CN115916802A - 位点特异性抗体偶联物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了位点特异性蛋白质偶联物及其制备方法。所述蛋白质偶联物包含蛋白质和寡糖，其中所述寡糖包含(I)，其中：所述GlcNAc直接或间接与所述蛋白质的氨基酸连接；所述Gal是半乳糖；所述(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；所述Fuc*包含与目标分子(MOI)连接的岩藻糖或岩藻糖衍生物，所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月21日提交的标题为“抗体偶联物和用于制备抗体偶联物的化学酶N-聚糖编辑策略”的申请号为PCT/CN2020/110607的PCT申请的优先权的权益，所述申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
抗体偶联物，即通过连接子与目标分子(MOI)偶联的抗体，在本领域是已知的。它们独特的性质组合了单克隆抗体(mAb)的特异性和MOI的活性(诸如毒性)。抗体-偶联物作为将高效药物递送至肿瘤的强效试剂，具有极小的脱靶毒性。大约有数百种抗体偶联药物已经被FDA批准或正在进行临床/临床前评估。。
本领域已知的抗体-偶联物通常有几个缺陷。例如，大多数经FDA批准或正在进行临床评估的ADC通过修饰天然氨基酸侧链(赖氨酸、半胱氨酸)与有效载荷偶联，导致药物-抗体比(DAR)的随机分布。这种ADC的异质混合物已被证明显示出低疗效和窄治疗窗。此外，这种连接不稳定，导致高毒性有效载荷解离进入血液中。不同的方法已经被开发用于来高效地获得位点特异性且稳定的ADC。然而，这些方法中的大多数仍然需要通过定点突变或引入基因编码的标签来修饰抗体。抗体的基因再工程改造是艰巨的任务，并且有时会导致受损的表达产率，这对ADC的商品成本具有负面影响。此外，待引入的氨基酸或氨基酸序列的位置需要被仔细的优化。
最近，抗体的侧链聚糖的修饰已成为位点特异性偶联的便捷方式，而无需另外的基因再工程改造。然而，糖基化是高度异质的翻译后修饰，从而使得使用化学修饰产生同质聚糖成为艰巨的挑战。大多数治疗性mAb在Asn297具有在核心α-1,6-岩藻糖基化、末端唾液酸化和半乳糖基化方面具有异质性的单一N-连接的双天线碳水化合物结构，其位于分子Fc区的两条重链中。已经进行了几种尝试用以改造N297聚糖部分，从而在天然抗体上构建抗体偶联物(Bertozzi C.R.等人，Bioconjugate Chem.2015,26,176-192)。
通过代谢引入策略，Okeley N.M.等人能够以60-70％的比例将6-硫代岩藻糖引入到IgG的聚糖中(Okeley N.M.等人，Bioconjugate Chem.2013,24,1650-1655)。紧接着与马来酰亚胺连接的MMAE缀合后，他们得到了DAR为1.3的偶联物。然而，非天然6-硫代岩藻糖的引入比例难以控制，导致异质抗体偶联物。
通过使用内切糖苷酶及其突变体在抗体的Fc结构域的N-聚糖上安装反应手柄，几种策略被开发了出来。一般来说，N297聚糖首先被内切糖苷酶修饰，留下有或无核心岩藻糖基化的核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分。然后，使用内切糖苷酶突变体将具有炔基或叠氮基的寡糖转移到经修剪的抗体上。Wang L.等人报道了通过使用EndoS及其突变体将含有两个6-叠氮基甘露糖部分的四糖噁唑啉转移到利妥昔单抗上，产生了含有四个叠氮基的抗体分子(Wang L.等人，J.Am.Chem.Soc.2012,134,12308-12318)。同样，Huang W.等人报道了将具有叠氮标签的非天然蛋黄唾液酸糖肽(SGP)衍生物转移到曲妥珠单抗上，随后通过与缀合有DBCO的细胞毒素反应，产生了DAR为4的均一抗体药物偶联物(Huang W.等人，Org.Biomol.Chem.,2016,14,9501–9518)。然而，糖苷合成酶策略的缺点是所需的寡糖衍生物的比较冗长并且合成复杂。
Zhou Q.等人使用半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶在抗体上的N297的天然聚糖上引入末端唾液酸(Zhou Q.等人，Bioconjugate Chem.2014,25,510-520)。通过对这些唾液酸进行高碘酸盐氧化产生醛基，这些醛基随后被用于通过肟连接反应偶联氨氧基功能化的细胞毒素。这种策略使得每个抗体分子平均能引入1.6个细胞毒素。类似地，通过用高碘酸钠处理核心岩藻糖基化的IgG，Neri D.等人能够将核心岩藻糖残基氧化成醛，所述醛被进一步用于制备具有荧光团的或者多拉司他汀类似物的腙偶联物和具有(Neri D.等人，Chem.Commun.,2012,48,7100–7102)。然而，使用高碘酸盐氧化可能导致对抗体的氧化损伤。
Dimitrov D.S.等人利用牛GalT-Y289L半乳糖基转移酶突变体将C2酮基取代的半乳糖转移至完整的抗体的去半乳糖化的G0F糖型的末端的GlcNAc上(Dimitrov D.S等人，mAbs,2014,6,1190-1200)。接下来的肟连接反应，使得能够将细胞毒素安装到修饰的抗体上。Boons G.等人利用ST6Gal1将C9位被叠氮修饰的唾液酸衍生物引入到完整抗体的末端半乳糖上，产生了四个叠氮基修饰的抗体(Boons G.等人，Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7179-7182)。van Delft F.L.等人利用牛半乳糖基转移酶的突变体(GalT-Y289L)将叠氮标记的N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAz)转移到完整抗体的核心-GlcNAc-Fc结构域上，无论是否具有核心-岩藻糖基化，产生了含有两个叠氮基的抗体分子，随后与缀合有双环壬炔(BCN)的细胞毒素反应，能够产生DAR为2的同质ADC(van Delft F.L.等人，BioconjugateChem.2015,26,2233-2242)。然而，通过这些策略，只有非常有限的基团(通常是叠氮基和酮基)能被修饰到抗体上，导致第二个连接步骤中仅有非常有限的反应可以被使用，用于将目标分子引入抗体。因此，一种能够将多个功能反应基团引入抗体中，或者将目标分子(MOI)直接引入抗体中而无需第二步连接反应的糖编辑策略，是高度被需要的。然而，由于众多因素，包括对抗体亲和力的最小干扰、装载的有效载荷的数量和位点、键联稳定性和偶联物的均一性难以控制，开发这种强大的偶联策略以产生有效且安全的ADC仍然具有很高的挑战性。因此，具有明确DAR、高度均一性和高稳定性的抗体偶联物，以及制备该抗体偶联物的方法，是被迫切需要的。
发明内容
本申请提供了蛋白质偶联物及其制备方法。本申请的蛋白质偶联物具有以下特征中的至少一个：(a)良好控制和明确的偶联位点；(b)明确的目标分子(MOI)与抗体的比率(MAR)(c)高均一性；(d)对抗体结合亲和力的影响可忽略不计；(e)高稳定性(例如，偶联键联在人血浆中稳定至少一天，例如两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天或更多天)；(f)高反应性或良好的活性。
利用本发明开发的方法，可以使用α-1,3-岩藻糖转移酶和GDP-(F)m-(L)n-Y1将多种功能性反应基团(例如叠氮、BCN、TCO、MCP和Tz)转移到抗体上，以产生具有高反应性的抗体-官能团-偶联物。多种连接反应可用于将药学活性物质P(例如细胞毒素)安装到抗体上以产生抗体偶联物(“两步”法)。此外，可以使用α-1,3-岩藻糖转移酶和GDP-(F)m-(L)n-P将药学活性物质P(例如细胞毒素)直接转移到抗体上，以产生抗体偶联物(“一步”法)。通过“一步”或“两步”法，我们能够产生高度均一和稳定的抗体偶联物，具有优异的活性和可忽略的抗体结合亲和力影响。
一方面，本申请提供了蛋白质偶联物，其包含蛋白质和寡糖，其中所述寡糖包含
的结构，其中：所述GlcNAc与所述蛋白质的氨基酸直接或间接连接；所述Gal是半乳糖；所述(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；所述Fuc*包含与目标分子(MOI)连接的岩藻糖或岩藻糖衍生物，所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段。
在一些实施方案中，寡糖是N-连接的寡糖。在一些实施方案中，寡糖是O-连接的寡糖。
在一些实施方案中，寡糖与所述蛋白质的Asn残基连接。
在一些实施方案中，所述寡糖中的GlcNAc直接与所述蛋白质的Asn残基连接。
在一些实施方案中，所述寡糖中的GlcNAc与所述寡糖的糖连接。
在一些实施方案中，所述寡糖中的GlcNAc与所述寡糖的甘露糖连接。
在一些实施方案中，蛋白质包含Fc片段。
在一些实施方案中，蛋白质包含Fc片段，并且寡糖与所述Fc片段连接。
在一些实施方案中，寡糖与所述Fc片段的CH2结构域连接。
在一些实施方案中，寡糖与所述Fc片段的Asn297位置(根据Kabat编号系统编号的)连接。
在一些实施方案中，蛋白质是抗体。
在一些实施方案中，蛋白质是抗体，并且蛋白质偶联物能够与抗原结合。在一些实施方案中，蛋白质是抗体，并且与相应的抗体相比，蛋白质偶联物对抗原具有相似的结合亲和力。在一些实施方案中，蛋白质是抗体，并且与相应的抗体相比，蛋白质偶联物对抗原具有相当的结合亲和力。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且所述蛋白质偶联物的结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约0.1％至约100000％。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且所述蛋白质偶联物的结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约1％至约10000％。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且所述蛋白质偶联物的结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约10％至约1000％。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且所述蛋白质偶联物的结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约50％至约200％。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG2抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG3抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体。
在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是全人抗体。
在一些实施方案中，所述Fuc*的岩藻糖或岩藻糖衍生物通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与所述GlcNAc连接。
在一些实施方案中，Gal通过Galβ1,4GlcNA键联与所述GlcNAc连接。
在一些实施方案中，岩藻糖(Fuc)通过α1,6键联与所述GlcNAc连接。
在一些实施方案中，Fuc*的MOI包含活性部分。
在一些实施方案中，所述活性部分是化学活性部分、酶促活性部分、生物活性部分和/或药学活性部分。
在一些实施方案中，活性部分包含化学活性部分和/或酶促活性部分。
在一些实施方案中，所述活性部分包含能够参与连接反应的官能团Y1。
在一些实施方案中，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
在一些实施方案中，Y1包含选自以下组：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
在一些实施方案中，Y1包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
在一些实施方案中，Y1包含选自以下组的功能性部分：
在一些实施方案中，MOI的活性部分包含P，并且P是生物和/或药学活性物质。
在一些实施方案中，P是药学活性物质。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质或其任意组合。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、寡核苷酸、肽、多肽或其任意组合。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂或其任意组合。
在一些实施方案中，P包含抗肿瘤剂。在一些实施方案中，P包含导致细胞损伤或细胞死亡的物质。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素。在一些实施方案中，P包含选自以下组的细胞毒素：DNA破坏剂、拓扑异构酶抑制剂和微管抑制剂。
在一些实施方案中，P包含选自以下组的细胞毒素：吡咯并苯二氮卓(PBD)、奥瑞他汀(例如MMAE或MMAF)、美登木素生物碱(美登素、DM1或DM4)、多卡霉素、微管溶素、烯二炔(enediyne)(例如卡利奇霉素)、多柔比星(PNU)、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、卡利奇霉素、鹅膏蕈碱(例如a-鹅膏蕈碱)、喜树碱(例如伊西替康、deruxtecan德卢替康)。
在一些实施方案中，P包含选自以下组的细胞毒素：MMAE、DXd、MMAF、seco-DUBA和DM4。
在一些实施方案中，MOI还可包含在所述Y1与官能团Y2之间的连接反应之后的剩余基团Y1Y2，。
在一些实施方案中，Y1Y2在Fuc*的所述岩藻糖或的岩藻糖衍生物与所述P之间。
在一些实施方案中，Y2包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
在一些实施方案中，Y2包含选自以下组的功能性部分：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
在一些实施方案中，Y2包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
在一些实施方案中，Y2包含选自以下组的功能性部分：
在一些实施方案中，基团Y1Y2选自以下组：
其中R1和R2是如上定义的。
在一些实施方案中，Y1和Y2包含选自以下组的功能性部分:a)Y1包含
并且Y2包含
b)Y1包含
并且Y2包含
c)Y1包含
并且Y2包含
以及d)Y1包含
并且Y2包含
其中R1和R2是如上定义的。
在一些实施方案中，Fuc*的MOI还可包含L，并且L是连接子。连接子可以是可切割的连接子或不可切割的连接子。
在一些实施方案中，连接子L是可切割的连接子(例如，在细胞内条件下易于切割的)。在一些实施方案中，可切割的连接子可以通过化学或生物过程选择性切割，并且在切割时分离出P。
在一些实施方案中，L是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或可蛋白水解可切割的连接子。
在一些实施方案中，L是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
在一些实施方案中，L在Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述P之间。在一些实施方案中，L在Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1之间。在一些实施方案中，L在Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1Y2之间。
在一些实施方案中中，Fuc*的MOI还可包含F，并且F是连接物。
在一些实施方案中，F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。在一些实施方案中，s是1。
在一些实施方案中，F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。在一些实施方案中，s是1。
在一些实施方案中，F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。在一些实施方案中，s是1。
在一些实施方案中，FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
在一些实施方案中，FL是具有选自以下组的结构：
在一些实施方案中，F在Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述P之间。在一些实施方案中，F在Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1之间。在一些实施方案中，F在Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1Y2之间。
