CN115916979A - 针对il-21的适体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与IL‑21结合的适体、抑制IL‑21与其受体的结合的与IL‑21结合的适体、包含式(1)：CGRYKACY表示的核苷酸序列的与IL‑21结合的适体，式中，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U。

Description

针对IL-21的适体及其应用
技术领域
本发明为涉及一种针对白细胞介素-21的适体的发明。
背景技术
动脉性肺动脉高压(下面，有时简称为“PAH”)是一种以肺动脉的中膜、内膜增生为病情基础的疾病。目前，肺动脉高压治疗中使用内皮素受体拮抗剂(波生坦、安贝生坦等)、磷酸二酯酶(PDE)5抑制剂(西地那非、他达拉非等)、前列腺素I2及其衍生物(依前列醇、贝前列素等)等。但是，以上药物治疗对预后的改善不足，PAH被列为疑难杂症之一。因此，需要开发新的PAH治疗方法。
有报道称炎症与PAH病情发展相关，特别是有报道指出作为炎性细胞因子的白细胞介素-6(IL-6)参与PAH病情的发展。并且，近年来，有报道指出，IL-6的作用导致作为辅助性T细胞的一种的Th17细胞分泌白细胞介素-21(下面记作“IL-21”)，由此对PAH的发病起到重要的作用(非专利文献1)。具体而言，一般认为，IL-21将肺内存在的巨噬细胞诱导至M2巨噬细胞优势状态，与M2巨噬细胞向肺组织的聚集相关，促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，从而导致PAH发病。
专利文献1中记载了可以通过抑制来自IL-21的信号转导来预防及治疗肺动脉高压症。具体而言，基于通过抗IL-21抗体抑制IL-21和IL-21受体的相互作用来抑制来自IL-21的信号转导。然而，虽然专利文献1中就能够抑制IL-21和IL-21受体的相互作用的物质列举了IL-21抗体、IL-21受体抗体、IL-21及与IL-21受体结合的肽等，但并未记载或暗示IL-21适体。
适体是与靶分子(蛋白质、糖链、激素等)特异性结合的核酸，能够通过单链RNA(或DNA)所形成的三维立体结构与靶分子结合。一种被称为SELEX法(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment)的筛选方法被用于获取适体(专利文献2～4)。通过SELEX法得到的适体的链长为80个核苷酸左右，之后以靶分子的生理抑制活性为指标，实现了短链化。并且，为了提高体内的稳定性进行化学修饰，从而实现作为药品的优化。适体不易受到免疫清除，从而不易产生抗体特有的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)及补体依赖性细胞毒作用(CDC)等副作用。此外，同为分子靶向药的低分子化合物中也有难溶性的分子，为了实现其制剂化，有时需要进行优化，但是适体的水溶性高，因此这一点是优势。并且，由于是通过化学合成生产的，所以如果大量生产，则能够降低成本。另外，长期保存稳定性及耐热性和耐溶剂性也是适体的优势特征。另一方面，一般适体的血中半衰期比抗体短。但是，从毒性的观点来看，这一点有时也是优点。已经开发了以2004年12月美国批准的第1个RNA适体药品Macugen(适用疾病：年龄相关性黄斑变性)为代表的各种适体药品。近年来，不仅是RNA适体，能够在体内稳定且廉价制造的DNA适体的开发也在不断推进。
此外，利用适体所具有的对靶分子的高亲和性，将适体用于靶分子的精制及分子靶向的尝试也很多。适体与具有相同功能的抗体相比，其亲和性普遍较高。从递送的观点来看，适体的分子大小为抗体的1/10左右，因此容易产生组织转移，更容易将药物递送到目标位点。因此，有可能开发出比抗体更有用的药品。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第6359921号公报
专利文献2：国际公开第91/19813号
专利文献3：国际公开第94/08050号
专利文献4：国际公开第95/07364号
非专利文献
非专利文献1：PNAS May 19，2015 112(20)E2677-E2686
发明内容
发明要解决的问题
本发明旨在提供一种针对IL-21的适体。
解决问题的方法
本发明的发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果成功制得与IL-21结合的适体。此外，发现该适体能抑制IL-21与IL-21受体的结合。并且还发现本IL-21适体是具有特征基序序列的适体。
即，本发明如下所述。
[1]一种适体，其与白细胞介素-21结合。
[2]根据[1]所述的适体，其中，上述适体抑制白细胞介素-21与其受体的结合。
[3]根据[1]或[2]所述的适体，其中，上述适体包含以下式(1)表示的核苷酸序列，
CGRYKACY     (1)
式中，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U。
[4]根据[3]所述的适体，其中，在式(1)中的第1个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。
[5]根据[3]或[4]所述的适体，其中，上述适体进一步包含以下式(2)表示的核苷酸序列和以下式(3)表示的核苷酸序列，
CCKYC     (2)
式中，K表示G或U，Y表示C或U；
GYMCG     (3)
式中，Y表示C或U，M表示A或C。
[6]根据[5]所述的适体，其中，上述适体从5’端侧起依次包含式(2)、式(1)、式(3)的各核苷酸序列。
[7]根据[5]或[6]所述的适体，其中，式(1)中的第4个Y为C，K和第8个Y分别为U，
式(2)中的K和Y分别为U，
式(3)中的Y和M分别为C。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的适体，其中，上述适体包含以下式(4)表示的核苷酸序列，
CCKYC-N1-CGRYKACY-N2-GYMCG   (4)
式中，N1为5～9个中任意长度的核苷酸序列，N2为5～10个中任意长度的核苷酸序列，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U，M表示A或C。
[9]根据[1]～[7]中任一项所述的适体，其中，上述适体包含以下式(5)表示的核苷酸序列，
X1CCKYCX2-N1a-X3CGRYKACYX4-N2a-X5GYMCGX6   (5)
式中，N1a为3～7个中任意长度的核苷酸序列，N2a为3～8个中任意长度的核苷酸序列，X1和X6、X2和X5及X3和X4分别为彼此互补的核苷酸，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U，M表示A或C。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的适体，其包含取代、缺失、插入或添加一个或多个核苷酸后的核苷酸序列，其中，
(a)在该适体所含的核苷酸中，
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位为氟原子，
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位为羟基；
(b)在该(a)的适体中，
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位的氟原子分别独立地为非取代，或被选自氢原子、羟基和甲氧基中的原子或基团取代，
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位的羟基分别独立地为非取代，或被选自氢原子、甲氧基和氟原子中的原子或基团取代。
[11]根据[5]～[9]中任一项所述的适体，其中，在式(3)：GYMCG的第4个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的适体，其中，核苷酸的长度为65个核苷酸以下。
[13]根据[8]或[9]所述的适体，其中，上述适体包含以下(a)或(b)的核苷酸序列，
(a)序列号1～5、7、20～29及31～43中任一项所表示的核苷酸序列，其中，尿嘧啶(U)可以为胸腺嘧啶(T)；
(b)在上述(a)的核苷酸序列中取代、缺失、插入或添加一个或多个核苷酸而成的核苷酸序列。
[14]一种复合物，其包含[1]～[13]中任一项所述的适体和功能性物质。
[15]根据[14]所述的复合物，其中，功能性物质为亲和性物质、标记用物质、酶、药物递送介质或药物。
[16]一种药剂，其包含[1]～[13]中任一项所述的适体或者[14]或[15]所述的复合物。
[17]根据[16]所述的药剂，其中，上述药剂用于治疗或防止肺动脉高压症。
发明的效果
本发明的适体或包含适体的复合物可以用于预防或治疗IL-21参与的疾病、特别是可以用于预防或治疗肺动脉高压症。或者也可以用于精制和浓缩IL-21、标记IL-21、以及检测和定量IL-21。
序列表
<110> 力博美科股份有限公司
<120> 针对IL-21的适体及其应用
<130> PF02709A
<150> JP 2020-104831
<151> 2020-06-17
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 1
gggagaagaa ccuucaacac gcgacuacuc gugauugccc guucugagcc cagacgcucu 60
gcgcu 65
<210> 2
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 2
gggagaagaa ccuuccacga ccgacuacug ucaauggccc guucuuugcc cagacgcucu 60
gcgcu 65
<210> 3
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
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<213> 人工序列
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<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 14
ggaccuucaa cacgcgauac ucgugauugc ccgucc 36
<210> 15
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 15
ggaccuucaa cacgcgacac ucgugauugc ccgucc 36
<210> 16
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 16
ggaccuucaa cacgcgacuc ucgugauugc ccgucc 36
<210> 17
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 17
ggaccuucaa cacgcgacua ucgugauugc ccgucc 36
<210> 18
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 18
ggaccuucaa cacgcgacua ccgugauugc ccgucc 36
<210> 19
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 19
ggaccuucaa cacgcgacua cucgugauug ccgucc 36
<210> 20
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 20
gaccuucaac acgcgacuac ucgugauugc ccguc 35
<210> 21
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:20所示的适体的变体
<400> 21
accuucaaca cgcgacuacu cgugauugcc cgu 33
<210> 22
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 22
ggaccuucaa cacgcggcua cucgugauug cccgucc 37
<210> 23
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 23
gaaccuucaa cacgcgacua cucgugauug cccguuc 37
<210> 24
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:22所示的适体的变体
<400> 24
gaccuucaac acgcggcuac ucgugauugc ccguc 35
<210> 25
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 25
ggaccuucaa cacgcgauua cucgugauug cccgucc 37
<210> 26
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 26
ggaccuucaa caagcgauua cucuugauug cacgucc 37
<210> 27
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 27
ggaccuucaa cccgcgauua cucgggauug cccgucc 37
<210> 28
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 28
ggaccuucaa cccgcgacua cucgggauug cccgucc 37
<210> 29
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 29
ggcccgccaa cacacgauua cuugugauug uccggcc 37
<210> 30
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 30
ggaccuucaa cacgcgauua cucgugauug accgucc 37
<210> 31
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 31
ggaccuucaa cgcgcgacua cucgcgauug cccgucc 37
<210> 32
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 32
ggaccgccaa cacacgauua cuugugauug cccgucc 37
<210> 33
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 33
ggaccuucaa cccgcgauua cucgggauug cacgucc 37
<210> 34
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 34
ggaccgccaa cacacgacua cuugugauug uccgucc 37
<210> 35
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 35
ggaccuucau cacgcgauua cucgugaaug cccgucc 37
<210> 36
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过SELEX筛选的与人IL-21结合的适体
<400> 36
ggaccgccaa caaacgauua cuuuugauug uccgucc 37
<210> 37
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:28所示的适体的变体
<400> 37
ggaccuucaa cccgcggcua cucgggauug cccgucc 37
<210> 38
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:37所示的适体的变体
<400> 38
gaccuucaac ccgcggcuac ucgggauugc ccguc 35
<210> 39
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 39
ggaccgucaa cacgcgacua cucgugauug cccgucc 37
<210> 40
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 40
