CN115918527A - 一种四倍体马铃薯的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种四倍体马铃薯的育种方法，包含以下操作步骤：(1)将纯合二倍体马铃薯实生种子进行消毒、春化处理；(2)将步骤(1)中的消毒、春化处理后纯合二倍体马铃薯实生种子转至含有质量浓度为0.1‑0.2％的秋水仙素诱导萌发培养基中培育2‑7天，至实生苗萌发后继续培养2‑10天，(3)将步骤(2)中继续培养后的纯合二倍体马铃薯实生种子转移至生长培养基中继续培养3‑5周，进行倍性加倍检测，得到所述的四倍体马铃薯。本发明方法采用马铃薯的种子进行直接加倍，操作简单、便于重复、加倍率高，避免了用组培苗进行加倍造成的操作复杂、出芽点加倍不均匀、嵌合体多等问题。

Description

一种四倍体马铃薯的育种方法

技术领域

本发明属于农业育种技术领域，特别涉及一种四倍体马铃薯的育种方法。

背景技术

经典的马铃薯育种方式面临遗传背景高度杂合，栽培种遗传背景狭窄，块茎繁殖系数低且成本高等困难。

马铃薯杂交种子相关种质资源的创制和研究目前还有很长的路要走。二倍体产量普遍低于四倍体产量是困扰马铃薯育种的一个普遍问题，为了解决这个问题，现有技术多采用将二倍体马铃薯无菌组培苗的茎段在含有秋水仙素的液体或者固体培养基中进行培养的方法进行染色体加倍的方法。但现有技术存在以下问题：第一、方法有问题：目前多为采用组培苗的无性繁殖能力进行体细胞加倍，现有方法存在操作复杂、嵌合体多、加倍效率不稳定、速度慢的现象；第二、方法上有欠缺：目前仅有的一篇报道马铃薯杂合二倍体实生子加倍的文献为 1996年发表在中国马铃薯学术研讨文集的《利用秋水仙素结合组织培养对马铃薯双单倍体染色体加倍的研究》，此报道针对的是马铃薯杂合二倍体实生子，运用的是液体浸种法，方法单一，并不适用于所有的马铃薯二倍体实生子；第三、基本材料上有欠缺：目前现有的方法都是基于杂合马铃薯二倍体的，尚无争对纯合二倍体的加倍方法。当前，以纯合二倍体马铃薯种子为外植体材料，进行染色体加倍，培养成再生植物的方法，还未见报道，并且，秋水仙素诱导马铃薯纯合二倍体染色体加倍的有效处理时期不明确，处理浓度、处理时间尚未揭示，这些问题严重制约了马铃薯二倍体尤其是纯合二倍体的染色体加倍进程的发展。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种四倍体马铃薯的育种方法，以改良马铃薯的基因型，为杂交育种提供基础材料，该方法采用马铃薯的种子进行直接加倍，操作简单、便于重复、加倍率高，避免了用组培苗进行加倍造成的操作复杂、出芽点加倍不均匀、嵌合体多等问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种四倍体马铃薯的育种方法，包含以下操作步骤：

(1)将纯合二倍体马铃薯实生种子进行消毒、春化处理；

(2)将步骤(1)中的消毒、春化处理后纯合二倍体马铃薯实生种子转至含有质量浓度为0.1-0.2％的秋水仙素诱导萌发固体培养基中培育2-7天，至实生苗萌发后继续培养2-10天，

(3)将步骤(2)中继续培养后的纯合二倍体马铃薯实生种子转移至生长培养基中继续培养3-5周，进行倍性加倍检测，得到所述的四倍体马铃薯。

优选地，步骤(1)中所述的消毒处理具体为：将纯合二倍体马铃薯实生种子先用加入无菌水清洗杂质，将灭菌水吸出；再依次使用灭菌水、16％次氯酸钠、吐温-80，反复清洗10min，倒去清洗液，无菌水冲洗4-5次至无泡沫。