在一些实施方案中，Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-Y1、Fuc-(F)m-(L)n-P或Fuc-(F)m-(L)n-Y1Y2-(FL’)m’-(L’)n-P，其中Fuc是Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，Y1是官能团，FL’是与FL相同的间隔子，L’是与L相同定义的连接子，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。例如，Fuc*是Fuc-Y1。例如，Fuc*是Fuc-F-Y1。例如，Fuc*是Fuc-L-Y1。例如，Fuc*是Fuc-F-L-P。例如，Fuc*是Fuc-P。例如，Fuc*是Fuc-F-P。例如，Fuc*是Fuc-L-P。例如，Fuc*是Fuc-Y1Y2-L’-P。。例如，Fuc*是Fuc-Y1Y2-FL’-L’-P。例如，Fuc*是Fuc-Y1Y2-FL’-P。例如，Fuc*是Fuc-Y1Y2-P。例如，Fuc*是Fuc-F-Y1Y2-FL’-L’-P。例如，Fuc*是Fuc-F-Y1Y2-FL’-P。例如，Fuc*是Fuc-F-Y1Y2-P。例如，Fuc*是Fuc-F-Y1Y2-L’-P。
在一些实施方案中，Fuc如下式所示
在一些实施方案中，Fuc*如下式所示
在一些实施方案中，蛋白质偶联物包含1-20个
在一些实施方案中，蛋白质偶联物包含2或4个
在一些实施方案中，在蛋白质偶联物中，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与
的末端LacNAc的GlcNAc连接，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与核心GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，并且
是抗体或Fc-融合蛋白。例如，Fuc*与抗体-G2F的末端LacNAc的GlcNAc连接。例如，Fuc*与Fc-融合蛋白-G2F的末端LacNAc的GlcNAc连接。
在一些实施方案中，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与
的核心GlcNAc连接，其中
是GlcNAc，
是(Fuc)通过α1,6键联与核心GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNA键联与GlcNAc连接的半乳糖，并且
是抗体或Fc融合蛋白。例如，Fuc*与抗体的-((Fuc)α1,6)GlcNAc-Gal的核心GlcNAc连接。例如，Fuc*与Fc-融合蛋白的-((Fuc)α1,6)GlcNAc-Gal的核心GlcNAc连接。例如，Fuc*与抗体的-GlcNAc-Gal的核心GlcNAc连接。例如，Fuc*与Fc融合蛋白的-GlcNAc-Gal的核心GlcNAc连接。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α-1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是抗体或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，寡糖与抗体或Fc融合蛋白的Fc部分的N297位连接。例如，蛋白质是抗体。例如，抗体偶联物用于治疗疾病。例如，当Fuc*包含药学活性物质P时，抗体偶联物用于治疗疾病。例如，当Fuc*包含官能团Y1时，抗体偶联物用于制备治疗疾病的试剂。例如，蛋白质偶联物可能能够结合抗原。例如，蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联连接至GlcNAc岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNA键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，b是0或1。在一些实施方案中，GlcNAc与Fc部分的N297位置连接。例如，b是0。例如，b是1。例如，抗体偶联物用于治疗疾病。例如，当Fuc*包含药学活性物质P时，抗体偶联物用于治疗疾病。例如，当Fuc*包含官能团Y1时，抗体偶联物用于制备治疗疾病的试剂。例如，蛋白质偶联物可能能够结合抗原。例如，蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物是抗体-药物偶联物。在一些实施方案中，蛋白质偶联物是用于治疗疾病的蛋白质偶联物。
在一些实施方案中，当蛋白质偶联物的Fuc*包含官能团Y1时，抗体偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物具有下列性质中的一种或多种：(1)具有为2或4的MAR，(2)能够与抗原结合，(3)能够与抗原结合，与相应抗体具有相似的结合亲和力，(4)在血浆中稳定至少一天(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或更长时间)，如通过质谱分析中所测量的，(5)Fuc*的Fuc与-GlcNAc(Fuc)b-Gal的GlcNAc之间的键联在血浆中稳定至少1天(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或更长时间)，如在质谱分析中所测量的，b是0或1。(6)具有高反应活性，和/或(7)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
另一方面，本申请提供了包含本申请的蛋白质偶联物的组合物。在一些实施方案中，本申请提供了包含如下式所示
的蛋白质偶联物的组合物，其中
是GlcNAc，
是通过α-1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是抗体或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，寡糖与抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域的N297位连接。在一些实施方案中，该组合物的平均MOI与抗体的比率(MAR)约为2.4-4。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为2.8-4。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为3-4。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为3.5-4。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为3.8-4。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为4。
另一方面，本申请提供了包含本申请的蛋白质偶联物的组合物。在一些实施方案中，本申请提供了包含如下式所示
的蛋白质偶联物的组合物，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，并且b是0或1。在一些实施方案中，GlcNAc与抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域的N297位连接。在一些实施方案中，b是0。在一些实施方案中，b是1。在一些实施方案中，该组合物的平均MOI与抗体的比率(MAR)约为0.5-2。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为1-2。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为1.5-2。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为1.8-2。在一些实施方案中，该组合物的平均MAR约为2。
另一方面，本申请提供了用于制备本申请的蛋白质偶联物和/或组合物的方法。
另一方面，本申请提供了用于制备蛋白质偶联物的方法，其中该方法包括步骤(a)，并且步骤(a)包括在催化剂存在的情况下，使岩藻糖衍生物供体Q-Fuc*与包含寡糖的蛋白质接触，其中寡糖包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中GlcNAc与蛋白质的氨基酸直接或间接连接；Gal是半乳糖；(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；Fuc*’包含与目标分子(MOI’)连接的岩藻糖或岩藻糖衍生物；所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段；Q-Fuc*’是包含Fuc*’的分子。
在一些实施方案中，所述方法包括将包含
的所获蛋白质偶联物交换到缓冲液中。在一些实施方案中，缓冲液是配制缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是储存缓冲液。
在一些实施方案中，催化剂是岩藻糖基转移酶或其功能变体或片段。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶是α-1,3-岩藻糖基转移酶或其功能变体或片段。
在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于细菌、线虫、吸虫或哺乳动物。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含如GenBank登录号AF008596.1、GenBank登录号AAD07447.1、GenBank登录号AAD07710.1、GenBank登录号AAF35291.2或GenBank登录号AAB93985.1或其功能变体或片段中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含GenBank登录号AAD07710.1中所示的氨基酸序列，或其功能变体或片段。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于人。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含如Uniprot登录号P51993中所示的氨基酸序列，或其功能变体或片段。
在一些实施方案中，寡糖是N-连接的寡糖。
在一些实施方案中，寡糖与所述蛋白质的Asn残基连接。
在一些实施方案中，所述寡糖中的GlcNAc直接与所述蛋白质的Asn残基连接。
在一些实施方案中，所述寡糖中的GlcNAc与所述寡糖的糖连接。
在一些实施方案中，所述寡糖中的GlcNAc与所述寡糖的甘露糖连接。
在一些实施方案中，蛋白质包含Fc片段。
在一些实施方案中，所述寡糖与Fc片段连接。
在一些实施方案中，寡糖与所述Fc片段的CH2结构域连接。
在一些实施方案中，寡糖与所述Fc片段的Asn297位置(根据Kabat编号系统编号的)连接。
在一些实施方案中，蛋白质是抗体。在一些实施方案中，蛋白质是抗体，并且蛋白质偶联物能够与抗原结合。
在一些实施方案中，蛋白质是抗体，并且与相应的抗体相比，蛋白质偶联物对抗原具有相似的结合亲和力。在一些实施方案中，蛋白质是抗体，并且与相应的抗体相比，蛋白质偶联物对抗原具有相当的结合亲和力。
在一些实施方案中，获得的蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约0.1％至约100000％。
在一些实施方案中，获得的蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约1％至约10000％。
在一些实施方案中，获得的蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约10％至约1000％。
在一些实施方案中，获得的蛋白质偶联物能够与抗原结合，并且结合亲和力是相应抗体的结合亲和力的约50％至约200％。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG2抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG3抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体。
在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是全人抗体。
在一些实施方案中，Gal通过Galβ1,4GlcNAc键联与所述GlcNAc连接。
在一些实施方案中，岩藻糖(Fuc)通过α1,6键联与所述GlcNAc连接。
在一些实施方案中，Q-Fuc*’包含核糖核苷酸二磷酸。
在一些实施方案中，Q-Fuc*’包含二磷酸尿苷(UDP)、二磷酸鸟苷(GDP)或二磷酸胞苷(CDP)。在一些实施方案中，Q-Fuc*'是GDP-Fuc*’。
在一些实施方案中，Fuc*’的MOI’包含活性部分。
在一些实施方案中，MOI’的活性部分包含化学活性部分、酶促活性部分、生物活性部分和/或药学活性部分。
在一些实施方案中，MOI’的活性部分包含化学活性部分和/或酶促活性部分。
在一些实施方案中，MOI’的活性部分包含能够参与连接反应的官能团Y1。
在一些实施方案中，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
在一些实施方案中，Y1包含选自以下组：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
在一些实施方案中，Y1包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
在一些实施方案中，Y1包含选自以下组的功能性部分：
在一些实施方案中，该方法包括使Q-Fuc*'与蛋白质接触以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Q-Fuc*’是Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1，Fuc是Fuc*’的岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，b是0或1，m是0或1，n是0或1。例如，m是1，n是0。例如，m是0，n是1。例如，m是1，n是1。
在一些实施方案中，MOI’的活性部分包含P，并且P是生物和/或药学活性物质。
在一些实施方案中，该方法包括使所述Q-Fuc*’与所述蛋白质接触以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Q-Fuc*’是Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1，Fuc是Fuc*'的岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，并且P是生物和/或药学活性部分，b是0或1，m是0或1并且n是0或1。例如，m是0并且n是1。例如，m是1并且n是0。例如，m是1并且n是1。
在一些实施方案中，该方法还包括步骤(b)使所述包含
的蛋白质偶联物与Y2-(FL’)m’-(L’)n’-P接触，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Y1Y2是在所述Y1与包含能够与Y1反应的功能性部分的官能团Y2之间的连接反应后的剩余基团，FL'是与FL相同定义的间隔子，L'是与L相同定义的连接子，b是0或1，m是0或1，n是0或1，m'是0或1，n'是0或1，并且P是生物学和/或药学活性物质。例如，m是1并且n是0。例如，m是1并且n是1。
在一些实施方案中，所述是药学活性物质。
在一些实施方案中，P是细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质或其任意组合。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、寡核苷酸、肽、多肽或其任意组合。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂或其任意组合。
在一些实施方案中，P包含抗肿瘤剂。
在一些实施方案中，P包含导致细胞损伤或细胞死亡的物质。
在一些实施方案中，P包含细胞毒素。
在一些实施方案中，P包含选自以下组的细胞毒素：DNA破坏剂、拓扑异构酶抑制剂和微管抑制剂。
在一些实施方案中，P包含选自以下组的细胞毒素：吡咯并苯二氮卓(PBD)、奥瑞他汀(例如MMAE或MMAF)、美登木素生物碱(美登素、DM1或DM4)、多卡霉素、微管溶素、烯二炔(例如卡利奇霉素)、多柔比星(PNU)、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、卡利奇霉素、鹅膏蕈碱(例如a-鹅膏蕈碱)、喜树碱(例如伊西替康、deruxtecan德卢替康)。
在一些实施方案中，P包含选自以下组的细胞毒素：MMAE、DXd、MMAF、seco-DUBA和Dm4。
在一些实施方案中，连接子L是可切割的连接子。
在一些实施方案中，L是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或可蛋白水解可切割的连接子。
在一些实施方案中，L是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
在一些实施方案中，连接子L’是可切割的连接子。
在一些实施方案中，L’是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或蛋白水解可切割的连接子。
在一些实施方案中，L’是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
