发明属于医学领域。更特别地，本发明涉及用于哺乳动物(比如人类)的阿尔茨海默病的治疗和医学治疗的药物。

背景技术

阿尔茨海默病是人类痴呆最常见的原因之一。它是一种与受影响个体的脑中的神经细胞变性相关的慢性致命疾病，其特征在于存在由淀粉样β-肽(Aβ-肽)的细胞外沉积物组成的淀粉样斑。

Aβ前体蛋白(AβPP)的蛋白水解加工产生不同长度的Aβ肽，其中Aβ42最容易聚集并有毒。Aβ42聚集的动力学遵循最近定义的成核依赖性微观事件(microscopic event)。在初级成核期间，Aβ42单体缔合并形成一个核，原纤维可以从该核开始伸长。在二次成核期间，单体附着在原纤维表面，这催化新核的形成，导致原纤维指数生长。此单体依赖性二次成核自催化途径是有毒Aβ42物质的主要来源。寻找AD治疗的主要挑战是特异性降低Aβ42神经毒性，而不是专注于整体聚集和斑块形成。

一种防止聚集的策略是利用功能上定义为伴侣分子的分子。伴侣分子通过帮助复杂细胞内环境中的蛋白质的正确折叠发挥重要作用。许多分子伴侣(比如热休克蛋白(Hsp))已知在折叠过程中很重要，并已被广泛研究。这些伴侣分子中的一些显然能与某些多肽的淀粉样原纤维形成相互作用并对其产生影响。

已在几种人前体蛋白中发现BRICHOS结构域，最初是在Bri2、软骨调节素-1和前表面活性剂蛋白C(proSP-C)中。Sanchez-Pulido等人，Trends Biochem Sci[生物化学科学趋势]27(7)：329-332，2002提供了BRICHOS结构域的综述。已提出BRICHOS结构域在生物合成期间防止相应蛋白质原的易聚集区域(客户)的淀粉样物质形成。来自proSP-C和Bri2的重组人(rh)BRICHOS结构域也是非客户蛋白(比如medin、胰岛淀粉多肽、Aβ40和Aβ42)的淀粉样物质形成的有效抑制剂。

WO 2011/162655披露了Bri2的BRICHOS结构域减少Aβ肽和ABri/ADan肽的淀粉样原纤维形成和聚集。

Bri2在中枢神经系统(CNS)中产生，在人海马和皮质的神经元中表达，并与AD患者的老年斑共定位。Bri2的已知序列包括源自苇栖多鳍鱼(Erpetoichtys calabaricus)(NCBI登录号XP_028655526)和小体鲟(Acipenser ruthenus)(UniProt/TrEMBL登录号A0A444U9X2)的序列。在生理条件下，BRICHOS结构域通过蛋白分解从Bri2前体蛋白中释放出来。重组人(rh)Bri2 BRICHOS有效抑制体外Aβ42原纤维的形成并减轻对海马脑片制备和果蝇模型的相关神经毒性。Rh proSP-C BRICHOS特异性地阻碍Aβ42原纤维形成中的二次成核步骤。Rh Bri2 BRICHOS调节延伸和二次成核事件两者，但Bri2 BRICHOS的不同组装状态以不同方式影响Aβ原纤维形成。Bri2 BRICHOS单体在防止Aβ42诱导的神经元网络活动的破坏方面最有效，而二聚体最有效地抑制Aβ42整体原纤维形成，并且寡聚体抑制非原纤维蛋白的聚集(Chen等人，Nat.Commun.[自然通讯]，8：2081(2017))。Bri2 BRICHOS单体不是长期稳定的并且在磷酸盐缓冲液或体外小鼠血清中以浓度依赖的方式形成高分子量的寡聚体，这伴随着Aβ42原纤维形成的效力降低。Bri2 BRICHOS单体向高分子量寡聚体的转化可能与AD有关，因为发现与健康对照相比，AD脑中不同Bri2形式的量增加。这些观察结果意味着，调节Bri2 BRICHOS组装状态的分布，以增加单体量是对抗Aβ42神经毒性的概念，参见例如WO 2012/138284。

尽管本领域取得了这些进展，但仍然迫切需要改进和替代疗法来治疗与哺乳动物(比如人类)中淀粉样蛋白原纤维的形成有关的病症。

发明内容

一个目的是降低易于原纤化的蛋白质聚集成淀粉样原纤维的趋势，或者甚至防止易于原纤维化的蛋白质聚集成淀粉样原纤维。

还有一个目的是减少淀粉样斑的形成，这些斑由易于原纤化的蛋白质在哺乳动物的脑中的细胞外沉积物组成。

还有一个目的是为治疗阿尔茨海默病提供一种新的治疗选择。

又另一个目的是提供用于治疗阿尔茨海默病的化合物、化合物的组合和包含此类化合物的药物组合物。

一个目的是为了对抗Aβ42神经毒性，调节Bri2 BRICHOS组装状态的分布，以增加单体量。

本发明通常基于以下见解：与来自人的Bri2的BRICHOS结构域具有高同一性的伴侣分子蛋白单体可用于阿尔茨海默病的医学治疗。在此，我们设计了稳定单体状态的Bri2BRICHOS的单点突变体。此突变单体在防止Aβ42神经毒性中有效，特异性抑制原纤维形成期间的二次成核，并且重要的是，显著增强针对Aβ42神经毒性的野生型(wt)蛋白。

对于从以下描述中显而易见的这些和其他目的，本发明根据不同方面提供了一种新的分离的蛋白质；包含该蛋白质的药物组合物；该蛋白质作为药物在治疗阿尔茨海默病中使用的用途；以及治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括施用该蛋白质。

附图说明

图1显示一些哺乳动物Bri2-Brichos氨基酸序列(SEQ ID NO：7-12)的比对。

图2通过(A)γ振荡数据、(B)非变性PAGE和蛋白质印迹以及(C)ThT动力学分析显示Bri2 BRICHOS R221E单体增强针对Aβ42神经毒性的wt Bri2BRICHOS寡聚体。

图3展示了Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体对Aβ42原纤维形成的微观事件的影响。

图4展示了Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体对Aβ42寡聚体形成和神经毒性的影响。

图5展示了不同Bri2 BRICHOS R221E物质对小鼠海马脑片中Aβ42毒性的影响。

图6提供了通过改变Bri2 BRICHOS组装状态来增强针对Aβ42神经毒性的伴侣分子活性的模型。

图7展示了Bri2 BRICHOS R221E形成通过血脑屏障(BBB)的稳定单体。

图8展示了Bri2 BRICHOS R221E在患有阿尔茨海默氏样病理的小鼠中的行为作用。

图9显示Bri2 BRICHOS R221E在患有阿尔茨海默氏样病理的小鼠中的生化作用。

图10展示了施用rh Bri2 BRICHOS R221E的App^NL-G-F小鼠的学习和记忆功能。

图11显示在App^NL-F小鼠中用rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的Aβ斑块计数和斑块负荷。

图12展示了脑组织中胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)水平和与Aβ的共定位。

图13显示脑组织中的Iba1水平。

附加序列表

SEQ ID NO：1人Bri2

SEQ ID NO：2NT*-Bri2 BRICHOS突变体

SEQ ID NO：3Bri2 BRICHOS[Bri2(113-231)]

SEQ ID NO：4Bri2 BRICHOS[Bri2(113-231)]突变体

SEQ ID NO：5人Bri2(1-89)

SEQ ID NO：6人Bri23[Bri2(244-266)]

SEQ ID NO：7人Bri2_Brichos[Bri2(137-231)]

SEQ ID NO：8黑猩猩Bri2_Brichos

SEQ ID NO：9牛Bri2_Brichos

SEQ ID NO：10猪Bri2_Brichos

SEQ ID NO：11小鼠Bri2_Brichos

SEQ ID NO：12大鼠Bri2_Brichos

SEQ ID NO：13人Bri2_Brichos[Bri2(137-231)]突变体

SEQ ID NO：14正向PCR引物

SEQ ID NO：15反向PCR引物

SEQ ID NO：16NT*-Bri2 BRICHOS突变体[DNA]

具体实施方式

Bri2(SEQ ID NO：1)(也称为整合膜蛋白2B(ITM2B))含有跨残基137-231的进化保守Brichos结构域(图1，SEQ ID NO：7-12)。Bri2的Brichos结构域可以可替代地被视为跨残基113-231(SEQ ID NO：3)。

本发明通常基于以下见解：与来自人的Bri2的BRICHOS结构域具有高同一性的伴侣分子蛋白单体可用于阿尔茨海默病的医学治疗。在此，我们设计了稳定单体状态的Bri2BRICHOS的单点突变体。它在小鼠血清和可渗透的血脑屏障(BBB)中的长期温育期间是稳定的。此突变单体在防止Aβ42神经毒性中有效，特异性抑制原纤维形成期间的二次成核，并且重要的是，显著增强针对Aβ42神经毒性的野生型(wt)蛋白。Bri2 BRICHOS的单点突变体的全身施用显示AD小鼠的记忆响应和行为得到改善。还显示星形胶质细胞介导的神经炎症的减少。

本文还证明，用反复静脉内注射rh Bri2 BRICHOS R221E治疗已建立阿尔茨海默氏样病理的老年Aβ前体蛋白(APP)敲入小鼠改善了旷场活动并减少星形胶质细胞增生、小胶质细胞增生并将Aβ斑块负荷减少至与体外预测的Aβ42寡聚体生成和神经毒性的减少在数量上一致的程度。这些结果表明，针对Aβ42介导的体外毒性的伴侣分子作用可以转化为具有晚期病理的阿尔茨海默病小鼠模型中的临床相关治疗。

根据第一方面，提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质选自由包含90-200个氨基酸残基的部分的蛋白质组成的组，该部分与具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：3的来自人的Bri2的Brichos结构域中的一种具有至少70％同一性，其中对应于SEQ ID NO：1中的位置221(Arg)的氨基酸残基不是Arg、Lys或His。为避免疑问，SEQ ID NO：1的位置221的Arg残基对应于SEQ ID NO：3的位置109的Arg残基，并且对应于SEQ ID NO：7的位置85的Arg残基。

如整个说明书和所附权利要求中使用的术语″同一性％″计算如下。使用CLUSTALW算法将查询序列与靶序列比对(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.，NucleicAcids Research[核酸研究]，22：4673-4680(1994))。在对应于最短比对序列的窗口进行比较。比较每个位置的氨基酸残基，并将查询序列中与靶序列具有相同对应关系的位置百分比报告为同一性％。

如整个说明书和所附权利要求中使用的术语″相似度％(％similarity)″是如针对″同一性％″所计算的，除了疏水性残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys相似；碱性残基Lys、Arg和His相似；酸性残基Glu和Asp相似；并且亲水性、不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr相似。在该背景下其余的天然氨基酸Gly与任何其他氨基酸均不相似。

在整个说明书中，可选实施方式代替了指定的同一性百分比而实现了相应的相似度百分比。其他可选实施方式实现了指定的同一性百分比以及另一更高的相似度百分比，其选自每个序列的优选同一性百分比。例如，分离的蛋白序列可能与另一个蛋白序列的相似度为70％；或其可能与另一个序列的同一性为70％；或其可能与另一个序列的同一性为70％并且此外，相似度为90％。

为避免疑问，与来自人的Bri2的Brichos结构域具有至少给定的同一性的氨基酸序列由大于或等于70个，比如大于或等于80个，比如大于或等于90个氨基酸残基组成。优选的大小范围是70-140个氨基酸残基，比如80-140个氨基酸残基，例如90-140个氨基酸残基。

应注意，来自人(SEQ ID NO：7)、黑猩猩(SEQ ID NO：8)、牛(SEQ ID NO：9)、猪(SEQID NO：10)、小鼠(SEQ ID NO：11)和大鼠(SEQ ID NO：12)的Bri2的Brichos结构域高度保守，参见图1中的比对。不期望受任何特定理论束缚，预期Brichos结构域相对于Aβ肽具有所期望的活性。优选的是，分离的蛋白质选自由包含氨基酸序列的蛋白质组成的组，该氨基酸序列与来自人的Bri2的Brichos结构域(包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3)中的任一种具有至少80％、优选地至少90％、比如至少95％同一性。在优选的实施方式中，分离的蛋白质含有在来自人(SEQ ID NO：7)、黑猩猩(SEQ ID NO：8)、牛(SEQ ID NO：9)、猪(SEQ ID NO：10)、小鼠(SEQ ID NO：11)和大鼠(SEQ ID NO：12)的Bri2的Brichos结构域中保守的所有氨基酸残基，即SEQ ID NO：7的所有氨基酸残基，除了残基42、76和82(对应于全长Bri2，即SEQ IDNO：1的残基178、212和218)。在特定的实施方式中，分离的蛋白质选自由包含来自人的Bri2的Brichos结构域(包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3)中的任一种的蛋白质组成的组，即它含有这些Brichos结构域中的一种，但其中对应于SEQ ID NO：1中位置221(Arg)的氨基酸残基不是Arg、Lys或His。