优选地，所述步骤(1)中的春化处理为：将消毒处理后纯合二倍体马铃薯实生种子置于春化液体培养基中，4℃条件下避光处理2天。

优选地，所述春化液体培养基为浓度1500mg/L的赤霉素。

优选地，步骤(2)中所述的诱导萌发培养基为MS+0.1％的秋水仙素+20g/L 蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基。

优选地，在步骤(2)中消毒、春化处理的纯合二倍体马铃薯实生种子整体插入含有秋水仙素的固体培养基中。

优选地，所述步骤(2)中的纯合二倍体马铃薯实生种子萌发前培养条件为：温度22℃，培养2-7天至种子萌发，光周期为16h光/8h暗，光照强度为1000- 2000Lux。

优选地，步骤(3)所述的生长培养基为MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基。

优选地，所述步骤(3)中的培养条件为：温度22℃，光周期为16h光/8h 暗，光照强度为2000-4000Lux。

优选地，所述纯合二倍体马铃薯为DL19、ML19、DL10、DL5中一种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用马铃薯的种子进行直接加倍，操作简单、便于重复、加倍率高，避免了用组培苗进行加倍造成的操作复杂、出芽点加倍不均匀、嵌合体多等问题；确定了秋水仙素溶液诱导纯合二倍体马铃薯染色体加倍的有效处理时期，明确了秋水仙素诱导纯合二倍体马铃薯染色体加倍有效的处理浓度和处理时间，极大地推动了马铃薯种质创新及育种进程的发展。

附图说明

图1传统浸泡加倍法倍性鉴定结果；图1A：二倍体；图1B：四倍体；图 1C：未加倍材料；图1D：未加倍材料；

图2马铃薯种子加倍与植株生长图；图2A：浸没在含秋水仙素的MS固体培养基里的种子；图2B：萌芽后置于MS培养基的幼苗；图2C：移植后死亡的幼苗；图2D：生长畸形的植株；图2E：加倍成功的(左)和加倍失败(右) 的马铃薯植株；

图3培养基加倍法倍性鉴定结果；图3A：二倍体；图3B：四倍体；图3C：未加倍材料；图3D：加倍材料DL19；图3E：加倍材料DL10；图3F：DL5；图3G：加倍材料ML19。

图4植物组织切片结果；图4A：叶柄(2n)；图4B：叶柄(4n)；图4C：叶片(2n)；图4D：叶片(4n)；图4E：茎(2n)；图4F：茎(4n)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所用的马铃薯种子为纯合二倍体马铃薯种子，该种子的名称为DL19、ML19、DL10和DL5，来源于纯和二倍体DM和M6的杂交后代的多代自交纯合系，所使用的其他材料均可自常规方式购买得到。

实施例1

一种四倍体马铃薯的育种方法，包含以下操作步骤：

(1)将消毒处理后的纯合二倍体马铃薯DL19的实生种子置于浓度为 1500mg/L的赤霉素液体培养基中，4℃条件下避光处理2天；消毒处理具体为：取少量马铃薯种子分装于灭菌后的2.0mL EP管中，加入无菌水1mL清洗杂质 1min后，将灭菌水吸出；向管中依次加入700mL灭菌水、700mL16％次氯酸钠、 100μL吐温-80，反复清洗10min，倒去清洗液，无菌水冲洗4次至无泡沫；

(2)将步骤(1)中的实生种子转至含有质量浓度为0.1％的秋水仙素诱导萌发固体培养基中培育2天，至实生苗萌发，种子萌发后持续培养2天，期间确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的全过程一直浸没在培养基中，待胚根生长至2mm时，将已经萌发的种子从诱导萌发培养基中取出，在灭菌水中清洗，去除诱导萌发培养基，并在灭菌滤纸上吸干残留的水分；诱导萌发培养基为 MS+0.1％的秋水仙素+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为0.5厘米；培养条件为：温度22℃，培养2天至种子萌发，光周期为16h光/8h暗，光照强度为1000Lux；培养方法具体为：将实生种子整体插入MS培养基中，直至种子至培养基表面1mm之下，然后将培养皿倒置，确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的过程一直完全浸没在培养基中；