ggaccuccaa cacgcgacua cucgugauug cccgucc 37
<210> 41
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 41
ggaccuucaa cacgcgacga cucgugauug cccgucc 37
<210> 42
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 42
ggaccuucaa cacgcgacua cccgugauug cccgucc 37
<210> 43
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5所示的适体的变体
<400> 43
ggaccuucaa cacgcgacua cucgugauug cacgucc 37
<210> 44
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1               5                   10                  15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
            20                  25                  30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
        35                  40                  45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
    50                  55                  60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65                  70                  75                  80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
                85                  90                  95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
            100                 105                 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
        115                 120                 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
    130                 135                 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
145                 150                 155                 160
Asp Ser
<210> 45
<211> 538
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys
                245                 250                 255
Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser
            260                 265                 270
Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe
        275                 280                 285
Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly
    290                 295                 300
Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His
305                 310                 315                 320
Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu
                325                 330                 335
Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp
            340                 345                 350
Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp
        355                 360                 365
Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala
    370                 375                 380
Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro
385                 390                 395                 400
Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp
                405                 410                 415
Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser
            420                 425                 430
Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg
        435                 440                 445
Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro
    450                 455                 460
Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser
465                 470                 475                 480
Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly
                485                 490                 495
Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp
            500                 505                 510
Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro
        515                 520                 525
Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
    530                 535
<210> 46
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA模板
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(50)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
agcgcagagc gtctgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaaggttctt 60
ctccctatag tgagtcgtat tagg 84
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
cctaatacga ctcactatag ggagaagaac cttc 34
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
agcgcagagc gtctg 15
<210> 49
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非人IL-21适体
<400> 49
gggaagcucc gucgagcuuu ccugcauaag cuguauugca gccagcauuu a 51
<210> 50
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非人IL-21适体
<400> 50
gggaagcucc gucgagcuuu ccugcauaag cuguauugca gccagcauuu auuguacgcc 60
ugcguagcuc cu 72
<210> 51
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA模板
<400> 51
gcagagctcg tgctcagaac gggcaatcac gagtagtcgc gtgttgaagg ttcttctcac 60
tgtgagcc 68
<210> 52
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
taatacgact cactataggg ctcacagtga ga 32
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
gcagagctcg tgctc 15
附图说明
图1示出序列号1及2所表示的各适体的二级结构预测。
图2示出表示序列号1及2所表示的各适体与人IL-21结合的传感图。
图3示出表示序列号1所表示的适体抑制人IL-21与其受体的结合的传感图。
图4示出序列号3～5及7所表示的各适体的二级结构预测。
图5示出序列号22所表示的适体的二级结构预测。
图6示出序列号25～36所表示的各适体的二级结构预测。
发明的具体实施方式
本发明提供一种与白细胞介素(IL)21结合的适体，即对于IL-21具有结合活性的适体(下面，有时称为“本发明的适体”。)。
适体是指具有针对规定靶分子的结合活性的核酸分子。适体可以通过与规定靶分子结合来抑制规定靶分子的活性。本发明的适体可以为RNA、DNA、修饰核酸或它们的混合物。此外，本发明的适体可以为直链状、环状或茎-环状的形式，优选采用后者的茎-环状的结构。
本发明的适体在生理缓冲液中与IL-21结合。缓冲液不受特别限定，优选使用pH为约5.0～10.0左右的缓冲液，这样的缓冲液可列举例如后述的溶液A(参见实施例1)。本发明的适体以一定强度与IL-21结合，该强度可以通过下面的任一项试验检测到。
测定结合强度时，使用GE医疗公司制的Biacore T200。作为一种测定方法，首先将适体固定于传感器芯片。将用作分析物的IL-21溶液制备为0.1μM后注射，进而检测适体对人IL-21的结合。例如，如后述实施例中所使用那样，将以人IL-21以外为对象的适体(下面，称为“非人IL-21适体”)作为阴性对照，在人IL-21与该对照核酸相比显著与适体强效结合的情况下，则能够判断该适体具有与人IL-21结合的能力。此外，作为一种测定方法，还可以将人IL-21固定在传感器芯片上，注射适体溶液，从而检测结合。
在一种实施方式中，本发明的适体可以与IL-21结合以抑制IL-21的活性。即，本发明的适体也可以具有针对IL-21的抑制活性。
针对IL-21的抑制活性表示对于IL-21所具有的任意活性的抑制能力。例如，IL-21作用于IL-21受体表达细胞，激活信号转导，诱导产生各种细胞增殖因子及其受体。因此，针对IL-21的抑制活性可以表示抑制由IL-21受体介导的细胞内信号转导的活性。以上各种细胞增殖因子及其受体的表达可能最终导致细胞的增殖活性或迁移活性增强或者减少从各种细胞分泌的特定体液性因子。因此，IL-21的抑制活性表示抑制它们的活性或减少现有通过IL-21刺激所分泌的体液性因子。
由此，在本发明的适体与IL-21结合并抑制IL-21与IL-21受体的结合的情况下，可以抑制伴随IL-21受体介导的细胞内信号转导通路的激活所产生的作用，例如NK细胞的干扰素γ分泌等。换而言之，在本发明的适体降低NK细胞的干扰素γ分泌的情况下，则认为本发明的适体为与IL-21结合并抑制IL-21与IL-21受体的结合的适体。
IL-21是在CD4阳性T细胞及自然杀伤T细胞中强效表达的细胞因子，例如，为具有序列号44所表示的氨基酸序列的蛋白质。本发明中的IL-21除在动物体内产生之外，也可以通过使用小鼠等哺乳细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等培养细胞来制备，还可以通过化学合成制备。在通过培养细胞或化学合成制备的情况下，能够通过公知的方法容易地制备变异体。其中，IL-21的“变异体”是指公知的IL-21的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个～多个氨基酸等后的蛋白质或肽、或由公知的IL-21的氨基酸序列的部分氨基酸序列构成的蛋白质或肽，且具有IL-21原本所具有的活性中的至少一种以上活性。在取代、添加氨基酸的情况下，该氨基酸可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸。本发明中的IL-21包括这些变异体。
IL-21受体(下面，也称为“IL-21R”)表示IL-21所结合的细胞表面蛋白质。IL-21受体已知有例如具有序列号45所表示的氨基酸序列的蛋白质。本发明中的IL-21受体可以为包含天然氨基酸序列的蛋白质，也可以为其变异体。其中，IL-21受体的“变异体”是指构成公知的IL-21受体的氨基酸序列的氨基酸中取代、缺失或添加一个～多个等后的蛋白质或肽、或由公知的IL-21受体的氨基酸序列的部分氨基酸序列构成的蛋白质或肽，且对于IL-21具有结合活性。在一种实施方式中，本发明提供一种抑制IL-21与IL-21受体的结合的适体。
本发明的适体只要是与IL-21的任意部分结合的适体，则不受特别限制。此外，本发明的适体只要能够与IL-21的任意部分结合并抑制其活性，则不受特别限制。
本发明的适体的长度不受特别限定，通常可以为约200个核苷酸以下，例如约100个核苷酸以下，优选为约70个核苷酸以下，更优选为65个核苷酸以下，进一步优选为50个核苷酸以下，更进一步优选为约40个核苷酸以下，最优选为37个核苷酸以下。
如果核苷酸总数较少，则更容易化学合成及大量生产，且成本面方面也具有优势。此外，还容易进行化学修饰，体内稳定性也较高，毒性较低。作为本发明的适体长度的下限，只要其包含共有序列(CGRYKACY)，且可以采用后述的茎-环状的结构，则没有限制，该适体长度可以为例如20个核苷酸以上，优选为30个核苷酸以上，更优选为35个核苷酸以上。由此可知，在本发明的特别优选的实施方式中，本发明的适体的长度为35～40个核苷酸。
在一种优选的实施方式中，本发明的适体是包含式(1)表示的核苷酸序列的与IL-21结合的适体，
CGRYKACY    (1)
式中，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U。
构成本发明的适体的各核苷酸可以分别独立地为核糖，也可以为脱氧核糖。下面，在本发明的适体中，当核苷酸为脱氧核糖时，尿嘧啶(U)替换为胸腺嘧啶(T)。
式(1)中，第4个Y优选为C，K优选为U，第8个Y优选为U。
在进一步优选的一个实施方式中，本发明的适体是进一步包含式(2)表示的核苷酸序列和式(3)表示的核苷酸序列的、与IL-21结合的适体，
CCKYC   (2)
式中，K表示G或U，Y表示C或U。
GYMCG   (3)
式中，Y表示C或U，M表示A或C。
式(2)中，K优选为U，Y优选为U。此外，式(3)中，Y优选为C，M优选为C。
作为上述式(1)、式(2)和式(3)，在本发明的适体的序列中，可以从5’端侧起按照任意顺序排列，优选从5’端侧起依次排列式(2)、式(1)、式(3)的各核苷酸序列。通过按照该顺序配置各序列，本发明的适体可以良好地与IL-21结合。
