CN115919902A - 细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，提供细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途。本发明调节肠道稳态产品能上调有益微生物群、避免肠道机会性病原体大量繁殖；转移到派氏结激活黏膜免疫球蛋白A反应，调节肠道免疫稳态；进入肠上皮细胞刺激紧密连接和粘液的表达来维持肠屏障的完整性，以此逆转肠道生态紊乱。所述调节肠道稳态产品通过降低病原体丰度、维持免疫稳态和增强肠上皮紧密连接所构成的肠道稳态改善葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎症状和病理表现。所述调节肠道稳态产品还通过维持有益的肠道微生物结构克服肿瘤免疫治疗中对PD‑1阻断的耐药性。

Description

细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途。

背景技术

肠道微生物群已成为维持肠道和全身稳态的关键因素。在肠道生态系统中，由于存在上皮屏障，微生物与宿主通讯很少通过直接的细胞-细胞接触来介导。大量研究表明，细菌代谢物可以介导微生物与宿主的相互作用。例如，梭菌产生的丁酸盐可刺激结肠调节性T细胞，从而抑制宿主炎症反应。肠道微生物组修饰的胆汁酸已被证明能够调节肝脏肿瘤中自然杀伤T细胞的积累。毫无疑问，肠道微生物群与宿主之间错综复杂的串扰是多向和互惠的，这意味细菌分泌的具有最佳特征的衍生物可能参与了它们的相互作用。革兰氏阴性菌在生长过程中通常会释放外膜囊泡(OMV)。OMV是一种双层膜纳米结构，大小从20到400nm不等，含有核酸、蛋白质、酶和脂多糖等多种亲本成分。因为具备这些特性，OMV可能在微生物-微生物和宿主-微生物相互作用中发挥关键作用。最近的研究强调了由致病菌和工程共生细菌产生的OMV在穿越宿主屏障后引发的免疫刺激反应。尽管OMV的生物功能扩展到运输活性物质和防御外膜作用的压力因素，例如噬菌体捕食和抗菌剂的入侵，但其是否可以介导免疫系统单方面防御以外的其他宿主反应仍然知之甚少。人们普遍认为，长期进化促进了肠道微生物群与宿主的先进共生关系。然而，尚未有明确证据表明OMV可以成为有效调节肠道稳态的细胞外机制。因此，有必要提供一种共生细菌衍生的OMV在调节肠道微生物群、粘膜适应性免疫和物理化学屏障来治疗肠道及肠道外疾病的用途。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途，所述用途用于修复肠菌平衡、维持免疫稳态和增强肠道紧密连接所构成的肠道稳态，解决现有技术中目前利用肠道微生物群缓解结肠炎使用活细菌移植，以及尚未有通过维持肠道稳态来增强针对结直肠癌的抗PD-1免疫疗法的产品的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途。

优选地，所述调节肠道稳态产品为治疗肠炎产品或肿瘤治疗增强剂。

优选地，所述细菌外膜囊泡为通过革兰氏阴性菌制备得到。

本发明还提供一种调节肠道稳态的药物组合物，所述产品包含细菌外膜囊泡以及药学上可接受的载体或辅料。

一些具体实施方式中，所述细菌外膜囊泡为来自嗜黏蛋白阿克曼菌、巨单胞菌、考拉杆菌、拟杆菌、脱硫弧菌、普氏栖粪杆菌中的一种或多种产生的细胞外膜囊泡。

本发明还提供细菌外膜囊泡在制备以下任一产品中的用途：

1)增加肠道益生菌或共生细菌的相对丰度的产品；

2)降低导致肠道微生物群生态失调的细菌的相对丰度的产品；

3)促进益生菌的增殖的产品；

4)引发粘膜免疫调节反应的产品；

5)修复肠上皮物理化学屏障的产品；

6)减轻肠道生态紊乱表现的产品。

如上所述，本发明的细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途，具有以下有益效果：

1.本发明提供细菌外膜囊泡的用途能上调有益微生物群、避免肠道机会性病原体大量繁殖；

转移到派氏结激活黏膜免疫球蛋白A反应，调节肠道免疫稳态；进入肠上皮细胞刺激紧密连接和粘液的表达来维持肠屏障的完整性，以此逆转肠道生态紊乱。

2.本发明提供细菌外膜囊泡的用途通过肠菌平衡修复、免疫稳态维持和紧密连接增强所构成的肠道稳态改善葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎的症状和病理表现；