(3)将步骤(2)中洗干净的种子转移至生长培养基中继续培养3周；生长培养基为MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为3厘米；培养条件为：温度22℃，光周期为16h光/8h暗，光照强度为2000Lux；

(4)将步骤(3)中培养成苗后的实生苗取顶芽进行继代培养和倍性检测，加倍成功的实生苗为获得的四倍体种植材料；利用流式细胞仪(PA-1，由德国 partec公司生产)测定染色体数目的倍性，检测结果如图3所示。

实施例2

一种四倍体马铃薯的育种方法，包含以下操作步骤：

(1)将消毒处理后的纯合二倍体马铃薯ML19的实生种子置于浓度为 1500mg/L的赤霉素液体培养基中，4℃条件下避光处理2天；消毒处理具体为：取少量马铃薯种子分装于灭菌后的2.0mL EP管中，加入无菌水1mL清洗杂质 1min后，将灭菌水吸出；向管中依次加入700mL灭菌水、700mL16％次氯酸钠、 100μL吐温-80，反复清洗10min，倒去清洗液，无菌水冲洗5次至无泡沫；

(2)将步骤(1)中的实生种子转至含有质量浓度为0.1％的秋水仙素诱导萌发固体培养基中培育8天，至实生苗萌发，种子萌发后持续培养6天，期间确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的全过程一直浸没在培养基中，待胚根生长至4mm时，将已经萌发的种子从诱导萌发培养基中取出，在灭菌水中清洗，去除诱导萌发培养基，并在灭菌滤纸上吸干残留的水分；诱导萌发培养基为 MS+0.1％的秋水仙素+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为0.7厘米；培养条件为：温度22℃，培养5天至种子萌发，光周期为16h光/8h暗，光照强度为1500Lux；培养方法具体为：将实生种子整体插入培养基中，直至种子至培养基表面2mm之下，然后将培养皿倒置，确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的过程一直完全浸没在培养基中；

(3)将步骤(2)中洗干净的种子转移至生长培养基中继续培养4周；生长培养基为MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为4厘米；培养条件为：温度22℃，光周期为16h光/8h暗，光照强度为3000Lux；

(4)将步骤(3)中培养成苗后的实生苗取顶芽进行继代培养和倍性检测，加倍成功的实生苗为获得的四倍体种植材料。

实施例3

一种四倍体马铃薯的育种方法，包含以下操作步骤：

(1)将消毒处理后的纯合二倍体马铃薯DL10的实生种子置于浓度为 1500mg/L的赤霉素液体培养基中，4℃条件下避光处理2天；消毒处理具体为：取少量马铃薯种子分装于灭菌后的2.0mL EP管中，加入无菌水1mL清洗杂质 1min后，将灭菌水吸出；向管中依次加入700mL灭菌水、700mL16％次氯酸钠、 100μL吐温-80，反复清洗10min，倒去清洗液，无菌水冲洗5次至无泡沫；

(2)将步骤(1)中的实生种子转至含有质量浓度为0.1％的秋水仙素诱导萌发固体培养基中培育7天，至实生苗萌发，种子萌发后持续培养10天，期间确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的全过程一直浸没在培养基中，待胚根生长至5mm时，将已经萌发的种子从诱导萌发培养基中取出，在灭菌水中清洗，去除诱导萌发培养基，并在灭菌滤纸上吸干残留的水分；诱导萌发培养基为 MS+0.1％的秋水仙素+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为1.0厘米；培养条件为：温度22℃，培养7天至种子萌发，光周期为18h光/6h暗，光照强度为2000Lux；培养方法具体为：将实生种子整体插入培养基中，直至种子至培养基表面3mm之下，然后将培养皿倒置，确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的过程一直完全浸没在培养基中；

(3)将步骤(2)中洗干净的种子转移至生长培养基中继续培养5周；生长培养基为MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为5厘米；培养条件为：温度22℃，光周期为16h光/8h暗，光照强度为4000Lux；