此外，式(1)、式(2)和式(3)的各核苷酸序列可以通过作为接头(间隔物)的核苷酸序列结合。作为接头的核苷酸序列不受特别限定，只要使本发明的适体与IL-21结合，则可以采用任意序列。
作为本发明的适体，可更优选列举包含以下式(4)表示的核苷酸序列的适体，
CCKYC-N1-CGRYKACY-N2-GYMCG   (4)
式中，N1为5～9个中任意长度的核苷酸序列，N2为5～10个中任意长度的核苷酸序列，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U，M表示A或C。
其中，N1和N2相当于上述作为接头的核苷酸序列，可知式(2)、式(1)、式(3)的各核苷酸序列通过该接头从5’端侧起依次排列。
通过按照式(4)所示的配置和位置关系排列式(1)、式(2)和式(3)，本发明的适体可以与IL-21更强效结合，从而发挥较高的效果。
式(4)中，N1的长度通常为5～9个核苷酸，优选为5～7个核苷酸，最优选为6个核苷酸。N2的长度通常为5～10个核苷酸，优选为5～8个核苷酸，最优选为6或7个核苷酸。通过使N1和N2为该范围内的核苷酸长度，可以发挥本发明的适体的功能。
此外，N1和N2的长度的差优选为0～2，更优选为0或1。并且，位于式(1)部分的两侧的N1和N2形成茎结构，该茎结构只要整体形成茎结构，则也可以包含错配导致的部分突出结构或环结构。
并且，N1和N2的核苷酸序列可以为任意核苷酸序列，只要式(2)部分(CCKYC)和式(3)部分(GYMCG)可以在各自的两端形成碱基对以形成内环，且式(1)部分(CGRYKACY)可以形成环即可。
其中，式(1)部分可以整体(CGRYKACY)形成环，也可以通过例如在带有下划线的R和Y之间形成碱基对(例如，A-U)而形成环。无论哪种形成环的情况，只要具有前述的共有序列，就可以发挥本发明的适体的功能。需要说明的是，在后者中，N2的5’端侧的2个核苷酸优选与式(1)的5’端侧的“CG”形成茎结构，作为该序列，只要能够形成茎结构，则不受限定，优选为“CG”。
需要说明的是，式(4)中，相当于上述式(1)～(3)的各部分序列中优选的核苷酸如上面的式(1)～(3)中所述。
此外，作为本发明的适体，可更优选列举包含以下式(5)表示的核苷酸序列的适体，
X1CCKYCX2-N1a-X3CGRYKACYX4-N2a-X5GYMCGX6    (5)
式中，N1a为3～7个中任意长度的核苷酸序列，N2a为3～8个中任意长度的核苷酸序列，X1和X6、X2和X5及X3和X4分别为彼此互补的核苷酸，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U，M表示A或C。
其中，N1a和N2a相当于上述作为接头的核苷酸序列，可知式(2)、式(1)、式(3)的各核苷酸序列通过该接头从5’端侧起依次排列。
通过按照式(5)所示的配置和位置关系排列式(1)、式(2)和式(3)，本发明的适体可以与IL-21更加强效结合，从而可以发挥较高的效果。
式(5)中，N1a的长度通常为3～7个核苷酸，优选为3～5个核苷酸，最优选为4个核苷酸。N2a的长度通常为3～8个核苷酸，优选为3～6个核苷酸，最优选为4或5个核苷酸。通过使N1a和N2a为该范围内的核苷酸长度，可以发挥本发明的适体的功能。此外，N1a和N2a的长度的差优选为0～2，更优选为0或1。其中，N1a和N2a分别与X2、X3及X5、X4一起形成茎结构，但该茎结构只要整体形成了茎结构，则也可以包含因N1a和N2a之间的错配导致的部分突出结构或环结构。
并且，通过使X1和X6、X2和X5分别形成碱基对，式(2)部分(CCKYC)和式(3)部分(GYMCG)更加稳定地形成内环，通过X3和X4形成碱基对，式(1)部分(CGRYKACY)形成环。
需要说明的是，式(5)中，上述相当于式(1)～(3)的各部分序列中优选的核苷酸如以上式(1)～(3)中所述。
在一种优选的实施方式中，作为本发明的适体，可列举包含序列号1～5、7、20～29及31～43所表示的核苷酸序列的适体。下面，示出序列号1～5、7、20～29及31～43所表示的核苷酸序列，其中，尿嘧啶可以为胸腺嘧啶。下划线表示共有序列(从5’端侧起依次为式(2)、式(1)和式(3))。
序列号1：
GGGAGAAGAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUCUGAGCCCAGACGCUCUGCGCU
序列号2：
GGGAGAAGAACCUUCCACGACCGACUACUGUCAAUGGCCCGUUCUUUGCCCAGACGCUCUGCGCU
序列号3：
GGGAGAAGAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUCUGAGCCC
序列号4：
GGAGAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUCUCC
序列号5：
GGACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号7：
GGCCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGCC
序列号20：
GACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUC
序列号21：
ACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGU
序列号22：
GGACCUUCAACACGCGGCUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号23：
GAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUC
序列号24：
GACCUUCAACACGCGGCUACUCGUGAUUGCCCGUC
序列号25：
GGACCUUCAACACGCGAUUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号26：
GGACCUUCAACAAGCGAUUACUCUUGAUUGCACGUCC
序列号27：
GGACCUUCAACCCGCGAUUACUCGGGAUUGCCCGUCC
序列号28：
GGACCUUCAACCCGCGACUACUCGGGAUUGCCCGUCC
序列号29：
GGCCCGCCAACACACGAUUACUUGUGAUUGUCCGGCC
序列号31：
GGACCUUCAACGCGCGACUACUCGCGAUUGCCCGUCC
序列号32：
GGACCGCCAACACACGAUUACUUGUGAUUGCCCGUCC
序列号33：
GGACCUUCAACCCGCGAUUACUCGGGAUUGCACGUCC
序列号34：
GGACCGCCAACACACGACUACUUGUGAUUGUCCGUCC
序列号35：
GGACCUUCAUCACGCGAUUACUCGUGAAUGCCCGUCC
序列号36：
GGACCGCCAACAAACGAUUACUUUUGAUUGUCCGUCC
序列号37：
GGACCUUCAACCCGCGGCUACUCGGGAUUGCCCGUCC
序列号38：
GACCUUCAACCCGCGGCUACUCGGGAUUGCCCGUC
序列号39：
GGACCGUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号40：
GGACCUCCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号41：
GGACCUUCAACACGCGACGACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号42：
GGACCUUCAACACGCGACUACCCGUGAUUGCCCGUCC
序列号43：
GGACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCACGUCC
在一种特别优选的实施方式中，本发明的适体包含序列号24或38所表示的序列。
在一种实施方式中，作为本发明的适体，其包含上述任一项的适体中取代、缺失、插入或添加一个或多个核苷酸后而成的核苷酸序列，且具有与IL-21的结合活性，优选进一步具有抑制IL-21与其受体的结合的活性。
其中，只要在取代、缺失、插入或添加后仍然与IL-21结合，则上述取代、缺失、插入或添加的核苷酸数量不受特别限制，例如可以为1～约10个，优选为1～6个，更优选为1～5个，进一步优选为1～4个，进一步优选为1～3个，最优选为1个或2个。只要取代、缺失、插入或添加后仍然与IL-21结合，则核苷酸取代、缺失、插入或添加的位点也不受特别限制，在上述式(1)、(2)和(3)中，可以在1～3处，优选为1或2处，更优选为1处取代、缺失、插入或添加核苷酸，其中，式(1)、(2)和(3)中，在可采用多种核苷酸的位点(即，R、Y、K或M)处，不包括选项中所含的核苷酸之间的取代。特别优选地，在式(1)、(2)和(3)中，不包括核苷酸的取代、缺失或插入。另一方面，在除以上之外的其它位点处，也可以接受取代、缺失、插入或添加更多核苷酸(例如，1～约10个，优选为1～6个，更优选为1～5个，进一步优选为1～4个)。
此外，本发明的适体还可以为多种上述任意一种适体的连接物、分别包含一个以上选自上述的两种以上适体的连接物。这些连接物也可以与IL-21结合。
在此，连接可以通过串联结合来进行。此外，连接时可以利用接头。接头可列举：核苷酸链(例如，1～约20个核苷酸)、非核苷酸链(例如，-(CH2)n-接头、-(CH2CH2O)n-接头、六乙二醇接头、TEG接头、包含肽的接头、包含-S-S-键的接头、包含-CONH-键的接头、包含-OPO3-键的接头)。上述多个连接物中的多个只要为2个以上，则不受特别限制，可以为例如2个、3个或4个。
本发明的适体中所含的各核苷酸分别相同或不同，可以为核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖、嘌呤核苷酸的核糖)的2’位上包含羟基的核苷酸(即，天然的多聚核苷酸)或者在核糖的2’位上羟基被任意原子或基团取代(修饰)的核苷酸(本说明书中，有时记作“修饰核苷酸”)。
作为上述任意的原子或基团，可列举例如：氢原子、氟原子或-O-烷基(例如，-O-Me基)、-O-酰基(例如，-O-CHO基)、氨基(例如，-NH2基)等。此外，作为本发明的适体，至少一种(例如，1、2、3或4种)核苷酸可以在核糖的2’位上包含羟基或上述任意的原子或基团，例如选自氢原子、氟原子、-O-Me基中的至少两种(例如，2、3或4种)原子或基团。
此外，在本发明的适体中，全部嘧啶核苷酸可以是核糖的2’位为氟原子的核苷酸；或者为该氟原子相同或不同地为非取代或被上述任意的原子或基团，优选选自氢原子、羟基和甲氧基中的原子或基团取代的核苷酸。特别是在本发明的适体的制造方法应用利用T7Transcription Kit(本公司(Ribomic Inc.)制)的制造方法时，得到嘧啶核苷酸的核糖2’位氟化后的适体。氟原子被其它上述原子或基团取代的适体可以通过后述方法制造。
此外，在本发明的适体中，全部嘌呤核苷酸可以为核糖的2’位是羟基的核苷酸；或者为该羟基相同或不同地为非取代或被上述任意原子或基团，优选选自氢原子、甲氧基和氟原子中的原子或基团取代的核苷酸。羟基被其它上述原子或基团取代的适体可以通过后述方法来制造。
此外，在本发明的适体中，全部嘧啶核苷酸可以为核糖的2’位的氟原子被上述任意的原子或基团，例如选自氢原子、羟基和-O-Me基中的相同的原子或基团取代的核苷酸。
此外，在本发明的适体中，全部嘌呤核苷酸为核糖的2’位的羟基被上述任意的原子或基团，例如选自氢原子、氟原子和-O-Me基中的相同原子或基团取代的核苷酸。
在优选的实施方式中，本发明的适体中所含的各嘧啶核苷酸均为核糖的2’位上包含氟原子的核苷酸，且各嘌呤核苷酸均为核糖的2’位上包含羟基的核苷酸。在其它实施方式中，上述各嘧啶核苷酸的核糖的2’位的氟原子可以分别独立地被选自氢原子、羟基和甲氧基中的原子或基团取代，且，上述各嘌呤核苷酸的核糖的2’位的羟基可以分别独立地被选自氢原子、甲氧基和氟原子中的原子或基团取代。
需要说明的是，在本说明书中，假设构成适体的核苷酸为RNA(即假设糖基为核糖)，对对于核苷酸中的糖基的修饰方案进行说明，但这并不表示构成适体的核苷酸不包括DNA，也可以适当理解为对DNA的修饰。例如，在构成适体的核苷酸为DNA的情况下，核糖的2’位的羟基替换为X则理解为脱氧核糖的2’位的氢原子替换为X。
此外，在本发明的适体中，核苷酸中的磷酸二酯键的一个或多个、例如1～2个、1～3个、1～4个、1～5个核苷酸可以被任意取代基修饰或取代。例如，磷酸二酯键可以被硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基磷酸酯键、氨基磷酸酯键等取代。其中，例如“核苷酸被硫代磷酸酯键取代”表示相邻的核苷酸间的键合位点处的磷酸基被硫化，即表示磷酸二酯键被改变为硫代磷酸酯键。
此外，在本发明的适体中，为了稳定适体并提高其活性，一个或多个例如，1～2个、1～3个、1～4个、1～5个核苷酸可以被交联核酸Bridged Nucleic Acid(桥连核酸，BNA)或Locked Nucleic Acid(锁核酸，LNA)取代。其中，“交联核酸”表示具有通过利用分子内交联限制核酸的自由度来提高对于互补序列的结合亲和性，并获得核酸酶耐受性的结构的核酸，可列举例如2’，4’-BNA(LNA)、2’-O、4’-C-ethylene-bridged Nucleic Acid(2’-O,4’-C-乙烯桥连核酸，ENA)等，但不限定于此。
在本发明的适体中，为了提高针对IL-21的结合性、稳定性、药物递送性等，各核苷酸的糖残基(例如，核糖)可以是经修饰的。作为糖残基上被修饰的位点，可列举例如：将糖残基的2’位、3’位和/或4’位的氧原子替换为其它原子后的位点等。作为修饰的种类，可列举例如：氟化、O-烷基化(例如，O-甲基化，O-乙基化)、O-烯丙基化、S-烷基化(例如，S-甲基化，S-乙基化)、S-烯丙基化、氨基化(例如，-NH2)。此外，作为例子还可以列举：将4’位的氧取代为硫后的4’-SRNA、经由亚甲基将2’位和4’位交联后的LNA(Locked Nucleic Acid，锁核酸)、将3’位的羟基取代为氨基的3’-N-氨基磷酸酯核酸等。作为本发明的适体，根据其制造方法的不同，有时会制造嘧啶核苷酸的核糖2’位的氧原子具有一定修饰的适体，例如，当应用利用T7 Transcription Kit(T7转录试剂盒，本公司制)的制造方法时，优选制造全部嘧啶核苷酸的核糖2’位经氟化的适体。因此，通过随后对得到的适体进行如上的糖残基改造，可以制造出碱基序列相同但活性提高的变形适体。由此，本发明的适体可以优选为至少一个核苷酸的糖残基经修饰的适体。上述的糖残基改造可以通过自身公知的方法来进行(例如，参见Sproat et al.，(1991)，Nucl.Acid.Res.19，733-738；Cotton et al.，(1991)，Nucl.Acid.Res.19，2629-2635；Hobbs et al.，(1973)，Biochemistry 12，5138-5145)。具体而言，可以基于全部嘧啶核苷酸的核糖2’位的羟基被氟代基取代的适体，将核糖2’位上的羟基用选自氢原子、羟基和甲氧基中的原子或基团取代，从而制造适体。
在一种优选的实施方式中，作为本发明的适体，在式(1)中的第1个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。或者/并且，在式(1)中的第2个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。此外，在一种优选的实施方式中，作为本发明的适体，在式(3)：GYMCG的第4个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。
此外，为了提高针对IL-21的结合性、抗多聚化性、稳定性，药物递送性等，本发明的适体也可以由核酸碱基(例如，嘌呤、嘧啶)经改造(例如，化学取代)而成。作为这样的改造，可列举例如：5位嘧啶改造、6和/或8位嘌呤改造、环外胺处的改造、4-硫尿核苷处的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶处的取代。此外，还可以对本发明的适体中所含的磷酸基进行改造，以使适体对于核酸酶及水解具有抵抗性。例如，P(O)O基可以被P(O)S(硫代酯)、P(S)S(二硫代酯)、P(O)N(R)R’(氨基酯)、P(O)R、P(O)OR、CO或CH2(甲缩醛)或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)取代，其中，R或R’分别独立地为H、或者取代或未取代的烷基(例如，甲基、乙基)。
连接基示例有-O-、-N-或-S-，可以通过这些连接基与相邻的核苷酸结合。
此外，改造还可以包括加帽等3’及5’的改造。