3.本发明提供细菌外膜囊泡的用途通过维持有益的肠道微生物结构可以克服肿瘤免疫治疗中对PD-1阻断的耐药性。

附图说明

图1为肠道微生物群的调节。a-e肠道微生物群的16S核糖体RNA基因测序分析：DSS处理的小鼠每天用含有20μg总蛋白的100μl Akk OMV悬浮液灌胃5天，然后安乐死取样。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的健康小鼠和DSS小鼠分别用作对照；a稀疏曲线(上图)和香农曲线(下图)；b细菌属和c拟杆菌属的物种分布；d产酸拟杆菌(B.acidifaciens)和e多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)的相对丰度；f，g Akk OMV和拟杆菌属物种之间的相互作用:将50μl对数期细菌溶液和100μl Akk OMV悬浮液再1ml培养基中在37℃下共同孵育。用PBS培养的细菌用作对照；f拟杆菌孵育指定时间点后的3D共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像和流式细胞术直方图，比例尺：25μm；g通过记录600nm处的OD值来测量细菌生长曲线，数据是平均值±平均值的标准误差(SEM)；使用t检验或双向ANOVA检验评估显著性，给出p值，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图2为黏膜免疫反应的调节。a IVIS图像的小鼠派氏结(PP)(上图)和肠系膜淋巴结(MLN)(下图)。在肠内注射(将PP定位的肠段两端绑住)25μl Cy5.5标记的Akk OMV(0.1mg/ml)或PBS后2和4小时观察PP和MLN中的Akk OMV富集情况；与0.1mg/ml Akk OMV或PBS在37℃下孵育24小时后，b骨髓来源树突状状细胞(BMDC)的CLSM图像；c流式细胞术分析(左图)BMDC的CD80+百分比(右图)，Cy5.5标记的OMV用于CLSM和流式细胞术测量，比例尺：10μm；d-i每天给小鼠口服管饲含有20μg总蛋白或PBS的100μlAkk OMV悬浮液5天后，肠道紊乱小鼠的肠道粘膜免疫反应；d PP中CD80+DC的百分比；e PP中B细胞(B220+CD138-)和浆细胞(B220-CD138+)的代表性流式细胞仪散点图(左图)以及B细胞百分比(右图)；f PP中CD69+B细胞和IgA+浆细胞的定量分析；g肠道中的IgA浓度；h流式细胞仪直方图和IgA+粪便细菌的定量，裸细菌用作对照；i定量分析MLN中IFN-γ+CD4+T细胞、IL-4+CD4+T细胞、IL-17+CD4+T细胞，以及IL-4+/IFN-γ+CD4+T细胞和FOXP3+CD25+/IL-17+CD4+T细胞；数据是平均值±SEM，使用t检验评估显着性，给出p值，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图3为维持肠道物理化学屏障。a-d每日口服含有20μg总蛋白或PBS的100μl AkkOMV混悬液5天后对DSS诱导的小鼠的肠道理化屏障修复进行评估；a近端结肠的阿新蓝染色图像，黑色和黄色箭头分别代表具有病理空腔的杯状细胞和增厚的粘液层，比例尺：600μm；b肠上皮中杯状细胞的百分比；c肠上皮细胞摄取Ak k OMV的3D CLSM图像，红色荧光表示Cy5.5标记的Akk OMV，比例尺：50μm；d近端结肠上皮细胞上表达的紧密连接ZO-1和occludin的免疫荧光图像，比例尺：20μm；e、f在37℃下用0.1mg/ml Akk OMV和5μg/ml LPS和Caco-2细胞共同培养，处理24小时后对对紧密连接蛋白进行评估；Cy5.5标记的OMV用于CLSM；e CLSM和f免疫荧光图像，比例尺：25μm；g通过酶联免疫吸附测定法测量结肠组织中白介素(IL)-10、IL-13和血管紧张素转化酶(ACE)2以及血清中干扰素(IFN)-γ和C-反应蛋白(CRP)细胞因子水平，在用Akk OMV或PBS处理后，从DSS小鼠中收集样品；数据是平均值±SEM，使用t检验评估显着性，给出p值，*p<0.05。

