CN115927373A - 一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体具有第490位G→A的突变。根据本发明提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用，首次提出了一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，本发明提出的提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体植株，烟叶中烟碱含量比对照提高约58%，使烟叶的烟碱含量显著提高，降低了烟碱原料生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程技术领域，更具体地，涉及一种提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体及其应用。
背景技术
烟碱是栽培烟草烟叶中重要的特征性化合物，占烟草总生物碱的95%左右。随着国内细支烟、新型烟草如电子烟市场的迅速发展，烟草工业对高烟碱含量烟叶的需求日益迫切。过去的研究表明：
NtMYC2a基因是烟碱合成调控中的正调控因子。其氨基酸序列中含有一个JID结构域，烟碱合成负调控因子JAZ蛋白与该结构域互作而抑制NtMYC2a正调控烟碱合成的功能。利用生物技术手段提高烟草烟叶烟碱含量，对于生产高烟碱烟叶、降低烟碱的生产成本有重要意义。
发明内容
本发明主要目的在于获得提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体，在此基础上，提供提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体的应用，用于提高烟草植株的烟叶烟碱含量。
本发明采用如下技术方案实现。
本发明的第一个目的在于，提供一种提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体，所述提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的
NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体具有第490位 G→A的突变，使该基因编码蛋白质序列第164位氨基酸由天冬氨酸转变成天冬酰胺。
本发明中，
NtMYC2a基因CDS 490位的G突变为A，造成天冬氨酸转变成天冬酰胺。该突变在现有文献中并未被提到，更没有任何关于该突变能提高云烟87烟草植株烟叶烟碱含量的报道；且发明人发现，该突变能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量。
进一步地，所述提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体编码的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明的第二个目的在于，
NtMYC2a基因突变体应用于提高烟叶烟碱含量，所述提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体在获得烟叶烟碱含量提高的烟草植株中的应用。
NtMYC2a基因突变体的制备方法如下，该制备方法包括EMS诱变烟草种子和TILLING筛选烟草突变体；
EMS诱变烟草种子：
（1）：选用58% 漂白水处理云烟87种子6 分钟，离心滤干，待用；
（2）：将步骤（1）中漂白处理后的云烟87种子利用去离子水对种子进行漂洗1 分钟，离心滤干去除漂白水成分；
（3）：在室温条件下，去离子水浸泡步骤（2）中得到的去除漂白水成分并滤干的烟草种子12 小时，离心滤干；
（4）：在室温条件下，0.5% EMS（甲基磺酸乙酯）处理步骤（3）中得到的烟草种子12小时，离心滤干；
（5）：将步骤（4）中得到的烟草种子加入去离子水漂洗1 分钟，离心滤干，重复漂洗８次；然后使用布氏漏斗滤纸过滤干燥，得到诱变处理后的M1代种子。
TILLING筛选核苷酸变化的突变体：
（6）：将步骤（5）中得到的诱变处理后的M1代烟草种子播种于大田，单株套袋自交收种获得M2代，每个M1代单株收获的M2代种子播种1粒种子，得到多株M2代突变体单株；
（7）：取步骤（6）中得到的多株M2代突变体单株叶片，利用QIAGEN DNA提取试剂盒提取叶片DNA，得到多个样品；
（8）：样品浓度测定及建池：将多个样品按照顺序大小排列，分别取2ul DNA样品在16通道 Tecan infinite M200仪器上进行浓度测定；将所有的样品浓度稀释至40ng/ul，制作8倍DNA池用于TILLING分析。
（9）: 利用Primer3设计
NtMYC2a基因TILLING分析引物，
M3 Til F：CATATTTCAACCAAGAGTCA和M3 Til R：GGTATTCCTTGAAGGAACTG扩增长度为730bp左右。
（10）: TILLING分析 M2代突变体，筛选核苷酸突变的单株，并进行测序验证，获得一个突变体，其CDS 490位的G突变为A，造成天冬氨酸变成天冬酰胺。
（11）: 步骤（10）中获得的突变体植株继续经过自交形成纯合突变体株系。
（12）: 对步骤（11）中得到的纯合突变体株系进行烟碱含量测定，具体为在烟株旺长期，取烟株中部叶片，杀青烘干，检测烟碱含量。
（13）: 含有突变序列的烟草株系相比含有SEQ ID NO:1序列的烟草叶片烟碱含量提高58%左右。
本发明的有益效果为，1、本发明通过系统研究，首次提出了一种提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体，本发明提出的提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体植株，烟叶中烟碱含量比对照提高约58%，使烟叶的烟碱含量显著提高。
2、本发明通过系统研究，利用TILLING技术筛选核苷酸变化的突变体，获得
NtMYC2a基因CDS区 490位的G突变为A，造成天冬氨酸转变成天冬酰胺的突变体，该突变体使烟叶的烟碱含量显著提高，降低了烟碱原料生产成本。
附图说明
图1为突变体突变位点测序峰图。
图2为本发明
NtMYC2a突变体株系myc2a-490与对照云烟87叶片烟碱含量对比示意图。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。
实施例1，本发明提供了一种提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体。根据本发明的实施例，提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的野生型
NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体具有CDS 490位的G转变为A的突变，使该基因编码蛋白质序列第164位氨基酸由天冬氨酸转变成天冬酰胺。
以云烟87为例，野生型的
NtMYC2a基因的cDNA序列如下所示（SEQ ID NO：1）。
本发明的