改造还可以通过在末端添加聚乙二醇(PEG)、氨基酸、肽、反向dT(inverted dT)、核酸、核苷酸、肉豆蔻酰基、石胆酸-油烯基(lithocolic-oleyl)、二十二烷酰基、月桂酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚麻酰基、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌剂、毒素、酶、放射性物质、生物素等来进行。这些改造参见例如美国专利第5,660,985号、美国专利第5,756,703号。
特别是，在通过向末端添加PEG进行改造的情况下，PEG的分子量不受特别限制，优选为1000～100000，更优选为30000～90000。PEG可以为直链状，也可以分支为两条以上的链(多臂PEG)。末端添加PEG可以用于防止后述的适体多聚化。
这样的PEG不受特别限定，可以由本领域技术人员从市售或者公知的PEG中适当选用(例如，参见http：//www.peg-drug.com/peg＿product/branched.html)，作为用于本发明的适体的PEG的优选示例，具体而言，可列举：分子量40000的2支链AS型(官能团：-CH2-COO-NHS)PEG(Y-NHS-40K Jenkem制)、分子量40000的2支链GS型(官能团：-CO-(CH2)3-COO-NHS)PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS日油制)、分子量40000的2支链TS型(活性基团：-COO-NHS)PEG(SUNBRIGHT GL2-400TS日油制)、分子量40000的4支链TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS日油制)、分子量80000的2支链TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS日油制)、或分子量80000的4支链TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS日油制)等。
在该情况下，作为本发明的适体，PEG可以直接添加于末端，但更优选在其末端添加具有可以与PEG结合的基团的接头等，并经由该接头等将PEG添加于本发明的适体。
PEG和用于本发明的适体的接头不受特别限定，能够根据结合位点及PEG的种类等适当选择碳链数及官能团等。作为这样的接头，可列举例如具有氨基的接头，具体而言，在添加于5’端的情况下，示例ssH Linker(SAFC)或DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER(GLENRESEARCH)，当添加于3’端时，示例TFA Amino C-6lcaa CPG(ChemGenes)等。在选择了该接头的情况下，向PEG添加了例如N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)的活性基团之后，使其与接头侧的氨基反应，从而能够将用于本发明的适体和PEG通过接头结合。
需要说明的是，PEG及接头可以优选使用市售品。此外，PEG、接头及用于本发明的适体的结合相关的反应条件等可以由本领域技术人员适当设置。
本发明的适体能够通过本说明书的公开内容及该技术领域中本身公知的方法来化学合成。适体通过利用磷酸基的负电荷的离子键、利用核糖的疏水键及氢键、利用核酸碱基的氢键及堆垛键等各种键型与靶物质结合。特别是，利用与组成型核苷酸相同数量的磷酸基的负电荷的离子键很强，其与蛋白质表面存在的赖氨酸或精氨酸的正电荷结合。因此，不参与和靶物质的直接结合的核酸碱基可以被取代。特别是，由于茎结构的部分已经形成了碱基对，并且面向双螺旋结构的内侧，因此核酸碱基很难与靶物质直接结合。因此，很多情况下，即使将碱基对取代为其它碱基对，适体的活性也不会减少。即使在环结构等未形成碱基对的结构中，当核酸碱基不参与和靶分子的直接结合时，碱基也可以进行取代。关于核糖的2’位的修饰，在极少情况下，核糖的2’位的官能团与靶分子直接相互作用，但大多数情况下是无关的，可以被其它修饰分子取代。如此一来，只要是参与和靶分子直接结合的官能团不被取代或删除，适体则多保持其活性。此外，整体的立体结构变化不大也很重要。
适体能够利用SELEX法及其改良法(例如，Ellington et al.，(1990)，Nature，346，818-822；Tuerk et al.，(1990)，Science，249，505-510)来制作。在SELEX法中，通过增加轮数或使用竞争物质，将对靶物质结合力更强的适体富集筛选出来。由此，通过调节SELEX的轮数和/或改变竞争状态，有时可以获得结合力不同的适体、结合形式不同的适体、结合力和结合形式相同但碱基序列不同的适体。此外，SELEX法中包括PCR扩增过程，在此过程中，通过使用锰离子等加入变异，可以进行更富多样的SELEX。
通过SELEX得到的适体是对靶物质具有高亲和性的核酸，但这并不一定表示这些适体与靶物质的活性位点结合。因此，通过SELEX得到的适体不一定对靶物质的功能起作用。不与活性位点结合的适体可能不会影响其靶物质的活性。例如，BINKLEY etal.Nucleic Acids Res.23(16)：3198-3205(1995)中公开了通过SELEX得到的与神经增殖因子(NGF)结合的多种适体，其中，对于NGF的亲和性高的三种适体进行了抑制NGF与NGF受体的结合的活性测试，结果显示，三种适体均不抑制NGF与NGF受体的结合(WO2010/0357259)。这说明，即使通过SELEX法获得与IL-21结合的适体，也必须针对SELEX的各种条件寻找合适的组合并不断进行试错，以获得具有抑制IL-21与IL-21受体的结合进而抑制该受体介导的信号转导的活性的适体。需要说明的是，通过SELEX得到的针对IL-21的适体是否能够抑制IL-21的活性(例如，与IL-21受体的结合活性、IFN-γ的分泌诱导活性等)可以使用例如下述实施例中记载的各种测定法来验证。
这样选出的具有活性的适体可以通过进行优化SELEX来实现更高性能。优化SELEX是指，制作将某一序列已确定的适体的一部分作为随机序列的模板或掺杂了10～30％左右随机序列的模板，然后再次进行SELEX。
通过SELEX得到的适体具有80个核苷酸左右的长度，很难将其直接制成药剂。因此，优选反复试错以将其缩短至可容易化学合成的长度(例如，可化学合成的长度为约60个核苷酸以下，更优选为约50个核苷酸程度以下，进一步优选为45个核苷酸以下)。
通过SELEX得到的适体中，根据其引物设计，之后的最小化作业的难易度会产生变化。若未良好地设计引物，即使通过SELEX筛选出了具有活性的适体，也无法进行之后的开发工作。
由于适体可以化学合成，因此很容易改造。在适体中，通过利用MFOLD程序预测二级结构或通过X射线分析及NMR分析预测立体结构，在一定程度上可以预测哪些核苷酸可以被取代或缺失、以及在哪里可以插入新的核苷酸。预测得到的新序列的适体能够很容易化学合成，可以通过现有的测定系统来确认该适体是否保持有活性。
当能够通过如上所述的反复试错来确定对于得到的适体的与靶物质的结合很重要的部分时，即使在其序列的两端添加新的序列，多数情况下活性也不会改变。而且，新序列的长度不受特别限定。
并且，如上所述，修饰也与序列一样可以进行深度设计或改造。
综上所述，适体可以深度设计或改造。本发明还提供一种适体的制造方法，其可以深度设计或改造包含规定序列(例如，与选自茎部分、内环部分发夹环部分及单链部分的部分相对应的序列：下面，根据需要简称为固定序列)的适体。
例如，这样的适体的制造方法包括下述步骤：
使用由式1所表示的核苷酸序列构成的单一核酸分子或多种核酸分子(例如，a、b的数量等不同的核酸分子的文库)及与引物用序列(i)和(ii)分别对应的引物对，制造包含固定序列的适体。
【化学式1】
Figure BDA0003990624060000221
上式中，(N)a表示由a个N构成的核苷酸链，(N)b表示由b个N构成的核苷酸链，N分别相同或不同，表示选自A、G、C、U和T(优选为A，G、C和U)中的核苷酸。a、b分别相同或不同，可以为任意数量，例如可以为1～约100，优选为1～约50，更优选为1～约30，进一步更优选为1～约20或1～约10。
本发明还提供一种包含本发明的适体及与其结合的功能性物质的复合物。本发明的复合物中适体和功能性物质之间的结合可以为共价结合或非共价结合。本发明的复合物可以是本发明的适体与一个以上(例如，2个或3个)相同或不同功能性物质结合而成的。功能性物质只要为向本发明的适体新追加任意功能的物质或者可以改变(例如提高)本发明的适体可保持的任意特性的物质，则不受特别限制。作为功能性物质，可列举例如：蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖质、单糖、多聚核苷酸、核苷酸。作为功能性物质，还可列举例如：亲和性物质(例如，生物素、链霉亲和素、对靶互补序列具有亲和性的多聚核苷酸、抗体、谷胱甘肽；琼脂糖、组氨酸)、标记用物质(例如，荧光物质、发光物质、放射性同位素)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、药物递送介质(例如，脂质体、微球、肽、聚乙二醇类)、药物(例如，卡奇霉素及倍癌霉素等用于导弹疗法的药物、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺或曲磷胺等氮芥类似物、塞替派等亚乙基亚胺类、卡氮芥等亚硝基脲、替莫唑胺或达卡巴嗪等烷基化剂、甲氨蝶呤或雷替曲塞等叶酸类似代谢拮抗剂、硫鸟嘌呤、克拉屈滨或氟达拉滨等嘌呤类似物、氟尿嘧啶、替加氟或吉西他滨等嘧啶类似物、长春花碱、长春新碱或长春瑞滨等长春花生物碱及其类似物、依托泊苷、紫杉烷、多西他赛或紫杉醇等鬼臼毒素衍生物、阿霉素、表阿霉素、伊达比星及米托蒽醌等蒽环霉素类及类似物、博来霉素及米诺环素等其它细胞毒性抗生素、顺铂、卡铂和奥沙利铂等铂化合物、喷司他丁、米替福星、雌莫司汀、拓扑替康、伊立替康及比卡鲁胺)、毒素(例如，蓖麻毒素、白喉毒素及志贺样毒素)。这些功能性分子有时最终会被去除。此外，还可以是凝血酶和基质金属蛋白酶(MMP)、FactorX等酶可以识别并切割的肽、核酸酶及制限酶可以切割的多聚核苷酸。
本发明的适体或复合物可以用作例如药剂或诊断药、检查药、试剂。特别是可以用作治疗或预防肺动脉高压症的药剂、或者诊断药、检查药、试剂。
本发明的药剂可以配合有医药上可接受的载体。作为医药上可接受的载体，可列举例如：蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石粉、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂；纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等结合剂；淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂；硬脂酸镁、二氧化硅气凝胶、滑石粉、月桂基硫酸钠等润滑剂；柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸铵盐、甘氨酸、橙粉等芳香剂；苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等防腐剂；柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸等稳定剂；甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂；表面活性剂等分散剂，水、生理盐水、橙汁等稀释剂；可可脂、聚乙二醇、白煤油等基础蜡等，但不限定于此。
适合口服给药的制剂有将有效量的配体溶解在水、生理盐水、橙汁等稀释液中而成的液剂、含有固体或颗粒状的有效量的配体的胶囊剂、小袋剂或片剂、使有效量的有效成分悬浮在适当的分散介质中而成的悬浮液剂、将溶解有有效量的有效成分的溶液分散在适当的分散介质并乳化而成的乳剂等。
此外，本发明的药剂还可以根据需要通过本身已知的方法进行包衣，以实现矫味、肠溶性或者持久性等目的。作为用于包衣的包衣剂，可使用例如：羟基丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、聚氧乙二醇、吐温80、普朗尼克F68、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、EUDRAGIT(德国ROHM公司制、甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)及色素(例如，氧化铁红、二氧化钛等)等。该药剂可以为速释制剂及缓释制剂中的任意一种。作为缓释制剂的基材，可列举例如：脂质体、去端肽胶原、明胶、羟基磷灰石、PLGA等。
适合肠胃外给药(例如，静脉给药、皮下给药、肌肉给药、局部给药、腹腔给药、经鼻给药、经肺给药等)的制剂具有水性及非水性的等渗无菌注射液剂，其中可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、等渗剂等。此外，还可列举水性及非水性无菌悬浮液剂，其中可以包含悬浮剂、增溶剂、增粘剂、稳定剂、防腐剂等。该制剂可以像安瓿瓶及小瓶那样以单位给药量或者多次给药量封装在容器中。此外，也可以将有效成分及医药上可接受的载体冻干，以即将使用时溶解或悬浮于适当的无菌溶剂中即可的状态保存。此外，除注射液剂之外，也可以为吸入剂、软膏剂。当为吸入剂时，将冻干状态的有效成分微细化，使用适当的吸入装置吸入给药。吸入剂中可以根据需要进一步适当配合目前使用的表面活性剂、油、调味料、环糊精或其衍生物等。
其中，作为表面活性剂，可列举例如：油酸、卵磷脂、二乙二醇二油酸酯、四氢糠基油酸酯、乙基油酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、三油酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、亚油酸甘油基酯、十六醇、硬脂醇、聚乙二醇400、氯化十六烷吡啶、山梨醇酐三油酸酯(商品名Span(斯盘)85)、山梨醇酐单油酸酯(商品名Span(斯盘)80)、山梨醇酐单月桂酸酯(商品名Span(斯盘)20)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(商品名HCO-60)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(商品名Tween(吐温)20)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(商品名Tween(吐温)80)、来自天然来源的卵磷脂(商品名Epiclon(艾匹克隆))、油烯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij(布利吉)92)、硬脂基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij(布利吉)72)、月桂基聚氧乙烯(4)醚(商品名Brij 30)、油烯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Genapol(哥拿普卢)0-020)、氧乙烯和氧丙烯的嵌段共聚物(商品名Synperonic(西普洛尼可))等。Span(斯盘)、Tween(吐温)、Epiclon(艾匹克隆)、Brij(布利吉)、Genapol(哥拿普卢)及Synperonic(西普洛尼可)为商标。
作为油，可列举例如：玉米油，橄榄油，棉籽油，向日葵油等。此外，作为软膏剂时，可以将适当的医药上可接受的基剂(黄色凡士林、白色凡士林、石蜡、塑料基质、有机硅、白色软膏、蜂蜡、猪油、植物油、亲水软膏、亲水凡士林、精制羊毛脂、加水羊毛脂、吸水软膏、亲水塑料基质、MACROGOL软膏等)与有效成分混合后，制成制剂使用。
吸入剂能够按照常规方法来制造。即，可以将上述本发明的适体或复合物制成粉末或液状，配合在吸入喷射剂和/或载体中，并装入适当的吸入容器，由此制造吸入剂。此外，当上述本发明的适体或复合物为粉末时，也可以使用普通的机械式粉末吸入器，当上述本发明的适体或复合物为液状时，也可以使用喷雾器等吸入器。其中，喷射剂可以广泛使用现有公知的物质，可示例：氟利昂-11、氟利昂-12、氟利昂-21、氟利昂-22、氟利昂-113、氟利昂-114、氟利昂-123、氟利昂-142c、氟利昂-134a、氟利昂-227、氟利昂-C318、1,1,1,2-四氟乙烷等氟利昂类化合物、丙烷、异丁烷、正丁烷等烃类、二乙基醚等醚类、氮气、二氧化碳等的压缩气体等。
在将本发明的药剂用作预防及治疗上述疾病的药剂的情况下，本发明的药剂不仅可以直接给药于病变部位，也可以通过上述的其它方法给药。
由于本发明的适体为单链核酸，因此，也可以通过投予包含互补序列的核苷酸来解毒，其可以作为一种比中和抗体更安全的药品，中和抗体在给药后难以控制动力学。这一点对于抗体药剂治疗等中可能产生的感染的问题也是极为有利的，上述感染是因抗体在体内长时间滞留所导致的。特别是在将本发明的药剂用作预防或治疗上述疾病的药剂的情况下，考虑到疾病的严重度和副作用的风险，显然，利用容易控制体内动力学的适体可以获得具有更高安全性的药剂。