图4为改善DSS诱导的结肠炎的治疗价值。连续五天给DSS诱导的结肠炎小鼠口服灌胃含有20μg总蛋白的100μl Akk OMV悬浮液，然后安乐死以评估疗效，用10⁸CFU的Akk和PBS处理的DSS小鼠分别用作对照；a治疗期间的体重波动；b治疗后的平均结肠长度(左图)和从盲肠到直肠切除的结肠组织的数码照片(右图)，比例尺：1厘米。c近端结肠的代表性髓过氧化物酶(MPO)染色图像(左图)和MPO阳性细胞的定量分析(右图)，黑色箭头代表MPO阳性细胞，比例尺：100μm；d近端结肠的典型苏木精-伊红(H&E)染色图像，绿色、黄色和蓝色箭头分别代表炎症细胞浸润、粘膜水肿、隐窝肿胀和破坏，比例尺：625μm；数据是平均值±SEM，使用单向或双向ANOVA检验评估显着性，给出p值，*p<0.05，****p<0.0001。

图5为结直肠癌(CRC)的治疗价值。在腹膜内每3天注射1次PD-1抗体之前(共3次)，给带有CRC的小鼠服用含有20μg总蛋白的100μl Akk OMVs悬浮液2天，在相同实验条件下用10⁸CFU的Akk和PBS处理的DSS小鼠分别用作对照；a个体肿瘤生长曲线；b肿瘤中PD-L1+细胞、PD-L1+CD45-细胞和PD-L1+CD45+细胞的定量分析；c肿瘤床中PD-L1和CD45浸润的免疫荧光图像，比例尺：50μm；d肿瘤床中CD3和CD8浸润的代表性免疫荧光图像，比例尺：50μm；e肿瘤组织的典型H&E染色图像，比例尺：300毫米；数据是平均值±SEM，使用单向或双向ANOVA检验评估显著性，给出p值，*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

本发明提供细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途。

所述调节肠道稳态产品为治疗肠炎产品。

所述细菌外膜囊泡为通过革兰氏阴性菌制备得到。

所述细菌外膜囊泡的尺寸为20m-400nm。优选地，所述细菌外膜囊泡的平均尺寸为60nm-160nm。

所述革兰氏阴性菌嗜黏蛋白阿克曼菌、巨单胞菌、考拉杆菌、拟杆菌、脱硫弧菌、普氏栖粪杆菌中的一种或多种，优选地，所述革兰氏阴性菌为嗜黏蛋白阿克曼菌。

所述细菌外膜囊泡通过以下任一种或多种方式调节肠道稳态：增加益生菌或共生细菌的相对丰度、选择性地与肠道微生物群中的特定细菌相互作用、降低肠道条件致病性细菌的相对丰度、引发粘膜免疫调节反应、修复肠上皮物理化学屏障或减轻肠道生态紊乱表现中的一种或多种。

所述益生菌或共生细菌选自拟杆菌属、乳杆菌属、另枝菌属、梭状芽胞杆菌属、普雷沃氏菌属、双歧杆菌、嗜乳酸菌或毛螺菌科中的一种或多种。优选地，所述菌属选自拟杆菌属、乳杆菌属、另枝菌属或毛螺菌科中的一种或多种。

进一步地，细菌外膜囊泡可以使肠道中益生菌或共生细菌的相对丰度提高为原来的4-45倍。

所述特性细菌选自产酸拟杆菌(B.acidifaciens)、多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)、多氏拟杆菌(B.dorei)、单形拟杆菌(B.uniformi)、脆弱拟杆菌(B.fragilis)中的一种或多种。

所述导肠道条件致病性细菌选自普通拟杆菌(B.vulgatus)、变形杆菌门的细菌(埃希菌、志贺菌、沙门菌)中的一种或多种。优选地，所述导致肠道微生物群生态失调的细菌选自普通拟杆菌(B.vulgatus)或变形杆菌门的细菌。