在一些实施方案中，接头F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。例如，s是1。
在一些实施方案中，接头F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。例如，s是1。
在一些实施方案中，接头F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。例如，s是1。
在一些实施方案中，间隔子FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
在一些实施方案中，间隔子FL选自以下组的结构：
在一些实施方案中，间隔子FL’是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
在一些实施方案中，间隔子FL’选自以下组：
在一些实施方案中，Y2包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
在一些实施方案中，Y2包含选自以下组：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
在一些实施方案中，Y2包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
在一些实施方案中，Y2包含选自以下组的功能性部分：
在一些实施方案中，基团Y1Y2选自以下组：
其中所述R1和R2是如上定义的。
在一些实施方案中，Y1和Y2包含选自以下组的功能性部分:a)Y1包含
并且Y2包含
b)Y1包含
并且Y2包含
c)Y1包含
并且Y2包含
以及d)Y1包含
并且Y2包含
其中所述R1和R2是如上定义的。
在一些实施方案中，Q-Fuc*’具有
的结构，其中所述F是接头，L是连接子，Y1是官能团，m是0或1，n是0或1。在一些实施方案中，m是1，n是0。
在一些实施方案中，Q-Fuc*'选自以下组：
在一些实施方案中，Q-Fuc*’如下式所示
其中所述FL是间隔子，L是连接子，Y1是官能团，s是0或1并且n是0或1。在一些实施方案中，s是1并且n是0。
在一些实施方案中，Q-Fuc*'选自以下组：
在一些实施方案中，Q-Fuc*’具有
的结构，其中所述F是接头，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1并且n是0或1。在一些实施方案中，m是1并且n是1。在一些实施方案中，m是1并且n是0。
在一些实施方案中，Q-Fuc*’选自以下组：
在一些实施方案中，Q-Fuc*’具有
的结构，其中所述FL是间隔子，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，s是0或1并且n是0或1。在一些实施方案中，s是1并且n是1。在一些实施方案中，s是1并且n是0。在一些实施方案中，P是药学活性物质。在一些实施方案中，P是细胞毒素。
在一些实施方案中，Q-Fuc*'选自以下组：
在一些实施方案中，Fuc如下式所示
并且Fuc*'如下式所示
在一些实施方案中，在蛋白质偶联物中，所述Fuc*’的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物通过Fuc*’α1,3键联与所述GlcNAc连接。
在一些实施方案中，该蛋白质包含1至20个-GlcNAc(Fuc)b-Gal。
在一些实施方案中，蛋白质包含2或4个-GlcNAc(Fuc)b-Gal。
在一些实施方案中，包含寡糖的蛋白质如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α-1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，并且
是抗体或Fc融合蛋白。例如，寡糖与Fc片段的N297位连接。例如，蛋白质是抗体。例如，抗体偶联物包含4个
或4个
或4个
其中，Fuc为岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1以及n’是0或1。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，当蛋白质偶联物包含药学活性物质P时，抗体偶联物用于治疗疾病。例如，当蛋白质偶联物包含官能团Y1时，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。例如，当蛋白质是抗体时，蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。
在一些实施方案中，包含寡糖的蛋白质如下式所示
在一些实施方案中，该方法包括步骤(c)：在催化剂存在下，使包含寡糖(其包含-GlcNAc(Fuc)b)的蛋白质与UDP-半乳糖接触，以获得所述包含-GlcNAc(Fuc)b的蛋白质，其中Gal是半乳糖，b是0或1。例如，b是0。例如，b是1。
在一些实施方案中，催化剂是半乳糖基转移酶或其功能变体或片段。
在一些实施方案中，催化剂是β1,4-半乳糖基转移酶或其功能变体或片段。
在一些实施方案中，催化剂是牛β1,4-半乳糖基转移酶、人β1,4-半乳糖基转移酶或其功能变体或片段。
在一些实施方案中，催化剂是具有Y285L突变的人β(1,4)-GalT1或具有Y289L突变的牛β(1,4)-GalT1。
在一些实施方案中，催化剂包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 16中所示的氨基酸。
在一些实施方案中，步骤(c)在步骤(a)之前。
在一些实施方案中，该方法在步骤(c)与步骤(a)之间不包含纯化过程。
在一些实施方案中，步骤(a)和步骤(c)在同一反应容器中进行。
在一些实施方案中，步骤(a)和步骤(c)同时进行。
在一些实施方案中，该方法还包括步骤(d)将包含寡糖的蛋白质修饰成包含核心-((Fuc)α1,6)b GlcNAc的蛋白质，其中b是0或1。例如，b是0。例如，b是1。
在一些实施方案中，步骤(d)在内切糖苷酶或其功能变体或片段的存在的情况下进行。
在一些实施方案中，步骤(d)在EndoS或其功能变体或片段存在的情况下进行。
在一些实施方案中，EndoS包含SEQ ID NO 6中所示的氨基酸。
在一些实施方案中，步骤(d)在步骤(c)之前。
在一些实施方案中，该方法包括步骤(e)：将包含核心-(Fuc)α1,6)GlcNAc的蛋白质修饰为包含核心-GlcNAc的蛋白质。
在一些实施方案中，步骤(e)在核心-α1,6岩藻糖苷酶或其功能变体或片段的存在的情况进行。
在一些实施方案中，核心-α1,6岩藻糖苷酶是Alfc或其功能变体或片段。
在一些实施方案中，Alfc包含如SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 18中所示的氨基酸。
在一些实施方案中，步骤(e)在步骤(d)之后和步骤(c)之前进行。
在一些实施方案中，步骤(d)和步骤(e)同时进行。
在一些实施方案中，步骤(d)和步骤(e)在同一反应容器中进行。
在一些实施方案中，该方法在步骤(a)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)之间不包含纯化过程。
在一些实施方案中，步骤(a)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)在同一反应容器中进行。
在一些实施方案中，蛋白质偶联物是用于治疗疾病的蛋白质偶联物。
在一些实施方案中，当MOI’包含Y1时，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
另一方面，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法。
在一些实施方案中，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法，所述蛋白质偶联物包含4个
或4个
或4个
其中，Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。例如，蛋白质是抗体。例如，GlcNAc与
的甘露糖连接。例如，蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。例如，该组合物的平均MAR约为2.4-4。例如，该组合物的平均MAR约为2.8-4。例如，该组合物的平均MAR约为3.2-4。例如，该组合物的平均MAR约为3.6-4。例如，该组合物的平均MAR约为3.8-4。例如，该组合物的平均MAR约为4。
在一些实施方案中，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法，所述蛋白质偶联物包含2个
或2个
或2个
在一些实施方案中，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法，所述蛋白质偶联物包含2个
或2个
或2个
其中，(Fuc)是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖，Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。例如，蛋白质是抗体。例如，GlcNAc直接与抗体的Asn连接。例如，蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。例如，该组合物的平均MAR约为0.5-2。例如，该组合物的平均MAR约为1-2。例如，该组合物的平均MAR约为1.5-2。例如，该组合物的平均MAR约为1.8-2。例如，该组合物的平均MAR约为2。
另一方面，本申请提供了蛋白质偶联物，其由本申请的方法中获得。
另一方面，本申请提供了组合物，其由本申请的方法获得。
另一方面，本申请提供了本申请的Q-Fuc*’在制备所述蛋白质偶联物中的用途。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请的蛋白质偶联物和任选的药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请的组合物和任选的药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了缓解、预防或治疗疾病的方法，其包括施用本申请的蛋白质偶联物和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了缓解、预防或治疗疾病的方法，其包括施用本申请的组合物和/或本申请的药物组合物。在一些实施方案中，疾病是肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤包括乳腺癌和/或胃癌。
另一方面，本申请提供了蛋白质偶联物和/或药物组合物在制备用于缓解、预防或治疗疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，疾病是肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤包括乳腺癌和/或胃癌。
另一方面，本申请提供了组合物和/或药物组合物在制备用于缓解、预防或治疗疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，疾病是肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤包括乳腺癌和/或胃癌。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗疾病的蛋白质偶联物和/或药物组合物。在一些实施方案中，疾病是肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤包括乳腺癌和/或胃癌。
另一方面，本申请提供了用于缓解、预防或治疗疾病的组合物和/或药物组合物。在一些实施方案中，疾病是肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤包括乳腺癌和/或胃癌。
从以下详细描述中，本申请的另外的方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本申请的说明性实施方案。如将认识到的，本申请能够具有其它和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本申请。因此，附图和说明书应被认为是说明性的，而不是限制性的。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体地和单独地指出以引用的方式并入。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下详细描述和附图(本文中也称为“图(figure)”、“图(FIG.)”和“图(Fig.)”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了采用本发明原理的说明性实施方案，其中：
图1示出了使用GDP-Fuc-MOI(具有目标分子的GDP-Fuc衍生物)和α1,3-FucT制备抗体-Fuc*偶联物的优选实施方案方法。MOI：目标分子。
图2A和图2B示出了示例性GDP-Fuc-MOI(具有目标分子的GDP-Fuc衍生物)的结构。
图3示出了用于合成GDP-Fuc-MOI(具有目标分子的GDP-Fuc衍生物)的合成方案。
图4示出了用于合成GDP-Fuc-MOI(具有目标分子的GDP-Fuc衍生物)的化合物的结构。
图5示出了用于由“两步”法产生抗体偶联物的化合物的结构。
图6分别示出了商业化的曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-FAz的转化和曲妥珠单抗-G2F至曲妥珠单抗-G2F-FAz的转化的MS分析。
图7示出了使用GDP-Fuc-MOI(具有目标分子的GDP-Fuc衍生物)和α1,3-FucT制备抗体-G2F-Fuc*偶联物的优选实施方案方法。
图8示出了由“一步”法产生的本申请的一些示例性抗体-G2(F)-Fuc*偶联物的MS分析。
图9示出了用于制备抗体偶联物的“两步”方法的优选实施方案以及Y1和Y2基团的示例性组合。首先通过1,3-FucT催化的反应将反应手柄Y1安装到抗体上，以产生抗体-Y1偶联物。然后使抗体-Y1偶联物与互补反应手柄Y2反应以产生抗体偶联物，互补反应手柄Y2连接到包含活性物质的X部分。
图10示出了由“两步”法产生的曲妥珠单抗-G2F-GGG偶联物的MS分析。
图11示出了分别由“一步”和“两步”法产生的曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE和曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE的MS分析。
图12分别示出了曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE和曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE对SK-Br-3(Her2+)细胞系和MDA-MB-231(Her2-)细胞系的体外细胞毒性。
图13示出了使用GDP-Fuc-MOI(具有目标分子的GDP-Fuc衍生物)和α1,3-FucT制备抗体-((Fuc)α1,6)0,1(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物的优选实施方案方法。
图14示出了本申请的一些示例性抗体-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物的MS分析。
图15示出了本申请的一些示例性抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物的MS分析。
图16示出了Hp-α(1,3)-FucT分别在抗体-G2F和抗体-(Galβ1,4)GlcNAc上对GDP-FAzX衍生物和GDP-FAmX衍生物的催化效率的比较。Hp-α(1,3)-FucT对GDP-FAmX衍生物的催化效率明显高于对GDP-FAzX的催化效率。A)将曲妥珠单抗-G2F或曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc在GDP-FAzP4生物素或GDP-FAmP4生物素存在的情况下用Hp-α(1,3)-FucT处理指定时间(曲妥珠单抗-G2F处理6h，曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc)处理2h)，并用LC-MS进行测定。B)将妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc在GDP-FAzP4MMAE或GDP-FAmP4MMAE存在的情况下用Hp-α(1,3)-FucT处理指定时间2小时，并用LC-MS进行测定。对于抗体-G2F，转化率百分比＝平均MAR/4*100％，对于抗体-(Galβ1,4)GlcNAc，转化率百分比＝平均MAR/2*100％。
图17示出了由“一步”或“两步”法产生的一些示例性抗体-药物偶联物(DAR 2或DAR 4)的MS分析。
图18示出了Hp-α(1,3)-FucT和人FT6在将抗体转移到GDP-FAmP4生物素中的催化效率。
图19示出了不同的曲妥珠单抗-G2F-Az偶联物和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-Az偶联物分别对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性，以及曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz分别对TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。