在一种变体中，分离的蛋白质选自由以下蛋白质组成的组，这些蛋白质与来自人的Bri2(SEQ ID NO：1)具有至少70％，比如至少80％，优选地至少90％，比如至少95％，或甚至100％同一性，但其中对应于SEQ ID NO：1中的位置221(Arg)的氨基酸残基不是Arg、Lys或His。在特定的实施方式中，分离的蛋白质是SEQ ID NO：1，但其中对应于SEQ ID NO：1中位置221(Arg)的氨基酸残基不是Arg、Lys或His。

在特定的实施方式中，分离的蛋白质选自由来自人的Bri2的Brichos结构域(包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3)中的任一种组成的组，即它含有这些Brichos结构域中的一种，但其中对应于SEQ ID NO：1中位置221(Arg)的氨基酸残基不是Arg、Lys或His。

在本文披露的分离的蛋白质中，对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基优选地选自由Glu、Asp、Gln和Asn组成的组，更优选地选自由Glu和Asp组成的组。

在本文披露的分离的蛋白质中，对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基优选地是Glu。可替代地，对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基还可以是Asp。

在本文披露的某些分离的蛋白质中，该部分具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或SEQID NO：13的氨基酸序列。特定的分离的蛋白质的实例包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的蛋白质。

本文披露的一组优选的分离的蛋白质是其单体部分。提供单体部分的一种优选的方法是通过尺寸排阻色谱法分离。在本文披露的分离的蛋白质的样品中，优选的是至少25％、比如至少50％、或至少75％的分离的蛋白质以单体存在。在本文披露的分离的蛋白质的样品中，进一步优选的是基本上所有分离的蛋白质都以单体存在。

分离的蛋白质优选地不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO：5)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，分离的蛋白质不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO：5)具有至少50％同一性的氨基酸序列。这意味着分离的蛋白质含有展现出与Bri2的Brichos结构域的高度相似性或同一性的核心氨基酸序列，以及任选地一个或多个其他氨基酸序列，这些其他氨基酸序列可能不展现出与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO：5)的高度相似性或同一性。

为避免疑问，短于10个氨基酸残基的氨基酸序列在从分离的蛋白质中排除的情况下不被认为是相关的。因此，分离的蛋白质不包含由多于或等于10个与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO：5)具有至少给定的同一性的氨基酸残基组成的氨基酸序列。

此外，分离的蛋白质优选地不包含与来自人的Bri2(即人Bri23)的残基244-266(SEQ ID NO：6)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，分离的蛋白质不包含与人Bri23的残基(SEQ ID NO：6)具有至少50％同一性的氨基酸序列。如上文所述，这意味着分离的蛋白质含有展现出与Bri2的Brichos结构域的高度相似性或同一性的核心氨基酸序列，以及任选地一个或多个其他氨基酸序列，这些其他氨基酸序列可能不展现出与人Bri23(SEQ ID NO：6)的高度相似性或同一性。

为避免疑问，短于10个氨基酸残基的氨基酸序列在从分离的蛋白质中排除的情况下不被认为是相关的。因此，分离的蛋白质不包含由多于或等于10个与人Bri23(SEQ IDNO：6)具有至少给定的同一性的氨基酸残基组成的氨基酸序列。

包含与如上文所述的Bri2 BRICHOS序列具有高同一性的核心氨基酸序列的蛋白质可以进一步包含不干扰核心氨基酸序列的功能，即与Aβ肽的相互作用的另外的氨基酸序列。另外的氨基酸序列可以连接到核心氨基酸序列的N末端、核心氨基酸序列的C末端、或两者。它也可以经由氨基酸侧链，例如经由二硫键连接。另外的氨基酸序列可以是基本上无功能的，或者可以为所得蛋白质提供另外的功能，例如溶解度、稳定性或所期望的亲和力。核心氨基酸序列和任何另外的氨基酸序列两者都可以被化学修饰，包括翻译后化学修饰。

在某些实施方式中，分离的蛋白质由小于或等于500个、比如小于或等于300个、比如小于或等于250个、比如小于或等于200个、比如小于或等于150个或甚至100个氨基酸残基组成。在某些实施方式中，分离的蛋白质由多于或等于90个、比如多于或等于100个氨基酸残基组成。优选的大小范围是90-300个氨基酸残基，比如90-200个或90-140个氨基酸残基。

单体Bri2 BRICHOS物质最有效地防止Aβ42诱导的神经毒性，并且因此它们组装成寡聚体导致抗Aβ42神经毒性降低。在此研究中，我们设计了形成稳定的单体并使rh wtBri2 BRICHOS寡聚体释放单体的R221E Bri2 BRICHOS突变体。Rh Bri2 BRICHOS R221E单体通过选择性阻断二次成核来有效缓解Aβ42诱导的神经毒性，先前已表明该二次成核在Aβ42聚集期间构成有毒物质的主要来源。而且，rh Bri2 BRICHOS R221E单体分解wt寡聚体的能力导致延迟Aβ42原纤维化的能力提高，并且重要的是，降低了Aβ42对海马脑片制备的毒性(图2)。

抵消蛋白质毒性的手段包括伴侣分子介导的淀粉样物质形成的预防、预先存在的聚集体的解聚和聚集体隔离。我们在示意性模型中合理化了我们的结果，以使小Bri2BRICHOS R221E物质在Aβ42原纤维化和有毒物质的潜在隔离期间对特定成核事件的抑制效率可视化(图6A)。

(A)Aβ42经由初级成核、延伸和二次成核形成原纤维，速率常数分别为k_n、k₊和k₂。而Bri2 BRICHOS R221E二聚体(实线箭头)减弱k₊和k₂两者，单体(虚线箭头)主要降低k₂。二次成核催化新成核单元的形成，用作原纤维形成的正反馈环路(弯曲箭头)，并且此机制可能与神经毒性Aβ42物质的生成增加有关。此外，Bri2 BRICHOS单体的分子大小非常适合β结构Aβ42分子的单层，这可能是神经毒性Aβ42物质的结构元件。相反，二聚体的大小与原纤维末端(PDB登录代码5KK3)的横截面面积很好地匹配，可能促进原纤维末端延伸速率的降低。因此，结构特性以及k₂的特异性降低可以使Bri2 BRICHOS单体在预防Aβ42相关的神经毒性中最有效。

(B)Rh Bri2 BRICHOS R221E主要形成单体和少量寡聚体(虚线圆圈中的假设模型)，而rh wt Bri2 BRICHOS主要组装成与单体平衡的高分子量寡聚体(电子显微镜数据库登录代码EMD-3918)。rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体与rh Bri2BRICHOS R221E单体的温育使寡聚体不稳定并使动力学平衡向单体状态移动，导致预防Aβ42神经毒性的效力的总体增加(图2)。因此，此模型为理解单点突变R221E如何调节Bri2 BRICHOS的组装状态，并且由此调节其对Aβ42原纤维形成的影响并增强针对Aβ42相关神经毒性的活性提供了基础。

已提出由二次成核促进的新成核单元的产生与小的神经毒性Aβ42物质的形成有关，并且因此对二次成核事件的特异性预防可能对Aβ42诱导的神经毒性有益。然而，近期研究表明，导致整体聚集速率增加(主要由提高的二次成核速率引起)的药剂也可能有益于抑制Aβ42毒性，条件是发生另外的相互作用。虽然Aβ42引起毒性的详细机制仍在研究中，但有效的毒性调节剂可能特别适合与神经毒性低聚Aβ42物质特异性相互作用，以屏蔽可用于异常相互作用的表面。然后，这些相互作用可能阻碍一种或多种潜在的神经毒性机制，比如与受体的直接结合或膜破坏。有趣的是，已表明，细胞内和细胞外的伴侣分子两者(包括凝聚素、Hsp70和αB-晶状体蛋白)都可以与几种不同的致淀粉样肽(包括Aβ)的寡聚体结合，并且从而诱导它们组装成屏蔽反应性表面的更大的物质。这种机制是否也适用于BRICHOS结构域仍有待研究，但电子显微镜数据表明rh Bri2BRICHOS单体与寡聚Aβ42物质相互作用。

目前的研究中，我们发现Bri2 BRICHOS R221E单体主要降低二次成核速率，而二聚体显著影响延伸速率和二次成核速率(图3和6A)。这导致在Bri2BRICHOS R221E单体而非二聚体存在下产生的成核单元数量减少(图4A)。Bri2BRICHOS R221E二聚体的分子大小与最近发表的Aβ42原纤维结构的横截面面积的表面很好地匹配，这提供了一个可能的解释，即为什么Bri2 BRICHOS二聚体除了降低了二次成核速率k₂外，还有效地降低了延伸速率k₊。与单体相比，Bri2 BRICHOS二聚体的不同特异性还支持二次成核和延伸事件发生在Aβ42聚集体的不同位点。虽然关于可溶性神经毒性Aβ42物质的结构细节仍然缺失，但已经报道了有毒Aβ42物质/寡聚体的β结构状态。我们观察到Bri2 BRICHOS单体的分子大小非常适合β结构的Aβ42分子的单层，这可能形成神经毒性Aβ42物质(图6A)。因此，有效减少新成核单元产生的能力以及用于与推定的神经毒性Aβ42物质相互作用的很好地匹配的分子大小可能使Bri2 BRICHOS单体在预防使海马γ振荡的Aβ42诱导的神经毒性中最有效(图4B)。

对于AD，衰老是主要风险因素，但缺少详细的潜在机制。衰老期间伴侣分子网络衰退被认为会影响许多与衰老相关的疾病。在衰老的生物体中，错误折叠的蛋白质和功能性伴侣分子之间的平衡被打乱。与健康对照相比，在AD脑中观察到不同Bri2形式的量增加。通过增加局部浓度可以提高伴侣分子活性，但由于伴侣分子是精确平衡的，某些伴侣分子的过量产生可能导致疾病。因此，增加某些伴侣分子网络能力的概念具有预防和治疗与蛋白质组衰退相关的病理的潜力。在我们目前的研究中，显示了针对Aβ42诱导的神经毒性的rhBri2 BRICHOS活性的增强是由较大的寡聚体形成单体物质的结果(图2)。因此，结果提出了一个合理的概念来增强针对Aβ42诱导的神经毒性的内源性Bri2 BRICHOS活性。

根据另一方面，提供了包含编码本文披露的分离的蛋白质的序列的核酸。示例性核酸是编码NT*-Bri2 BRICHOS突变体的SEQ ID NO：16和编码具有SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：13的Bri2 BRICHOS突变体的SEQ ID NO：16的部分序列。

根据进一步的方面，提供了包含治疗有效量的本文披露的分离的蛋白质或本文披露的核酸的药物组合物。药物组合物还含有适合其的药物载体。

药物组合物可用作药物。药物组合物可用于治疗哺乳动物(包括人类)的阿尔茨海默病。

根据相关的方面，提供了分离的蛋白质用于制造用于治疗哺乳动物(包括人类)的阿尔茨海默病的药物的用途。

可用于药物组合物的一组优选的分离的蛋白质是其单体部分。提供单体部分的一种优选的方法是通过尺寸排阻色谱法分离。在药物组合物中，优选的是至少25％、比如至少50％、或至少75％的分离的蛋白质以单体存在。在药物组合物中，进一步优选的是基本上所有分离的蛋白质都以单体存在。

可以将分离的蛋白质掺入药物组合物中。此类组合物典型地包括分离的蛋白质和合适的药学上可接受的载体。如本文所用，″合适的药物载体″包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。

将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如静脉内、皮内、皮下、鞘内和脑室内(例如，使用具有串联过滤器的Omaya储器-分流器(reservoir-shunt)，将其通过手术置于脑池空间(cisternal space)))施用。

用于组合物的潜在有用的肠胃外递送系统包括缓慢溶解的聚合物颗粒、可植入的输注系统和脂质体。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，比如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲液比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的药剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

阿尔茨海默病的治疗还可以通过将分离的蛋白质直接递送至中枢神经系统，优先地脑来实现。

适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内的施用，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM或磷酸酯缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下应该稳定并且必须抗比如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物。例如，可以通过使用分离的蛋白质的颗粒上的涂层(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选的在组合物中包括等渗剂。此类药剂的实例包括糖、多元醇(比如甘露醇和山梨糖醇)、以及氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的长时间吸收。

可以通过以下各项来制备无菌可注射溶液：将分离的蛋白质以所需的量，根据需要，与一种以上列举的成分或这些成分的组合掺入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。总体上，通过将分离的蛋白质掺入无菌媒介物来制备分散液，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上列举的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生分离的蛋白质的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所期望的成分。

在一个实施方式中，将分离的蛋白质与保护该化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，比如控释配制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备此类配制剂的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。脂质体悬浮液(包括用单克隆抗体靶向特定受阿尔茨海默病影响的细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。

可以有利地以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以易于施用和实现剂量均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为要治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所要求的药物载体联合产生所期望的治疗效果的预定量的分离的蛋白质。

分离的蛋白质的毒性与治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如以确定LD₅₀(50％群体的致死剂量)以及ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)。可以使用合适的动物模型，比如以下中针对淀粉样变性所描述的那些：Sturchler-Pierrat等人，Rev Neurosci[神经科学综述]，10：15-24，1999；Seabrook等人，Neuropharmacol[神经药理学]38：1-17，1999；DeArmond等人，Brain Pathology[脑病理学]5：77-89，1995；Telling，Neuropathol Appl Neurobiol[神经病理学和应用神经生物学]26：209-220，2000；以及Price等人，Science[科学]282：1079-1083，1998。

在毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，它可以表示为比率LD₅₀/ED₅₀。表现出高的治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应小心设计将此类化合物靶向至受累组织的位点的递送系统，从而将对未受影响的细胞的潜在损伤最小化，并且由此减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人中使用的剂量。优选化合物的剂量处于包括ED₅₀在内的有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。

剂量可根据所应用的剂型和所使用的施用途径在所述范围内变化。对于该方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养测定中估计，其中，例如观察原纤维形成的速率或细胞死亡的速率。可以在动物模型中配制剂量，以达到在细胞培养中确定的循环血浆浓度范围，该范围包括IC₅₀(即，供试化合物达到半数最大症状抑制的浓度)。此类信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。

如本文定义的，分离的蛋白质的治疗有效量(即有效剂量)的范围为约0.1至100mg/kg体重、更优选地约1至100mg/kg体重、以及甚至更优选地约1至50mg/kg体重。化合物可以在延长的时间段内施用于受试者，例如，受试者的终生。1mg/kg至100mg/kg的剂量通常是合适的，比如指定作用于脑的抗体的情况。

在一些情况下，化合物可以在有限的时间段内施用。也可以长期施用化合物。技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，包括但不限于疾病或障碍的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。而且，用治疗有效量的化合物治疗受试者可以包括单一治疗，或者优选地，可以包括一系列治疗。

可以以几种方式制备用于向表达人APP的小鼠或人施用的重组分离蛋白。可以如本文所述的纯化重组蛋白。

当将分离的蛋白质施用于动物(例如人)以治疗阿尔茨海默病时，医师、兽医或研究人员可以，例如首先开出相对低的剂量的处方，随后增加剂量直到获得适当的响应。另外，应理解，针对任何特定动物受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食，施用时间、施用途径和排泄速率、任何药物组合以及要调节的表达或活性程度。

药物组合物可以与施用的说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。例如，说明书可以包括使用组合物治疗患有阿尔茨海默病或处于阿尔茨海默病风险的个体的说明。

根据另一方面，提供了一种在有需要的哺乳动物(包括人类)中治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的分离的蛋白质或药物组合物。

可用于治疗方法的一组优选的分离的蛋白质是其单体部分。提供单体部分的一种优选的方法是通过尺寸排阻色谱法分离。在治疗方法中，优选的是至少25％、比如至少50％、或至少75％的分离的蛋白质以单体施用。进一步优选的是基本上所有分离的蛋白质都以单体施用。

在特定的实施方式中，治疗可以是预防性治疗。在其他特定的实施方式中，治疗可以是姑息治疗。在某些特定的实施方式中，治疗可以是治愈性治疗。

本披露提供了治疗处于阿尔茨海默病风险(或易患阿尔茨海默病)的受试者的预防性和治疗性方法两者。如本文所用，术语″治疗″被定义为将分离的蛋白质应用或施用于患者，或将分离的蛋白质应用或施用于来自患有阿尔茨海默病、具有疾病症状或易患疾病的体质的患者的分离组织或细胞系，目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善或影响疾病、疾病症状或易患疾病的体质。

在一个方面，提供了一种用于通过向受试者施用减少多肽聚集的分离的蛋白质来预防与由Aβ肽引起的原纤维形成相关的疾病或病症(即降低感染的风险，或降低与疾病或病症相关的症状出现的速率)的方法。可以通过例如本领域已知的适当的诊断或预后测定中任一种或组合来鉴定处于阿尔茨海默病风险的受试者。可以在疾病特征性症状表现之前施用预防剂，从而防止或可替代地延缓疾病的进展。

可以将分离的蛋白质以治疗有效剂量施用于患者以预防、治疗或改进涉及与阿尔茨海默病相关的原纤维形成的障碍。治疗有效剂量是指足以导致障碍症状减轻的化合物的量。此类化合物的毒性和治疗功效可以通过如上所述的标准制药程序确定。

还预期可以通过基因疗法，比如通过使用表达载体、质粒或病毒转染神经系统(优选地脑)中的细胞来施用蛋白质，使得分离的蛋白质由中枢神经系统中的这些细胞表达。这可用于治疗阿尔茨海默病。

现在将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例

材料与方法

Bri2 BRICHOS R221E和AU1标记的Bri2 BRICHOS wt的制备

为了产生rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)，合成了引物5’-CACCTGGGTTTCTTTATTTATGAACTGTGTCATGACAAGGAAAC-3’(SEQ ID NO：14)和5’-

GTTTCCTTGTCATGACACAGTTCATAAATAAAGAAACCCAGGTG-3’(SEQ ID NO：15)。以wtNT*-Bri2 BRICHOS(对应于溶解度标签NT*，随后是Bri2残基113-231)质粒作为PCR模板，用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(安捷伦公司(Agilent)，美国)获得Bri2 BRICHOSR221E，并确认序列(GATC Bioteq公司，德国)。

将具有SEQ ID NO：16并编码His₆-NT^*-凝血酶切割位点-Bri2 BRICHOS R221E(SEQID NO：2)的构建体转染到SHuffle T7感受态大肠杆菌细胞中。将细胞在30℃下在含有15μgmL-1卡那霉素的LB培养基中温育，直到OD600nm为约0.9，此时将温度降至20℃。添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至0.5mM，并将细胞温育过夜。然后在4℃下通过7,000×g离心收获细胞，随后将细胞沉淀重新悬浮在20mM Tris pH 8.0中，并在冰上超声处理5min(2秒开启，2秒关闭，65％功率)。将裂解物在4℃下离心(24,000×g)30min，并用Ni-NTA柱纯化目标蛋白。为了去除His₆-NT*部分，将融合蛋白在4℃下用凝血酶(酶与底物为1∶1000，w/w)切割过夜，并加载到第二个Ni-NTA柱上。所得Bri2 BRICHOS R221E蛋白具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。使用

系统(通用健康医疗集团(GE Healthcare)，英国)通过Superdex 200PG、200GL或75PG柱(通用健康医疗集团，英国)分离并分析不同的rhBri2BRICHOS R221E物质(单体、二聚体、寡聚体)。

对于特异性免疫检测，通过PCR扩增将AU1标签(DTYRYI)或mCherry结构域融合到rh wt Bri2 BRICHOS的C末端。用与Bri2 BRICHOS R221E相同的方案表达并纯化编码His6-NT*-凝血酶切割位点-Bri2 BRICHOS wt-AU1或His6-NT^*-凝血酶切割位点-Bri2 BRICHOSwt-mCherry的构建体。通过Superdex200PG柱(通用健康医疗集团，英国)分离rh wt Bri2BRICHOS-AU1或rh wtBri2 BRICHOS-mCherry寡聚体。

Bri2 BRICHOS R221E单体的ESI-MS

在ESI-MS分析前，使用BioSpin微量离心柱(伯乐公司(BioRad)，美国)将通过SEC分离的rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)单体缓冲液交换至pH 7.5的200mM乙酸铵中。单体亚基的最终浓度为20μM。在Waters Synapt G1质谱仪(沃特世公司(Waters)，米尔福德，马塞诸塞州)上记录光谱，该质谱仪经过改进以用于高质量分析。使用内部生产的金涂覆硼硅酸盐毛细管将样品引入质谱仪。仪器设置为：毛细管电压1.5V，采样锥电压30V，萃取锥电压4V，碰撞阱电压50V，和传输电压10V。源压力为7mbar，阱气为N₂，流速为8mL h^-1。使用Waters MassLynx 4.1软件进行数据分析。

在25℃下在1mm路径长度的石英比色皿中在Aviv 410光谱仪(莱克伍德，新泽西州，美国)中记录260至190nm的CD光谱法、双-ANS荧光和CS热聚集CD光谱，其中蛋白质浓度为12μM。波长步长为0.5nm，平均时间为0.3s，时间常数为100ms，带宽为1nm。显示的光谱是三个连续扫描的平均值。将20mM Tris pH 8.0中的1μM(按单体亚基计算)的不同rh Bri2BRICHOS R221E物质与2μM双-ANS(4，4′-双(苯基氨基)-[1，1′-联萘]-5，5′-二磺酸二钾盐)在25℃下温育10分钟，并用SLM-Aminco AB-2分光荧光计和恒温比色皿支架(ThermoSpectronic公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)记录荧光。在395nm激发后记录420至600nm的荧光发射光谱。有和没有不同浓度的各种rh Bri2BRICHOS R221E物质的情况下，将来自猪心脏的CS(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，德国)在40mM HEPES/KOH pH 7.5中稀释至600nM，然后在45℃下平衡。使用酶标仪(来自BMG实验室技术公司(BMG Labtech)，奥芬堡，德国的FLUOStar Galaxy)通过读取在45℃下在静止条件下温育期间在360nm处的吸光度的明显增加，一式三份测量聚集动力学。

Bri2 BRICHOS R221E温育

在37℃下，将浓度为20μM的Rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)寡聚体、二聚体和单体(称为单体亚基)在ThT测定缓冲液(20mM磷酸钠，pH 8.0，与0.2mM EDTA和0.02％NaN₃)中温育。将样品在0、1、4和24h后取出，并在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析组装状态。将10μM rh Bri2BRICHOS R221E寡聚体和单体在37℃下在ThT测定缓冲液中温育过夜，并通过非变性PAGE分析。还将20μM rh Bri2 BRICHOS R221E二聚体在20mM磷酸钠，pH8.0，与0.2mM EDTA和0.02％NaN₃中在37℃下温育过夜，并通过非变性PAGE分析。

Aβ42单体制备和ThT测定

重组Met-Aβ(1-42)(这里称为Aβ42)在BL21*(DE3)pLysS大肠杆菌(B菌株)细胞中产生并通过离子交换纯化。将纯化的Aβ42蛋白冻干过夜并重新溶解在7M Gdn-HCl中，并且然后注射到Superdex 75柱(通用健康医疗集团，英国)中，以在20mM磷酸钠，pH 8.0，与0.2mM EDTA和0.02％NaN3中进行单体分离。使用(A280-A300)的1,424M-1cm-1的消光系数由280和300nm处的吸光度计算Aβ42浓度。将纯化的Aβ42单体等分于低结合Eppendorf管(Axygene公司)中。为了分析淀粉样原纤维形成的动力学，将含有3μM Aβ42单体、10μM ThT和不同浓度的rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)单体或二聚体(所有浓度均指单体亚基)(其相对于Aβ42的摩尔比为0、10％、30％、50％、70％和100％)的80μL溶液添加到具有透明底部和非结合表面的半区域96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Corning Glass 3881，美国)的每个孔中，并在37℃下在静止条件下温育。使用440nm激发滤光片和480发射滤光片(来自BMG实验室技术公司，奥芬堡，德国的FLUOStar Galaxy)记录荧光。以相同方式测量在恒定浓度(0.9μM)的rh Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体存在下不同浓度的Aβ42的聚集动力学。对于Aβ42种子的制备，将3μM Aβ42单体在37℃下温育约20h，并且然后将产生的原纤维在水浴中超声处理3min。为了分析种子存在时Aβ42原纤维形成动力学，将含有3μM Aβ42、10μMThT、不同浓度的rh Bri2 BRICHOS R221E单体或二聚体(其相对于Aβ42单体为0％、10％、30％、50％、70％和100％)、和0.6μM种子(由原始A□42单体浓度计算)的80μL溶液在4℃下一式三份添加至半区域96孔板的每个孔中，并立即在37℃下在静止条件下温育。如上所述记录荧光。由高接种实验(highly seeded experiment)计算rh Bri2 BRICHOS R221E单体或二聚体存在下的延伸速率常数k₊(参见下文)。凹聚集轨迹的初始斜率通过前25-30min轨迹的线性拟合确定。对于所有实验，使用3-4次重复来对聚集轨迹进行归一化和平均，并且从同一板记录定义一个数据集的数据。

rh Bri2 BRICHOS R221E单体和wt寡聚体的共温育

将Rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)单体(5μM)、rh wt Bri2BRICHOS寡聚体(5μM)和混合物(rh Bri2 BRICHOS R221E单体和rh wt Bri2BRICHOS寡聚体，5μM∶5μM或9μM∶4.5μM)在37℃下温育过夜。然后，通过ThT测定测试针对Aβ42原纤维形成的活性(在相等的总rh Bri2 BRICHOS浓度下)，并通过海马脑片中的γ振荡测量来测试这些活性对Aβ42神经毒性的预防(参见下文)。还使用兔抗AU1抗体(1∶1000，艾博抗公司(Abcam)，英国)通过非变性PAGE和蛋白质印迹分析样品。

Aβ42聚集动力学分析

将不同浓度的rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)单体或二聚体存在下Aβ42的宏观聚集曲线拟合至经验S型方程：

F＝F₀+A/(1+exp[r_max(τ_1/2-t)]) 方程(1)

其中τ_1/2是半数聚集时间，r_max是最大生长速率，A是振幅，F₀是基值。通过应用方程(1)，在有和没有rh Bri2 BRICHOS R221E物质的情况下，评估了τ_1/2和r_max的聚集轨迹。