进一步地，细菌外膜囊泡可以使导致肠道微生物群生态失调的细菌的相对丰度降低的范围为原来的0.5-0.6。

在一些具体实施方式中，细菌外膜囊泡可以使有益菌种的增殖为PBS对照组的1.3-2.6倍。

进一步地，所述免疫调节反应为免疫球蛋白A(IgA)反应或T细胞反应。

进一步地，所述引发粘膜免疫调节反应为引发派尔斑或肠系膜淋巴结中的一种或多种部位的粘膜免疫调节反应。

在一些具体实施方式中，细菌外膜囊泡可以使免疫球蛋白A(IgA)浓度提升为原来的1.1到2.5倍。

进一步地，修复肠上皮物理化学屏障修复通过如下方式的一种或多种实现：增加杯状细胞数量和/或上调肠上皮细胞中黏蛋白Muc2、紧密连接组分闭合蛋白(Occludin)或紧密连接蛋白ZO-1的表达。

在一些具体实施方式中，细菌外膜囊泡可以使状细胞数量增加为原来的2到10倍。

在一些具体实施方式中，细菌外膜囊泡可以使肠上皮细胞中黏蛋白Muc2、紧密连接组分闭合蛋白(Occludin)或紧密连接蛋白ZO-1的表达上调为原来的1.2-2.0倍。

进一步地，所述减轻肠道生态紊乱表现通过减少炎症细胞浸润、上调抗炎细胞因子和/或下调促炎细胞因子实现。

在一些具体实施方式中，所述炎症细胞为髓过氧化物酶阳性的细胞。细菌外膜囊泡可以使髓过氧化物酶阳性的细胞减少为原来的0.4-0.5。

在一些具体实施方式中，所述抗炎细胞因子选自IL-10、IL-13、中的一种或多种。细菌外膜囊泡可以使抗炎细胞因子提高为原来的1.5-1.8。

在一些具体实施方式中，所述促炎细胞因子选自ACE2、IFN-γ、CRP、IL-1β的一种或多种。和/或，细菌外膜囊泡可以使促炎细胞因子降低为原来的0.2-0.9。

所述肠炎选自放射性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、免疫检查点抑制剂相关性肠炎、抗生素相关性肠炎中的一种或多种。

所述调节肠道稳态产品还为肿瘤治疗增强剂。

所述细菌外膜囊泡通过调节肠道稳态增强肿瘤治疗药物的治疗效果。所述肿瘤治疗药物根据肿瘤的不同而不同，本领域技术人员可以根据实际情况选择。

进一步地，所述细菌外膜囊泡通过调节肠道稳态增强PD-1免疫疗法的治疗效果。

所述针对PD-1免疫疗法包含施用针对PD-1的药物。所述药物选自含有纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗或替雷利珠单抗作为有效成分的药物的一种或多种。

所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞癌、膀胱癌、胆管细胞癌、透明细胞肾癌、前列腺癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、原发性未知癌、胸腺癌、胶质瘤、神经胶质瘤、星型细胞瘤、子宫颈癌、前列腺癌、白血病、骨癌、脑癌、支气管癌、室管膜瘤癌、成视网膜瘤癌、胃癌、胃肠道癌、黑素瘤癌、肾癌、淋巴瘤癌、间皮瘤癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、甲状腺癌、垂体癌、肾癌、唾液腺癌、肉瘤癌和皮肤癌中的一种或多种。

在一些具体实施方式中，细菌外膜囊泡可以使细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)上调为原来的1.2-1.5倍。细菌外膜囊泡可以使CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的浸润扩大为原来的4-10倍。

本发明还提供一种调节肠道稳态的药物组合物。

所述药物组合物包含细菌外膜囊泡。

在一些具体实施方式中，所述细菌外膜囊泡为来自嗜黏蛋白阿克曼菌、巨单胞菌、考拉杆菌、拟杆菌、脱硫弧菌、普氏栖粪杆菌中的一种或多种产生的细胞外膜囊泡。优选地，所述细菌外膜囊泡来自嗜黏蛋白阿克曼菌产生的细胞外膜囊泡。

进一步地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

所述药学上可接受的载体或辅料应当与所述肿瘤饥饿治疗药物的有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子选自透明质酸钠凝胶，糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素或甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸或硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油或可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇或聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液中的一种或多种。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明还提供一种调节肠道稳态的方法，所述调节肠道稳态的方法包括向有需要的受试者施用治疗安全有效量的所述包含细菌外膜囊泡的产品。

所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的。在一些具体实施方案中，所述包含细菌外膜囊泡的产品的施用量依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述双功能化合物的施用量为1～1000mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～200mg/kg/day、200～500mg/kg/day、或大于500mg/kg/day。