图20示出了与曲妥珠单抗相比，由A)“两步”法或B)“一步”法产生的一些示例性DAR 2或DAR 4曲妥珠单抗-药物偶联物的结合亲和力分析。
图21示出了由“两步”法和“一步”法产生的一些示例性抗体-药物偶联物的HIC-HPLC分析。
图22示出了由“一步”和“两步”法产生的一些示例性抗体-药物偶联物(DAR 2或DAR 4)的血浆稳定性分析。
图23示出了一些示例性曲妥珠单抗-MMAE或曲妥珠单抗-MMAF偶联物分别对SK-Br-3(Her2+)细胞系、BT474(Her2+)细胞系和MDA-MB-231(Her2-)细胞系的体外细胞毒性。
图24示出了曲妥珠单抗-seco-DUBA偶联物(曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA)对NCI-N87(Her2+)细胞系、SKBr3(Her2+)细胞系、BT474(Her2+)细胞系和MDA-MB-231(Her2-)细胞系的体外细胞毒性。
图25示出了一些示例性曲妥珠单抗-药物偶联物分别对NCI-N87(Her2+)细胞系和MDA-MB-231(Her2-)细胞系的体外细胞毒性。
图26示出了示例性抗Trop2-MMAE偶联物(hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE)分别对JIMT-1(trop2高表达)细胞系和MDA-MB-231(trop2低表达)细胞系的体外细胞毒性。
图27示出了曲妥珠单抗-药物偶联物在裸鼠(BALB/c)人胃NCI-N87(Her2+)异种移植模型上的体内效果。A)曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE相较于曲妥珠单抗和
的抗肿瘤活性。B)单次注射后小鼠的体重。第0天的黑色箭头代表单次i.v.注射。(n＝6只小鼠/组)。
图28示出了抗Trop 2-药物偶联物在裸鼠(BALB/c)人乳腺癌JIMT-1(Trop2高表达)异种移植物模型上的体内效果。A)hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE相较于hRS7的抗肿瘤活性。B)单次注射后小鼠的体重。第0天的黑色箭头代表单次i.v.注射。(n＝6只小鼠/组)。
图29示出了抗体的G0、G0F、G1、G1F、G2和G2F糖型。G0(F)型在双天线链末端处缺少两个半乳糖(Gal)残基。G1(F)是具有一个连接至甘露糖GlcNAc分支的Gal残基的双天线异构体。在G2(F)中，两个分支都具有Gal残基。在G0F、G1F和G2F中，核心岩藻糖以α-1,6键联附接至核心GlcNAc。G1F和G2F结构均含有二糖N-乙酰乳糖胺(LacNAc,Galβ1,4GlcNAc)单元。
具体实施方式
虽然本文已示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员来说，显然此类实施方案仅仅是作为实例提供的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。
如本文中所用，术语“偶联物”通常指由分离的部分结合在一起形成的任何物质。在偶联物中，分离的部分可以在一个或多个活性位点相互连接。此外，分离的部分可以彼此共价或非共价缔合或连接，并表现出不同的化学计量摩尔比。偶联物可包含肽、多肽、蛋白质、体内代谢为活性剂的前药、聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子和放射性同位素。
如本文中所用，术语“Fc片段”通常指抗体恒定区的一部分。常规地，术语Fc结构域是指蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶)切割产物，其包含抗体的配对CH2、CH3和铰链区。在本申请的说明书中，术语Fc结构域或Fc是指任何多肽(或编码这种多肽的核酸)，无论其生产方式如何，其包含免疫球蛋白多肽的全部或部分CH2、CH3和铰链区。
如本文中所用，术语“抗原结合片段”通常指能够结合抗原的肽片段。抗原结合片段可以是免疫球蛋白分子的片段。抗原结合片段可包含一条轻链和具有单个抗原结合位点的重链的一部分。抗原结合片段可通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白分子来获得。例如，抗原结合片段可由每条重链和轻链的一个恒定区和一个可变区组成。可变结构域可以在免疫球蛋白分子的氨基末端含有互补位(抗原结合位点)，包括一组互补决定区。例如，抗原结合片段可以是Fab、F(ab)2、F(ab’)、F(ab’)2、ScFv和/或纳米抗体。
如本文中所用，术语“Fc-融合蛋白”通常是指由与目标肽或蛋白质转基因连接的IgG的Fc结构域组成的蛋白质。
如本文中所用，术语“直接连接的”通常指一个部分在没有任何中间部分或连接子存在的情况下与另一个部分连接。例如，GlcNAc与抗体的氨基酸残基直接连接通常是指GlcNAc通过共价键与抗体的氨基酸残基键合，例如通过N-糖苷键与抗体的氨基酸(例如，天冬酰胺氨基酸)侧链上的酰胺氮原子键合。在本申请中，当GlcNAc与蛋白质的氨基酸“间接连接”时，在GlcNAc与蛋白质的氨基酸之间通常有至少一个单糖部分。
术语“GlcNAc”或“N-乙酰葡糖胺”可互换使用，通常指单糖葡萄糖的酰胺衍生物，其通常通过β-(1,4)键联线性聚合。
糖基化通常是指其中将碳水化合物(即，糖基供体)附接至另一分子(糖基受体)的羟基或其它官能团的反应。在一些实施方案中，糖基化主要特别地指将聚糖附接至到蛋白质或其它有机分子的酶促过程。可在糖基化键联、糖基化结构、糖基化组成和/或糖基化长度方面改变蛋白质中的糖基化。糖基化可包括N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、磷酸丝氨酸糖基化、C-甘露糖基化、GPI锚的形成(糖基磷脂酰肌醇化(glypiation))和/或化学糖基化。相应地，蛋白质的糖基化寡糖可以是N-连接的寡糖、O-连接的寡糖、磷酸丝氨酸寡糖、C-甘露糖基化的寡糖、糖基磷脂酰肌醇化寡糖和/或化学寡糖。
如本文中所用，术语“抗体”通常指特异性结合抗原表位或其模拟表位的多肽或蛋白质复合物。抗体包括完整抗体或与完整抗体竞争特异性结合的其结合片段，并包括嵌合抗体、人源化抗体、全长人抗体和双特异性抗体。结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、单链抗体、纳米抗体。在一些实施方案中，抗体被称为免疫球蛋白，并且包括各种类别和同种型，诸如IgA(IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgG(IgG 1、IgG3和IgG4)等。在一些实施方案中，如本文中所用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体及其功能片段。抗体包括经修饰的或经衍生的抗体变体，其保持特异性结合表位的能力。抗体能够选择性地与目标抗原或表位结合。抗体可包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化和其它嵌合抗体、纳米抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、F(ab’)2片段和二硫键连接的Fv(sdFv)片段。在一些实施方案中，抗体来自任何来源，诸如小鼠或人，包括其嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化的。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”通常是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，组成该群体的单个抗体是相同的。
如本文中所用，术语“IgG”通常是指可通过生物化学方法区分的各种大类多肽或蛋白质。本领域技术人员将理解，免疫球蛋白重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4或α1-α2))。正是这种链的性质决定了抗体的“同种型”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi、IgA2等已被充分表征，并已知赋予功能特化。人IgG的典型特征在于Fc区的重链CH2区中Asn297位(根据Kabat编号)的糖基化。
在本申请中，“Asn297”或“N297”可以互换使用，是抗体Fc片段的位点297(根据Kabat编号系统编号的)处的天冬酰胺。Asn297可以附接有一个或多个寡糖。
如本文中所用，术语“人源化抗体”通常是指含有来自非人动物的一些或全部CDR的抗体，并且抗体的框架和恒定区含有源自人抗体序列的氨基酸残基。
如本文中所用，术语“Fuc*α1,3GlcNAc键联”通常指Fuc*的岩藻糖或岩藻糖衍生物与GlcNAc之间的键联。
如本文中所用，术语“Galβ1,4GlcNAc键联”通常指半乳糖与GlcNAc之间的键联。
如本文中所用，术语“N-连接的寡糖”通常指寡糖与氮原子的连接。在一些实施方案中，寡糖可包含由若干糖分子组成的碳水化合物，有时也称为聚糖。在一些实施方案中，氮原子是蛋白质的氨基酸残基例如蛋白质的天冬酰胺(Asn)的酰胺氮。
如本文中所用，术语“目标分子(MOI)”通常指具有所需特征的分子。期望的特征可以是物理特性或化学特性，例如反应活性、稳定性、溶解度、结合活性、抑制活性、毒性或降解度。MOI可包含具有所需生物活性和/或反应性官能团的任何物质，其可用于将药物引入本申请的蛋白质偶联物中。例如，MOI可包含活性物质。例如，活性物质可以是治疗剂、诊断剂、药剂和/或生物剂，例如细胞毒素、细胞生长抑制剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、抗生素、荧光团、生物素标签、肽、蛋白质或其任意组合。在一些情况下，活性物质可以是化学活性物质。例如，化学活性物质可以是能够与另一化学功能性部分反应形成共价键的化学功能性部分。例如，化学活性物质可能能够参与连接反应。在一些情况下，活性物质可以是酶促活性物质，其可以在酶存在的情况下与互补的功能性部分反应形成共价键。例如，酶促活性物质可以是N-末端肽标签GGG(NH2-GGG)，所述N末端肽标签可以在分选酶连接酶存在的情况下与C末端肽标签LPETGG(LPETGG-COOH)(SEQ.ID NO.23)反应以形成共价键。
如本文中所用，术语“官能团”通常指能够与另一个基团反应的基团。官能团可用于将试剂(例如，没有反应活性或具有低反应活性的试剂)引入本申请的蛋白质偶联物中。例如，试剂可以是药学活性物质(例如细胞毒素)。官能团可以是化学基团或具有化学和/或酶促反应性的残基。在一些实施方案中，官能团可以是能够在连接反应中反应的基团。官能团通常包含功能性部分，并且由于该功能性部分，该官能团可以与另一个基团反应。
如本文中所用，术语“连接反应”通常指其中一个分子能够与另一个分子连接的化学和/或酶促反应。这种结合可能是由反应分子的官能团驱动的。
如本文中所用，术语“岩藻糖基转移酶”通常指能够将L-岩藻糖从岩藻糖供体底物(诸如，二磷酸鸟苷-岩藻糖)转移到受体底物的酶或其功能片段或变体。受体底物可以是另一种糖，诸如包含GlcNAc-Gal(LacNAc)的糖，如在N-糖基化的情况下，或在O-连接的糖基化的情况下。术语“岩藻糖基转移酶”可包含任何功能片段或其催化结构域，以及具有催化活性结构域的功能变体(诸如，突变体、同种型)。岩藻糖基转移酶的实例可以是α-1,3岩藻糖基转移酶。术语“岩藻糖基转移酶”可来源于各种物种，诸如哺乳动物(例如，人)、细菌、线虫或吸虫。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含GenBank登录号YP_213065.1或其功能变体或片段中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。在一些实施方案中，其中所述岩藻糖基转移酶包含如GenBank登录号AF008596.1、GenBank登录号AAD07447.1、GenBank登录号AAD07710.1、GenBank登录号AAF35291.2或GenBank登录号AAB93985.1或其功能性变体或片段中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含GenBank登录号AAD07710.1中所示的氨基酸序列，或其功能变体或片段。例如，岩藻糖基转移酶可包含如GenBank登录号AAD07710.1中所示的氨基酸序列，或者岩藻糖基转移酶可包含与GenBank登录号AAD07710.1中所示的氨基酸序列具有超过80％(例如，超过83％、超过88％、超过90％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％、超过99％或更多)的同一性的氨基酸序列，或其功能变体或片段。作为另一个实例，岩藻糖基转移酶可包含如SEQ ID NO:3或4中所示的氨基酸序列，或者岩藻糖基转移酶可以包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有超过80％(例如，超过88％、超过88％、超过90％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％、超过99％或更多)的同一性的氨基酸序列。
如本文中所用，术语G2、G1或G0通常指如图29所示的G2、G1或G0的糖型。如本文中所用，术语G2F、G1F、G0F通常指如图29所示的G2F、G1F、G0F的糖型。如本文中所用，术语G2(F)通常指具有任选的核心α1,6-岩藻糖的G2糖型。如本文中所用，“抗体-G2F”通常指具有G2F糖型的抗体。如本文中所用，抗体-G2(F)、抗体-G1(F)和抗体-G0(F)通常分别指具有G2(F)、G1(F)和G0(F)糖型的抗体。
如本文中所用，术语“(Fuc)”通常指与GlcNAc连接的岩藻糖，其中GlcNAc直接与蛋白质(例如，抗体或其片段)的氨基酸连接。例如，“(Fuc)”通过α1,6键联与GlcNAc连接。(Fuc)的岩藻糖不同于本申请的Fuc*的岩藻糖或岩藻糖衍生物。在本申请中，“Fuc”代表Fuc*的岩藻糖或岩藻糖衍生物。
如本文中所用，术语“第一部分”通常是指在本申请的偶联物中包含GlcNAc-Gal(即LacNAc)的部分。在一些实施方案中，所述第一部分可以是具有GlcNAc-Gal(即LacNAc)的分离的蛋白质。如本文中所用，术语“第二部分”通常指在本申请的偶联物中包含岩藻糖或岩藻糖衍生物Fuc的部分。第一部分可通过GlcNAc与岩藻糖或岩藻糖衍生物Fuc之间的共价键与第二部分连接。如本文中所用，术语“第一分子”通常是指具有LacNAc的分离的分子，尤其是蛋白质，诸如抗体或具有Fc结构域的片段。如本文中所用，术语“第二分子”通常指包含岩藻糖或岩藻糖衍生物Fuc和活性部分的分子。第一分子与第二分子能够相互反应形成偶联物。并且在偶联物中，源自第一分子的部分可以是第一部分，源自第二分子的部分可以是第二部分。
术语“连接单元”W是指存在于岩藻糖或岩藻糖衍生物Fuc与活性部分之间的部分。连接单元W连接Fuc与活性部分。在一些实施方案中，“连接单元”W可以包含多肽、PEG、烷基和/或其衍生物。
如本文中所用，术语“药学活性物质”通常指任何药物上有用或具有药物效果的物质。在本申请中，药学活性物质可以不包含检测试剂(例如，具有物理的或化学的检测功能元件的试剂，并且/或者仅用于本申请中的检测目的)。在本申请中，荧光标记物可以不是药学活性物质。例如，药学活性物质可以是能够缓解、治疗、预防疾病或延缓疾病进程的试剂。所述疾病可以是与异常细胞增殖和/或细胞功能障碍相关的疾病。所述疾病可以是肿瘤和/或免疫性疾病。
药学活性物质可包含可用于肿瘤或其它医学状况表征(例如诊断、肿瘤进展的表征和肿瘤细胞分泌因子的测定)的化合物。例如，药学活性物质可以是放射性同位素或放射性核素。例如，药学活性物质可以是PET成像剂。
药学活性物质可以是细胞毒素。细胞毒素可以包含能够破坏细胞增殖和/或分化的任何试剂。细胞毒素可对肿瘤具有细胞毒性作用，包括耗尽、消除和/或杀死肿瘤细胞。
如本文中所用，术语“相应抗体”通常是指在一些修饰后，例如糖基化修饰或结合后，尤其是在实施本申请的方法后，可从其获得蛋白质结合物的抗体。蛋白质偶联物可能能够与其相应抗体结合相同的抗原或相同的抗原表位。相应抗体可以与目标分子缀合，成为蛋白质偶联物。例如，在本发明的蛋白质偶联物中，其可包含抗体和寡糖，其中所述寡糖包含