NtMYC2a基因突变体，在上述野生型云烟87 序列的加框处由碱基G突变为A（SEQ ID NO：3）。该位点的单核苷酸改变导致NtMYC2a蛋白第164位氨基酸由天冬氨酸转变成天冬酰胺（SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4）。
研究发现，该突变体与烟草植株的烟叶烟碱含量密切相关，从而利用该突变体，获得烟叶烟碱含量高的烟草株系；根据本发明的实施例，该突变体的核酸为培育高烟碱烟草品种提供基因资源，降低烟碱原料生产成本。
实施例2，请参考图1，根据本发明的第二方面，提出了
NtMYC2a突变体的制备方法,具体制备方法包括以下步骤：
1、烟草种子EMS诱变
（1）、选用58% 漂白水处理云烟87种子6 分钟，离心滤干，待用；
（2）、将步骤（1）中漂白处理后的云烟87种子利用去离子水对种子进行漂洗1 分钟，离心滤干去除漂白水成分；
（3）、在室温条件下，去离子水浸泡步骤（2）中得到的去除漂白水成分并滤干的烟草种子12 小时，离心滤干；
（4）、在室温条件下，0.5% EMS（甲基磺酸乙酯）处理步骤（3）中得到的烟草种子12小时，离心滤干；
（5）、将步骤（4）中得到的烟草种子加入去离子水漂洗1 分钟，离心滤干，重复漂洗８次；然后使用布氏漏斗滤纸过滤干燥，得到诱变处理后的M1代种子。
2、TILLING筛选核苷酸变化的突变体。通过分析
NtMYC2a基因，我们筛选云烟87EMS突变体库，获得一个
NtMYC2a基因突变的植株；
（6）、将步骤（5）中得到的诱变处理后的M1代种子播种于大田，单株套袋自交收种获得M2代。
（7）、取骤（6）中得到的M2代突变体单株叶片作为样品，进行DNA基因组提取；
具体步骤为：将样品用液氮研磨，并用1.5ml离心管收取；在离心管中加入400ul的AP1溶液，4ul的RNA酶混匀；把具有上述样品的离心管放入65℃水浴锅水浴10min，期间摇匀3次；加入130ul P3溶液，冰浴5mim；13200rpm高速离心5min，取上层液倒入紫色过滤柱，13200rpm离心2min；将滤液转入新的1.5mL离心管并加入675ul AW1溶液混匀；把混匀样品溶液分2次转入淡黄色过滤柱，10000rpm离心1min，弃除滤液；把淡黄色过滤柱放入新的2ml离心管中并加入500ul AW2溶液，10000rpm离心1min，弃滤液 (此步骤重复两次)；继续将淡黄色过滤柱进行空转（10000rpm，1min），随后放入新的1.5ml离心管中加入50ul AE溶液，静置5min，10000rpm离心1min，收集过滤液，所收集到的滤液即为基因组DNA，将收集到的滤液放入4℃冰箱保存。
（8）、样品浓度测定及建池
分别取2ul DNA基因组的滤液样品在16通道 Tecan infinite M200仪器上进行浓度测定。将已知浓度的所有滤液样品分别将浓度稀释至40ng/ul，构成8倍DNA池。
（9）、TILLING分析 M2代突变体：
利用Primer3设计
NtMYC2a基因TILLING分析引物，设计的扩增用引物序列如下：
M3 Til F：CATATTTCAACCAAGAGTCA和M3 Til R：GGTATTCCTTGAAGGAACTG。
（10）、以步骤（8）中所构成8倍DNA池为模板，利用步骤（9）中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为
NtMYC2a的730bp长度的基因组片段；扩增产物通过毛细管电泳进行分析；
上述扩增体系为：1.0µl 10×buffer，0.8µl dNTP(2.5mM)，0.16 µl M3 Til Fprimer(10µM)，0.16µl M3 Til R primer (10uM)，6.78 µl H2O，1.0 µl DNA模板 (20ng/ul)。反应程序为95℃ 3min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃30s，30个循环，72℃10min，4℃保存。
（11）、通过步骤（10）分析后，筛选出核苷酸突变的单株，进行测序验证，获得一个M2代突变体，该突变体
NtMYC2a基因CDS 490位的G突变为A，造成天冬氨酸转变成天冬酰胺。该突变体自交获得M3代突变体。
（12）、在M3代突变体中经过测序筛选突变位点纯合的植株，自交收种。随后继续进行自交，形成烟草株系myc2a-490，突变位点序列如图1所示。
实施例3，请参考图2，本发明的另一方面在于提高烟叶烟碱含量的
NtMYC2a基因突变体在获得烟叶烟碱含量提高的烟草植株中的应用。
具体为：
（1）对突变体株系进行田间试验，即，在田间种植突变体株系及对照野生型云烟87，在烟株旺长期，取烟株中部叶片，杀青烘干；利用YC/T383-2010的方法检测烟叶烟碱含量。
（2）如图2所示，经对烟叶烟碱含量进行检测，含有突变序列的烟草株系myc2a-490的烟碱相比含有SEQ ID NO:1序列的云烟87烟草植株叶片烟碱含量提高58%左右。
SEQ ID NO：1
ATGACGGATTATAGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACTACATCCGATGATAATATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGCCCGGAACAACTACTACACCAACTCCCCGGAGTTCAGTTTCTCCAGCGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCTATGCCATATTTCAACCAAGAGTCACTGCAACAGCGACTCCAGACTTTAATCGATGGGGCTCGCGAAGGGTGGACGTATGCCATATTTTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCGCGAGCCCCTCGGTTTTGGGGTGGGGAGATGGGTATTATAAAGGTGAAGAAGATAAAAATAAGCGTAAAACGGCGTCGTTTTCGCCTGACTTTATCACGGAACAAGCACACCGGAAAAAGGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACCGGTGGTGAAAATGATGCTGTAGATGAAGAAGTAACTGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCCATGACACAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCGATGTATAGTTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAACAGAGAGATTAGCTGTTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATTGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGACTGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAGTTTTGTTTAATTTTAATATTGATATGGGTGCGACTACGGGCTCAGGATCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCCGAGCCCGATCCTTCAGCCCTTTGGCTGACTGATCCGGCTTCTTCAGTTGTGGAAGTCAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGGAATACCAGTAAGCAACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGGTAATCAAAATTCTCAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAATATGGATTTGATGGAAGTAATACTCGGTATGGAAATGGGAATGCGAATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTGAGTCTGGTGAAATCTTGAATTTTGGTGATAGTACTAAGAGGAGTGCTTGCAGTGCAAATGGGAGCTTGTTTTCGGGCCAATCACAGTTCGGGCCCGGGCCTGCGGAGGAGAACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCAACGATGAAGGAATCCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATTTTGCCAAGTTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCAATCAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGAGTTGTAGACCCCGAGAAGAAGCCGAGGAAACGAGGGAGGAAACCGGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGAGACAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAGCTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGGTGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAATTCTGACTCAGATAAAGAGGACTTGAGGAACCAAATCGAATCTTTAAGGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCCCCGTCAAATCAAGAACTCAAGATTGTAGATATGGACATCGACGTTAAGGTGATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAGAACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGACCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACTGTGAAAATGGGAAGCCGGCTTTACACGCAAGAACAACTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATGA
SEQ ID NO：2
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SEQ ID NO：3
ATGACGGATTATAGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACTACATCCGATGATAATATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGCCCGGAACAACTACTACACCAACTCCCCGGAGTTCAGTTTCTCCAGCGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCTATGCCATATTTCAACCAAGAGTCACTGCAACAGCGACTCCAGACTTTAATCGATGGGGCTCGCGAAGGGTGGACGTATGCCATATTTTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCGCGAGCCCCTCGGTTTTGGGGTGGGGAGATGGGTATTATAAAGGTGAAGAAGATAAAAATAAGCGTAAAACGGCGTCGTTTTCGCCTGACTTTATCACGGAACAAGCACACCGGAAAAAGGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACCGGTGGTGAAAATGATGCTGTAAATGAAGAAGTAACTGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCCATGACACAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCGATGTATAGTTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAACAGAGAGATTAGCTGTTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATTGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGACTGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAGTTTTGTTTAATTTTAATATTGATATGGGTGCGACTACGGGCTCAGGATCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCCGAGCCCGATCCTTCAGCCCTTTGGCTGACTGATCCGGCTTCTTCAGTTGTGGAAGTCAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGGAATACCAGTAAGCAACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGGTAATCAAAATTCTCAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAATATGGATTTGATGGAAGTAATACTCGGTATGGAAATGGGAATGCGAATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTGAGTCTGGTGAAATCTTGAATTTTGGTGATAGTACTAAGAGGAGTGCTTGCAGTGCAAATGGGAGCTTGTTTTCGGGCCAATCACAGTTCGGGCCCGGGCCTGCGGAGGAGAACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCAACGATGAAGGAATCCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATTTTGCCAAGTTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCAATCAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGAGTTGTAGACCCCGAGAAGAAGCCGAGGAAACGAGGGAGGAAACCGGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGAGACAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAGCTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGGTGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAATTCTGACTCAGATAAAGAGGACTTGAGGAACCAAATCGAATCTTTAAGGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCCCCGTCAAATCAAGAACTCAAGATTGTAGATATGGACATCGACGTTAAGGTGATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAGAACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGACCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACTGTGAAAATGGGAAGCCGGCTTTACACGCAAGAACAACTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATGA
SEQ ID NO：4
MTDYRIPTMTNIWSNTTSDDNMMEAFLSSDPSSFWPGTTTTPTPRSSVSPAPAPVTGIAGDPLKSMPYFNQESLQQRLQTLIDGAREGWTYAIFWQSSVVDFASPSVLGWGDGYYKGEEDKNKRKTASFSPDFITEQAHRKKVLRELNSLISGTQTGGENDAVNEEVTDTEWFFLISMTQSFVNGSGLPGLAMYSSSPIWVTGTERLAVSHCERARQAQGFGLQTIVCIPSANGVVELGSTELIFQTADLMNKVKVLFNFNIDMGATTGSGSGSCAIQAEPDPSALWLTDPASSVVEVKDSSNTVPSRNTSKQLVFGNENSENGNQNSQQTQGFFTRELNFSEYGFDGSNTRYGNGNANSSRSCKPESGEILNFGDSTKRSACSANGSLFSGQSQFGPGPAEENKNKNKKRSPASRGSNDEGILSFVSGVILPSSNTGKSGGGGDSDQSDLEASVVKEADSSRVVDPEKKPRKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNVSKMDKASLLGDAIAFINELKSKVQNSDSDKEDLRNQIESLRNELANKGSNYTGPPPSNQELKIVDMDIDVKVIGWDAMIRIQSNKKNHPAARLMTALMELDLDVHHASVSVVNELMIQQATVKMGSRLYTQEQLRISLTSRIAESR
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (4)
1.一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，其特征在于：所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体具有第490位 G→A的突变。
2.根据权利要求1所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，其特征在于，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，其特征在于，所述NtMYC2a基因突变体编码蛋白质序列第164位氨基酸为天冬酰胺。
4.权利要求1或2或3所述的NtMYC2a基因突变体在于提高烟草植株中的烟叶烟碱含量的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202210939781.5A CN115927373B (zh) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN115927373B CN115927373B (zh) | 2024-05-28 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN106636136A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-05-10 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种NtHMA2基因突变体与应用 |
| WO2018222667A1 (en) * | 2017-05-31 | 2018-12-06 | 22Nd Century Limited, Llc | Genome editing methods for producing low-nicotine tobacco products |
| CN110643616A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-01-03 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用 |
| WO2021205000A2 (en) * | 2020-04-09 | 2021-10-14 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Method |
-
2022
- 2022-08-05 CN CN202210939781.5A patent/CN115927373B/zh active Active
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
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| 郑淑心 等: "高烟碱K326定向改良材料的创制与分析", 《烟草科技》, pages 1 - 8 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115927373B (zh) | 2024-05-28 |
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