本发明还提供细菌外膜囊泡在制备以下任一产品中的用途：

1)增加肠道益生菌或共生细菌的相对丰度的产品；

2)降低导致肠道微生物群生态失调的细菌的相对丰度的产品；

3)促进益生菌的增殖的产品；

4)引发粘膜免疫调节反应的产品；

5)修复肠上皮物理化学屏障的产品；

6)减轻肠道生态紊乱表现的产品。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例一肠道微生物群的调节

为了评估OMVs对肠道微生物群的影响，DSS诱导的小鼠(一种肠道疾病模型)每天通过口服管饲法连续5天给予含有20μg总蛋白的Akk OMVs，并提取结肠内容物通过16S核糖体RNA基因测序进行微生物组成分析。在37℃下与模拟胃液(pH 1.2)孵育4小时后，OMV的大小和数量没有显著变化图1，表明OMV口服摄入后通过胃腔的稳定性令人满意。如图1a(上图)所示，稀疏曲线没有急剧上升，这意味着样本测序量足以进行数据分析，并且OMV处理的小鼠肠道菌群的OTU数量显着大于PBS处理组。OMV治疗小鼠的香农指数也大大增加，与健康对照组相当(图1a，下图)。总体而言，与PBS处理的小鼠相比，OMV处理组在肠道微生物群的丰富度和多样性方面均表现出显著改善。与PBS相比，Akk OMV增加了多种益生菌或共生细菌属的相对丰度，包括拟杆菌属、乳杆菌属和另枝菌属，以及毛螺菌科NK4A136组和毛螺菌科细菌(图1b)。特别是，OMV处理组中拟杆菌属的有益成员显著上调(图1c-e)。B.acidifaciens和B.thetaiotaomicron的相对丰度分别从0.47％±0.16％增加到1.99％±0.44％，0.02％±0.02％到0.64％±0.11％(图1d和e)。据报道，B.acidifaciens通过将免疫球蛋白Ig M转换为IgA并促进肠道IgA的产生来改善粘膜免疫功能，而B.thetaiotaomicron可以通过刺激粘液和IgA的产生以及逆转上皮细胞的损伤来维持肠道屏障功能并改善结肠炎症损害。OMVs还提高了与缓解溃疡性结肠炎和结肠炎相关肿瘤发生相关的Bacteroides stercorirosoris and Bacteroides caecimuris的相对丰度，从0.14％±0.14％到2.21％±0.54％，0.10％±0.01％到0.45％±分别为0.13％。然而，与上述拟杆菌属不同，普通拟杆菌(B.vulgatus)的相对丰度下降，它具有诱导蛋白酶活性依赖性肠道屏障功能障碍和溃疡性结肠炎的能力(图1c)。此外，OMV降低了属于变形杆菌门的细菌的相对丰度(图1b)。变形杆菌门含有大量致病菌，被认为是肠道微生物群中生态失调的微生物特征。这些结果表明，Akk OMV可以通过上调有益细菌，尤其是拟杆菌属物种，同时减少机会性病原体，从而有力地逆转肠道微生物失衡。