的结构，b是0或1，相应抗体是未被Fuc*修饰的抗体。例如，在本申请中，在该方法的步骤(a)中，包含寡糖的蛋白质可以是抗体，并且该抗体可以与Q-Fuc*’反应，以获得蛋白质偶联物。在这种情况下，抗体可以是针对获得的蛋白质偶联物的“相应抗体”。例如，在本申请中，相应抗体可以是包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal的抗体，b是0或1。可通过步骤(a)修饰相应抗体以获得蛋白质偶联物。可通过步骤(a)和步骤(b)修饰相应的抗体，以获得蛋白质偶联物。在这些条件下，包含-GlcNAc(Fuc)b的抗体可以是那些蛋白质偶联物的“相应抗体”。例如，在本申请中，相应抗体可以是包含-GlcNAc(Fuc)b的抗体，b是0或1。可通过步骤(c)和步骤(a)修饰相应抗体，以获得蛋白质偶联物。可通过步骤(c)、步骤(a)和步骤(b)修饰相应抗体，以获得蛋白质偶联物。在这些条件下，包含-GlcNAc(Fuc)b的抗体可以是那些蛋白质偶联物的相应抗体。例如，在本申请中，相应的抗体可以是包含异质糖型(例如G2(F)、G1(F)和G0(F)的混合物)的抗体。可通过步骤(c)和步骤(a)修饰抗体，以获得蛋白质偶联物。可通过步骤(c)、步骤(a)和步骤(b)修饰抗体，以获得蛋白质偶联物。在这些条件下，包含异质糖形(例如G2(F)、G1(F)和G0(F)的混合物)的抗体可以是那些蛋白质偶联物的相应抗体。例如，在本申请中，相应抗体可以是包含异质糖型(例如G2(F)、G1(F)和G0(F)的混合物)的抗体。可通过步骤(d)、步骤(c)和步骤(a)修饰抗体，以获得蛋白质偶联物。可以通过步骤(d)、步骤(c)、步骤(a)和步骤(b)修饰抗体，以获得蛋白质偶联物。可以通过步骤(d)、步骤(e)、步骤(c)和步骤(a)修饰抗体，以获得蛋白结合物。可以通过步骤(d)、步骤(e)、步骤(c)、步骤(a)和步骤(b)修饰抗体，以获得蛋白质偶联物。在这些条件下，包含异质糖型的抗体可以是那些蛋白质偶联物的相应抗体。例如，由“一步法”和“两步法”制备的曲妥珠单抗-G2F-Fuc*偶联物的相应抗体可以是具有异质糖型(例如G2(F)、G1(F)和G0(F)的混合物)的曲妥珠单抗。例如，由“一步法”和“两步法”制备的曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*的相应抗体可以是具有异质糖型(例如G2(F)、G1(F)和G0(F)的混合物)的曲妥珠单抗。图20显示，由“一步”法和“两步”法制备的曲妥珠单抗-G2F-Fuc*偶联物和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物具有与其相应抗体(即具有异质糖型的曲妥珠单抗)相似的对Her2抗原的结合亲和力。
术语“包含”及其变体在这些术语出现在说明书和权利要求中时没有限制意义。
除非另有说明，否则“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“该(the)”和“至少一个/种(at least one)”可互换使用，表示一个/种或超过一个/种。
蛋白质偶联物
在本申请中，本申请提供了蛋白质偶联物，并且该蛋白质偶联物包含蛋白质和寡糖，其中寡糖包含
例如，寡糖可以包含
其中GlcNAc之下的(Fuc)是岩藻糖。当寡糖包含
时，(Fuc)可以通过α1,6键联与GlcNAc连接。
例如，Gal可以通过Galβ1,4GlcNAc键联与所述GlcNAc连接。
在
和/或
中，GlcNAc直接或间接与所述蛋白质的氨基酸连接；所述Gal是半乳糖；所述(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；所述Fuc*包含与目标分子(MOI)连接的岩藻糖或岩藻糖衍生物，所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段。在蛋白质偶联物中，目标分子可以通过寡糖与蛋白质缀合。
在本申请中，寡糖可以是N-连接的寡糖。在本申请中，寡糖可与蛋白质的氨基酸残基的氮原子连接。在本申请中，寡糖可与蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基连接。
例如，
的GlcNAc可直接与蛋白质的氨基酸残基连接。例如，
的GlcNAc可直接与蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基连接。例如，寡糖可以是
例如，
的GlcNAc可间接与蛋白质的氨基酸残基连接。例如，糖可位于
的GlcNAc与蛋白质的氨基酸残基之间。例如，糖可以包含甘露糖。例如，糖可以是
其中
是GlcNAc，
是岩藻糖，
是甘露糖。
例如，
的GlcNAc可与蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基间接连接。例如，糖可位于
的GlcNAc与蛋白质的Asn之间。例如，糖可以包含甘露糖。例如，糖可以是
其中
是GlcNAc，
是岩藻糖，
是甘露糖。
例如，
的GlcNAc可与糖的甘露糖连接，包含
的寡糖可以是
其中
是GlcNAc(其中与Fuc*连接的
是
的GlcNAc)，
是岩藻糖，
是甘露糖，○是半乳糖。
在本申请中，蛋白质偶联物的蛋白质可以包含Fc片段。在本申请中，包含
的寡糖可位于Fc片段中。当蛋白质偶联物的蛋白质包含Fc片段时，包含
的寡糖可位于Fc片段的CH2结构域中。例如，包含
的寡糖可与根据Kabat编号系统编号的所述Fc片段的Asn297连接。
例如，蛋白质偶联物的蛋白质可以是Fc融合蛋白。蛋白质偶联物的蛋白质可包含Fc片段和生物活性蛋白质。例如，生物活性蛋白质可以是治疗性蛋白质。例如，生物活性蛋白可以来源于非免疫球蛋白。例如，生物活性蛋白可以是细胞因子、补体和/或抗原或其片段。
在本申请中，蛋白质偶联物的蛋白质可包含抗原结合片段。在本申请中，包含
的寡糖可位于抗原结合片段中。例如，蛋白质偶联物的蛋白质可包含纳米抗体、ScFv、Fab、F(ab)2、F(ab’)和/或F(ab’)2。
在本申请中，蛋白质偶联物的蛋白质可包含Fc片段和抗原结合片段。在本申请中，蛋白质可以是抗体或其片段。在本申请的一个方面，抗体可以识别靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原，并且可以定位于肿瘤细胞的表面。在一些情况下，与靶抗原结合的抗体可以在与肿瘤细胞结合后内化。当抗体与目标分子共价连接时，目标分子可以在内化后释放到细胞中。例如，当功能化抗体与细胞毒性药物连接时，细胞毒性药物可以在内化后释放到细胞中，导致细胞死亡。在某些情况下，靶抗原在正常细胞与肿瘤细胞之间表现出差异表达，在肿瘤细胞上表现出增加的表达。例如，靶抗原可选自Trop2、Her2、CD20和VEGF。
在本申请中，蛋白质可以是抗体或其片段。抗体或抗体片段可以是任何种类的，诸如IgM、IgA、IgD、IgE或IgG种类，或免疫球蛋白分子的亚类。在一些实施方案中，抗体或抗体片段属于IgG类。抗体或抗体片段可来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4亚类。在一些实施方案中，抗体或抗体片段来自IgGl亚类。在一些实施方案中，抗体或抗体片段在由Kabat编号系统定义的重链的297位具有保守的天冬酰胺(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第1卷，第5版U.S.Public Health Service,NationalInstitutes of Health.NIH PublicationNo.91-3242；版权1991)。
在本申请中，蛋白质可以是抗体或其片段。抗体或抗体片段可来源于人、小鼠、大鼠或另一种哺乳动物。抗体或抗体片段也可以是来自人、小鼠、大鼠和/或其它哺乳动物的抗体的杂交体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段来源于人。抗体或抗体片段可由杂交瘤细胞或细胞系产生。抗体或抗体片段可以是人源化的。例如，抗体可以是但不限于曲妥珠单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、度伐单抗(duravalumab)、帕妥株单抗、瑞西巴库单抗、达妥昔单抗、艾克珠单抗(ixekizumab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、奥德西单抗(odisivimab)、瑞莎珠单抗(risankizumab)、迪妥昔单抗、阿达木单抗、西妥昔单抗、达雷妥尤单抗(daratumumab)、托珠单抗等。例如，抗体可以是曲妥单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗或hRS7。例如，曲妥珠单抗的重链可包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，并且曲妥珠单抗的轻链可包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。例如，利妥昔单抗的重链可包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，并且利妥昔单抗的轻链可以包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。例如，贝伐单抗的重链可包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，并且贝伐单抗的轻链可包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。例如，hRS7的重链可包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，hRS7的轻链可包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。
在本申请中，蛋白质偶联物可以包含抗体。例如，蛋白质可以是抗体，并且与相应抗体相比，蛋白质偶联物可对抗原具有相似的结合亲和力。例如，蛋白质可以是抗体，并且与相应抗体相比，蛋白质偶联物可对抗原具有相当的结合活性。
例如，本申请中蛋白质偶联物对抗原的结合活性或结合亲和力可以是相应抗体的结合活性或结合亲和力的约0.1％至约100000％(例如，约1％-10000％，约10％-1000％，或约50％-200％)。对抗原的结合活性可以通过定量或非定量方法进行比较。在一些情况下，结合活性或结合亲和力可被限定。例如，通过ELISA，在允许蛋白质偶联物和/或其相应抗原与靶标(例如抗原)结合的条件下，使蛋白质偶联物和/或其相应抗原与靶标(例如抗原)接触，确定蛋白质偶联物与靶标(例如抗原)之间是否形成复合物，并确定相应抗原与靶标(例如抗原)之间是否形成复合物。例如，对靶标(例如抗原)的结合活性或结合亲和力可以通过数值来量化。例如，该值是Kd值。例如，该值是OD值。例如，该值是吸光度值。结合亲和力可以通过统计分析后的值(例如，OD值、KD值或吸光度值)来限定，其中相应抗体的结合亲和力可以设置为100％。
在本申请中，可使用多种方法来确定蛋白质偶联物及其相应抗原的结合活性。
结合活性可以通过例如ELISA、等温滴定量热法、表面等离子共振和/或生物层干涉法来测定。例如，相应抗体的结合活性可以设定为100％。
在本申请中，Fuc*可以是Fuc-MOI，其中所述Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物。Fuc*的岩藻糖连接寡糖的MOI和GlcNAc。例如，Fuc*的岩藻糖或岩藻糖衍生物可以通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接。
在本申请中，Fuc*的MOI可以包含活性部分。一个或多个期望的特征可以被引入具有MOI的蛋白质偶联物中。
在本申请中，活性部分可以包含官能团Y1。官能团Y1可以参与连接反应。例如，官能团Y1可能能够将与Y1连接的分子连接到另一官能团连接的另一分子上，另一分子连接的另一官能团能够与Y1反应。
例如，官能团Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。例如，Y1的功能性部分可选自以下组：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇和马来酰亚胺。例如，Y1的功能性部分可选自以下组：叠氮衍生物、末端炔衍生物、环状炔衍生物、四嗪衍生物、1,2,4-三嗪衍生物、末端烯衍生物、反式环辛烯衍生物、环丙烯衍生物、降冰片烯衍生物、酮衍生物、醛衍生物、氨氧基衍生物、硫醇衍生物和马来酰亚胺衍生物。
例如，官能团Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。例如，Y1的功能性部分可以选自以下组：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
例如，官能团Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。例如，Y1的功能性部分可选自以下组：
在本申请中，Fuc*的MOI还可包含接头F。在一些情况下，接头F在酶促反应、糖基转移反应和/或配体反应(例如生物正交反应)中是必需的。例如，接头F可包含a、a或a。例如，接头F可包含间隔子FL。例如，接头F可以包含a、a或a以及间隔子FL。间隔子FL可以是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。例如，间隔子FL可以选自以下组：
例如，接头F可以是
或其组合。例如，接头F可以是
或其组合，其中FL是间隔子，s是1。
例如，接头F是
其中所述FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，并且s是1。
例如，接头F是
其中所述FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合并且s是1。例如，FL是
在本申请中，Fuc*的MOI还可包含连接子L。在一些情况下，例如，在特定的pH范围内，在特定的温度范围内，或者在酶存在的情况下，连接子可以被切割。
在本申请中，Fuc*可具有Fuc-(F)m-(L)n-Y1的结构，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，Y1是官能团，m、n是0或1。例如，Fuc*可以具有Fuc-Y1、Fuc-L-Y1、Fuc-F-Y1或Fuc-F-L-Y1的结构，其中Fuc、F和Y1是如上定义的。
例如，Fuc*可以具有Fuc-F-L-Y1的结构，其中F是
s是1，并且FL可以选自以下组：
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自以下组：
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自以下组：
在本申请中，活性部分可以包含生物和/或药学活性物质P。生物和/或药学活性物质P本身可以不参与连接反应。P可以诱导蛋白质偶联物的生物学和/或药学活性。例如，P可包含细胞毒素、细胞生长抑制剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、抗生素、荧光团、生物素标签、肽或蛋白质或其任意组合。例如，P可包含选自以下组的药学活性物质：细胞毒素、细胞生长抑制剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、抗生素、肽或蛋白质和/或其任意组合。
例如，P可以是毒素、细胞因子、生长因子、放射性核素、激素、抗病毒剂、抗菌剂、荧光染料、试剂、半衰期延长部分、溶解度增加部分、聚合物-毒素偶联物、核酸、生物素或链霉抗生物素蛋白部分、维生素、靶结合部分和/或抗炎剂。例如，P可以是毒素、细胞因子、生长因子、放射性核素、激素、抗病毒剂、抗菌剂、半衰期延长部分、促可溶部分、聚合物-毒素偶联物、核酸、维生素、靶向结合部分和/或抗炎剂。
例如，P可以是治疗活性部分，其可以用于预防、治疗和/或缓解疾病。例如，P可以是抗肿瘤剂，其可以选自化学治疗剂和/或靶向治疗剂。例如，P可以是导致细胞损伤或细胞死亡的物质，例如细胞毒素。例如，P包含选自以下组的细胞毒素：吡咯并苯二氮卓(PBD)、奥瑞他汀(例如MMAE或MMAF)、美登木素生物碱(美坦素(Maytansine)、DM1或DM4)、多卡霉素、微管溶素、烯二炔(例如卡利奇霉素)、多柔比星(PNU)、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、卡利奇霉素、鹅膏蕈碱(例如a-鹅膏蕈碱)和喜树碱(例如伊西替康、deruxtecan德卢替康)。
例如，P可包含细胞毒素。例如，P可包含MMAE、DXd、MMAF、seco-DUBA或DM4。
在本申请中，Fuc*的MOI还可包含连接子L。在一些情况下，例如，在特定的pH范围内，在特定的温度范围内，或者在酶存在的情况下，连接子可以被切割，并且根据蛋白质偶联物的蛋白质所在的地方，MOI的P可以在体内或体外发挥生物学和/或药学活性。例如，L是可切割的连接子。本领域中许多类型的可切割连接子可用于本申请。例如，L可以是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或蛋白水解可切割的连接子。例如，L可以是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
在本申请中，Fuc*的MOI还可包含接头F。在一些情况下，接头F在酶促反应、糖基转移反应和/或配体反应(例如生物正交反应)中是必需的。例如，接头F可包含
例如，接头F可包含间隔子FL。例如，接头F可包含
以及间隔子FL。间隔子FL可以是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。例如，间隔子FL可以选自以下组：
例如，接头F可以是
或其组合。例如，接头F是
或其组合，其中FL是间隔子并且s是1。
例如，接头F是
其中所述FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合并且m是0或1。例如，FL可以选自以下组：
例如，接头F是
其中所述FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合并且m是0或1。例如，FL可以选自以下组：
在本申请中，Fuc*可以具有Fuc-(F)m-(L)n-P的结构，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1。例如，Fuc*可具有Fuc-P、Fuc-F-P、Fuc-L-P、Fuc-F-L-P的结构，其中Fuc、F、L和P是如上定义的。