本发明的药剂的给药量根据有效成分的种类及活性、疾病的严重程度、作为给药对象的动物物种、给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而不同，通常，成人每天有效成分量可以为约0.0001～约100mg/kg，例如约0.0001～约10mg/kg，优选为约0.005～约1mg/kg。
下面，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于此。
【实施例】
实施例1：制作与人IL-21特异性结合的RNA适体(1)
使用SELEX法制作与人IL-21特异性结合的RNA适体。SELEX参考Ellington等人的方法(Ellington and Szostak，Nature 346，818-822，1990)及Tuerk等人的方法(Tuerkand Gold，Science 249，505-510，1990)进行。靶物质使用人IL-21(PeproTech公司制)以及小鼠IL-21(PeproTech公司制)。将人IL-21及小鼠IL-21分别单独固定于NHS-activatedSepharose 4Fast Flow(GE医疗公司制)的载体。IL-21在载体的固相化方法按照GE医疗公司的说明书进行。固相化量通过利用SDS-PAGE考察固相化前的IL-21溶液和刚刚固相化后的上清液来确认。根据SDS-PAGE的结果确认，未从上清中检测到IL-21的条带，所使用的IL-21几乎全部被固相化。
将通过化学合成得到的DNA模板用Fwd引物制成双链，再使用T7TranscriptionKit(本公司制)转录，得到首轮中使用的RNA(35N)。通过该方法得到的RNA中，嘧啶核苷酸的核糖的2’位被氟化。DNA模板使用下面所示的35个核苷酸的随机序列的两端带有引物序列而成的长度为84个核苷酸的DNA。DNA模板和引物通过化学合成制作。
DNA模板：
5’-AGCGCAGAGCGTCTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAAGGTTCTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGG-3’(序列号46)
引物Fwd(正向引物)：
5’-CCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAACCTTC-3’(序列号47)
引物Rev(反向引物)：5’-AGCGCAGAGCGTCTG-3’(序列号48)
DNA模板(序列号46)中的N的连续表示任意组合的35个核苷酸(35N：每个N为A、C、G或T)，其产生所得到的适体独特的序列区。正向引物包含T7 RNA聚合酶的启动子序列。
首轮中，将分别固相化有人IL-21和小鼠IL-21的载体混合使用，然后，每2轮交替使用，以实施SELEX。向固相化有IL-21的载体中加入RNA池，在37℃下缓慢搅拌并保持20分钟，然后，用溶液A清洗树脂，以除去未与IL-21结合的RNA。其中，溶液A是145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH7.6)、0.05％Tween20的混合溶液。加入6M脲(Urea)洗脱液，并在85℃下进行2分钟热処理，从上清中回收与IL-21结合后的RNA。回收后的RNA通过逆转录PCR扩增，并用T7Transcription Kit转录后，用作下一轮的池。将以上作为1轮，并反复进行多次相同的作业。5轮以后，用溶液A’(将溶液A的145mM氯化钠变更为295mM氯化钠后的溶液)清洗树脂，以去除与树脂弱结合的RNA。SELEX完成后，使用新一代测序仪进行碱基序列分析。新一代测序仪使用Ion PGMTM系统(Thermo公司制)，按照Thermo公司的说明书进行分析。
实施9轮SELEX之后，通过新一代测序仪确定了44,423个克隆序列，并确定收敛为32,891种序列。这些克隆的部分序列示于序列号1～2。序列号1所表示的序列有182个序列。序列号2所表示的序列有69个序列。序列号1和2中存在的共有序列在各自序列中用下划线表示。需要说明的是，各末端的15个碱基是引物区，因此序列是相同的。
下面分别示出核苷酸序列。如无特别说明，则下面列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，嘌呤碱基(A及G)为2’-OH体，嘧啶碱基(U及C)为2’-氟修饰体。此外，两个序列号所表示的适体的二级结构预测示于图1。该二级结构使用MFOLD程序(M.Zukker，NucleicAcids Res.31(13)，3406-3415，2003)预测(图4～6也相同)。
序列号1：
GGGAGAAGAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUCUGAGCCCAGACGCUCUGCGCU
序列号2：
GGGAGAAGAACCUUCCACGACCGACUACUGUCAAUGGCCCGUUCUUUGCCCAGACGCUCUGCGCU
通过表面等离子体共振评价序列号1和2所表示的适体对人IL-21的结合活性。测定时使用GE医疗公司制的Biacore T200。传感器芯片使用固定有右旋糖酐(葡聚糖)的CM4芯片，该右旋糖酐中导入有CM基。该传感器芯片上固定有1000RU左右作为配体的人IL-21。使用溶液A将分析物RNA制备为0.1μM，以20μL/min的流速注射60秒。运行缓冲液也使用溶液A。
根据测定判断，序列号1和2所表示的适体与人IL-21结合。将显示这些适体与人IL-21结合的情况的传感图示于图2。用作阴性对照的核苷酸序列(非人IL-21适体，51mer(GGGAAGCUCCGUCGAGCUUUCCUGCAUAAGCUGUAUUGCAGCCAGCAUUUA；序列号49))未见与人IL-21结合。由此表明，序列号1和2所表示的适体序列特异性地与人IL-21结合。
通过表面等离子体共振法评价序列号1所表示的适体是否抑制人IL-21与其受体IL-21R的结合。测定使用GE医疗公司制的Biacore T200。传感器芯片使用固定有右旋糖酐的CM5芯片，右旋糖酐导入有CM基，该传感器芯片上固定1500RU左右Protein A(Pierce公司制)。用溶液A将作为配体的人IL-21R/Fc嵌合蛋白质(R&D systems公司制)制备为0.1μM，按照10μL/min的流速注射60秒，从而固定700RU左右。按照10μL/min的流速向其中注射30秒制备为0.02μM的人IL-21后，可见结合35RU左右。为了评估适体是否会抑制该结合，在相同条件下注射人IL-21和适体的混合溶液。用溶液A制备该混合溶液，使溶液中的人IL-21浓度为0.02μM，适体浓度为0.2μM。运行缓冲液也使用溶液A。
将通过测定得到的传感图示于图3。人IL-21和序列号1的混合溶液中，未见与受体IL-21R结合，表明序列号1所表示的适体抑制人IL-21与IL-21R结合。
使用下述细胞评价系统评价序列号1和2所表示的适体在诸如细胞评价系统之类的模拟血液中的环境的条件是否还会抑制人IL-21的功能。人NK(自然杀伤)样细胞系的NK92细胞(从American Type Culture Collection公司购买)经人IL-21刺激后分泌干扰素-γ(IFN-γ)，干扰素-γ(IFN-γ)是细胞因子中的一种。将NK92细胞按照所附的说明书培养数天之后，使用从标准培养基中除去IL-2(Roche公司制)后的培养基将细胞传代。这是为了抑制IL-2导致的IFN-γ分泌。
培养过夜之后，使用相同培养基，向每1孔中分别接种2×104细胞，以用于试验。向其中仅添加人IL-21或者添加人IL-21和适体的溶液，并培养16小时。人IL-21的最终浓度调制为0.05nM。16小时后回收培养上清，通过三明治ELISA法定量上清中所含的IFN-γ。定量使用R&D systems公司制或Diaclone公司制的ELISA Kit。定量后，使用下述式子计算抑制率。
抑制率(％)＝(CIL-21-Capt)/(CIL-21-C0)×100
其中，CIL-21为仅添加人IL-21时每单位容量的IFN-γ浓度，Capt是同时添加人IL-21和适体时的IFN-γ浓度，C0是未添加人IL-21时的IFN-γ浓度。
根据试验结果判断，序列号1和2所表示的适体均会抑制人IL-21刺激引发的NK92细胞分泌IFN-γ。用作阴性对照的72个碱基的核苷酸序列(非人IL-21适体、72merGGGAAGCUCCGUCGAGCUUUCCUGCAUAAGCUGUAUUGCAGCCAGCAUUUAUUGUACGCCUGCGUAGCUCCU；(序列号50))未显示抑制活性(抑制率-7.5％)。
将上面的序列号1和2所表示的适体的评价结果总结示于表1。表1中，结合的“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。此外，“n.d.”表示未测定。
【表1】
Figure BDA0003990624060000301
序列号1和2所表示的适体与人IL-21结合并抑制其与受体IL-21R的作用。在诸如细胞评价系统之类的模拟血液中的环境的条件下也能发挥该效果，表明它们是抑制人IL-21的优异的适体。
实施例2：适体的短链化(1)
根据图1中得到的二级结构预测，进行序列号1所表示的适体的短链化。下面，将通过短链化制作的适体的核苷酸序列示作序列号3～19。各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应(序列号6中的下划线与式(1)对应))。
只要没有特别说明，则下面所列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，嘌呤碱基(A及G)为2’-OH体，嘧啶碱基(U及C)为2’-氟修饰体。
序列号3(序列号1所表示的序列缩短为51个核苷酸的长度后的序列)：
GGGAGAAGAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUCUGAGCCC
序列号4(序列号1所表示的序列缩短为43个核苷酸的长度后的序列)：
GGAGAACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUUCUCC
序列号5(序列号1所表示的序列缩短为37个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号6(序列号1所表示的序列缩短为27个核苷酸的长度后的序列)：
GGCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCC
序列号7(序列号5所表示的序列缺失由第3个和第35个碱基构成的AU碱基对，缩短为35个核苷酸的长度后的序列)：
GGCCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGCC
序列号8(将序列号7所表示的序列的由第3个和第33个碱基构成的CG碱基对(共有序列中的碱基)取代为AU碱基对后的35个核苷酸的序列)：
GGACUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCUCC
序列号9(序列号5所表示的序列缺失第5个C(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号10(序列号5所表示的序列缺失第6个U(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号11(序列号5所表示的序列缺失第15个C(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号12(序列号5所表示的序列缺失第16个G(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号13(序列号5所表示的序列缺失第17个A(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGCUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号14(序列号5所表示的序列缺失第18个C(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGAUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号15(序列号5所表示的序列缺失第19个U(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号16(序列号5所表示的序列缺失第20个A(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUCUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号17(序列号5所表示的序列缺失第21个C(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUAUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号18(序列号5所表示的序列缺失第22个U(共有序列中的碱基)，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUACCGUGAUUGCCCGUCC
序列号19(序列号5所表示的序列缺失第31个C(共有序列中的碱基，缩短为36个核苷酸的长度后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCGUCC
通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21并抑制其功能。适体是以双链DNA为模板通过转录得到的。其结果示于表2。表中，Biacore测得的结合活性的“++”表示结合量(RU值)为100以上，“+”表示结合量为20以上且低于100，“-”表示结合量低于20。抑制活性的“+”表示浓度10nM的适体通过细胞评价系统获得的抑制率(％)为20％以上，不满足标准者示作“-”。此外，“n.d.”表示未测定。
【表2】
Figure BDA0003990624060000331
Figure BDA0003990624060000341
在细胞评价系统中显示抑制活性的序列号3～5及7所表示的适体的二级结构预测示于图4。由这些结果判断，即使序列号1所表示的适体缺失末端侧而缩短为37个碱基，仍能够保持活性。此外，序列号7所表示的适体的结果表明，通过从序列号5所表示的37个碱基的适体中缺失由第3个和第35个构成的AU碱基对，可以将其缩短至35个碱基。
另一方面，序列号8所表示的适体的结果表明，若将由共有序列中的碱基彼此所构成的CG碱基对取代为AU碱基对，则活性会大幅度降低。并且，序列号9～19所表示的适体分别缺失了共有序列中的一个碱基，这些适体的结果表明，共有序列部分即使缺失了一个碱基，抑制活性也会大幅度降低。因此，本实施例显示了共有序列部分的重要性。
实施例3：适体的改造和末端修饰的研究(1)
为了提高序列号4所表示的适体(嘧啶核苷酸的核糖的2’位经氟化)的核酸酶耐受性，制作向3’端添加idT，并导入2’-O-甲基的改造体。将实施改造后的序列示于序列号4(1)～4(13)。
此外，为了考察是否可以对适体的5’端进行修饰，在序列号4和5及序列号5进一步短链化而成的序列的5’端添加PEG，从而制作修饰体。将它们示于序列号4(14)、5(1)、20、21。
下面，将序列号4(1)～4(14)、5(1)、20、21所表示的适体各自的核苷酸序列与修饰一并示出。只要没有特别说明，则下面所列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，大写字母表示RNA。核苷酸中的括号表示核糖的2’位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基。序列末端的idT表示通过inverted-dT进行的修饰，PEG表示通过40kDa的支链型聚乙二醇进行的修饰。此外，各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)，[]表示2’-O-甲基修饰的导入等，该序列号中导入了修饰或变异后的碱基。