我们用Cy5.5共价标记OMV的外膜，并用Hoechst染色内部核酸。选择拟杆菌属的代表性菌株进行验证，包括B.acidifaciens、B.thetaiotaomicron、B.vulgatus和脆弱拟杆菌(B.fragilis)。将对数期的拟杆菌与标记的OMV一起培养，并在指定的时间点收集细菌。CLSM图像显示Akk OMV与这些拟杆菌属细菌均能融合，尽管融合水平因物种而异(图1f)。共孵育1.5h后，B.acidifaciens和B.fragilis被Cy5.5强烈染色，而B.thetaiotaomicron和B.vulgatus则观察到相对较低的荧光信号。这些增殖的拟杆菌中Cy5.5的荧光强度随着共孵育时间的增加而增加，表明Akk OMV被细菌持续摄取。3D CLSM图像显示，共孵育后，这些拟杆菌表面出现Cy5.5荧光信号和细胞内Hoechst荧光信号，表明Akk OMV与拟杆菌的良好融合。为了检查OMV融合的特异性，我们选择了典型的益生菌菌株大肠杆菌Nissle 1917(E.coil)和常见病原菌鼠伤寒沙门氏菌SL1344(S.typhimurium)来研究Akk OMV的摄取。在共同孵育25小时后，也没有观察到鼠伤寒沙门氏菌的荧光信号，而在一些大肠杆菌中观察到微弱的信号，这些证据支持Akk OMV能够优先与特定菌属融合。与CLSM成像的结果非常一致，流式细胞术分析进一步定量证实，与鼠伤寒沙门氏菌相比，这些共生细菌明显与更多的Akk OMV融合(图1f，右图)。我们通过记录600nm处的OD值测量相应的生长曲线，进一步探索了OMV融合对细菌增殖的影响。如图1g所示，Akk OMV显着促进B.acidifaciens、B.thetaiotaomicron和B.fragilis的生长，但对B.vulgatus没有益处，这意味着它们对肠道微生物群中特定菌株的增殖的选择性刺激可以通过与Akk OMV的有效融合来解释。尽管存在相似的OMV融合水平，但对B.vulgatus的生长没有产生有益影响，这表明在肠道紊乱情况下，Akk OMV不能促进潜在机会性拟杆菌属物种的增殖。正如预期，由于OMV融合缺失或低效，在与Akk OMV共孵育后，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的增殖作用可忽略不计。这些数据表明Akk OMV在恢复平衡的肠道微生物结构方面的机制之一是通过选择性融合、直接上调有益物种的增殖。

实施例二黏膜免疫反应的调节

在体内研究中，Cy5.5标记的Akk OMV在直接递送到肠腔后2小时进入PPs并在给药后时间延长至4小时后迁移到MLN(图2a)。这一观察结果促使我们研究OMV是否可以引发粘膜免疫调节反应以调节肠道紊乱。鉴于肠道微生物群可以影响IgA的产生，而初级IgA的产生主要发生在PP中，我们推测Akk OMV的进入可能会诱导IgA反应，这对于肠道免疫屏障防止病原体入侵至关重要。为了分析粘膜免疫反应，在连续5天口服强饲Akk OMV后，从肠道紊乱的小鼠肠道中收集PP和MLN。因为B细胞与PP中上皮下DCs的相互作用是IgA产生所必需的，我们首先分析了Akk OMV在树突状细胞(DC)活化中的作用。正如预期的那样，在OMV给药小鼠的PP中，DC表面的CD80的表达显著增加(图2d)。与BMDC的体外共培养进一步证实AkkOMV能够在被内化后诱导更高的CD80+DC产量(图2b和c)。随后，我们分析了取样PP中B细胞(B220+CD138-)的活化和浆细胞(B220-CD138+)的产生。OMV治疗组显著增加了CD69+B细胞和IgA+浆细胞以及总B细胞的产生，从而将肠道IgA浓度从18.71±1.52增加到29.47±2.73mg/ml(图2e-g)。除了Akk OMV对粘膜IgA反应的直接影响外，改善的肠道微生物结构可能通过上调活化诱导的胞苷脱氨酶(即酸杆菌)和聚合免疫球蛋白受体的表达，将IgM转换为IgA，从而刺激IgA的产生。B.thetaiotaomicron可以将IgA转运穿过上皮细胞运送到肠腔。另一方面，肠腔中的IgA可以通过抗体涂层中和和排除致病菌。事实上，由于IgA的产生增加，OMV处理组中IgA+粪便细菌的数量显著增加(图2h)。这可能是Akk OMV能够降低肠道微生物群中有害病原体相对丰度的另一个原因。此外，肠道共生细菌可以利用IgA进行黏膜定植，这意味着宿主-微生物共生的稳健性可以促进恢复健康的微生物组成。因此，Akk OMV在黏膜IgA反应和肠道微生物群之间的复杂相互作用中发挥了重要的双向作用，可以促进调节肠道稳态的失调。