例如，Fuc*可具有Fuc-F-L-P的结构，其中F是
s是1，并且FL可以选自以下组：
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自以下组：
例如，所述获得的蛋白质偶联物的结合亲和力可以是相应抗体的结合亲和力的约0.1％至约100000％(例如，约1％-10000％，约10％-1000％，或约50％-200％)。
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自以下组：
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自以下组：
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自：
在这种情况下，蛋白质偶联物的蛋白质可以是抗体，并且与相应抗体相比，蛋白质偶联物可具有相似的对抗原的结合亲和力。
在本申请中，基团Y1Y2可以在Fuc*的岩藻糖与P之间。基团Y1Y2可以在Y1与官能团Y2之间的连接反应之后保留。连接反应将P与偶联物的蛋白质缀合。例如，连接反应可以是生物正交反应。例如，Y2可包含功能性部分。
例如，Y2可以包含选自以下组的功能性部分：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇和马来酰亚胺。例如，Y2的功能性部分可选自以下组：叠氮衍生物、末端炔衍生物、环状炔衍生物、四嗪衍生物、1,2,4-三嗪衍生物、末端烯衍生物、反式环辛烯衍生物、环丙烯衍生物、降冰片烯衍生物、酮衍生物、醛衍生物、氨氧基氨氧基衍生物、硫醇衍生物和马来酰亚胺衍生物。
在本申请中，Y2可包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
例如，剩余基团Y1Y2可以选自以下组：
当Y1包含特定的功能性部分时，可选择什么样的Y2的功能性部分的类型是本领域已知的。例如，Y1和Y2可包含选自以下组的功能性部分：a)Y1包含
Y2包含
b)Y1包含
Y2包含
c)Y1包含
Y2包含
以及d)Y1包含
Y2包含
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基各自独立地任选地被取代。
在本申请中，生物和/或药学活性物质P可以通过酶催化的反应与蛋白质偶联。
在本申请中，Fuc*可以具有Fuc-(F)m-(L)n-Y1Y2-(FL')m’-(L’)n’-P的结构，其中Fuc是岩藻糖，F是接头，Y1Y2是剩余基团，L是连接子，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m、n、m’和n’各自独立地是0或1。其中F、Y1Y2、L和P是如上定义的。
例如，Fuc*可以具有Fuc-F-L-Y1Y2-FL’-L’-P的结构，其中F是
FL可以选自以下组：
并且FL’可选自以下组：
例如，Fuc*可包含
的结构，其中X选自以下组：
在本申请中，Fuc*包含岩藻糖或岩藻糖衍生物。Fuc*中的岩藻糖或岩藻糖衍生物的结构可以是
其中MOI是如上定义的目标分子。
在本申请中，蛋白质偶联物的寡糖包含
其中(Fuc)、F、FL’、L、L’、GlcNAc、Y1、Y1Y2、P、Gal是如上定义的，b是0或1，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，并且n’是0或1。
例如，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与
的末端LacNAc的GlcNAc连接，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与核心GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，并且
是抗体或Fc-融合蛋白。
例如，本申请的蛋白质偶联物可以如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是抗体或Fc融合蛋白。寡糖可以与Fc片段的N297位连接。例如，
是抗体。例如，与相应抗体相比，蛋白质偶联物可具有相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，当蛋白质偶联物包含Y1时，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，以及
Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-Y1，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或它们的衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分，s是0或1，m是0或1，并且n是0或1。例如，
是抗体。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-F-(L)n-Y1，其中，Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分，s是0或1，n是0或1。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-F-Y1，其中，Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分，s是0或1，并且
与抗体的N297位连接。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中，
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，并且Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-P，其中Fuc如下式所示
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是生物和/或药学活性物质，s是0或1，m是0或1，n是0或1。例如，
是抗体。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-F-(L)n-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是药学活性物质，s是0或1，n是0或1。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中，
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-F-L-P，其中，Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是药学活性物质，s是0或1，并且
与抗体的N297位连接。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNA键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，并且Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-Y1Y2-(FL’)m’-(L’)n’-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，s是0或1，L是可切割的连接子，Y1Y2是连接反应后的剩余基团，FL’是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，并且n’是0或1。例如，
是抗体。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-Fuc-F-Y1Y2-(FL’)n’-L’-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，s是0或1，Y1Y2是连接反应后的剩余基团，L’是可切割的连接子，P是药学活性物质(例如，毒素)，n’是0或1，并且蛋白质偶联物具有与其相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中，
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-F-Y1Y2-FL’-L’-P，其中Fuc根据下式
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，s是0或1，Y1Y2是连接反应后的剩余基团，FL’是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是药学活性物质(例如，毒素)，并且
与抗体的N297位连接。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与
的核心GlcNAc连接，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与核心GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，
是抗体或Fc融合蛋白，b是0或1。在一些实施方案中，蛋白质偶联物可以具有一个或两个缀合在GlcNAc中的目标分子(优选两个分子)。
例如，蛋白质偶联物如下式所示
其中所述
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是包含Fc片段的抗体或Fc融合蛋白。GlcNAc可与蛋白质的N297位连接。例如，
是抗体。例如，与相应抗体相比，蛋白质偶联物可具有相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，当蛋白质偶联物包含Y1时，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
例如，蛋白质偶联物如下式所示
其中所述
是GlcNAc，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是包含Fc片段的抗体或Fc融合蛋白。GlcNAc可与蛋白质的N297位连接。例如，
是抗体。例如，与相应抗体相比，蛋白质偶联物可具有相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，当蛋白质偶联物包含Y1时，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
例如，蛋白质偶联物如下式所示
其中所述
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是包含Fc片段的抗体或Fc融合蛋白。GlcNAc可与蛋白质的N297位连接。例如，
是抗体。例如，与相应抗体相比，蛋白质偶联物可具有相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，当蛋白质偶联物包含Y1时，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中，
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-Y1，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分，s是0或1，m是0或1，n是0或1。例如，
是抗体。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中，
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，b是0或1，Fuc*是Fuc-F-(L)n-Y1，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分，s是0或1，n是0或1。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，并且Fuc*是Fuc-F-Y1，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分，s是0或1，并且
与抗体的N297位连接。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
在本申请中，蛋白质偶联物可以具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是生物和/或药学活性物质，s是0或1，n是0或1。例如，
是抗体。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原具的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-F-(L)n-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是药学活性物质，s是0或1，n是0或1。例如，蛋白质偶联物具有与其对应的抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-F-L-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是药学活性物质，并且
与抗体的297位连接。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可具有式
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc融合蛋白，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-Y1Y2-(FL’)m’-(L’)n’-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，s是0或1，L是可切割的连接子，Y1Y2是连接反应后的剩余基团，FL’是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L’是可切割的连接子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，并且n’是0或1。例如，
是抗体。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可具有式
，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-Fuc-F-Y1Y2-(FL’)n’-L’-P，其中Fuc如下式所示
，F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，s是0或1，Y1Y2是连接反应后的剩余基团，L’是可切割的连接子，P是生物和/或药学活性物质(例如，毒素)，并且n’是0或1。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
在本申请中，蛋白质偶联物可具有式
，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体，b是0或1，并且Fuc*是Fuc-F-Y1Y2-FL’-L’-P，其中Fuc如下式所示
F是
其中FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，s是0或1，Y1Y2是连接反应后的剩余基团，FL’是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合，L是可切割的连接子，P是生物和/或药学活性物质(例如，毒素)，并且
与抗体的N297位连接。例如，蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。
例如，由“一步”法或“两步”法制备的一些示例性抗体-G2(F)-Fuc*偶联物和一些抗体-((Galβ1,4)(GlcNAc)-Fuc*偶联物与其相应抗体相比较的结合亲和力如图20所示。图20显示了一些示例性曲妥珠单抗-G2F-Fuc*偶联物和一些曲妥珠单抗-((Galβ1,4)(GlcNAc)-Fuc*偶联物的结合亲和力与曲妥珠单抗对Her2的结合亲和力相似。结果表明，本申请中的抗体偶联物具有与相应抗体相似的对的结合亲和力。结果表明，本申请中的偶联方法对抗体的结合亲和力的影响可忽略不计。
本申请提供了蛋白质偶联物的组合物。
在本申请中，蛋白质偶联物的组合物可以具有约为4(例如，3.5-4的范围)的平均MOI与抗体的比率(MAR)。例如，当蛋白质偶联物具有式
时，蛋白质偶联物的组成可以具有2.4-4、2.8-4、3.2-4、3.5-4或3.6-4之间的目标分子与抗体的比率(MAR)。当目标分子包含药学活性物质(即，药物)时，MAR可以是药物与抗体的比率(DAR)。
在本申请中，蛋白质偶联物的组成可具有约为2(例如，1.6-2的范围)的目标分子与抗体的比率(MAR)。例如，当蛋白质偶联物具有式
时。例如，蛋白质偶联物的组成可具有0.5-2、1-2、1.5-2、1.6-2、1.8-2或1.9-2之间的目标分子与抗体的比率(MAR)。当目标分子包含药学活性物质(即，药物)时，MAR可以是药物与抗体的比率(DAR)。
例如，一些示例性抗体偶联物的平均MAR或DAR列于实施例中。