序列号4(1)(向序列号4所表示的序列的3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(2)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)[A(M)]AC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(3)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)A[A(M)]C(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(4)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)[A(M)]C(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(5)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)[G(M)]C(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(6)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)[G(M)]AC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(7)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)G[A(M)]C(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(8)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)[A(M)]C(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(9)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)[G(M)]U(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(10)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)[G(M)]AU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(11)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)G[A(M)]U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(12)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)[G(M)]C(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(13)(向序列号4所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)[G(M)]U(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号4(14)(向序列号4所表示的序列的5’端添加PEG，并向3’端添加idT后的序列)：
PEG-GGAGAAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(1)(向序列号5所表示的序列的5’端添加PEG，并向3’端添加idT后的序列)：
PEG-GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号20(在序列号5所表示的序列缺失由各末端的碱基构成的GC碱基对后缩短的35个碱基中，向5’端添加PEG，向3’端添加idT后的序列)：
PEG-GAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)-idT
序列号21(在序列号20所表示的序列缺失由各末端的碱基构成的GC碱基对后缩短的33个碱基中，向5’端添加PEG，向3’端添加idT的序列)：
PEG-AC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)-idT
通过化学合成制作适体，并通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21结合并抑制其功能。在核酸最终浓度1nM及0.2nM时通过细胞评价系统进行抑制评价。将其结果示于表3。表中，Biacore测得的结合活性中，“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。抑制活性中，“+”表示1nM时抑制40％以上，且0.2nM时抑制15％以上，不满足标准者记作“-”。表中，“n.d.”表示未测定。
【表3】
Figure BDA0003990624060000391
以上结果表明，可以向本发明的适体的3’端添加idT。本实施例中的序列号4(1)的合成品的抑制活性比实施例2中制造的序列号4的转录品的抑制活性更高，考虑这是因为：化学合成提高了目标核酸序列的纯度；idT的添加提高了对于3’外切酶分解的抵抗性。
此外，根据以上结果还可以判断，在序列号4(2)～(13)表示的适体中，除序列号4(7)之外，全部适体保持针对人IL-21的抑制活性，即使向不同部位的碱基导入2’-O-甲基修饰，仍然可以发挥功能。序列号4(3)及4(8)的抑制活性相比序列号4(1)表示的适体提高。
另一方面，对共有序列(CGACUACU：式(1))中的第3个A进行2’-O-甲基修饰后的序列号4(7)表示的适体的抑制活性降低。
序列号4(14)、5(1)、20及21所表示的适体的结果表明，可以进行5’端的PEG修饰。序列号20和21所表示的适体的结果表明，序列号5(1)的末端缺失一个碱基对后的35个碱基保持抑制活性，末端缺失两个碱基对后的33个碱基仍具有抑制活性。
实施例4：适体的改造(2)
为了提高序列号5所表示的适体(嘧啶核苷酸的核糖的2’位经氟化)的核酸酶耐受性，制作导入有2’-O-甲基的改造体。下面，将所制作的改造体的核苷酸序列作为序列号5(2)～5(18)与修饰一并示出。
此外，为了优化序列，制作取代了序列的一部分的改造体。下面，将通过序列取代所制作的改造体的核苷酸序列作为序列号22、23与修饰一并示出。只要没有特别说明，则下面列举的各个序列按照5’至3’的方向表示，大写字母表示RNA。核苷酸中的括号表示核糖的2’位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基。序列末端的idT表示通过inverted-dT进行的修饰。此外，各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)，[]表示2’-O-甲基修饰的导入等，向其最近的序列号新导入修饰或变异后的碱基。
序列号5(2)(向序列号5所表示的序列的3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(3)(以反映序列号4(3)、(8)～(11)、(13)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号5所表示的序列导入修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)A[A(M)]C(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)[A(M)]C(F)U(F)C(F)[G(M)]U(F)[G(M)][A(M)]U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)[G(M)]U(F)C(F)C(F)-idT
序列号22(将序列号5(3)表示的序列的第17个A(共有序列中的碱基)取代为G后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AA(M)C(F)AC(F)GC(F)G[G]C(F)U(F)A(M)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(4)(以反映序列号4(4)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号5(3)表示的序列导入修饰后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AA(M)C(F)[A(M)]C(F)GC(F)GAC(F)U(F)A(M)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(5)(以反映序列号4(5)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号5(4)表示的序列导入修饰后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AA(M)C(F)A(M)C(F)[G(M)]C(F)GAC(F)U(F)A(M)C(F)U (F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(6)(以反映序列号4(2)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号5(5)表示的序列导入修饰后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)[A(M)]A(M)C(F)A(M)C(F)G(M)C(F)GAC(F)U(F)A(M)C (F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(7)(以反映序列号4(12)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号5(6)表示的序列导入修饰后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(F)A(M)C(F)G(M)C(F)GAC(F)U(F)A(M)C(F) U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)[G(M)]C(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(8)(向序列号5(3)表示的序列的两个末端的3个碱基(3个碱基对)分别导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
[G(M)][G(M)][A(M)]C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AA(M)C(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)A (M)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)G(M)[U(M)][C(M)][C(M)]-idT
序列号23(将序列号5(8)表示的序列的由第2个和第36个碱基构成的GC碱基对取代为AU碱基对后的序列)：
G(M)[A(M)]A(M)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AA(M)C(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)A(M)C (F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)A(M)U(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)G(M)U(M)[U(M)]C(M)-idT
序列号5(9)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGA[C(M)]C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(10)(向序列号5所表示的序列的两处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AA[C(M)]A[C(M)]GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(11)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)G[C(M)]GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(12)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GA[C(M)]U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(13)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)[U(M)]AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(14)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)A[C(M)]U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(15)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)G[U(M)]GAU(F)U(F)GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(16)(向序列号5所表示的序列的两处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GA[U(M)][U(M)]GC(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(17)(向序列号5所表示的序列的两处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)G[C(M)][C(M)]C(F)GU(F)C(F)C(F)-idT
序列号5(18)(向序列号5所表示的序列的一处导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
GGAC(F)C(F)U(F)U(F)C(F)AAC(F)AC(F)GC(F)GAC(F)U(F)AC(F)U(F)C(F)GU(F)GAU(F)U(F)GC(F)C(F)[C(M)]GU(F)C(F)C(F)-idT
通过化学合成制作适体，并通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21结合并抑制其功能。在核酸最终浓度1nM和0.2nM时通过细胞评价系统进行抑制评价。将其结果示于表4。表中，Biacore测定的结合中，“++”表示适体针对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。抑制的“+”表示1nM时抑制40％以上，且0.2nM时抑制15％以上，不满足标准者记作“-”。表中，“n.d.”表示未测定。
【表4】
Figure BDA0003990624060000451
根据序列号5(3)～5(7)表示的适体的结果判断，在序列号4所表示的适体中针对每个碱基导入的2’-O-甲基修饰即使组合导入，也不会影响适体的抑制活性，反而会提高活性。这表明，对于最新探讨了2’-O-甲基修饰的部位，序列号5(9)～5(10)及5(14)～5(17)表示的适体保持或提高活性。
另一方面，序列号5(11)～5(13)及5(18)表示的适体的抑制活性降低。结合实施例3的结果来看，序列号5所表示的适体的从第15个至第19个碱基(CGACU)的活性因2’-O-甲基修饰而降低。该序列是共有序列(CGACUACU：式(1))的一部分，本实施例的结果也表明共有序列部分对于抑制活性很重要。
序列号22所表示的适体中，将序列号5的共有序列(CGACUACU：式(1))中的第3个A取代为了G，但判断该碱基取代不会影响抑制活性。此外，该碱基取代会改变适体的二级结构预测。序列号22所表示的适体的二级结构预测示于图5。根据序列号23所表示的适体的结果判断，即使将序列号5所表示的序列的由第2个和第36个碱基构成的GC碱基对取代为AU碱基对，也不会影响活性。
实施例5：适体的改造(3)
为了提高序列号22所表示的适体的核酸酶耐受性，制作导入有2’-O-甲基的改造体、将部分碱基从RNA取代为DNA的改造体。将所制作的改造体示于序列号22(1)～22(14)。其中，对序列号22(2)实施5’端的PEG修饰后，再将该序列缩短2个碱基大小后实施相同的末端修饰，从而制造改造体。将这些示于序列号22(15)、24。
下面，将序列号22(1)～22(15)、24所表示的适体各自的核苷酸序列与修饰一并示出。只要没有特别说明，则下面列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，大写字母表示RNA，小写字母表示DNA。核苷酸中的括号表示核糖的2’位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基。序列末端中的idT表示通过inverted-dT进行的修饰，PEG表示40kDa的支链型聚乙二醇进行的修饰。此外，各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)，[]表示2’-O-甲基修饰的导入等，向其最近的序列号新导入修饰或变异后的碱基。
