CN115927664A - 一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用 - Google Patents
一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物，所述引物为3条2对引物，分别为F1、F2和R，F1序列如SEQ ID NO:1所示，F2序列如SEQ ID NO:2所示，R序列如SEQ ID NO:3所示。本发明还公开了所述引物在快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型中的应用。本发明通过这3条2对引物的设计和实验方法，能够快速、高通量地鉴别irf2bpl突变系斑马鱼的基因型，当天即可判断基因型，并可同时进行多个样本检测，成本较低，准确度高，能有效提高irf2bpl突变系斑马鱼的筛选效率。本发明较之Sanger测序的方法，更加省时省力，且节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因分子鉴定技术领域，具体涉及一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用。
背景技术
斑马鱼相较于人类有85％疾病基因组相似度以及各项生理过程高度保守，是研究人类疾病的一个很有吸引力的动物模型。在前期的癫痫患者的全外显子组测序(WES)结果中，筛选到可能引起癫痫疾病的基因IRF2BPL(基因编号为：Gene ID:64207)，并随后构建了irf2bpl基因敲除斑马鱼癫痫模型(CN115058424A)。该斑马鱼癫痫模型具有一定潜在的科研和医疗价值，有望用于研究IRF2BPL突变与癫痫发病机制的关系及后续抗癫痫药物筛选。因此，有必要将该基因敲除斑马鱼建系和扩繁，而对该突变系斑马鱼的筛选工作则显得尤为重要。
前期构建的irf2bpl基因敲除斑马鱼突变形式为缺失7bp，基于Sanger测序的传统基因型鉴定方式比较费时费力，需要将每个包含突变位点序列的测序结果一一解读才能判断基因型。因此，有必要开发一种更加省时省力的基因型鉴定方法。
发明内容
本发明提供了一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物，所述引物为3条2对引物，分别为F1、F2和R，F1序列如SEQ ID NO:1所示，F2序列如SEQ IDNO:2所示，R序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明第二方面提供了上述引物在快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型中的应用。
进一步地，包括如下步骤：以同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组为模板，使用两个PCR扩增体系进行PCR扩增反应，其中第一个PCR扩增体系为F1和R，第二个PCR扩增体系为F2和R；PCR扩增反应结束后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳结束后利用凝胶成像系统进行拍照，得出电泳图谱结果进行判断基因型：如果F1和R扩增出条带而F2和R没有扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为野生型；如果F1和R没有扩增出条带而F2和R扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为纯合突变体；如果F1和R扩增出条带，同时F2和R也扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为杂合子。
更进一步地，PCR扩增体系中：上游引物F1或F2加入1μL，下游引物R加入1μL，2×Rapid Taq Master Mix加入10μL，ddH2O加入7μL，模板DNA加入1μL，总反应体系为20μL体系。
更进一步地，PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min；35个循环：变性95℃15s，退火56℃15s，延伸72℃15s；再72℃7min。
本发明的有益效果：
本发明通过分析irf2bpl突变体与野生型序列的不同，设计筛选了3条2对引物，对同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组模板进行2个PCR体系扩增，从PCR产物中得到野生型等位基因片段或/和突变型等位基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，从而判断该基因组模板对应的斑马鱼的基因型：野生型、纯合突变体和杂合子。通过这3条2对引物的设计和实验方法，能够快速、高通量地鉴别irf2bpl突变系斑马鱼的基因型，当天即可判断基因型，并可同时进行多个样本检测，成本较低，准确度高，能有效提高irf2bpl突变系斑马鱼的筛选效率。本发明较之Sanger测序的方法，更加省时省力，且节约成本。
附图说明
图1为irf2bpl野生型等位基因、突变型等位基因部分序列，F1、F2和R引物位置及序列。
图2为F3、F4和F5引物位置及序列。
图3为F5和R扩增体系扩增结果电泳图。
图4为16尾irf2bpl F2代基因型鉴定电泳图。
图5为2号斑马鱼(irf2bpl F2代斑马鱼野生型)测序峰图。
图6为4号斑马鱼(irf2bpl F2代斑马鱼纯合突变体)测序峰图。
图7为1号斑马鱼(irf2bpl F2代斑马鱼杂合子)测序峰图。
具体实施方式
实施例1
1)设计引物，前期构建的irf2bpl基因敲除斑马鱼的突变形式为在第1号外显子上缺失7bp，如图1所示，突变等位基因的部分序列为“ACGGAGCCCGTGTGCAGGGGTTGCGT-------GAGGGCGCGGAT”，其中“-”表示缺失，缺失的序列为“GAATTAC”。先确定上游引物设计在突变位置上，下游引物设计在距离上游引物约370bp的位置上。
上游引物设计两条，第一条为F1，第二条为F2，下游引物设计一条，为R，如图1。引物F1和R能够扩增野生型等位基因片段，而不能扩增突变型等位基因片段；引物F2和R能够扩增突变型等位基因片段，而不能扩增野生型等位基因片段。通过这3条2对引物对同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组模板进行扩增，以此来达到鉴定基因型的目的。其中F1的序列为：“GCAGGGGTTGCGTGAATTAC”(5’→3’)，该引物的3’端位于突变位点里面，使用该引物和R引物进行PCR扩增时，只会结合到野生型等位基因上并延伸；而对于突变型等位基因，该引物的3’端不能与之碱基互补配对而不会产生扩增。F2的序列为：“TGTGCAGGGGTTGCGTGAG”(5’→3’)，该引物跨过突变序列，且与突变位点之后的3个碱基能够碱基互补配对，使用该引物和R引物进行PCR扩增时，只会结合到突变型等位基因上并延伸；而对于野生型等位基因，该引物的3’端不能与之碱基互补配对而不会产生扩增。R引物的序列为“TCGGGCTCTGTCGGTTAAGC”(5’→3’)。