总原纤维质量浓度M(t)的聚集轨迹由以下积分速率定律描述：

其中附加系数是λ和κ的函数：

其是通过

和

的微观速率常数的两种组合。微观速率常数k_n、k₊和k₂分别是初级成核、延伸和二次成核速率常数，参数n_C和n₂分别是初级和次级成核的反应级数。

我们通过应用方程(2)来描述宏观聚集曲线并比较描述在存在和不存在伴侣分子的情况下原纤维形成的时间演变所需要的一组微观速率常数k₊k₂和k_nk₊来鉴定了被rhBri2 BRICHOS R221E抑制的微观事件。

首先，全局拟合恒定rh Bri2 BRICHOS R221E浓度下不同初始Aβ42单体浓度下的动力学轨迹，其中√(k_nk₊)和√(k₊k₂)在所有浓度下都被限制为相同的值。然后通过应用此动力学成核模型(图3)全局分析恒定Aβ42浓度下不同rh Bri2BRICHOS R221E浓度的动力学数据，其中√(k_nk₊)和√(k₊k₂)是所有浓度的自由拟合参数。我们还在恒定Aβ42浓度和不同rh Bri2 BRICHOS R221E浓度下对动力学数据集进行了全局拟合，其中拟合受到约束，使得一个拟合参数在所有rh Bri2BRICHOS R221E浓度下保持恒定值，而第二个参数是唯一的自由参数。此程序导致只有一个速率常数，即k_n、k₊或k₂，是唯一的拟合参数。

为了说明成核单元的产生，我们根据成核速率r_n(t)(通过r_n(t)＝k_nm(t)^nc+k₂M(t)m(t)ⁿ²)计算了单体新原纤维生成速率的时间演化。通过对反应中的成核速率r_n(t)积分来计算成核单元的数量。

Aβ42原纤维的免疫金染色和透射电子显微镜分析

将5μM Aβ42单体在37℃下与50％rh Bri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)单体或二聚体温育约15h，并且在4℃下通过以22,000×g离心1h来收集原纤维。将原纤维小心地重新悬浮在20μL 1×TBS中，其中将2μL涂在覆有聚乙烯醇缩甲醛(formvar)的镍网上，并温育约5min。用Kleenex纸巾的边缘除去过量溶液。通过在TBS中的1％BSA中温育30min来进行封闭，然后通过TBS洗涤网格3×10min。然后将网格与山羊抗Bri2 BRICHOS抗体(1∶200稀释)在4℃下温育过夜，并用TBS洗涤3×10min。最后，将网格与抗山羊IgG二抗(1∶40稀释)(与10nm金颗粒(BBI Solutions公司，英国，EM.RAG10)偶联)在室温下温育2h，并用1×TBS洗涤5×10min。用Kleenex纸巾的边缘从网格表面除去过量溶液。为了染色，向每个网格中添加2μL 2.5％的乙酸双氧铀(保持约20s)，并除去过量溶液。将网格干燥约20sec，并通过透射电子显微镜(TEM，Jeol JEM2100F，200kV)进行分析。

Bri2 BRICHOS R221E的电生理研究

实验根据斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会(Norra Stockholm’s

)(dnr N45/13)授予的道德许可进行。实验中使用了任一性别的C57BL/6小鼠(出生后第14-23天，由查尔斯河实验室(Charles River)，德国提供)。使用异氟烷深度麻醉动物，随后通过断头处死。

将脑解剖出来并放置在经改进的冰冷ACSF(人工脑脊液)中，以用于解剖。此溶液含有80mM NaCl、24mM NaHCO₃、25mM葡萄糖、1.25mM NaH₂PO₄、1mM抗坏血酸、3mM丙酮酸钠、2.5mM KCl、4mM MgCl₂、0.5mM CaCl₂和75mM蔗糖。用Leica VT1200S振动切片机(微系统公司(Microsystems)，斯德哥尔摩，瑞典)制备两个半球的腹侧海马体的水平切片(350μm厚)。切片后，立即将切片转移到含有标准ACSF：124mM NaCl、30mM NaHCO₃、10mM葡萄糖、1.25mMNaH₂PO₄、3.5mM KCl、1.5mM MgCl₂和1.5mM CaCl₂的浸没温育室中。解剖后，将室在34℃下保持至少20min。随后使其冷却至环境室温(约22℃)，持续至少40min。将蛋白质(Aβ42、rhBri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)物质及其组合)添加至温育溶液中，持续15分钟，然后将切片转移到界面式记录室(interface-style recording chamber)中，以进行细胞外记录。温育时，连续向切片供应鼓泡至ACSF中的卡波金(carbogen)气体(5％CO2，95％O₂)。

用硼硅酸盐玻璃微电极(电阻拉至3-5MΩ)在海马区CA3中进行记录。在32℃下在界面式室(灌注速率4.5mL/分钟)中使用置于锥体层中的填充有ACSF的微电极记录局部场电位(LFP)。通过将红藻氨酸(KA)(100nM，托克里斯公司(Tocris))应用到浴中来引发LFPγ-振荡。在进行任何记录之前，允许振荡稳定20min。在γ振荡稳定期间或之后的电生理记录期间，记录室中不存在Aβ42、rh Bri2 BRICHOS R221E物质或其组合。界面室记录溶液含有124mM NaCl、30mM NaHCO₃、10mM葡萄糖、1.25mM NaH₂PO₄、3.5mM KCl、1.5mM MgCl₂和1.5mM CaCl₂。

用4通道放大器/信号调节器M102放大器(电子实验室，数学与自然科学学院，科隆大学，科隆，德国)进行界面室LFP记录。在10kHz采样信号，使用Hum Bug 50Hz噪音消除器(仅LFP信号；Quest Scientific公司，北温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)进行调节，以1kHz进行软件低通滤波，使用Digidata1322A和Clampex 9.6 software(分子设备公司(Molecular Devices)，加利福尼亚州，美国)进行数字化和存储。

使用Axograph X(Kagi公司，伯克利，加利福尼亚州，美国)在8,192个点的平均傅立叶段中计算功率谱密度图(来自60s长LFP记录)。通过积分20与80Hz之间的功率谱密度来计算振荡功率。数据报告为平均值±平均值的标准误差。对于统计分析，采用了学生t检验(非配对)。显著性水平为*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。所有的实验都用来自同一动物/制剂的平行对照进行。

rh Bri2 BRICHOS R221E物质和Aβ40的NMR研究

将冻干的15N-Aβ40溶解在10mM NaOH中至浓度为2mg mL-1，并在冰水浴中超声处理2min。将溶液稀释至16mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，0.02％NaN₃，0.2mM EDTA和5％D₂O中75μM的最终Aβ浓度。在8℃下在配备有低温探头的500MHz Bruker光谱仪上，使用了2,048x128个复点和32次扫描记录¹H-¹⁵N HSQC谱。

BBB通过的分析

将三个月大的C57BL/6NTac(泰康利公司(Taconic)，丹麦)雄性小鼠保持在受控的湿度和温度，12小时的光照-黑暗循环下，分组饲养(每笼7只)(随意采食和饮水)。所有的动物实验都得到了斯德哥尔摩南部动物实验伦理委员会(dnr S 6-15)和林雪平伦理委员会(

etiska

)(ID855)的批准。通过使用带有30号针头的0.3mL注射器使小鼠接受单次静脉内注射rh Bri2BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4)单体，20mg/kg，或等体积的PBS至侧尾静脉。在注射前，将小鼠置于加热灯下的单个笼子中5分钟，以扩张尾静脉。在注射后1、2或6h，用异氟醚麻醉小鼠，并心内灌注40mL盐水(0.9％NaCl)。将脑迅速取出并在干冰中速冻并储存在-80℃下直到分析。

在注射rh Bri2 BRICHOS R221E单体后5、30、60、120和360min，从尾静脉采集血样。使用27号针头穿刺外侧尾静脉，并在每个时间点采集50-100μL血液。将血样凝固，在4℃下以3000rpm离心10min，收集血清并储存于-20℃下。在分析前，将样品在1×PBS中1∶5稀释。

将小鼠组织在50mM Tris/HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1.0％(v/v)Triton X-100、0.1％(w/v)SDS和10mM EDTA(补充有蛋白酶抑制剂)中均质化。将脑样本在4℃下以14000rpm离心30min，然后收集上清液并储存在-20℃下。通过Bradford法确定蛋白质浓度。在含有2％SDS、0.03M Tris、5％2-巯基乙醇、10％甘油、溴酚蓝的变性缓冲液中制备血清和脑样本，并将其在96℃下加热10min。将血清和脑匀浆的样品体积归一化，以使得每孔装载100μg总蛋白质。将样品在还原条件下在10％SDS-PAGE凝胶上分离并印迹到硝酸纤维素膜(通用健康医疗集团)上。印迹后，将膜在5％牛奶/PBS中封闭1h，随后与山羊抗Bri2BRICHOS抗体(1∶300)在5％牛奶，0.1％吐温/PBS中在4℃下温育过夜。将膜用0.1％吐温/PBS洗涤3次，并与抗山羊二抗(1∶10000)在室温下温育1小时。洗涤后，使用荧光成像系统(Li-Cor公司，Odysey CLx)获取图像。

在用ImageJ对rh Bri2 BRICHOS R221E单体带强度进行光密度分析后计算血清半衰期。浓度表示为相对强度，并将每条曲线相对于5min时的样品强度归一化。使用GraphPadPrism通过非线性单相衰减分析获得表观半衰期。

Bri2 BRICHOS R221E在患有阿尔茨海默氏样病理的小鼠中的作用

研究了rh Bri2 BRICHOS R221E在患有阿尔茨海默氏样病理的老年APP^NLF小鼠中的作用。APP^NLF小鼠在生理水平上表达APP，并且含有Swedish(KM670/671NL)和Beyreuther/Iberian(I716F)突变(Saito等人.，Nature Neuroscience[自然神经科学]17(5)：661-663(2014))。此模型是优选的，因为它过度产生Aβ42而不过度表达APP。

研究设计

使携带Swedish(KM670/671NL)和Beyreuther/Iberian(I716F)突变的App敲入雌性小鼠(AppNL-F小鼠)在卡罗林斯卡学院Huddinge校区的动物设施中年龄至19个月。将小鼠关在三到五个个体一组的笼子里，光照-黑暗条件是12-h∶12-h(8:00亮灯)。将小鼠随机分为PBS施用或rh Bri2 BRICHOS R221E施用，n＝10/组。小鼠每周接受两次静脉内PBS或rhBri2 BRICHOS R221E(SEQ ID NO：4；20mg/kg体重)注射，持续10周。将小鼠使用2％-4％异氟醚麻醉并用缓慢输注注射PBS或rh Bri2 BRICHOS R221E。每组有两只小鼠在接受第14-16次注射后死亡。研究使用一系列行为和生化测定来确定治疗效果。评估行为和生化测定的实验者对干预组不知情。行为实验在光照阶段期间(10:00-18:00)进行。所有生物重复的数量在各自的方法部分中给出。使用Rout方法(Q＝1％)或Grubbs方法(α＝0.2)使用Prism8(格拉夫派得软件公司(GraphPad software Inc.)，加利福尼亚州，美国)检测异常值并将其去除。年龄匹配的23-25个月大的wt小鼠用于比较一些数据。

除了携带Swedish和Beyreuther/Iberian突变外，还携带Arctic(E693G)突变的App敲入雌性小鼠(AppNL-G-F小鼠)从3个月大开始每五天一次用静脉内注射PBS或rh Bri2BRICHOS R221E(10mg/kg)治疗12周(共17次注射)，n＝12/组。

所有动物处理和实验程序均根据当地道德准则进行并获得斯德哥尔摩南部动物实验伦理委员会(dnr S 6-15)和林雪平动物伦理委员会(ID 855)的批准。

行为研究

Y迷宫。Y迷宫装置由灰色塑料制成，由三个隔室(36×15em)(从中心平台(15×15×15cm)延伸)组成。将每只小鼠放在一个面向迷宫中心的臂上，并且然后允许其自由探索5min。用70％乙醇清洁装置，以去除每个环节之间的任何气味提示。通过除以改变的数量/(总条目-1)手动确定小鼠的自发行为。

高架十字迷宫。装置由从中心平台(5×5cm)延伸的两个相对的开放臂(30×5cm)和两个相对的封闭臂(30×5cm，由15cm高的透明墙包围)组成。迷宫在具有漫射光的房间中高出地板40cm。将小鼠单独放置在面对开放臂的装置的中心，并允许自由探索装置5min。用70％乙醇清洁装置，以去除每个环节之间的任何气味提示。通过视频跟踪

XT软件Noldus(瓦赫宁根，荷兰)测量在一个或多个开放臂中花费的时间和进入开放臂的次数。

旷场和新物体识别。旷场场所是一个方形塑料盒(35×35)，壁为20cm。将每只小鼠轻轻放在面向不透明壁的角落，并允许其自由探索5min以适应。间隔2h后，将小鼠置于同一打开的盒子中，其中将两个相似的样本物体(乐高)对角放置在盒子的角落附近，并允许小鼠自由探索它们。第二天，将其中一个物体替换为一个新物体(煮蛋计时器)，并允许小鼠探索这两个物体5min。使用