另一方面，本申请提供了用作药物的抗体-药物偶联物，其中抗体是特异性结合肿瘤抗原的抗体，并且其中目标分子是细胞毒素。本发明还涉及用于治疗癌症的根据本发明的抗体-药物偶联物，其中抗体是特异性结合肿瘤抗原的抗体，并且其中目标分子是细胞毒素。在一些实施方案中，肿瘤抗原可以是Trop2、VEGF、CD20和/或Her2。在一些实施方案中，蛋白质偶联物(例如，抗体-药物偶联物)能够治疗乳腺癌、淋巴瘤、结直肠癌、肺癌、肾癌、脑癌和/或卵巢癌。
在本申请中，连接子L或L’是可切割的连接子，并且对于本申请中的抗体-偶联物来说可能是实现P部分的功能性所必需的。例如，在本申请中，与没有连接子的抗体-偶联物相比，具有可切割连接子的抗体-偶联物可以具有高得多的效果。
在本申请中，蛋白质偶联物具有至少一种以下特征：(a)良好控制和明确的a位点；(b)明确定义且良好控制的DAR或MAR(c)高均一性；(d)对抗体结合亲和力的影响可以忽略不计；(e)高稳定性(例如，Fuc*的Fuc与-GlcNAc-Gal的GlcNAc之间的偶联键联在人血浆中至少稳定一天)；(f)良好的效果。例如，图17显示了由“一步”法和“两步”法制备的抗体-药物偶联物的MS分析，说明了明确定义且良好控制的DAR或MAR，以及抗体-药物偶联物的高均一性。对于另一个实例，图21显示了由“一步”法和“两步”法制备的一些抗体-药物偶联物的HIC-HPLC分析，也显示了抗体-药物偶联物的高均一性。对于另一个实例，图20说明了曲妥珠单抗-药物偶联物显示出与曲妥珠单抗相似的对Her2抗原的结合亲和力，表明对抗体的结合亲和力的影响可以忽略不计。对于另一个实例，图22显示由“一步”法和“两步”法制备的抗体-药物偶联物在人血浆中稳定至少8天。图22还显示了Fuc*的Fuc与-GlcNAc-Gal的GlcNAc之间的键联在血浆中至少稳定1天(甚至8天)，如在质谱分析中所测量的。通过常规策略制备的抗体偶联物在血浆中可能不稳定。例如，通过半胱氨酸-马来酰亚胺缀合制备的抗体偶联物在血浆中不稳定，并随着时间的推移导致显著的DAR损失。半胱氨酸-马来酰亚胺的连接在血浆中不稳定。例如，血浆可以是人血浆。对于另一个例子，图12、图23、图24、图25、图26、图27和图28说明了本申请中的抗体偶联物显示出良好的体外和体内效果。
化合物
另一方面，本申请提供了化合物，其包含二磷酸鸟苷(GDP)和药学活性物质(P)。
例如，P是药学活性物质。例如，P可以是细胞毒素、细胞生长抑制剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、抗生素、肽和/或蛋白质，或其任意组合。例如，P可以是抗肿瘤剂。例如，P可以包含细胞毒素。例如，P可以包含选自以下组的细胞毒素：吡咯并苯二氮卓、奥瑞他汀、美登素、多卡霉素、微管溶素、烯二炔、多柔比星、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂、卡利奇霉素、鹅膏蕈碱、喜树碱。例如，P可以包含选自以下组的细胞毒素：MMAE、DXd、MMAF、seco-DUBA和DM4。
所述化合物可具有比所述P更高的亲水性。
在本申请中，化合物可具有式GDP-(F)m-(L)n-P，其中F是接头，L是连接子，m是0或1，n是0或1。
例如，F可以是
其中所述FL是间隔子，s是0或1。
例如，化合物可以包含式(I)：
例如，L可以是可切割的连接子。
例如，L可以是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或蛋白水解可切割的连接子。
例如，L可以是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
例如，FL可以是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
例如，FL可选自以下组：
例如，化合物可以选自以下组：
另一方面，本申请还提供了包含下式(II)的化合物：
例如，包含式(II)的示例性化合物可选自以下组：
另一方面，本申请提供了制备蛋白质复合物的方法，其包括使用本申请的化合物。当蛋白质是抗体时，蛋白质偶联物对相应抗体具有相似的结合亲和力。
方法
另一方面，本申请提供了用于制备蛋白质偶联物的方法。所述方法包括步骤(a)在催化剂存在的情况下，使岩藻糖衍生物供体Q-Fuc*’与包含寡糖的蛋白质接触，其中寡糖包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中GlcNAc直接或间与蛋白质的氨基酸连接；Gal是半乳糖；(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；Fuc*’包含与目标分子(MOI’)连接的岩藻糖或岩藻糖衍生物；所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段；Q-Fuc*’是包含Fuc*’的分子。本申请的方法可以在能够将所述Fuc*’转移到所述-GlcNAc(Fuc)b-Gal的GlcNAc上的催化剂存在的情况下进行。用于根据本发明的方法的几种合适的条件在本领域是已知的。用于特定方法的合适条件是催化剂，因此该特定方法中的岩藻糖或岩藻糖衍生物供体是底物。在本申请中，催化剂可以选自岩藻糖基转移酶的组。
在一个实施方案中，Q-Fuc*’的Fuc*'可被转移至蛋白质所包含的寡糖的-GlcNAc(Fuc)b-Gal的GlcNAc。岩藻糖基转移酶可以是α-1,3-岩藻糖基转移酶或其催化结构域。在一个实施方案中，岩藻糖基转移酶可以从细菌(例如幽门螺杆菌)中获得。在一个实施方案中，α-1,3-岩藻糖基转移酶由重组制备获得。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于脆弱拟杆菌。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶包含GenBank登录号YP_213065.1或其功能变体或片段中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌。在一些实施方案中，其中所述岩藻糖基转移酶包含如GenBank登录号AF008596.1、GenBank登录号AAD07447.1、GenBank登录号AAD07710.1、GenBank登录号AAF35291.2、GenBank登录号AAB93985.1中所示的氨基酸序列，或其功能变体或片段。例如，岩藻糖基转移酶可包含GenBank登录号AAD07710.1中所示的氨基酸序列，或其功能变体或片段。例如，岩藻糖基转移酶可包含SEQ ID NO:3或4中所示的氨基酸序列，或其功能变体或片段。
例如，岩藻糖基转移酶可来自细菌。例如，步骤(a)可以在Hpα-1,3-岩藻糖基转移酶存在情况下进行。
在本申请中，所述Q-Fuc*'可以是供体和Fuc*'。供体可以包含二磷酸尿苷(UDP)、二磷酸鸟苷(GDP)或二磷酸胞苷(CDP)。
在本申请中，Q-Fuc*'可以包含GDP、岩藻糖或岩藻糖衍生物、任选的接头F、任选的连接子L和活性分子(例如官能团Y1或P)。在一些实施方案中，Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1，其中所述Fuc是
，n是0或1，m是0或1。在一些实施方案中，Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P，其中所述Fuc是
，n是0或1，m是0或1。
在本申请中，P可以通过糖基转移反应(“一步”法)直接与蛋白质偶联。例如，Q-Fuc*'可以是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P，其中n是0或1，m是0或1。在岩藻糖基转移酶存在的情况下，可以将-Fuc-(F)m-(L)n-P转移到包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal的蛋白质的GlcNAc上，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Fuc是
，b是0或1，m是0或1，n是0或1。
例如，Q-Fuc-(F)m-(L)n-P可以具有
的结构，并且X可以选自以下组：
在本申请中，在步骤(a)中，当Q-Fuc*’是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P.时，包含
的蛋白质偶联物直接通过糖基转移反应获得，而不需要进一步的连接反应(“一步”法)，Q-Fuc*’中的Fuc*’和包含
的蛋白质偶联物的相应Fuc*是相同的。例如，当Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P时，Q-Fuc*’中的Fuc*'和包含
的蛋白质偶联物的相应Fuc*具有相同的Fuc-(F)m-(L)n-P的结构。同时，Fuc*'的MOI'和Fuc*的MOI相同，并且
相同。
在本申请中，P可以通过糖基转移反应和进一步的连接反应(“两步”法)与蛋白质缀合。例如，Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1，其中n是0或1，m是0或1。在岩藻糖基转移酶存在的情况下，Fuc-(F)m-(L)n-Y1可被转移到包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal的蛋白质的GlcNAc上，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Fuc是
，b是0或1，m是0或1，n是0或1。
例如，Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1可以具有
的结构，并且X可以选自以下组：
在本申请中，当Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1时，包含
的蛋白质偶联物是在没有进一步的连接反应的情况下通过糖基转移反应获得的，Q-Fuc*’中的Fuc*'和包含
的蛋白质偶联物的相应Fuc*是相同的。例如，当Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1时，Q-Fuc*'中的Fuc*'和包含
的蛋白质偶联物的相应Fuc*具有相同的Fuc-(F)m-(L)n-Y1结构，同时，Fuc*'的MOI'和Fuc*的MOI相同，并且
相同。
该方法还可包括步骤(b)将包含
的蛋白质偶联物与Y2-(FL’)m’-(L’)n’-P接触，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Y1Y2是所述Y1与包含能够与Y1反应的功能性部分的官能团Y2之间的连接反应后的剩余基团，(Fuc)是岩藻糖，Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，L是连接子，F是接头，L’是可切割的，其定义与L相同，“FL”是与FL相同定义的间隔子，b是0或1，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。
在本申请中，步骤(b)可以在步骤(a)之后进行。在本申请中，在步骤(b)与步骤(a)之间可以有纯化过程。
在本申请中，当Q-Fuc*'是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1，并且包含
的蛋白质偶联物通过糖转移反应和进一步的连接反应(“两步”法)获得时，蛋白质偶联物的
是
例如，在“两步”法中，Q-Fuc*’的Fuc*’具有Fuc-(F)m-(L)n-Y1的结构，而包含
的蛋白质偶联物的相应Fuc*具有Fuc-(F)m-(L)n-Y1Y2-(FL’)n’-(L’)m’-P的结构。在这种情况下，Fuc*和Fuc*’是不同的，并且Fuc*’的MOI'和Fuc*的MOI是不同的。
在本申请中，当蛋白质偶联物包含
时，
的接头的存在可以显著增强官能团Y1对官能团Y2的反应性，其中s是0或1。.例如，与包含相同官能团Y1但无
的接头F的抗体偶联物相比，具有
的接头F的包含官能团Y1的抗体偶联物可具有显著增强的Y1对其相应官能团Y2的反应性，其中s是0或1。例如，具有或不具有接头F的包含相同
的抗体偶联物对与药学活性物质P连接的DBCO具有显著不同的反应性。例如，抗体-G2(F)-FAmAz
和抗体-G2(F)-FAmP4Az
可显示出比抗体-G2(F)-FAz
高得多的对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。又如，抗体-((Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz
和抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az
可显示出比抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz
显著更高的对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。例如，曲妥珠单抗-G2F-FAmAz
和曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az
显示出比曲妥珠单抗-G2F-FAz
高得多的对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。例如，已显示曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz
和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az
对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性明显高于曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz
对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。图19A显示了曲妥珠单抗-G2F-FAz、曲妥珠单抗-G2F-FAmAz和曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性的比较。图19B显示了曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性的比较。
在本申请中，当蛋白质偶联物包含
时，Y1可以包含能够参与SPAAC(环张力促进的叠氮-炔烃环加成)反应的
基团，以将药学活性物质P安装到蛋白质上。在本申请中，当蛋白质偶联物包含
时，Y1可以包含
其可参与将药学活性物质P安装到蛋白质上的IEDDA(逆电子需求狄尔斯-阿尔德(Inverse electron demand Diels-Alder))反应。IEDDA反应通常比SPAAC反应快得多。通过使用可能参与iEDDA反应的官能团，可以显著促进“两步”法中的第二步骤，以制备抗体偶联物或Fc-融合蛋白。例如，包含
的抗体偶联物或Fc-融合蛋白偶联物安装药学活性物质P所需的时间可能比包含
的抗体偶联物或Fc-融合蛋白偶联物安装药学活性物质P所需的时间少。例如，如图19A所示，曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz对TCO-PEG4-vc-PAB-MMAEE的反应性明显高于曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。又如，如图19B所示，曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz对TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性明显高于曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。
在本申请中，由“两步”法制备的蛋白质偶联物可以包含剩余基团，该基团可以不存在于由“一步”法产生的蛋白质偶联物中。剩余基团可以是疏水基团。例如，具有剩余基团的蛋白质偶联物(由“两步”法产生)可能比没有剩余基团的蛋白质偶联物(由“一步”法产生)更加疏水。例如，具有剩余基团的抗体偶联物(由“两步”法产生)可能比没有剩余基团的抗体偶联物(由“一步”法产生)更加疏水。例如，如图21所示，曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE(由“两步”法产生)比曲妥珠单抗-G2F-FAmP4MMAE(由“一步”法产生)更加疏水。例如，如图21所示，曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCOMMAE(由“两步”法产生)比曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4MMAE(由“一步”法产生)更加疏水。
在本申请中，步骤(a)可以在合适的缓冲溶液中进行，所述缓冲液是例如磷酸盐缓冲盐水(例如磷酸盐-缓冲盐水、tris缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPEs、Tris、Tris-HCl和甘氨酸。合适的缓冲剂是本领域已知的。例如，缓冲溶液是含有Mg2+的Tris-HCl缓冲液。例如，缓冲溶液是含有Mn2+的Tris-HCl缓冲液。例如，缓冲溶液是PBS缓冲液。
步骤(a)可在约0℃至约50℃的范围内的温度下进行。在一些实施方案中，该方法可在约10℃至约45℃的范围内的温度下进行。在一些实施方案中，该方法可在约20℃至约40℃的范围内的温度下进行。在一些实施方案中，该方法可以在约20℃至约30℃的范围内的温度下进行。例如，该方法可以在约30℃的温度下进行。例如，该方法可以在约37℃的温度下进行。