(4)将步骤(3)中培养成苗后的实生苗取顶芽进行继代培养和倍性检测，加倍成功的实生苗为获得的四倍体种植材料。

实施例4

一种四倍体马铃薯的育种方法，包含以下操作步骤：

(1)将消毒处理后的纯合二倍体马铃薯DL5的实生种子置于浓度为 1500mg/L的赤霉素液体培养基中，4℃条件下避光处理2天；消毒处理具体为：取少量马铃薯种子分装于灭菌后的2.0mL EP管中，加入无菌水1mL清洗杂质 1min后，将灭菌水吸出；向管中依次加入700mL灭菌水、700mL16％次氯酸钠、 100μL吐温-80，反复清洗10min，倒去清洗液，无菌水冲洗5次至无泡沫；

(2)将步骤(1)中的实生种子转至含有质量浓度为0.2％的秋水仙素诱导萌发固体培养基中培育7天，至实生苗萌发，种子萌发后持续培养10天，期间确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的全过程一直浸没在培养基中，待胚根生长至5mm时，将已经萌发的种子从诱导萌发培养基中取出，在灭菌水中清洗，去除诱导萌发培养基，并在灭菌滤纸上吸干残留的水分；诱导萌发培养基为 MS+0.1％的秋水仙素+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为1.0厘米；培养条件为：温度22℃，培养7天至种子萌发，光周期为18h光/6h暗，光照强度为2000Lux；培养方法具体为：将实生种子整体插入培养基中，直至种子至培养基表面3mm之下，然后将培养皿倒置，确保种子从萌发至胚根突破种皮并伸长的过程一直完全浸没在培养基中；

(3)将步骤(2)中洗干净的种子转移至生长培养基中继续培养5周；生长培养基为MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基，培养基厚度为5厘米；培养条件为：温度22℃，光周期为16h光/8h暗，光照强度为4000Lux；

(4)将步骤(3)中培养成苗后的实生苗取顶芽进行继代培养和倍性检测，加倍成功的实生苗为获得的四倍体种植材料。

具体实验例1

(1)培养基加倍法

染色体加倍培养基为MS固体培养基，分为普通培养基(MS+20g/L蔗糖 +4.5g/L琼脂)与含有秋水仙素0.1％浓度的固体培养基。首先，将马铃薯种子置于2个1.5ml离心管中(一管进行加倍处理，另一管作为对照，前期处理一致) 使用灭菌水对马铃薯种子进行7次消毒处理；其次，消毒后的种子加入1ml浓度0.15％的赤霉素溶液，用锡箔纸进行包裹，将其置于4℃冰箱，进行48小时春化处理；

在超净工作台内，将春化结束后的DL9马铃薯种子用灭菌水进行7次消毒处理，将需要加倍的种子，置于含有秋水仙素的培养基(MS+0.1％的秋水仙素 +20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂)表面之下，将作为对照的种子置于含有普通培养基的试管中进行直接萌发处理；待种子萌发后，再以2天、4天、6天、8天、10天的5个处理时间分批从培养皿中取出，将萌发的加倍种子移到含有普通培养基 (MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂)的试管中，置于植物组织培养室内生长(16h光照/8h黑暗，16℃)；待试管苗长到一定高度，在超净工作台内进行接苗、扩繁(只进行芽尖接苗)，之后进行多次接苗(继代培养)，待试管苗成长稳定之后进行倍性鉴定及植物组织切片处理。加倍处理植株命名：XHY-0.1％-Ad-B(A为加倍天数，B为植株序号)统计处理材料的正常成苗率和加倍率，萌发率＝萌发种子数/种子数，正常成苗率＝正常成苗株系数/种子数,加倍率＝检测加倍株系数/成苗株系数。

(2)染色体倍性鉴定

对需要进行倍性鉴定的材料，采用流式细胞仪进行倍性鉴定，参照吴雅琴 (吴雅琴,常瑞丰,程和禾.流式细胞术进行倍性分析的原理和方法[J].云南农业大学学报,2006(04):407-409+414.)等的原理与方法，以马铃薯二倍体材料DM 与四倍体材料Katadin作为对照，利Sysmex