XT软件Noldus(瓦赫宁根，荷兰)视频监控并分析每只小鼠的行为。每个环节后用70％乙醇清洁场所。适应阶段用于使用Ethovision软件的活动跟踪功能分析小鼠的活动。由熟悉阶段期间对相似物体所花费的时间分析小鼠的探索行为。通过将探索新物体所花费的时间除以探索两个物体所花费的总时间来计算辨别指数。

莫里斯水迷宫。在圆形水池(直径1.2m，高60cm)(Ugobasile公司，意大利)中训练小鼠定位隐藏的逃生平台(直径10cm，高30cm)。将池虚拟地分为四个相等的象限，指定为东北、西北、东南和西南。罐中装有温度为21℃±2℃的自来水，直至高于平台顶部1cm，并用牛奶使水变得不透明。用罐底部附近的4盏灯照亮罐。将平台放置在罐的固定位置(在西北象限的中间)。将池放置在有漫射照明和窗帘的大房间中，以隐藏实验者以及许多额外的迷宫视觉提示。在采集阶段期间，每只小鼠每天训练4次试验，连续四天，试验间间隔为30min。将小鼠从以下起点中的一个面向池壁释放：北、东、南或西，并允许其搜索平台60s。在每一天期间，起始位置保持不变。如果小鼠在60s后不能找到平台，则将它轻轻引导至平台并允许其停留15s。在探测试验期间，通过在第五天(最后一次采集试验后24h)移除平台来评估参考记忆，对所有小鼠使用相同的释放点。将摄像机放置在池中心的上方，并连接到

XT视频跟踪系统，Noldus(瓦赫宁根，荷兰)。将找到隐藏平台的潜伏期用作学习的量度。对于探测试验，将在目标象限中花费的总时间用作获得的空间记忆的保留的度量。

恐惧条件反射。将小鼠在具有被消音白色箱子包围的不锈钢网格地板(KinderScientific公司，美国)的条件反射室(17×10×10cm)中进行训练和测试。在条件反射当天，将每只小鼠单独放置在条件反射室中，并允许其自由探索2min，随后是30s的声音(65dB)和轻微的足部电击(0.5mA，2s)。再进行一次声音和足部电击的环节，其中刺激间的间隔为1min，并在最后一次足部电击后30s秒使小鼠回到它们的居住笼。用70％乙醇清洁这些室，以去除每个环节之间的任何气味提示。条件反射后一天，将小鼠置于同一室中，并允许其自由探索3min，不施用足部电击(基于环境的僵直)。第3天，将小鼠置于放置在消音的白色箱子内的黑色方形室中，并允许其自由探索2min，随后是2min声音，在此期间评估基于提示的恐惧条件反射的僵直响应。在每个测试中，使用Motor Monitor软件(KinderScientific公司，美国)计算僵直时间。通过从总僵直时间中减去基线(环境恐惧条件反射的条件反射当天的初始2min时间段和第3天的提示恐惧条件反射的初始2min时间段)来计算活动校正僵直。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

将小鼠皮质和海马分为TRIS可溶性(TS)部分和盐酸胍可溶性(GS)。根据制造商的说明，使用AβELISA试剂盒(IBL公司，日本)定量AβX-40和AβX-42。

硫磺素-S染色

使用切片机在Superfrost Plus显微镜玻璃载玻片上从石蜡包埋的脑组织中切割并获得5μm厚的切片，并使其在37℃下干燥过夜。通过在二甲苯和在降低(99％-70％)浓度的乙醇中洗涤来对切片进行去石蜡，随后用在蒸馏水中制备的1％过滤硫磺素-S在室温下避光染色1h。将切片在70％和95％的乙醇中洗涤，随后用蒸馏水洗涤。然后将切片与Hoechst核染色剂温育，随后用PBS-T洗涤三次，并用PermaFluor水溶性封片剂覆盖。然后将切片(4个切片/小鼠)用NikonEclipse E800共聚焦显微镜可视化，并以2x放大倍率成像(Nikon DS-Qi2相机)。计数(由盲式观察员)皮质和海马区域的总表面的斑块。

组织制备和免疫荧光

通过在二甲苯和降低(99％-70％)浓度的乙醇中洗涤来对玻璃载玻片上的小鼠组织切片去石蜡。对于抗原修复，将载玻片在柠檬酸盐缓冲溶液(0.1M柠檬酸和0.1M柠檬酸钠)中在110℃下加压煮沸5min，并且然后用自来水，随后用PBS吐温0.05％洗涤，每次5分钟。然后将切片与TNB封闭缓冲液(0.1M Tris-HCl pH 7.5，0.15M NaCl和0.5％封闭试剂；珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，美国)或NGS(正常山羊血清，载体实验室公司(VectorLaboratories)，美国)在室温下温育30min。

然后将脑切片与抗Aβ(82E1；IBL公司，美国)1∶2000在TNB缓冲液中、与抗GFAP(胶质原纤维酸性蛋白；安捷伦科技有限公司(Agilant technologies)，美国)1∶500在TNB缓冲液中或与抗Iba1(富士胶片公司(Fujifilm Wako)，日本)1∶250在NGS中在4℃下温育过夜。此后，将切片与生物素化抗小鼠或抗兔抗体(载体实验室公司；英国)1∶200在TNB缓冲液或NGS中在室温下温育2小时，并且然后与HRP-缀合的链霉亲和素(珀金埃尔默公司；美国)1∶100在TNB缓冲液或NGS中温育30min。对于信号放大，将样品在酪酰胺(珀金埃尔默公司；美国)1∶50中在放大试剂中温育10min。

最后，将样品与Hoechst溶液1∶3000在PBS-T中温育15min，伴随缓慢搅拌，随后用PermaFluor水溶性封片剂(赛默科技公司(Thermo Scientific)，美国)封固并干燥过夜。在每个温育步骤之间，将样品在PBS-T中洗涤3次，持续5min，同时缓慢搅拌。然后将切片(每只小鼠4个)用Nikon Eclipse E800共聚焦显微镜可视化，并用Nikon DS-Qi2相机在2x和10x放大倍率下成像，以在ImageJ软件(美国国立卫生研究院(National InstitutesofHealth)，马里兰州)上进一步分析。

蛋白质印迹

将皮质和海马组织(n＝4-7/组)在具有完全蛋白酶抑制剂混合物(西格玛-奥德里奇公司，美国)的RIPA缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国)中均质化。使用Bradford蛋白测定(伯乐公司(Bio-Rad)，美国)对获得的上清液进行蛋白质浓度测定。然后将50ug蛋白质加载到4％-20％预制凝胶(伯乐公司，美国)上，并转移到0.2μm硝酸纤维素或PVDF膜(Amersham^TM Hybond□，通用健康医疗集团，德国)。将膜用TBS-T(0.05％吐温-20)中的5％脱脂牛奶封闭，并用抗GFAP(安捷伦科技有限公司，美国)1∶3000、抗AIF-1/Ibal(罗福斯生物制剂公司(Novus biologicals)，美国)1∶1000、或抗Aβ1-16(6E10；生物传奇公司(Biolegend)，美国)1∶1000探测并在4℃下保持过夜，并且然后与抗小鼠或抗兔Cy31∶2500(通用健康医疗集团，英国)、HRP缀合的抗小鼠IgG 1∶5000(通用健康医疗集团，英国)或荧光标记的抗兔二抗1∶10000(LI-COR生物科学公司(Li-CORBiosciences)，美国)温育。在每个温育步骤后用TBS-T洗涤膜三次。

对于APP和CTFα/β片段，将皮质组织在4x Pipes缓冲液(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，美国)中均质化，随后以70000rpm超速离心30min。将获得的沉淀重新悬浮在Pipes缓冲液中，并使用Bradford蛋白测定测量蛋白质浓度。将2.5ug/ul蛋白质在37℃下温育30min，随后是氯仿/甲醇，2∶1(v/v)，轻轻混合提取30min。向离心(15000rpm，15min)后获得的白色界面中添加2∶1(v/v)氯仿/甲醇，轻轻混合1h，随后离心(15000rpm，15min)。将沉淀使用speed vac干燥2min，并重新悬浮在样品缓冲液(含有9M尿素的SDS样品缓冲液)中，并在室温下保持过夜。然后将40ug蛋白质加载到8％-16％预制凝胶(伯乐公司，美国)上，转移到0.2μm硝酸纤维素膜上，并用抗APP C末端抗体(西格玛-奥德里奇公司，美国)1∶5000探测，以检测APP的CTFα/β片段。将抗β-肌动蛋白(西格玛-奥德里奇公司，美国)1∶3500或抗GAPDH(西格玛-奥德里奇公司，美国)1∶5000用作上样对照。使用Amersham imager 600(通用健康医疗集团)或Odyssey CLx(Li-COR生物科学公司，美国)将蛋白质条带可视化，并用Image J软件测量条带强度并用上样对照归一化。

统计分析

使用Prism 8(格拉夫派得软件公司，加利福尼亚州，美国)进行所有统计比较。使用夏皮罗一威尔克检验法(Shapiro-Wilk test)检查正态性。通过具有邦费罗尼校正(Bonferroni correction)的双因素方差分析(two-way ANOVA)分析不同时间点的数据，以进行多重比较。通过多重t检验或双尾学生t检验分析所有其他数据。误差传播用于解释免疫染色实验中来自同一只小鼠的切片之间的差异。估计的变异性报告为平均值的标准误差(SEM)，p＜0.05被认为具有统计学意义。

相关分析

rh Bri2 BRICHOS R221E和PBS治疗组的相关性。在PBS治疗的对照组和用rh Bri2BRICHOS R221E治疗的小鼠两者中，所有小鼠的相关性成对计算为Pearson相关系数。样本量为3至8只小鼠。为了鉴定相关的相关性和趋势，我们考虑了比较的相关系数和双尾p值(p＜0.05或p＜0.2)。

体内结果与小鼠脑中BRICHOS/Aβ42比率预测的体外和离体结果的相关性。rhBri2 BRICHOS R221E治疗对斑块负荷、斑块数量、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生的影响，其中积极的治疗作用对应于降低的水平，相对作用计算为BRICHOS/PBS比率，而对于行为研究，治疗时积极的作用对应于增加的水平时，作用计算为PBS/BRICHOS比率。比率的误差条对应于单个测量的传播的SEM(propagated SEM)。分析中不包括p值＞0.2的比较和恐惧条件反射研究的数据(由于没有显著的治疗效果)。

假设脑密度为1.04g/ml，由rh Bri2 BRICHOS R221E治疗组的皮质脑匀浆中的GS可溶性Aβ42的量估计体外产生的寡聚体的数量。进一步地，基于2h后野生型rh Bri2BRICHOS的BBB通过程度(400±150nM)估计脑中BRICHOS∶Aβ42的比率，得出AppNL-F小鼠中BRICHOS∶Aβ42的比率为0.14±0.06。

对海马γ振荡的离体毒性的估计影响是基于先前的结果，其中向Aβ42中添加100％的野生型或rh Bri2 BRICHOS R221E单体得到与未治疗对照相同的γ振荡值并在rh野生型Bri2 BRICHOS单体浓度上发现了近似线性响应。因此，我们应用此线性关系来由估计的体内BRICHOS∶Aβ42比率计算离体毒性的影响。假设线性关系，由对照、单独的Aβ42和100％BRICHOS数据集的相对误差估计误差。

根据已发表的灰质和白质值，使用55.4％灰质和44.6％白质的加权平均值估计人AD患者中的Aβ42水平。应用用于减少新成核单元的，与以上所述的相同的计算和假设(包括BRICHOS在人中具有与小鼠相同的BBB渗透性)，可以估计人AD Aβ42水平的体内作用，包括用于误差估计的公布的Aβ42水平的标准偏差值。

结果

Bri2 BRICHOS R221E形成稳定的单体和不稳定的寡聚体

rh proSP-C BRICHOS的晶体结构，即唯一可用的BRICHOS结构域的高分辨率结构，显示了一个同型三聚体，其中螺旋2的残基指向相邻亚基的口袋。在基于proSP-C BRICHOS结构的Bri2 BRICHOS亚基的结构模型中，Arg221在螺旋2中表面暴露并且可以指向相邻亚基的口袋。据信，Arg221Glu突变引入了相反的表面静电位，使寡聚体不稳定并产生稳定的亚基单体。

Rh Bri2 BRICHOS R221E与溶解度标签(NT*)融合产生，该标签是最近基于蜘蛛丝蛋白的N末端结构域开发的。通过尺寸排阻色谱法(SEC)，将纯化的NT*-Bri2 BRICHOSR221E分离成寡聚体、二聚体和单体。相比于wt蛋白，突变体在很大程度上形成单体，这表明Arg221确实有助于Bri2 BRICHOS寡聚化。在NT*标签蛋白水解释放后，将分离的rh Bri2BRICHOS R221E寡聚体通过亚基间二硫键部分连接，并且二聚体依赖于二硫键。电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)证实了SEC分离的rh Bri2 BRICHOS R221E单体的四级结构。通过ESI-MS确定的质量(14050.2Da)与计算得到的单体质量(14050.1Da)完全一致，其中两个保守的Cys形成分子内二硫键。圆二色(CD)光谱法显示单体rh Bri2 BRICHOS R221E的整体二级结构与wt单体相似。与寡聚体的形成相关，205-210nm附近的负CD峰向右移动，表明结构稳定，这与rh wt Bri2 BRICHOS观察到的模式相当。与游离双-ANS相比，荧光发射强度显著增加以及发射最大值从约533nm蓝移至480-490nm证明，分离的rh Bri2 BRICHOS R221E单体、二聚体和寡聚体结合双-ANS。这表明所有rh Bri2 BRICHOS R221E物质均暴露疏水表面，这与wt物质的情况相似。针对热变性柠檬酸合酶(CS)评估了不同组装状态的rh Bri2 BRICHOSR221E防止非原纤维蛋白聚集的能力。二聚体和单体在抑制CS聚集中效率相对较低，而寡聚体有效地减少了CS的聚集，像wt物质的情况一样。在整篇论文中，不同rh Bri2 BRICHOSR221E物质的浓度是指其单体亚基。