序列号22(1)(以组合反映序列号5(7)、(8)、(12)、(16)、(18)、(20)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号22所表示的序列导入修饰后的序列)：
[G(M)][G(M)][A(M)]C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)[A(M)]A(M)[C(M)][A(M)][C(M)][G(M)]C(F)GGC(F)U(F)A(M)[C(M)]U(F)C(F)G(M)[U(M)]G(M)A(M)U(F)U(F)[G(M)][C(M)][C (M)]C(F)G(M)[U(M)][C(M)][C(M)]-idT
序列号22(2)(以反映序列号5(9)、(19)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号22(1)表示的序列导入修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)[C(M)]C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)[U(M)][U(M)]G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(3)(在序列号22(1)表示的序列中2’位经氟化中的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(F)[C(M)]U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(F)U(F)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(4)(向序列号22(1)表示的序列中2’位经氟化的碱基中的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(F)C(F)[U(M)]U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(F)U(F)G(M)C(M)C(M)(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(5)(向序列号22(1)表示的序列中2’位经氟化的碱基中的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(F)C(F)U(F)[U(M)]C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(F)U(F)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(6)(向序列号22(1)表示的序列中2’位经氟化的碱基中的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(F)C(F)U(F)U(F)[C(M)]A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(F)U(F)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(7)(向序列号22(1)表示的序列中2’位经氟化的碱基中的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)[U(M)]C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(F)U(F)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(8)(向序列号22(1)表示的序列中2’位经氟化的碱基中的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)[C(M)]G(M)U(M)G(M)A(M)U(F)U(F)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(9)(以组合反映序列号22(4)、(6)、(8)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号22(2)表示的序列导入修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(M)C(F)[U(M)]U(F)[C(M)]A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC (F)U(F)A(M)C(M)U(F)[C(M)]G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(10)(向序列号22(9)表示的序列的未修饰RNA的一处导入2’-O-甲基修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(M)C(F)U(M)U(F)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)[G(M)]GC (F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(11)(以组合反映序列号22(3)、(5)的2’-O-甲基修饰的方式向序列号22(10)表示的序列导入修饰后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(M)[C(M)]U(M)[U(M)]C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)G(M) GC(F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(12)(将序列号22(2)表示的序列中的未修饰RNA的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)[g]GC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(13)(将序列号22(2)表示的序列中的未修饰RNA的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)G[g]C(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(14)(将序列号22(2)表示的序列中的未修饰RNA的两处取代为DNA后的序列)：
G(M)G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)[g][g]C (F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号22(15)(向序列号22(2)表示的序列的5’端添加PEG后的序列)：
PEG-G(M)G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC (F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)C(M)-idT
序列号24(使序列号22(15)表示的序列的两个末端分别缺失一个碱基，缩短成35个碱基，并实施同样的末端修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
通过化学合成制作适体，并通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21结合并抑制其功能。在核酸最终浓度1nM及0.2nM时通过细胞评价系统实施抑制评价。将其结果示于表5。表中，Biacore测得的结合的“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。抑制的“+”表示1nM时抑制40％以上，且0.2nM时抑制15％以上，不满足标准者记作“-”。表中，“n.d.”表示未测定。
【表5】
Figure BDA0003990624060000511
序列号22(1)和22(2)表示的适体的评价结果表明，通过将实施例4中针对每个碱基所进行的2’-O-甲基修饰组合，使得抑制活性进一步提高。根据序列号22(7)表示的适体的结果判断，共有序列(CGGCUACU：式(1))的第8个U的活性因2’-O-甲基修饰而降低。
针对序列号22(3)～22(6)表示的适体中进行了修饰的序列(CUUC(共有序列：式(2)的一部分))，单碱基修饰对活性没有很大影响，但如果像序列号22(11)表示的适体那样，向全部四个碱基导入修饰，则判明对IL-21的结合活性会消失。
根据序列号22(12)～22(14)表示的适体的结果判断，即使共有序列(CGGCUACU：式(1))的第2个G及第3个G是DNA，也会起作用。
根据序列号22(15)表示的适体的结果判断，即使对5’端进行PEG修饰，也不会影响活性，并且将该适体的末端缩短一个碱基对制成35个碱基后的由序列号24所表示的适体也保持了活性。
实施例6：制作与人IL-21特异性结合的RNA适体(2)
使用随机序列和引物序列与实施例1中使用的序列不同的模板，与实施例1相同地进行SELEX。靶物质使用固相化于NHS-activated Sepharose 4Fast Flow(GE医疗公司制)的载体的人IL-21(PeproTech公司制)。下面示出所使用的模板和引物的序列。DNA模板和引物通过化学合成制作。模板DNA中基于序列号4的序列导入了变异。
DNA模板：5’-GCAGAGCTCGTGCTC(A)(G)(A)(A)(C)(G)(G)(G)(C)(A)(A)(T)(C)(A)(C)(G)(A)(G)(T)(A)(G)(T)(C)(G)(C)(G)(T)(G)(T)(T)(G)(A)(A)(G)(G)(T)(T)(C)(T)TCTCACTGTGAGCCC-3’(序列号51)
引物Fwd(正向引物)：
5’-TAATACGACTCACTATAGGGCTCACAGTGAGA-3’(序列号52)
引物Rev(反向引物)：5’-GCAGAGCTCGTGCTC-3’(序列号53)
DNA模板(序列号51)中的括号表示导入变异，设计括号内所示的核苷酸包含76％，其它三种核苷酸分别包含8％。引物Fwd包含T7 RNA聚合酶的启动子序列。
向固相化有人IL-21的载体加入RNA池，在37℃下缓慢搅拌并保持20分钟，然后，用溶液A清洗树脂，以除去未与人IL-21结合的RNA。其中，溶液A是145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH7.6)、0.05％Tween20的混合溶液。加入超纯水(ELGA水)，并在90℃下进行2分钟热処理，从上清中回收与人IL-21结合后的RNA。回收后的RNA通过逆转录PCR扩增，并用T7 Transcription Kit转录后，用作下一轮的池。将以上作为1轮，并反复进行多次相同的作业。4轮以后，用溶液A’(将溶液A的145mM氯化钠变更为295mM氯化钠后的溶液)清洗树脂，以去除与树脂弱结合的RNA。SELEX完成后，使用新一代测序仪进行碱基序列分析。新一代测序仪使用Ion PGMTM系统(Thermo公司制)，按照Thermo公司的说明书进行分析。
实施6轮SELEX之后，通过新一代测序仪确定了546,954个克隆序列，并且确定收敛为67,013种序列。此时，包含作为基础的序列号4的序列的克隆有2,765个序列，在整体中排在第14位。分析后的克隆的部分序列示于序列号25～36。需要说明的是，这里所示的序列是将通过SELEX获得的69个碱基的序列缩短为37个碱基后的序列，使其具有与序列号5的序列相同的结构。各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)。此外，这些克隆序列的二级结构预测示于图6。序列与序列号5不同的碱基用箭头(黑三角形)表示。
下面示出序列号25～36所表示的适体各自的核苷酸序列。只要没有特别说明，则下面列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，嘌呤碱基(A及G)为2’-OH体，嘧啶碱基(U及C)为2’-氟修饰体。
序列号25：
GGACCUUCAACACGCGAUUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号26：
GGACCUUCAACAAGCGAUUACUCUUGAUUGCACGUCC
序列号27：
GGACCUUCAACCCGCGAUUACUCGGGAUUGCCCGUCC
序列号28：
GGACCUUCAACCCGCGACUACUCGGGAUUGCCCGUCC
序列号29：
GGCCCGCCAACACACGAUUACUUGUGAUUGUCCGGCC
序列号30：
GGACCUUCAACACGCGAUUACUCGUGAUUGACCGUCC
序列号31：
GGACCUUCAACGCGCGACUACUCGCGAUUGCCCGUCC
序列号32：
GGACCGCCAACACACGAUUACUUGUGAUUGCCCGUCC
序列号33：
GGACCUUCAACCCGCGAUUACUCGGGAUUGCACGUCC
序列号34：
GGACCGCCAACACACGACUACUUGUGAUUGUCCGUCC
序列号35：
GGACCUUCAUCACGCGAUUACUCGUGAAUGCCCGUCC
序列号36：
GGACCGCCAACAAACGAUUACUUUUGAUUGUCCGUCC
通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21结合并抑制其功能。适体是以双链DNA为模板通过转录得到的。在核酸最终浓度30nM及10nM时通过细胞评价系统进行抑制评价。将其结果示于表6。表中，Biacore测得的结合的“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。抑制的“+”表示30nM时抑制50％以上，且10nM时抑制20％以上，不满足标准者记作“-”。
【表6】
Figure BDA0003990624060000551
在序列号25～36所表示的适体中，除序列号30所表示的适体之外，均强效抑制人IL-21的功能。如图6所示，多个克隆中也有发生相同碱基取代的部位。具有多个共有序列(CGACUACU：式(1))中的第4个C取代为U的克隆。此外，还存在多个共有序列(CCUUC：式(2))中第3个U和第4个U分别取代为G和C的克隆。同样地，也存在多个共有序列(GCCCG：式(3))中的第2个C取代为U，第3个C取代为A的克隆，判断在由式(2)部分和式(3)部分形成的内环中，也存在可以进行碱基取代并同时保持抑制活性的部位。判断在茎部分的碱基中产生了各种各样的碱基取代，并允许各种组合。
实施例7：适体的改造(4)
为了提高序列号28所表示的适体的核酸酶耐受性，制作导入有2’-O-甲基的改造体。此外，短链化之后，还实施了5’端的PEG修饰。下面，将所制作的改造体的核苷酸序列作为序列号37、38、38(1)与修饰一并示出。只要没有特别说明，则下面列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，大写字母表示RNA。核苷酸中的括号表示核糖的2’位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基。序列末端的idT表示通过inverted-dT进行的修饰，PEG表示通过40kDa的支链型聚乙二醇进行的修饰。此外，各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)，[]表示2’-O-甲基修饰的导入等，向其最近的序列号新导入修饰或变异后的碱基。
序列号37(将序列号28所表示的序列的第17个A取代为G，以反映序列号22(2)的2’位的修饰的方式导入2’-O-甲基修饰，并向3’端添加idT后的序列)：
[G(M)][G(M)][A(M)][C(M)]C(F)U(F)U(F)C(F)[A(M)][A(M)][C(M)][C(M)][C(M)][G(M)]C(F)G[G]C(F)U(F)[A(M)][C(M)]U(F)C(F)[G(M)][G(M)][G(M)][A(M)][U(M)][U(M)][G(M)][C(M)][C(M)][C(F)][G(M)][U(M)][C(M)][C(M)]-idT
序列号38(使序列号37所表示的序列的两个末端分别缺失一个碱基，缩短为35个核苷酸的长度，并向3’端添加idT后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A (M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(1)(向序列号38所表示的序列的5’端添加PEG后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