基于这些发现，我们推断Akk OMV可能同时调节MLN中的细胞免疫反应。以前的研究已经证明，粘膜免疫细胞组成性地探测响应肠道环境，例如，DC捕获抗原以协调T细胞反应。PP中CD80+DC水平的增加启发我们研究MLN中的T细胞反应。流式细胞术分析显示IL-4+/IFN-γ+CD4+T细胞和FOXP3+CD25+/IL-17+CD4+T细胞在从用Akk OMV处理的小鼠收集的MLN中的比率增加(图2i)。T细胞表现出的抗炎表型极化以及MLN中相对较低水平的免疫反应表明Akk OMV可以帮助宿主维持粘膜免疫稳态(图2i)。体内适应性免疫反应的变化可归因于肠道微生物群与其宿主之间进化的共生关系，尽管体外研究显示BMDC与脾脏CD4+T细胞共培养显示出由Akk OMVs直接引发的免疫激活效应。从机制上讲，OMV辅助恢复肠道生物屏障和诱导粘膜IgA反应，可导致能够产生细胞因子风暴的肠道病原体大大减少，能促进最终维持宿主免疫稳态。

实施例三维持肠道物理化学屏障

我们从处理过的小鼠身上采集了近端结肠组织，发现阿尔新蓝染色的样本显示了在OMV处理的小鼠的近端结肠中充满酸性粘液的杯状细胞的显著增加。与PBS给药的肠道紊乱小鼠中具有病理空腔的单个分散杯状细胞相比，OMV治疗小鼠近端结肠中的杯状细胞在数量和功能上都有明显改善，导致肠道中形成更厚的粘液层(图3a)。此外，肠上皮中杯状细胞的百分比从5.11±2.34大幅增加至19.89±3.57(图3b)。Akk OMV修复粘液屏障的显著功效可归因于OMV的内化、刺激杯状细胞产生粘液和OMV介导的有益物种丰度增加(B.thetaiotaomicron促进产生粘液)。

与体型较大的细菌不同，Akk OMV可以穿过粘液层并被肠上皮细胞内化(图3c)，表明OMV可以直接与物理化学屏障产生相互作用。屏障功能和肠道通透性与紧密连接复合物密切相关，后者充当细胞旁通路的看门人。Occludin是紧密连接的主要成分，随着上皮屏障功能的减弱而减少，而ZO-1是一种重要的紧密连接相关蛋白，可以促进上皮增殖，从而有利于黏膜修复。值得注意的是，OMV治疗组的近端结肠上皮细胞中occludin和ZO-1的表达明显增加，伴随着肠上皮损伤的恢复，并且在形态正常的肠上皮轮廓中观察到更多重叠和完整的荧光信号(图3d)。和LPS处理的上皮细胞系Caco-2共培养后的体外免疫荧光研究进一步显示Akk OMV能促进occludin和ZO-1表达的立即增强(图3f)。Akk OMVs在细胞内化后上调肠道紧密连接的机制之一可能是通过激活腺苷5'-单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径来调节紧密连接的重新组装和稳定性(图3e)。此外，OMV介导的肠道菌群失调逆转和免疫稳态的维持共同促进包括IL-10和IL-13在内的抗炎细胞因子的显著上调，以及包括血管紧张素转换酶(ACE)2在内的促炎细胞因子下调、IFN-γ和C反应蛋白(CRP)，在调节紧密连接蛋白、增强肠道屏障完整性方面发挥关键作用(图3g)。

实施例四OMV介导的肠道稳态用于肠炎干预和治疗

为了检查治疗潜力，我们通过口服给药Akk OMV治疗由DSS诱导的急性结肠炎小鼠。正如先前的研究表明，Akk可以减弱结肠炎和相关的肿瘤发生，因此这里使用Akk和PBS治疗的结肠炎小鼠作为对照。连续5天每天口服管饲后，OMV处理的小鼠的体重增加与Akk处理小鼠相当，明显超过PBS对照组(图4a)。同时，Akk OMV的口服给药纠正了结肠炎小鼠结肠长度的减少和结肠重量与长度比的升高(图4b)。已经证明中性粒细胞浸润是IBD的特征之一，MPO是一种中性粒细胞的细胞内蛋白，其浓度与IBD活性呈正相关。如图4c所示，结肠组织的MPO染色表明，与PBS相比，用OMV或Akk处理大大降低了相应结肠组织中的MPO阳性细胞浸润。H&E染色突出显示白细胞浸润引起的病理症状，例如DSS诱导的小鼠近端结肠中的粘膜水肿和隐窝肿胀和破坏，在OMV治疗后明显减少(图4d)。据报道，在IBD小鼠模型中，促炎细胞因子，例如IFN-γ，会增加炎症细胞的过度浸润和黏膜上皮损伤，而抗炎细胞因子，例如IL-10，则发挥关键的抗炎作用角色。因此，Akk OMVs在上调有益微生物群、避免肠道机会性病原体大量繁殖以及促进T细胞抗炎表型极化的作用导致结肠组织中炎症细胞浸润的募集以及炎症病理改变减轻。此外，OMV增强的紧密连接蛋白可以促进上皮增殖以进行黏膜修复。这些结果证明，口服Akk OMV能够改善DSS诱导的结肠炎的症状和病理表现，这可能受益于由OMV介导的病原体丰度降低、免疫稳态维持和紧密连接增强所构成的肠道稳态。