如通过SEC所见的，分离的rh wt Bri2 BRICHOS单体在浓度增加时形成二聚体，而rh Bri2 BRICHOS R221E单体在浓度增加时在SEC上没有显示改变的迁移。同样，rh Bri2BRICHOS R221E单体在20mM NaPi pH 8.0中在37℃下温育过夜随后通过非变性PAGE显示它们保持单体状态，而wt蛋白不是这种情况。通过非变性PAGE分析表明，rh Bri2 BRICHOSR221E寡聚体在37℃下温育过夜后会释放单体和其他低n物质，而rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体在温育期间不自发释放较小的物质。

Bri2 BRICHOS寡聚体的不稳定增强抗Aβ42神经毒性活性

为了研究rh Bri2 BRICHOS寡聚体的不稳定对减轻Aβ42相关的神经毒性的作用，我们测试了防止小鼠海马脑片中Aβ42诱导的γ振荡减少的功效。γ振荡与学习、记忆、认知和其他高级过程相关，在AD患者中观察到的认知下降与γ振荡的减少密切相关。在这里，通过用100nM红藻氨酸(KA)灌流切片并且然后使它们稳定30min，来在来自wt C57BL/6小鼠的水平海马脑片中诱导γ振荡。

图2A显示在对照条件(灰色)下，用50nM Aβ42、50nM Aβ42+25nM预温育的rh Bri2BRICHOS R221E单体、50nM Aβ42+25nM预温育的rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体、50nM Aβ42+50nM预温育的rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体、50nM Aβ42+50nM预温育的rh Bri2 BRICHOSR221E寡聚体、和50nM Aβ42+25nM rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体和25nM rh Bri2 BRICHOSR221E单体的预温育的混合物温育15min后的实例轨迹和实例功率谱(i和ii)。还显示了来自实验的归一化γ振荡功率(iii和iv)的汇总直方图。直方图下的数字表示生物学重复的数量，并且数据报告为平均值±平均值的标准误差。对照相对于Aβ42：p＜0.0001，ns，无显著差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

用50nM Aβ42预温育海马脑片15min明显降低了随后KA应用产生的γ振荡的功率(图2A)。添加50nM rh Bri2 BRICHOS R221E寡聚体以及50nM Aβ42导致的γ振荡与未治疗的对照的没有区别，而添加rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体与50nM Aβ42导致的γ振荡与未治疗的对照的和用rh Bri2 BRICHOS R221E寡聚体和Aβ42治疗后获得的γ振荡相比明显降低(图2Ai，iii)。这些观察表明，rh Bri2 BRICHOS R221E寡聚体的不稳定和较小物质的释放增加了抗Aβ42神经毒性的活性。我们接下来假设，rh Bri2 BRICHOS R221E单体可以干扰rhwt Bri2 BRICHOS寡聚体形成，并且从而增加单体的比率，这将有望增加对抗Aβ42神经毒性的效力。

为了测试此假设，我们将rh Bri2 BRICHOS R221E单体和rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体共温育，之后评估了Bri2 BRICHOS组装状态的分布，以及对Aβ42原纤维形成和神经毒性的影响。为了能区分wt和R221E rh Bri2 BRICHOS单体，我们使用了含有AU1标签的rh wtBri2 BRICHOS构建体，其行为与无标签的wt蛋白相似，并且可以用抗AU1抗体对其进行选择性地免疫检测。在图2B中，将Rh Bri2 BRICHOS R221E单体和含有用于免疫检测的AU1标签的rhwt Bri2 BRICHOS寡聚体(5∶5μM和9∶4.5μM)在37℃下共温育过夜，并通过非变性PAGE和蛋白质印迹用抗AU1标签抗体进行分析。虚线框表示wt Bri2 BRICHOS单体的迁移。非变性PAGE和蛋白质印迹分析显示，rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体与rh Bri2 BRICHOS R221E单体的共温育导致较小物质，特别是单体的释放(图2B)。我们用Bri2 BRICHOS与mCherry的融合来进一步研究rh Bri2 BRICHOS R221E从wt rh Bri2 BRICHOS寡聚体中释放单体的能力。rh Bri2 BRICHOS R221E单体和rh Bri2 BRICHOS-mCherry寡聚体的共温育产生wt单体的浓度依赖性释放，其在突变体和wt寡聚体之间约2∶1的摩尔比时饱和。添加rh Bri2BRICHOS R221E单体也增加了rh wt Bri2 BRICHOS的抗Aβ42神经毒性功效(图2A)。我们将25nM的rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体和25nM的rh Bri2 BRICHOS R221E单体在37℃下共温育过夜，并且与50nM的rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体(以与混合物相同的方式预温育)相比，该混合物更有力地减弱Aβ42诱导的γ振荡功率降低(图2A)。值得注意的是，混合物的效率提高不能仅通过增加两个单一物质的效率来解释(图2A)，并且与相同总浓度的单独的任何物质的相比，Aβ42纤维化动力学被rh Bri2 BRICHOS R221E单体和rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体的温育混合物更强烈地延迟(图2C)。图2C显示在3μM rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体、3μMrh Bri2 BRICHOS R221E单体或1.5μM wt寡聚体和1.5μM R221E单体的预温育混合物存在下，单独3μM Aβ42的ThT动力学分析。因此，这些结果表明将Bri2 BRICHOS的分布从寡聚体转移到单体是增强抗Aβ42神经毒性能力的一种方法。

Bri2 BRICHOS R221E单体选择性抑制Aβ42原纤维化的二次成核

为了发现rh wt Bri2 BRICHOS寡聚体释放小的物质的分子机制以及这与增加的针对Aβ42神经毒性的能力如何相关，我们研究了rh Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体对Aβ42原纤维形成的影响。我们使用硫磺素ThT荧光来监测在不存在和存在不同浓度的rhBri2 BRICHOS R221E物质的情况下，Aβ42原纤维形成的动力学。

图3展示了rh Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体对Aβ42原纤维形成的微观事件的影响：

(A-B)在0、10％、30％、50％、70％和100％rh Bri2 BRICHOS R221E单体(A)和二聚体(B)存在下，3μM Aβ42的归一化和平均聚集轨迹(交叉)的单个拟合(实线)，其中组合速率常数

和√(k₊k₂)作为自由拟合参数。从拟合(插图)中获得的相对组合速率常数的依赖性揭示了两种rh Bri2 BRICHOS R221E物质对二次成核(k₊k₂)的强烈影响，但对初级(k_nk₊)途径没有强烈影响。

(C)如(A)和(B)中所示，在不同浓度的rh Bri2 BRICHOS R221E物质存在下，从拟合Aβ42聚集轨迹中提取的r_max和T_1/2(插图)的值。

(D-E)在0、10％、30％、50％、70％和100％rh Bri2 BRICHOS R221E单体(D)和二聚体(E)存在下，3μM Aβ42与0.6μM预制的Aβ42原纤维的种子聚集轨迹。

(F)由(D)和(E)中的高种子聚集动力学确定的延伸速率(k₊)。

(G-H)在37℃下，在存在和不存在50％摩尔比的rh Bri2 BRICHOS R221E单体(G)或二聚体(H)的情况下将5μM Aβ42温育过夜。将样品用山羊抗Bri2BRICHOS抗体和金标记的二抗处理，并通过TEM表征。比例尺为100nm。箭头表示原纤维末端。

(I)在与rh Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体共纤维化后，位于8个Aβ42原纤维末端30nm内的金颗粒的数量。数据报告为平均值±标准偏差。***p＜0.001。

rh Bri2 BRICHOS R221E单体在亚化学计量浓度下显示Aβ42原纤维形成的剂量依赖性逐渐减少，并且聚集动力学遵循典型的S型行为(图3A)。原纤维化半衰期T_1/2随着rhBri2 BRICHOS R221E单体浓度的增加而增加，而最大聚集速率rmax显示单指数下降(图3A，C)。rh Bri2 BRICHOS R221E二聚体显示与单体相似的效果，但在抑制Aβ42原纤维形成的总体速率方面更有效(图3B，C)。γ值，T_1/2αm(0)^γ(其中m(0)是初始Aβ42单体浓度)在存在或不存在两种rh Bri2 BRICHOS R221E物质的情况下是相似的，这表明在rh Bri2 BRICHOSR221E存在下，Aβ42原纤维化仍主要遵循单体依赖性二级途径。最终的ThT荧光强度(成熟原纤维质量的指标)显示相对于Aβ42浓度线性增加，并且在不同浓度的rh Bri2 BRICHOSR221E物质存在下没有显著变化。

Aβ42原纤维化动力学由一组微观速率常数描述，即初级(k_n)和二次(单体依赖性k₂和不依赖于单体的k_-)成核以及延伸(k₊)。为了确定Aβ42原纤维化途径中受不同rh Bri2BRICHOS R221E物质影响最大的微观过程，我们分别确定了初级成核事件的组合速率常数√(k_nk₊)和二次成核事件的组合速率常数√(k₊k₂)。我们在不同的Aβ42浓度和恒定的rhBri2 BRICHOS R221E浓度下全局拟合动力学模型，其中√(k_nk₊)和√(k₊k₂)在所有浓度下都被限制为相同的值。我们发现拟合参数√(k_nk₊)在存在rh Bri2 BRICHOS R221E物质的情况下与单独的Aβ42的相似，这表明主要二级途径受rh Bri2 BRICHOS R221E调节。结果还表明，rh Bri2 BRICHOS R221E二聚体在抑制与k₊k₂相关的成核事件(即原纤维延伸或/和二次成核)中比单体更有效。为了定量阐明rh Bri2 BRICHOS R221E对Aβ42纤维化的影响，我们随后将动力学模型单独拟合到用恒定Aβ42浓度和不同rh Bri2 BRICHOS R221E浓度获得的数据集(图3A-C)。分析揭示了rh Bri2 BRICHOS R221E显著改变√(k₊k₂)而没有改变√(k_nk₊)(图3A，B，插图)，再次表明二次成核是受影响的主要途径。单个拟合还表明，二聚体在降低√(k₊k₂)中比单体更有效(图3A，B，插图)。

单个微观速率常数k₊、k_n和k₂的扰动是最相关的，因为它们的相对贡献决定了新形成的成核单元的数量，这可能与神经毒性Aβ42寡聚物质的产生有关。为了评估对单个微观过程的影响，我们进行了恒定Aβ42和不同rh Bri2 BRICHOS R221E浓度下的动力学数据集的全局拟合，其中拟合受到约束，使得仅一个单一速率常数，即k_n、k₊或k₂，是拟合参数。初级成核速率k_n或延伸速率k₊(作为唯一拟合参数)导致两种rh Bri2 BRICHOS物质的拟合不足，NMR数据进一步证实了这一点，表明rh Bri2 BRICHOS R221E的单体或二聚体均不与Aβ40单体相互作用。用k₂作为唯一的自由拟合参数，充分描述rh Bri2 BRICHOS R221E单体(但不是二聚体)的动力学。因此我们推断，rh Bri2 R221E单体主要抑制Aβ42原纤维形成期间的二次成核。相反，二聚体抑制二次成核(k₂)和原纤维末端延伸(k₊)两者。

为了进一步研究在不同rh Bri2 BRICHOS物质存在下延伸过程如何受到影响，我们确定了在高初始原纤维种子浓度存在下，在初级和次级成核事件可忽略、并且仅原纤维延伸有助于原纤维质量的增加的条件下的聚集动力学。在这些条件下，原纤维化轨迹典型地遵循凹聚集行为(图3D，E)，其中初始斜率与延伸速率k₊成正比。这些接种实验揭示了，rhBri2 BRICHOS R221E二聚体以剂量依赖性方式显著降低延伸速率，并且在低浓度下原纤维末端延伸已经明显延迟(图3E，F)。相反，rh Bri2 R221E单体仅轻微影响原纤维末端延伸速率(图3D，F)。这表明两种rh Bri2 BRICHOS R221E物质经由对表面催化的二次成核的影响来减少Aβ42原纤维化，而原纤维末端延伸仅受rh Bri2 BRICHOS二聚体的显著影响。