2)上游引物第二条，我们同时还设计了F3、F4和F5，如图2。F3的序列为：“TGTGCAGGGGTTGCGTG”(5’→3’)，该引物3’端跨过突变序列，且与突变位点之后的1个碱基能够碱基互补配对，但是突变序列第一个碱基恰巧为“G”，因此该引物不能达到只扩增突变等位基因的效果；F4的序列为“TGTGCAGGGGTTGCGTGA”(5’→3’)，该引物3’端跨过突变序列，且与突变位点之后的2个碱基能够碱基互补配对，但是突变序列第一二个碱基恰巧为“GA”，因此该引物也不能达到只扩增突变等位基因的效果；F5的序列为“TGTGCAGGGGTTGCGTGAGG”(5’→3’)，该引物3’端跨过突变序列，且与突变位点之后的4个碱基能够碱基互补配对，但经过实验测试，使用该引物和R的扩增体系，无论以野生型基因组为模板还是以纯合突变体基因组为模板，扩增结果均显示有较多非特异性扩增，如图3，M为DNA maker，从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp，1号泳道对应的模板为野生型基因组，2号泳道对应的模板为纯合突变体基因组。
3)上述确定了F1、F2和R引物，对于同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组模板，使用两个PCR扩增体系进行PCR扩增，其中第一个PCR扩增体系为F1和R，第二个PCR扩增体系为F2和R。PCR扩增体系中：上游引物F1或F2加入1μL，下游引物R加入1μL，2×Rapid TaqMaster Mix(诺唯赞P222-01)加入10μL，ddH2O加入7μL，模板DNA加入1μL，总反应体系为20μL体系。
取16尾irf2bpl F2代斑马鱼(由irf2bpl F1代杂合子斑马鱼自交得到)，并使用碱裂解法提取基因组DNA，按照上述反应体系配置PCR体系，震荡混匀之后离心，将液体收集，于PCR仪上进行PCR扩增反应。PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃15s，退火56℃15s，延伸72℃15s)35个循环，再72℃7min。
4)待上述PCR扩增反应结束后，离心PCR扩增产物，取3μL样品点样于1wt％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳时电压为150V，电泳时间为20min。
5)上述电泳结束后，用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶拍照，得出电泳图谱如图4所示。对电泳图谱结果进行判断基因型：如果F1和R扩增出条带而F2和R没有扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为野生型；如果F1和R没有扩增出条带而F2和R扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为纯合突变体；如果F1和R扩增出条带，同时F2和R也扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为杂合子。因此，图4中野生型斑马鱼为2、3、5、8、9、10和16号；纯合突变斑马鱼为4、11和12号；杂合子为1、6、7、13和14号。其中15号对应的泳道均没有条带，原因可能是模板未成功提取到。
6)为了证明以上3条2对引物鉴定基因型的准确性，我们在突变位点上下游额外设计引物，目的是将该引物扩增出来的产物送测序，来验证基因型。上游引物irf2bpl-F序列为：“CATTCGCCTCCTAGTAACCGT”(5’→3’)，下游引物irf2bpl-R序列为：“CCACATGGTTCATCTGCACAG”(5’→3’)，目的片段长度为332bp。我们验证步骤5)中序号为1、2和4的基因型是否分别为杂合子、野生型和纯合突变体。此PCR扩增体系中：上游引物加入1μL，下游引物加入1μL，2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞P222-01)加入10μL，ddH2O加入7μL，模板DNA加入1μL，总反应体系为20μL体系。
配置完毕PCR体系，震荡混匀之后离心，将液体收集，于PCR仪上进行PCR扩增反应。PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃15s，退火56℃15s，延伸72℃15s)35个循环，再72℃7min。PCR扩增反应完成后将PCR扩增产物寄送到商业公司(南京擎科生物科技有限公司)进行sanger测序，测序均采用下游引物。
2号泳道对应的测序结果如图5，虚线方框部分表示突变体中缺失的7bp序列。
4号泳道对应的测序结果如图6，可见，序列中缺少了序列“GTAATTC”(“GAATTAC”的反向序列)。
1号泳道对应的测序结果如图7，图7中“GCGCCCTC”之后出现双峰，由图5野生型斑马鱼部分序列为：“GCGCCCTCGTAATTC”，通过读取双峰，然后与野生型斑马鱼部分序列进行比对，确认该泳道对应的斑马鱼为杂合子。
由图5、图6和图7可知，2号、4号和1号对应的斑马鱼分别为野生型、纯合突变体和杂合子，与以上3条2对引物鉴定结果一致。因此，本发明3条2对引物鉴定的准确性得到验证。
Claims (5)
1.一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物，其特征在于，所述引物为3条2对引物，分别为F1、F2和R，F1序列如SEQ ID NO:1所示，F2序列如SEQ ID NO:2所示，R序列如SEQ ID NO:3所示。
2.权利要求1所述引物在快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：以同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组为模板，使用两个PCR扩增体系进行PCR扩增反应，其中第一个PCR扩增体系为F1和R，第二个PCR扩增体系为F2和R；PCR扩增反应结束后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳结束后利用凝胶成像系统进行拍照，得出电泳图谱结果进行判断基因型：如果F1和R扩增出条带而F2和R没有扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为野生型；如果F1和R没有扩增出条带而F2和R扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为纯合突变体；如果F1和R扩增出条带，同时F2和R也扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为杂合子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增体系中：上游引物F1或F2加入1μL，下游引物R加入1μL，2×Rapid Taq Master Mix加入10μL，ddH2O加入7μL，模板DNA加入1μL，总反应体系为20μL体系。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min；35个循环：变性95℃15s，退火56℃15s，延伸72℃15s；再72℃7min。
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