Ploidy Analyser倍性分析仪(鉴定公司为广州吉源生物有限公司)，试剂盒为

UV Precise P。具体过程为：

(1)取0.5cm²的新鲜样本植物叶片，将叶片置于提前准备的培养皿中。

(2)取400μl Partec CyStain UV Precise P(货号：05-5002)核裂解液，并将其加于植物叶片周围，然后用锋利刀片将叶片切碎(注意：不可在培养皿底部刮蹭)，确保可以充分提取出完整的细胞核，提取时间取决于植物叶片性质，一般为10秒。

(3)用30μm滤网(货号：04-0042-2316)将培养皿中的液体过滤到样品管中。

(4)取1600μl Partec CyStain UV Precise P染色液，将其加入样品管中，染色时间取决于样本性质，一般为10秒。

(5)上机测试：调整Gain值(Gain值在200V-600V范围内)，以及Thresholds 阈值使标样的荧光强度在100(横坐标)或50，根据标样的倍性具体来定，如果标样是2倍体待测样本是4倍体或者6倍体，尽量让标样的位置在100或者50 的位置，如果标样是4倍体或六倍体，待测样品是2倍体，标样的位置尽量调到150-300的位置。检测速度为0.5-2μl/s,主峰的细胞数量需要达到1000-3000 个，以保证数据具有统计学意义。

(6)取待测样品，重复(1)-(4)。上机测试后看样品荧光强度的位置，与标样比较。根据荧光强度就可以确定待测样品的倍性。样本之间的误差范围在±5％内。

(7)实验使用的仪器是Sysmex Partec品牌的CyFlow PA，试剂盒是Sysmex Partec的CyStain UV Precise P试剂盒(货号：05-5002)。

倍性＝待测样本的峰值/参照物的峰值*参照物倍性(e.g.100/50x 2n＝4n)。

(3)加倍处理材料染色体倍性鉴定

根据1996年发表在中国马铃薯学术研讨文集的《利用秋水仙素结合组织培养对马铃薯双单倍体染色体加倍的研究》中报导所用方法，进行了传统的实生子浸种法。由表1所示，传统浸种加倍法的种子基本上全部都正常萌发，正常成苗率都在75％-100％之间。处理6天的种子萌发率最低只有70％，最高90％，这说明种子萌发后在秋水仙素溶液中浸泡时间越长，植株的生长发育会受到抑制，种子的正常成苗率越低。

表1传统浸种加倍法

注：n＝3

倍性鉴定结果如图1所示，经计算，所有材料倍性结果(例：图1C)显示与二倍体对照(图1A)一致，所有材料的倍性都没有改变，即利用传统浸种加倍法不能使本实验中马铃薯种子成功加倍。

表2秋水仙素固体培养基加倍法 (秋水仙素浓度为0.1％)

注：n＝3

由表2所示，秋水仙素浓度为0.1％时，处理时间为2、4、6天的种子萌发率明显高于8天与10天，正常成苗率为35％-65％，且正常成苗率与加倍率均呈现先增加后降低的趋势，处理时间为4天时，加倍率最高，为35.6％，处理时间为2天时，加倍率最低，只有4.6％，说明种子萌发后，在含有秋水仙素的培养基中处理时间过短，加倍作用不明显；处理时间过长，会抑制植株正常生长发育且减弱加倍效果。

表3秋水仙素固体培养基加倍法 (秋水仙素浓度为0.2％)

注：n＝3

由表3所示，秋水仙素浓度为0.2％时，DL19大部分种子都可以萌发，但是正常成苗率均为0，说明用培养基加倍法进行加倍时，浓度过大，会对DL19的正常生长发育造成伤害。其他的二倍体结果类似，但是ML19在0.2％处理2天时，有少量的种子加倍成功，加倍率为约4/％。

当种子置于含有秋水仙素培养基里时，一定要浸没在培养基中(如图2A)。秋水仙素对种子存在一定的伤害，一些正常萌芽后的种子移到含普通MS培养基的试管中之后，部分植株可以正常生长(如图2B)，另一部分植株前期无明显变化，后期部分幼苗逐渐枯死(如图2C)或者生长畸形(如图2D)。加倍成功的马铃薯植株与未加倍的植株有明显区别，如图2E所示，与不加倍的植株(图2E右图)相比，加倍成功(图2E左图)的试管苗根系较发达、茎秆粗壮、叶片大，生长发育快。