不同的影响暗示单体和二聚体与原纤维末端的缔合不同。为了研究这一点，我们使用了抗Bri2 BRICHOS免疫金染色和透射电子显微镜(TEM)。我们发现单体和二聚体两者均与Aβ42原纤维表面大量结合并具有相似的密度(图3G，H)，这支持动力学分析并为两种rhBri2 BRICHOS R221E物质对二次成核的影响提供基础。进一步地，与Aβ42原纤维末端结合的rh Bri2 BRICHOS R221E二聚体的数量显著高于单体的(图3I)，这证实了主要是二聚体调节原纤维末端延伸的动力学分析结果。

Bri2 BRICHOS R221E单体有效预防Aβ42神经毒性

Aβ42二次成核和延伸的相对抑制可能与毒性低分子量物质的形成减少有关，因为新成核单元的数量通过抑制二次成核而减少，但通过抑制延伸而增加。因此，图3F中所示的结果可能对分别在rh Bri2 BRICHOS R221E二聚体和单体存在下形成的毒性Aβ42物质的预期量具有重要意义。首先由组合速率常数(这些常数由存在和不存在恒定浓度的rh Bri2BRICHOS R221E的情况下不同Aβ42浓度的全局拟合确定)和30％摩尔当量的不同rh Bri2BRICHOS R221E物质的Aβ42原纤维延伸速率(由种子聚集实验确定)计算新Aβ42成核单元的数量(图3D-F)。

图4展示了rh Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体对Aβ42寡聚体形成和神经毒性的影响：

(A)上分图：在不存在或存在30％摩尔比的rh Bri2 BRICHOS R221E单体和二聚体的情况下，形成的Aβ42成核单元的相对数量，其由分图3F图中导出的全局拟合动力学参数和延伸速率(k₊)估计。

下分图：在存在不同浓度的rh Bri2 BRICHOS R221E单体(右柱)和二聚体(左柱)的情况下形成的Aβ42成核单元的相对数量，其由源自图3A、B的单个拟合参数和来自图3F的延伸速率(k₊)估计。

(B)在对照条件(KA)下，在与50nM Aβ42温育15min后，以及与50nM Aβ42+50nM rhBri2 BRICHOS R221E单体或二聚体温育15min后，小鼠海马γ振荡功率的汇总直方图。直方图下的数字表示生物学重复的数量，并且数据报告为平均值±平均值的标准误差。对照相对于Aβ42：p＜0.0001；ns，无显著差异；**p＜0.01。

结果(图4A，上分图)表明，在存在30％rh Bri2 BRICHOS R221E单体的情况下，成核单元的生成减少了大约25％，而二聚体没有影响。为了研究此抑制作用在较高的相对Bri2 BRICHOS浓度下是否也有效，我们接下来由从单个拟合获得的组合速率常数(与由全局拟合获得的值相比，受到更大的不确定性影响)(图3A-B)和延伸速率(图3F)估计成核单元的生成。事实上，在存在rh Bri2 BRICHOS R221E单体的情况下，成核单元的生成以剂量依赖性方式减少并且减少最高70％(图4A，下分图)。因此，结果表明rh Bri2 BRICHOSR221E单体(以与rh proSP-C BRICHOS的效率相当的效率)显著减少Aβ42成核单元的形成，而二聚体则没有。

为了研究rh Bri2 BRICHOS R22 1E降低Aβ42相关神经毒性的能力是否与成核单元的产生相关，我们测试了rh Bri2 BRICHOS单体和二聚体在防止Aβ42诱导的小鼠海马脑片中γ振荡减少的功效。我们发现向50nM Aβ42中添加50nM rh Bri2 BRICHOS R22 1E单体防止Aβ诱导的神经毒性，并且γ振荡的功率达到未治疗对照的水平(图4B)。相反，向50nM Aβ42中添加50nM rh Bri2 BRICHOS R221E二聚体未导致Aβ42诱导的毒性的显著预防(图4B)。这表明单体对Aβ42诱导的毒性有效，这支持动力学分析，即抑制二次成核显著降低有毒Aβ42寡聚体形成。

图5展示了不同rh Bri2 BRICHOS R221E物质对小鼠海马脑片中Aβ42毒性的影响。在对照条件(KA)下，在与50nM Aβ42温育15min后，与50nM Aβ42+100nM二聚体或100nM单体温育15min后，小鼠海马γ振荡功率的汇总直方图。直方图下的数字表示生物学重复的数量，并且数据报告为平均值±平均值的标准误差。***p＜0.001；ns，无显著差异。值得注意的是，将rh Bri2 BRICHOS二聚体的浓度从50nM增加到100nM导致Aβ42诱导的毒性的显著预防(图5)。

这些结果表明，Aβ42原纤维形成的抑制剂在对神经毒性的影响方面的最终结果取决于作用机制和相对于Aβ42的分子比率两者。

Bri2 BRICHOS R221E形成穿透BBB的稳定单体

图7展示了rh Bri2 BRICHOS R221E形成通过BBB的稳定单体：

(A)在rh Bri2 BRICHOS R221E单体在小鼠血清中在37℃下温育不同时间段的非还原条件下SDS-PAGE后的蛋白质印迹。泳道C含有未温育的rh Bri2 BRICHOS R221E单体。

(B)通过注射后不同时间点获得的蛋白质印迹条带的光密度测定确定的小鼠血清中rh Bri2 BRICHOS R22 1E单体的半衰期。凝胶和衰减曲线显示一项代表性实验，并且插图显示五只动物中确定的半衰期散点图。M表示蛋白质梯。

(C)在静脉内注射rh Bri2 BRICHOS R221E单体或PBS后1、2或6h收集的脑匀浆的还原条件下SDS-PAGE后的蛋白质印迹。泳道C显示rh Bri2 BRICHOS R221E单体的迁移。箭头指出脑匀浆样品中的条带。

将rh Bri2 BRICHOS R22 1E的单体在37℃下在小鼠血清中离体温育，并且24h后单体强度基本保持不变(图7A)，而rh wt Bri2 BRICHOS在相同条件下大部分转化为寡聚体(Chen等人.，Nat Commun[自然通讯]8：2081(2017))。

将剂量为20mg/kg的Rh BRICHOS R221E单体静脉内注射到C57BL/6NTac小鼠中，而对照小鼠仅接受PBS，并分别由血清和脑匀浆的蛋白质印迹评估血清的半衰期和BBB渗透性。在体内，rh Bri2 BRICHOS R221E单体的血清半衰期为53±19min(图7B)，比rh wt Bri2BRICHOS单体、二聚体或寡聚体的半衰期(约30-40min)长。在注射后两小时通过蛋白质印迹在脑匀浆中检测到Rh Bri2 BRICHOS R221E(图7C)，这表明rh Bri2 BRICHOS R221E像wt蛋白一样渗透BBB。

Bri2 BRICHOS R221E在患有阿尔茨海默氏样病理的小鼠中的作用

研究了rh Bri2 BRICHOS R221E在患有阿尔茨海默氏样病理的老年APP^NLF小鼠中的作用。

图9展示了施用rh Bri2 BRICHOS R221E的小鼠显示皮质区域的盐酸胍(A)可溶性部分中的Aβ42水平降低的趋势，而TRIS可溶性部分(B)中的Aβ42水平没有观察到影响。施用Rh Bri2 BRICHOS R221E的小鼠还显示GFAP(C)(与炎症相关的星形胶质细胞标志物)的表达降低，这表明老年AD小鼠中rh Bri2BRICHOS R221E的肠胃外治疗降低神经炎症。

因此，rh Bri2 BRICHOS R221E的全身施用显示AD小鼠的星形胶质细胞介导的神经炎症的减少。

施用rh Bri2 BRICHOS R221E的APP^NL-F小鼠的身体活动和旷场探索改善

在10周期间共给予APP^NL-F小鼠20次注射rh Bri2 BRICHOS R221E单体，与PBS注射对照相比，其没有导致不良副作用或体重减轻的宏观迹象。与PBS注射对照小鼠相比，RhBri2 BRICHOS R221E改善了小鼠的身体活动，并且它们的身体活动水平接近年龄匹配的wt小鼠的值(图8A-B)。

图8展示了rh Bri2 BRICHOS R22 1E在AppNL-F小鼠的焦虑水平没有变化的情况下改善了身体活动和探索。直方图代表平均活动(图8A)和速度(图8B)。对于PBS和rh Bri2BRICHOS R221E治疗的AppNL-F小鼠和年龄匹配的wt对照，数据显示为平均值±SEM。未配对参数双尾t检验用于计算所有分析的p值。PBS组中的4.99值作为分图(B)的异常值被删除。

rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的App敲入小鼠的厌恶学习和记忆

进行恐惧条件反射(FC)测试以评估施用和不施用rh Bri2 BRICHOS R221E的APP^NL-F小鼠的厌恶学习和记忆响应。在治疗的App^NL-F队列中，我们观察到对于环境和提示FC两者，与rhBri2 BRICHOS R221E小鼠相比，PBS对照中的僵直行为增加的趋势。

与App^NL-F敲入小鼠相比，除了携带Swedish和Iberian突变外，还携带Arctic突变的App^NL-G-F敲入小鼠显示更强并更早的AD样病理，包括行为缺陷。我们以10mg/kg的剂量每五天向App^NL-G-F敲入小鼠(从3个月大，当Aβ病理开始发展时)施用rhBri2 BRICHOS R221E，持续12周，共注射17次，并且然后在Y迷宫中测试它们并评估了新物体识别(NOR)中的物体识别记忆。这表明在rh Bri2 BRICHOS R221E治疗后，Y迷宫中交替频率(图10A)显著(p＜0.05)改善并且新物体辨别(图10B)改善。图10中的数据表示为平均值±SEM。双因素方差分析和非配对参数双尾t检验用于计算p值。

用rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的App^NL-F小鼠中Aβ斑块负荷的减弱

通过ELISA分析海马和皮质中Tris或盐酸胍可溶性Aβ40和Aβ42水平，其揭示了PBS和rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的App^NL-F小鼠之间的脑区域的Aβ40或Aβ42水平没有变化。相反，用硫磺素S染料对脑组织进行淀粉样物质染色或使用Aβ抗体的免疫染色揭示了，与PBS对照相比，rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠在皮质中具有较低的硫磺素S阳性斑块计数(图11A)并在皮质中显示较低的总Aβ阳性斑块负荷(图11B)。数据表示平均值±SEM。未配对参数双尾t检验用于计算p值。

rh Bri2 BRICHOS R221E治疗后APP^NL-F小鼠中星形胶质细胞增生减少

通过胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)水平和施用rh Bri2 BRICHOS R221E和PBS的App^NL-F小鼠的切片的免疫染色来评估皮质和海马中的星形胶质细胞增生。在用β肌动蛋白标准化后，与PBS对照相比，rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠的海马脑匀浆中的GFAP水平显著(p＜0.01)降低，并且在rh Bri2BRICHOS R221E治疗的小鼠中存在皮质中GFAP水平降低的趋势(图12A)。而且，脑切片的GFAP免疫染色显示，与PBS对照相比，在施用rh Bri2BRICHOS R221E的小鼠皮质中，GFAP阳性星形胶质细胞显著减少(p＝0.02)(图12B)。GFAP阳性星形胶质细胞的区域通常呈圆形簇状，表明它们可能围绕着斑块。为了解决此问题，我们对GFAP和Aβ的脑组织进行了双重染色，并且结果显示GFAP阳性细胞大量定位于Aβ斑块周围(图12C)。与PBS对照相比，rh Bri2BRICHOS R221E治疗的小鼠的海马和皮质中，GFAP和Aβ共定位程度显著(p＝0.03或p＜0.001)降低(图12C)。PBS和rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的App^NL-F小鼠的数据显示为平均值±SEM。未配对参数双尾t检验用于计算所有分析的p值。

rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的App^NL-F小鼠中小胶质细胞增生减弱

分析来自皮质和海马的脑组织匀浆以评估施用rh Bri2 BRICHOS R221E和PBS的App^NL-F小鼠中的Iba1水平。与PBS对照相比，rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠的皮质中的Ibal水平降低(p＝0.05)，但在海马区域没有可检测的差异。脑切片的Iba1免疫染色显示两个脑区域中染色减少，表明与PBS对照相比，rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠中Iba1阳性小胶质细胞较少，在皮质区域中显著(p＝0.01)减少(图13)。

用和未用Rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的App^NL-F小鼠中斑块与星形胶质细胞和小胶质细胞激活的标志物之间的相关性

临床前研究报道，可溶性Aβ寡聚体可以激活小胶质细胞并促进细胞因子的分泌。AD受试者的小胶质细胞标志物和匹兹堡化合物B(PIB)(Aβ沉积的标志物)的正电子发射断层扫描成像表明，这些标志物在皮质中共定位，并且还揭示了认知状态和小胶质细胞激活之间的负相关。而且，小胶质细胞激活和星形胶质细胞增生可能是AD的早期现象，但PIB阳性淀粉样物质沉积的个体水平和小胶质细胞激活不相关。这促使我们从我们的数据中阐明斑块与星形胶质细胞和小胶质细胞激活之间的潜在关系。因此，我们分别在PBS治疗的对照组和rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的组中小鼠的皮质和海马中成对相关的斑块负荷(Aβ免疫染色)、淀粉样斑计数(硫磺素S染色)、星形胶质细胞增生(GFAP免疫染色)、小胶质细胞增生(Iba1免疫染色)和共定位(Aβ和GFAP免疫染色)。