通过化学合成制作适体，通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21并抑制其功能。表中，Biacore测得的结合活性中，“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。在核酸最终浓度1nM及0.2nM时通过细胞评价系统进行抑制评价。此外，在细胞评价系统中，求得50％抑制IL-21刺激所引发的IFN-γ分泌时的适体浓度(IC50)。将其结果示于表7。表中，“n.d.”表示未测定。
【表7】
Figure BDA0003990624060000571
序列号37所表示的适体的结果表明，与序列号5所表示的适体相同，序列号28所表示的适体也可以将第17个A取代为G。此外还判断，即使向不同位置的碱基导入2’-O-甲基修饰，也不会影响活性。序列号38和38(1)表示的适体的结果表明，即使缩短为35个碱基，活性也保持不变，还可以对5’端进行PEG修饰。
实施例8：适体的改造和末端修饰(5)
为了提高序列号38所表示的适体的核酸酶耐受性，制造将部分碱基从RNA取代为DNA后的改造体、导入硫代磷酸酯的改造体。并且，为了对末端修饰也进行探讨，制作5’端添加有脂肪酸的序列。下面，将所制作的改造体的核苷酸序列作为序列号38(2)～38(21)与修饰一并示出。只要没有特别说明，则下面列举的每个序列按照5’至3’的方向表示，大写字母表示RNA，小写字母表示DNA。核苷酸中的括号表示核糖的2’位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基。序列末端中的idT表示通过inverted-dT进行的修饰，PEG表示通过40kDa的支链型聚乙二醇进行的修饰。作为脂肪酸修饰，Myr表示肉豆蔻酸，Pal表示棕榈酸。序列中的s表示将核苷酸彼此连接的磷酸基被硫代磷酸酯化。此外，各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)，[]表示取代为DNA等，向其最近的序列号新导入修饰或变异后的碱基。
序列号38(2)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)[c]U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(3)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)[u]U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(4)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)[u]C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(5)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)[c]A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(6)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)[c]GGC(F)U(F)A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(7)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GG[c]U(F)A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(8)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)[u]A(M) C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(9)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A (M)C(M)[u]C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(10)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A (M)C(M)U(F)[c]G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(11)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的碱基中的一处取代为DNA后的序列)：
G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U(F)A (M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)[c]G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(12)(将序列号38所表示的序列的2’位经氟化的全部碱基取代为DNA，并向5’端添加PEG后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)[c][u][u][c]A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)[c]GG[c][u]A(M)C (M)[u][c]G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)[c]G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(13)(向序列号38(1)表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)[C(F)s]GGC(F) U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(14)(向序列号38(1)表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)[Gs]GC(F) U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(15)(向序列号38(1)表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)G[Gs]C(F) U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(16)(向序列号38(1)表示的序列的两处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)[C(F)s][Gs]GC (F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(17)(向序列号38(1)表示的序列的两处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)[C(F)s]G[Gs]C (F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(18)(向序列号38(1)表示的序列的两处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)[Gs][Gs]C (F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(19)(向序列号38(1)表示的序列的三处导入硫代磷酸酯修饰后的序列)：
PEG-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)[C(F)s][Gs] [Gs]C(F)U(F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(20)(向序列号38所表示的序列的5’端添加Myr后的序列)：
Myr-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
序列号38(21)(向序列号38所表示的序列的5’端添加Pal后的序列)：
Pal-G(M)A(M)C(M)C(F)U(F)U(F)C(F)A(M)A(M)C(M)C(M)C(M)G(M)C(F)GGC(F)U (F)A(M)C(M)U(F)C(F)G(M)G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)C(M)C(M)C(F)G(M)U(M)C(M)-idT
通过化学合成制作适体，并通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21结合并抑制其功能。在核酸最终浓度1nM及0.1nM时通过细胞评价系统进行抑制评价。将其结果示于表8。表中，Biacore测得的结合的“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。抑制的“+”表示1nM时抑制40％以上，且0.1nM时抑制15％以上，不满足标准者记作“-”。表中，“n.d.”表示未测定。
【表8】
Figure BDA0003990624060000641
序列号38(2)～38(11)表示的适体的抑制活性虽然有强有弱，但均对人IL-21显示抑制活性。根据以上结果判断，即使将序列号38所表示的适体的2’位经氟化的碱基中的至少一处取代为DNA，也能够保持活性。其中，序列号38(12)表示的适体的结果表明，若将全部地方取代为DNA，则结合活性消失。序列号38(13)～38(19)表示的适体均保持较高的抑制活性，判断在本次探讨的三处，即使磷酸基被硫代磷酸酯化，也不会影响活性。
根据序列号38(20)和38(21)表示的适体的结果判断，对5’端的修饰不限定于PEG，也可以使用脂肪酸等。
实施例9：探讨适体的碱基取代
根据以上实施例的结果还可以判断，虽然在抑制人IL-21的功能方面，共有序列部分的碱基序列非常重要，但仍存在可进行碱基取代的部位。因此，制作序列号5所表示的适体的共有序列部分的一部分经碱基取代后的序列。下面，将所制作的碱基取代体的一部分核苷酸序列示作序列号39～43。只要没有特别说明，下面所列举的各个序列按照5’至3’的方向表示，嘌呤碱基(A及G)为2’-OH体，嘧啶碱基(U及C)为2’-氟修饰体。此外，各序列中的下划线表示共有序列(从5’端侧起依次与式(2)、式(1)及式(3)对应)，[]表示序列号5所表示的序列中的碱基取代。
序列号39(将序列号5所表示的序列的第6个U取代为G后的序列)：
GGACC[G]UCAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号40(将序列号5所表示的序列的第7个U取代为C的序列)：
GGACCU[C]CAACACGCGACUACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号41(将序列号5所表示的序列的第19个U取代为G后的序列)：
GGACCUUCAACACGCGAC[G]ACUCGUGAUUGCCCGUCC
序列号42(将序列号5所表示的序列的第22个U取代为C的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUAC[C]CGUGAUUGCCCGUCC
序列号43(将序列号5所表示的序列的第32个C取代为A的序列)：
GGACCUUCAACACGCGACUACUCGUGAUUGC[A]CGUCC
通过与实施例1相同的方法评价这些适体是否与人IL-21结合并抑制其功能。适体是以双链DNA为模板通过转录得到的。在核酸最终浓度10nM时通过细胞评价系统进行抑制评价。将其结果示于表9。表中，Biacore测得的结合的“++”表示适体对固定于CM4芯片的人IL-21的结合量(RU值)为100以上。抑制的“+”表示10nM时抑制20％以上，不满足标准者记作“-”。表中，“n.d.”表示未测定。
【表9】
Figure BDA0003990624060000661
与序列号5所表示的适体相同，序列号39～43所表示的适体也均抑制人IL-21的功能。
根据以上结果判断，共有序列(CGACUACU：式(1))中的第5个U可以取代为G，第8个U可以取代为C。同样可以判断，式(2)部分(CCUUC)还可以为CCGUC或CCUCC，式(3)部分(GCCCG)还可以为GCACG。
工业适用性
本发明的适体可以用于治疗或预防肺动脉高压症的药剂、或者诊断药、检查药、试剂。本申请以日本申请的日本特愿2020-104831(申请日：2020年6月17日)为基础，其内容全部包括在本说明书中。

Claims (17)

1.一种适体，其与白细胞介素-21结合。
2.根据权利要求1所述的适体，其中，所述适体抑制白细胞介素-21与其受体的结合。
3.根据权利要求1或2所述的适体，其中，所述适体包含以下式(1)表示的核苷酸序列，
CGRYKACY(1)
式中，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U。
4.根据权利要求3所述的适体，其中，在式(1)中的第1个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。
5.根据权利要求3或4所述的适体，其中，所述适体还包含以下式(2)表示的核苷酸序列和以下式(3)表示的核苷酸序列，
CCKYC(2)
式中，K表示G或U，Y表示C或U；
GYMCG(3)
式中，Y表示C或U，M表示A或C。
6.根据权利要求5所述的适体，其中，所述适体从5’端侧起依次包含式(2)、式(1)、式(3)的各核苷酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的适体，其中，式(1)中的第4个Y为C，K和第8个Y分别为U，
式(2)中的K和Y分别为U，
式(3)中的Y和M分别为C。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的适体，其中，所述适体包含以下式(4)表示的核苷酸序列，
CCKYC-N1-CGRYKACY-N2-GYMCG(4)
式中，N1为5～9个中任意长度的核苷酸序列，N2为5～10个中任意长度的核苷酸序列，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U，M表示A或C。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的适体，其中，所述适体包含以下式(5)表示的核苷酸序列，
X1CCKYCX2-N1a-X3CGRYKACYX4-N2a-X5GYMCGX6(5)
式中，N1a为3～7个中任意长度的核苷酸序列，N2a为3～8个中任意长度的核苷酸序列，X1和X6、X2和X5及X3和X4分别为彼此互补的核苷酸，R表示A或G，Y表示C或U，K表示G或U，M表示A或C。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的适体，所述适体包含取代、缺失、插入或添加一个或多个核苷酸后的核苷酸序列，其中，
(a)在该适体所含的核苷酸中，
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位为氟原子，
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位为羟基；
(b)在该(a)的适体中，
(i)各嘧啶核苷酸的核糖的2’位的氟原子分别独立地为非取代，或被选自氢原子、羟基和甲氧基中的原子或基团取代，
(ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2’位的羟基分别独立地为非取代，或被选自氢原子、甲氧基和氟原子中的原子或基团取代。
11.根据权利要求5～9中任一项所述的适体，其中，在式(3)：GYMCG的第4个C上，核糖2’位的羟基被氟代基取代。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的适体，其中，核苷酸的长度为65个核苷酸以下。
13.根据权利要求8或9所述的适体，其中，所述适体包含以下(a)或(b)的核苷酸序列，
(a)序列号1～5、7、20～29及31～43中任一个所表示的核苷酸序列，其中，尿嘧啶(U)可以为胸腺嘧啶(T)；
(b)在上述(a)的核苷酸序列中取代、缺失、插入或添加一个或多个核苷酸而成的核苷酸序列。
14.一种复合物，其包含权利要求1～13中任一项所述的适体和功能性物质。
15.根据权利要求14所述的复合物，其中，功能性物质为亲和性物质、标记用物质、酶、药物递送介质或药物。
16.一种药剂，其包含权利要求1～13中任一项所述的适体或者权利要求14或15所述的复合物。
17.根据权利要求16所述的药剂，其中，所述药剂用于治疗或预防肺动脉高压症。
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