倍性鉴定结果由图3所示，大部分处理材料的倍性没有改变，经计算，显示为二倍体(图3C)，与二倍体对照(图3A)一致；部分材料经鉴定发现倍性发生改变，结果显示为四倍体(图3D)，与四倍体对照(图3B)一致。且鉴定结果显示，不存在嵌合体材料，说明该加倍方法成功率高。

植物组织切片结果由图4所示，植物的叶柄结构与茎大致相同，四倍体植株的表皮(图4B)与二倍体植株(图4A)相比更为整齐、细胞形态更为统一；四倍体植株(图4B)的薄壁细胞体积大，维管(组织)束部分的大部分细胞形态整齐紧密，二倍体植株(图4A)的薄壁细胞体积比四倍体植株小，维管束部分排列更加紧密。二倍体试管苗叶片(图4C)的上表皮细胞多为皱缩、扁平，没有四倍体植株大、平滑；四倍体植株叶片的栅栏组织相比于二倍体，分布更加清晰、体积大、形状饱满；四倍体植株(图4D)的气孔更明显，其下表皮比二倍体植株更加平整、细胞分布规则、有序。在相同的标尺下，四倍体植株(图4F) 的茎：表皮细胞排列整齐而紧密，其皮层的薄壁细胞体积大、排列疏松，维管柱部分的薄壁组织体积大、分布清晰可见，髓位于茎的中心部分，由很多较大的薄壁细胞组成，细胞形态较为统一、整齐；二倍体植株(图4E)的茎：其髓的薄壁细胞体积大、细胞边缘形态多样、整体较松散，构成维管柱的薄壁组织体积较小，其皮层的薄壁细胞体积较小、排列较紧密，表皮边缘较散乱、细胞体积较小。

Claims (10)

1.一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，包含以下操作步骤：

(1)将纯合二倍体马铃薯实生种子进行消毒、春化处理；

(2)将步骤(1)中的消毒、春化处理后纯合二倍体马铃薯实生种子转至含有质量浓度为0.1-0.2％的秋水仙素诱导萌发培养基中培育2-7天，至实生苗萌发后继续培养2-10天，

(3)将步骤(2)中继续培养后的纯合二倍体马铃薯实生种子转移至生长培养基中继续培养3-5周，进行倍性加倍检测，得到所述的四倍体马铃薯。

2.根据权利要求1所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒处理具体为：将纯合二倍体马铃薯实生种子先用加入无菌水清洗杂质，将灭菌水吸出；再依次使用灭菌水、16％次氯酸钠、吐温-80，反复清洗10min，倒去清洗液，无菌水冲洗4-5次至无泡沫。

3.根据权利要求1所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，所述步骤(1)中的春化处理为：将消毒处理后纯合二倍体马铃薯实生种子置于春化液体培养基中，4℃条件下避光处理2天。

4.根据权利要求3所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，所述春化液体培养基为浓度1500mg/L的赤霉素。

5.根据权利要求1所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，步骤(2)中所述的诱导萌发培养基为MS+0.1％的秋水仙素+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基。

6.根据权利要求1所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，在步骤(2)中消毒、春化处理的纯合二倍体马铃薯实生种子整体插入培养基中。

7.根据权利要求4所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中的纯合二倍体马铃薯实生种子萌发前培养条件为：温度22℃，培养2-7天至种子萌发，光周期为16h光/8h暗，光照强度为1000-2000Lux。

8.根据权利要求1所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，步骤(3)所述的生长培养基为MS+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基。

9.根据权利要求1所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，步骤(3)中的所述培养的条件为：温度22℃，光周期为16h光/8h暗，光照强度为2000-4000Lux。

10.根据权利要求1-9任一所述的一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，所述纯合二倍体马铃薯为DL19、ML19、DL10、DL5中一种。

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