实施例五OMV用于肿瘤干预和治疗

我们探索了Akk OMV对肠道微生物组的有益调节可以增强针对PD-1的免疫疗法在CRC小鼠模型中的功效的可能性。每天通过口服管饲法连续2天给小鼠喂食Akk OMV，然后每3天腹腔注射PD-1单克隆抗体(aPD-1，共3剂)。引人注目的是，在OMV的帮助下，aPD-1在所有治疗组中实现了最有效的肿瘤生长抑制(图5a)。通过流式细胞术和免疫荧光成像分析的免疫学变化显示，aPD-1和OMV共同处理的小鼠的肿瘤细胞(CD45-)和免疫细胞(CD45+)中PD-L1显着上调，与Akk-处理的小鼠相当，并与根据先前从接受来自aPD-1应答者的粪便微生物群移植的化身小鼠获得的结论一致(图5b、5c)。这些结果显示，Akk OMV逆转了PD-1阻断在CRC小鼠中最初微弱的功效。此外，OMV与aPD-1的组合扩大了CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)的肿瘤浸润，从而提高了肿瘤对PD-1阻断的反应(图5d)。H&E染色图像还阐明了用OMV和aPD-1处理后肿瘤组织中坏死区域的扩张，说明了增强的抗肿瘤生长功效(图5e)。即，Akk OMV通过维持有益的肠道微生物结构克服了肿瘤免疫治疗中对PD-1阻断的主要耐药性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.细菌外膜囊泡在制备调节肠道稳态产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节肠道稳态产品为治疗肠炎产品或肿瘤治疗增强剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肠炎选自放射性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、免疫检查点抑制剂相关性肠炎、抗生素相关性肠炎中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞癌、膀胱癌、胆管细胞癌、透明细胞肾癌、前列腺癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、原发性未知癌、胸腺癌、胶质瘤、神经胶质瘤、星型细胞瘤、子宫颈癌、前列腺癌、白血病、骨癌、脑癌、支气管癌、室管膜瘤癌、成视网膜瘤癌、胃癌、胃肠道癌、黑素瘤癌、肾癌、淋巴瘤癌、间皮瘤癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、甲状腺癌、垂体癌、肾癌、唾液腺癌、肉瘤癌和皮肤癌中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细菌外膜囊泡为通过革兰氏阴性菌制备得到。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自嗜黏蛋白阿克曼菌、巨单胞菌、考拉杆菌、拟杆菌、脱硫弧菌、普氏栖粪杆菌中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细菌外膜囊泡通过以下任一种或多种方式调节肠道稳态：与肠道微生物群中的特定细菌相互作用、增加益生菌或共生细菌的相对丰度、降低肠道条件致病性细菌的相对丰度、引发粘膜免疫调节反应、修复肠上皮物理化学屏障、减轻肠道生态紊乱表现。

8.一种调节肠道稳态的药物组合物，其特征在于，所述产品包含细菌外膜囊泡以及药学上可接受的载体或辅料。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞外膜囊泡为嗜黏蛋白阿克曼菌、巨单胞菌、考拉杆菌、拟杆菌、脱硫弧菌、普氏栖粪杆菌中的一种或多种产生的细胞外膜囊泡。

10.细菌外膜囊泡在制备以下任一产品中的用途：

1)增加肠道益生菌或共生细菌的相对丰度的产品；

2)降低导致肠道微生物群生态失调的细菌的相对丰度的产品；

3)促进益生菌的增殖的产品；

4)引发粘膜免疫调节反应的产品；

5)修复肠上皮物理化学屏障的产品；

6)减轻肠道生态紊乱表现的产品。

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