在PBS和rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠中，GFAP和Iba1染色在皮质和海马中呈正相关(基于图12B和图13中提供的数据)。这是预期的，因为这两个标志物均报告了对中枢神经系统的损害，并支持在我们的研究中可以发现的相关的相关性，尽管使用的小鼠相对较少。此观察还表明，与PBS对照相比，rh Bri2 BRICHOS R221E治疗通常不会抑制相关性(进一步参见下文)。在PBS治疗的小鼠中，Aβ阳性斑块的面积(斑块负荷)倾向于与GFAP和Iba1染色以及Aβ和GFAP共定位呈正相关，特别是在皮质中(基于图11B、图12B-C中和图13中提供的数据)。令人惊讶的是，在PBS治疗的小鼠中，硫磺素S阳性斑块的数量(斑块计数)通常与GFAP和Iba1染色以及的Aβ和GFAP共定位呈负相关(基于图11A、图12B-C和图13中提供的数据)。而且，在PBS治疗的小鼠中，Aβ斑块负荷和硫磺素S斑块计数往往彼此负相关(基于图11A-B中提供的数据)。

与PBS治疗的对照App^NL-F小鼠的情况相反，rh Bri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠显示Aβ斑块负荷和硫磺素S斑块计数之间没有相关性(基于图11A-B提供的数据)。而且，在rhBri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠中未观察到PBS小鼠中观察到的硫磺素S斑块计数与GFAP和Iba1染色之间的负相关趋势(基于图11A和图12B；图11A和图13中提供的数据)并且在rhBri2 BRICHOS R221E治疗的小鼠中未看到PBS小鼠中的Aβ斑块负荷与GFAP和Iba1染色之间的正相关趋势(基于图11B和图12B；图11B和图13中提供的数据)。

rh Bri2 BRICHOS R221E治疗对APP^NL-F小鼠的影响与由脑BRICHOS/Aβ42比率估计的体外新Aβ42成核单元生成的减少和Aβ42诱导的离体神经毒性一致

已显示Rh Bri2 BRICHOS通过单体依赖性二次成核事件减弱新成核单元生成的独特能力，其可能在体外原纤维形成期间转化为神经毒性Aβ42寡聚体。进一步地，rh Bri2BRICHOS阻断Aβ42诱导的离体海马脑片中γ振荡的减少，并已成为Aβ42原纤化的分子研究中的模型化合物。为了研究现在观察到的体内rh Bri2 BRICHOS R221E施用后的治疗效果是否可以通过体外BRICHOS确定的分子机制来介导，我们询问通过rh Bri2 BRICHOS R221E的分别在体外和离体测量的Aβ42寡聚体产生的减少程度(在新成核单元的减少方面)和Aβ42诱导的γ振荡恶化的降低程度与在App^NL-F小鼠中看到的效果之间是否存在定量一致性。

为此，我们根据野生型小鼠中测量的野生型rh Bri2 BRICHOS的BBB通过程度估计了治疗的App^NL-F小鼠的脑中rh Bri2 BRICHOS R22 1E的量[Tambaro等人.，J Biol Chem.[生物化学杂志]294，2606-2615(2019)]并使用App^NL-F脑匀浆中Aβ42的测量水平来确定可能的体内rh Bri2 BRICHOS R221E/Aβ42比率。然后，我们使用先前发布的数据[Chen等人.，Nat.Commun.[自然通讯]8，2081，(2017)；Chen,等人.Commun Biol.[通讯生物学]3，32(2020)]进行估计，其中体外成核单元生成的减少程度和Aβ42诱导的对离体海马脑片γ振荡的影响的降低程度分别对应于此rh Bri2 BRICHOS R221E/Aβ42比率。值得注意的是，与估计的体内rh Bri2 BRICHOS R221E/Aβ42比率对应的预测的体外寡聚体生成的减少和Aβ42介导的离体神经毒性的降低与在rh Bri2 BRICHOS R221E后的App^NL-F小鼠中观察到的Aβ阳性和硫磺素S阳性斑块、GFAP染色、通过蛋白质印迹的皮质中的Iba1水平的减少，以及增加的身体活动非常吻合。对于Aβ和GFAP染色以及Iba1染色的共定位程度，体内的减少似乎比体外数据预期的更明显，这可能与放大级联涉及星形胶质细胞和小胶质细胞的体内激活有关。

结论

我们的结果表明，静脉内施用rh Bri2 BRICHOS R221E可以显著改善App^NL-F敲入小鼠的身体活动、Aβ斑块负荷以及星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。

特别地，我们的结果支持通过表面催化的二次成核途径产生新成核单元可引起毒性作用，如在App^NL-F小鼠中观察到的Aβ诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞激活所示的，并且用rh Bri2 BRICHOS R221E静脉内治疗有效地减少体内的神经毒性途径。

我们的观察支持用rh Bri2 BRICHOS R221E静脉内治疗App^NL-F敲入小鼠影响Aβ抗体和硫磺素S阳性斑块，并导致星形胶质细胞以及小胶质细胞的激活减少。

序列表

<110> 阿尔法贝塔公司

<120> 用于治疗阿尔茨海默病的化合物和方法

<130> XCH/HOLI/AWAST-23114

<150> EP20150738

<151> 2020-01-08

<160> 16

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Val Lys Val Thr Phe Asn Ser Ala Leu Ala Gln Lys Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Asp Glu Pro Lys Ser Gly Glu Glu Ala Leu Ile Ile Pro Pro Asp

20 25 30

Ala Val Ala Val Asp Cys Lys Asp Pro Asp Asp Val Val Pro Val Gly

35 40 45

Gln Arg Arg Ala Trp Cys Trp Cys Met Cys Phe Gly Leu Ala Phe Met

50 55 60

Leu Ala Gly Val Ile Leu Gly Gly Ala Tyr Leu Tyr Lys Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Leu Gln Pro Asp Asp Val Tyr Tyr Cys Gly Ile Lys Tyr Ile Lys Asp

85 90 95

Asp Val Ile Leu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Ala Pro Ala Ala Leu Tyr

100 105 110

Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu

115 120 125

Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn

130 135 140

Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn

145 150 155 160

Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro

165 170 175

Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr

180 185 190

Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg

195 200 205

Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His

210 215 220

Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu Gln Arg Arg Glu Thr Ile Lys Gly Ile

225 230 235 240

Gln Lys Arg Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn

245 250 255

Lys Phe Ala Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser

260 265

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体

<400> 2

Met Gly His His His His His His Met Ser His Thr Thr Pro Trp Thr

1 5 10 15

Asn Pro Gly Leu Ala Glu Asn Phe Met Asn Ser Phe Met Gln Gly Leu

20 25 30

Ser Ser Met Pro Gly Phe Thr Ala Ser Gln Leu Asp Lys Met Ser Thr

35 40 45

Ile Ala Gln Ser Met Val Gln Ser Ile Gln Ser Leu Ala Ala Gln Gly

50 55 60

Arg Thr Ser Pro Asn Asp Leu Gln Ala Leu Asn Met Ala Phe Ala Ser

65 70 75 80

Ser Met Ala Glu Ile Ala Ala Ser Glu Glu Gly Gly Gly Ser Leu Ser

85 90 95

Thr Lys Thr Ser Ser Ile Ala Ser Ala Met Ser Asn Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Thr Thr Gly Val Val Asn Gln Pro Phe Ile Asn Glu Ile Thr Gln Leu

115 120 125

Val Ser Met Phe Ala Gln Ala Gly Met Asn Asp Val Ser Ala Gly Asn

130 135 140

Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile

145 150 155 160

Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe

165 170 175

Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu

180 185 190

Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu

195 200 205

Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile

210 215 220

Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu

225 230 235 240

His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe

245 250 255

Phe Ile Tyr Glu Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

260 265 270

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu

1 5 10 15

Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn

35 40 45

Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro

50 55 60

Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg

85 90 95

Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His

100 105 110

Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

115

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体

<400> 4

Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu

1 5 10 15

Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn

35 40 45

Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro

50 55 60

Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg

85 90 95

Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Glu Leu Cys His

100 105 110

Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

115

<210> 5

<211> 89

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Val Lys Val Thr Phe Asn Ser Ala Leu Ala Gln Lys Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Asp Glu Pro Lys Ser Gly Glu Glu Ala Leu Ile Ile Pro Pro Asp

20 25 30

Ala Val Ala Val Asp Cys Lys Asp Pro Asp Asp Val Val Pro Val Gly

35 40 45

Gln Arg Arg Ala Trp Cys Trp Cys Met Cys Phe Gly Leu Ala Phe Met

50 55 60

Leu Ala Gly Val Ile Leu Gly Gly Ala Tyr Leu Tyr Lys Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Leu Gln Pro Asp Asp Val Tyr Tyr Cys

85

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala

1 5 10 15

Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser

20

<210> 7

<211> 95

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly

65 70 75 80

Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 8

<211> 95

<212> PRT

<213> 黑猩猩（Pan troglodytes）

<400> 8

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly

65 70 75 80

Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 9

<211> 95

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 9

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Lys Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly

65 70 75 80

Phe Tyr Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 10

<211> 95

<212> PRT

<213> 野猪（Sus scrofa）

<400> 10

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly

65 70 75 80

Phe Tyr Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 11

<211> 95

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 11

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Lys Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Val Asp Asn Leu Gly

65 70 75 80

Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 12

<211> 95

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 12

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Val Asp His Leu Gly

65 70 75 80

Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 13

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体

<400> 13

Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys

1 5 10 15

Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro

20 25 30

Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His

50 55 60

Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly

65 70 75 80

Phe Phe Ile Tyr Glu Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

cacctgggtt tctttattta tgaactgtgt catgacaagg aaac 44

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

gtttccttgt catgacacag ttcataaata aagaaaccca ggtg 44

<210> 16

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体

<400> 16

atgggccatc atcatcatca tcatatgtca cacactacac catggacaaa cccaggactc 60

gcagaaaact tcatgaacag tttcatgcaa ggcctgagct cgatgccagg tttcacggca 120

agccaattgg ataagatgtc aaccatcgca caatccatgg tacagtcaat acaatccttg 180

gcggcacaag gcaggacatc accgaatgac ctgcaggccc ttaacatggc ttttgcatct 240

tcgatggcag aaatcgcggc atccgaagaa ggagggggaa gcctttccac caaaactagc 300

tctatagcca gtgcaatgtc caacgcgttt ctgcaaacaa ctggagtggt aaaccaaccg 360

ttcataaatg aaataactca gctcgttagc atgtttgctc aagcaggtat gaatgatgtc 420

agtgctggga attccctggt gccacgcggt tctcagacaa ttgaagaaaa tattaaaatc 480

tttgaagaag aagaagttga atttatcagt gtgcctgtcc cagagtttgc agatagtgat 540

cctgccaaca ttgttcatga ctttaacaag aaacttacag cctatttaga tcttaacctg 600

gataagtgct atgtgatccc tctgaacact tccattgtta tgccacccag aaacctactg 660

gagttactta ttaacatcaa ggctggaacc tatttgcctc agtcctatct gattcatgag 720

cacatggtta ttactgatcg cattgaaaac attgatcacc tgggtttctt tatttatgaa 780

ctgtgtcatg acaaggaaac ttacaaactg 810

Claims

1.一种分离的蛋白质，其包含与SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的90-200个氨基酸残基的部分，其中对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组。

2.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，其中该对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基是Glu。

3.根据任一项前述权利要求所述的分离的蛋白质，其中该部分与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性，比如与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性。

4.根据任一项前述权利要求所述的分离的蛋白质，其由不超过500个氨基酸残基组成。

5.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或SEQ IDNO：13的氨基酸序列。

6.一种核酸，其包含编码根据权利要求1-5中任一项所述的分离的蛋白质的序列。

7.一种分离的蛋白质，其包含与SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的90-200个氨基酸残基的部分，其中该对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基不是Arg、Lys或His，或一种编码该分离的蛋白质的核酸，用于作为药物使用。

8.根据权利要求7所述使用的分离的蛋白质或核酸，其中该对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu、Asp、Gln和Asn组成的组。

9.根据权利要求8所述使用的分离的蛋白质或核酸，其中该对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组。

10.根据权利要求9所述使用的分离的蛋白质或核酸，其中该对应于SEQ ID NO：1中的位置221的氨基酸残基是Glu。

11.根据权利要求7-10中任一项所述使用的分离的蛋白质或核酸，其中该部分与SEQID NO：7具有至少80％同一性，比如与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性。

12.根据权利要求7-11中任一项所述使用的分离的蛋白质或核酸，其由不超过500个氨基酸残基组成。

13.根据权利要求7所述使用的分离的蛋白质或核酸，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

14.根据权利要求7-13中任一项所述的分离的蛋白质或核酸，用于在治疗阿尔茨海默病中使用。

15.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求7-13中任一项所述的分离的蛋白质或核酸。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，用于作为药物使用。

17.根据权利要求15所述的药物组合物，用于在治疗阿尔茨海默病中使用。

18.根据权利要求7-13中任一项所述的分离的蛋白质或核酸用于制造用于治疗阿尔茨海默病的药物的用途。

19.一种治疗有需要的哺乳动物，包括人类，的阿尔茨海默病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求7-13中任一项所述的分离的蛋白质或核酸或根据权利要求15所述的药物组合物。