步骤(a)可以在约4至约10的范围内的pH下进行。在一些实施方案中，该方法可以在约5至约9的范围内的pH下进行。在一些实施方案中，该方法可以在约5.5至约8.5的范围内的pH下进行。在一些实施方案中，该方法可以在约6至约8的范围内的pH下进行。在一些实施方案中，该方法可以在约7至约8的范围内，例如约7至约7.5的范围内的pH下进行。
在本申请中，用于制备蛋白质偶联物的方法可包括将获得的蛋白质偶联物交换到缓冲液中。例如，将获得的蛋白质偶联物交换到配制缓冲液或贮存缓冲液中。缓冲液可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。赋形剂可有助于提高活性药物成分(例如，本申请的蛋白质偶联物)在其贮存和使用期间的生物利用度或稳定性。
在本申请中，该方法还可包括步骤(c)在催化剂的存在下，使包含含有-GlcNAc(Fuc)b的寡糖的蛋白质与UDP-半乳糖接触，以获得所述含有-GlcNAc(Fuc)b-Gal的蛋白质，其中Gal是半乳糖，b是0或1。在本申请中，催化剂可以是β1,4-半乳糖基转移酶。例如，b是0。例如，b是1。
例如，在β1,4-半乳糖基转移酶和UDP-半乳糖存在的情况下，具有G0(F)、G1(F)、G2(F)的异质糖基化形式的抗体可被转化为均一的抗体-G2(F)，其在抗体分子中包含四个-GlcNAc-Gal部分。抗体-G2(F)如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，
是抗体或Fc-融合蛋白，并且寡糖与抗体的N297位连接。
例如，在β1,4-半乳糖基转移酶存在下，抗体-GlcNAc(Fuc)b可被转化为抗体-GlcNAc(Fuc)b-Gal(也称为抗体-(Fuc)b(Galβ1,4)GalNAc)，其在抗体分子中含有两个-GlcNAc(Fuc)b-Gal部分。抗体-GlcNAc(Fuc)b-Gal如下式所示
(例如，相应的抗体)，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，
是抗体或Fc-融合蛋白，b是0或1，并且GlcNAc与抗体的N297位连接。例如，b是0。例如，b是1。
在本申请中，步骤(c)可以在步骤(a)之前进行。在本申请中，所述方法在步骤(c)与步骤(a)之间可以包含纯化过程。在本申请中，所述方法在步骤(a)与步骤(c)之间可以不包含的纯化过程。在本申请中，步骤(a)和步骤(c)可在同一反应容器中进行。在本申请中，步骤(a)的岩藻糖基转移酶、Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和步骤(c)的半乳糖基转移酶和UDP-半乳糖可在同一反应容器中。在本申请中，步骤(a)和步骤(c)可以同时进行。在本申请中，步骤(a)和步骤(c)可以同时进行。在本申请中，步骤(a)可以在步骤(c)完成之前执行。
在本申请中，所述方法还可包括步骤(d)将包含寡糖的蛋白质修饰为包含核心-((Fuc)α1,6)GlcNAc或核心-GlcNAc的蛋白质，其中在核心-((Fuc)α1,6)GlcNAc或核心-GlcNAc中，GlcNAc直接与蛋白质的氨基酸(所述氨基酸通常是Asn)连接，并且(Fuc)通过α1,6键联与GlcNAc连接。核心“-((Fuc)α1,6)GlcNAc”的GlcNAc与蛋白质的氨基酸直接连接。例如，蛋白质的氨基酸是Asn。例如，蛋白质的氨基酸是Asn297。如果糖蛋白没有与核心GlcNAc连接的核心α1,6岩藻糖，那么内切糖苷酶可以从糖蛋白(例如抗体)上切割聚糖链，并留下核心GlcNAc。如果糖蛋白具有与核心GlcNAc连接的核心α1,6岩藻糖，则内切糖苷酶可以从糖蛋白(例如抗体)切割聚糖链，并留下核心-((Fuc)α1,6)GlcNAc。在本申请中，内切糖苷酶可以将抗体或Fc-融合蛋白的寡糖修饰为–GlcNAc或-((Fuc)α1,6)GlcNAc)。在本申请中，内切糖苷酶可以是Endo S、Endo A、Endo F、Endo M、Endo D或其功能突变体或变体，或其任意组合。在本申请中，内切糖苷酶可以是EndoS。例如，内切糖苷酶可以具有如SEQ ID NO:6或17中所示的氨基酸序列。
例如，具有异质糖基化形式的抗体(例如，相应的抗体)可通过使用内切糖苷酶修剪成均一的抗体-GlcNAc(Fuc)。抗体-((Fuc)α1,6)GlcNAc(即抗体-GlcNAc(Fuc))如下式所示
。其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖，
是抗体或Fc-融合蛋白，并且GlcNAc与抗体的N297位连接。例如，通过使用内切糖苷酶，具有异质糖基化形式的抗体可被修剪成均一的抗体-GlcNAc。抗体-GlcNAc如下式所示
其中
是GlcNAc，
是抗体或Fc-融合蛋白，并且GlcNAc与抗体的N297位连接。
在本申请中，所述方法还可包括步骤(e)以从包含核心-((Fuc)α1,6)GlcNAc的蛋白质中去除核心α-1,6岩藻糖，以产生包含核心-GlcNAc的蛋白质。例如，步骤(e)可在核心-α1,6岩藻糖苷酶存在的情况下进行。例如，核心-α1,6岩藻糖苷酶可以是BfFucH、岩藻糖苷酶O、Alfc、BKF、岩藻糖苷酶O或其功能突变体或变体，或其任意组合。
例如，核心-α1,6岩藻糖苷酶可以是Alfc。例如，核心-α1,6岩藻糖苷酶可具有根据SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18的蛋白质序列。
例如，可通过使用核心-α1,6岩藻糖苷酶(例如Alfc)将抗体-GlcNAc(Fuc)进一步修剪为抗体-GlcNAc。抗体-GlcNAc如下式所示
(例如，相应抗体)，其中
是GlcNAc，
是抗体或Fc-融合蛋白，并且GlcNAc与抗体的N297位连接。
在本申请中，步骤(e)可以在步骤(d)与步骤(c)之间进行。在本申请中，在步骤(d)与步骤(e)之间可以有纯化过程。在本申请中，在步骤(d)与步骤(e)之间可以没有纯化过程。在本申请中，在步骤(e)与步骤(c)之间可以有纯化过程。在本申请中，在步骤(e)与步骤(c)之间可以没有纯化过程。
在本申请中，步骤(d)与步骤(e)可以在同一反应容器中进行。在本申请中，步骤(d)与步骤(e)可以同时进行。例如，可通过同时添加核心-α1,6岩藻糖苷酶和内切糖苷酶，将抗体修饰为抗体-GlcNAc。例如，可通过在同一反应容器中同时添加核心-α1,6岩藻糖苷酶和内切糖苷酶，将抗体修饰为抗体-GlcNAc。
在本申请中，所述方法可按照步骤(c)-步骤(a)的顺序进行。在本申请中，所述步骤可以按照步骤(c)-步骤(a)-步骤(b)的顺序进行。在本申请中，在每个步骤之间可以有纯化步骤。在本申请中，在“一锅”法中，在步骤(c)与步骤(a)之间可以没有纯化过程。在本申请中，在“一锅”法中，步骤(a)和步骤(c)可以在同一反应容器中同时进行。
在本申请中，所述方法可以按照步骤(d)-步骤(c)-步骤(a)的顺序进行。在本申请中，所述方法可以按照步骤(d)-步骤(c)-步骤(a)-步骤(b)的顺序进行。在本申请中，在每个步骤之间可以有纯化步骤。在本申请中，在“一锅”法中，在步骤(d)与步骤(c)之间以及在步骤(c)与步骤(a)之间可以没有纯化过程。在本申请中，在“一锅”法中，步骤(a)、步骤(c)和步骤(d)可以在同一反应容器中同时进行。
在本申请中，所述方法可以按照步骤(d)-步骤(e)-步骤(c)-步骤(a)的顺序进行。在本申请中，所述方法可以按照步骤(d)-步骤(e)-步骤(c)-步骤(a)-步骤(b)的顺序进行。在本申请中，在每个步骤之间可以有纯化步骤。在本申请中，在“一锅”法中，在步骤(d)与步骤(e)之间、步骤(e)与步骤(c)之间以及步骤(c)与步骤(a)之间可以没有纯化过程。在本申请中，在“一锅”法中，步骤(d)和步骤(e)可以在步骤(c)之前在同一容器中同时进行，然后步骤(c)和步骤(a)在进行步骤(d)和步骤(e)的同一容器中同时进行。
在本申请中，酶、反应物(包含寡糖的蛋白质)和产物(包含寡糖的修饰蛋白质)可以同时在同一反应容器中。
在本申请中，所述方法可以是“一锅”法，其包括在“一锅”中使包含-GlcNAc(Fuc)b的蛋白质与UDP-半乳糖、β1,4-半乳糖基转移酶以及Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶接触，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，Y1是官能团，P是生物或药学活性物质，b是0或1，m是0或1，n是0或1。例如，b是0。例如，b是1。例如，抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-P或抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-Y1可通过使具有G0(F)、G1(F)、G2(F)的异质糖基化形式的抗体与UDP-半乳糖、β1,4-半乳糖基转移酶、Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶在“一锅”中接触来获得。在整个过程中，只进行了一次纯化过程来获得抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-P或抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-Y1。
在本申请中，所述方法可以是“一锅”法，其包括将包含-GlcNAc(Fuc)b的蛋白质与UDP-半乳糖和β1,4-半乳糖基转移酶接触一段时间，随后直接将Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶加入到反应混合物中，而无需从反应混合物中进一步纯化蛋白质，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，Y1是官能团，P是生物或药学活性物质，b是0或1，m是0或1，n是0或1。例如，b是0。例如，b是1。例如，抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-P或抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-Y1可以通过将具有G0(F)、G1(F)、G2(F)的异质糖基化形式的抗体与UDP-半乳糖和β1,4-半乳糖基转移酶接触，然后直接向反应混合物中加入Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶来获得，而无需进一步从反应混合物中纯化蛋白质。在整个过程中，仅进行一次纯化过程就获得抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-P或抗体-G2(F)-Fuc-(F)m-(L)n-Y1。
在本申请中，所述方法可以是“一锅”法，其包括使包含寡糖的蛋白质与内切糖苷酶、UDP-半乳糖、β1,4-半乳糖基转移酶、Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶在“一锅”中接触，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，Y1是官能团，P是生物或药学活性物质，m是0或1，n是0或1。例如，抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-P可以通过在“一锅”中将具有异质糖基化形式的抗体与内切糖苷酶、UDP-半乳糖、β1,4-半乳糖基转移酶、Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶接触来获得。在整个过程中，在所有反应完成后，只需进行一次纯化过程，即可获得抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-P或抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-Y1。
在本申请中，所述方法可以是“一锅”法，其包括将包含寡糖的蛋白质与内切糖苷酶和核心-α1,6岩藻糖苷酶接触一段时间，随后将UDP-半乳糖、β1,4-半乳糖基转移酶、Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶直接加入到反应混合物中以获得包含
的蛋白质偶联物，而无需从反应混合物中进一步纯化蛋白质，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，Y1是官能团，P是生物或药学活性物质，b是0或1，m是0或1，n是0或1。例如，b是0。例如，b是1。例如，抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-P可以通过使具有异质糖基化的抗体与内切糖苷酶和核心-α1,6岩藻糖苷酶接触一段时间来获得。反应后直接向反应混合物中加入UDP-半乳糖、β1,4-半乳糖基转移酶、Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P和Hpα1,3-岩藻糖基转移酶，而无需从反应混合物中进一步纯化蛋白质。在整个过程中，在所有反应完成后，只需进行一次纯化过程，即可获得抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-P或抗体-(Galβ1,4)GalNAc-Fuc-(F)m-(L)n-Y1。
从反应混合物中多轮纯化抗体是一项艰巨的任务。这些“一锅”法大大简化了抗体偶联物的制备过程。
另一方面，本申请提供了本申请的Q-Fuc*’在制备所述蛋白质偶联物中的用途。
在本申请中，Q-Fuc*’是Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或Q-Fuc-(F)m-(L)n-P。在一些实施方案中，Q-Fuc*’是GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P，其中F是接头，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，Y1是官能团，m是0或1，n是0或1。在一些实施方案中，Q-Fuc*’是GDP-Fuc-F-(L)n-Y1或GDP-Fuc-F-(L)n-P，其中n是0或1。接头F的结构可能对α-1,3-岩藻糖基转移酶在将活性部分(例如Y1或P)转移到由蛋白质组成的-GlcNAc(Fuc)b-Gal的GlcNAc中的催化效率有显著影响，其中b是0或1。例如，具有包含
(结构的左末端直接与Fuc连接)的接头F的GDP-Fuc-F-(L)n-Y1或GDP-Fuc-F-(L)n-P可以更高效地被转移到包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal的抗体或Fc融合蛋白上，其中b是0或1，n是0或1(即包含
的结构的GDP-Fuc-F-(L)n-Y1or GDP-Fuc-F-(L)n-P)。例如，在将活性部分(例如Y1或P)转移到包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal的抗体或Fc融合蛋白方面，α-1,3-岩藻糖基转移酶对具有包含
(结构的左端直接与岩藻连接)的接头的GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P的催化效率显著高于对具有那些包含
(结构的左端直接与岩藻聚糖连接)的接头的分子催化效率，其中b是0或1，n是0或1。即：ɑ-1,3-岩藻糖基转移酶对包含
的结构的GDP-Fuc-F-(L)n-Y1或GDP-Fuc-F-(L)n-P的催化效率显著高于那些包含
的结构的分子的催化效率。例如，在将活性部分(例如，Y1或P)转移至包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal的抗体或Fc融合蛋白方面，来自幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶可以展示出对包含
结构的GDP-Fuc-F-(L)n-Y1或GDP-Fuc-F-(L)n-P的催化效率显著高于对包含
结构的分子的催化效率，其中b是0或1，n是0或1。例如，在将活性部分(例如Y1或P)转移至抗体-G2(F)或抗体-(Galβ1,4)GlcNAc方面，包如含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的α-1,3-岩藻糖基转移酶可以展示出对包含
结构的GDP-Fuc-F-(L)n-Y1或GDP-Fuc-F-(L)n-P的催化效率显著高于对包含
结构的分子的些催化效率。例如，在将生物素转移至曲妥珠单抗-G2F和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc方面，Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)展示出对GDP-FAmP4生物素
的催化效率显著高于对GDP-FAzP4生物素
的催化效率，如图16A所示。例如，在将MMAE转移至曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc方面，Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)展示出对GDP-FAmP4MMAE
的催化效率显著高于对GDP-FAzP4MMAE
的催化效率，如图16B所示。
在本申请中，在将Q-Fuc*’转移至抗体或Fc-融合蛋白方面，Hpα-1,3-岩藻糖基转移酶可具有比人α-1,3-岩藻糖基转移酶高得多的催化效率。例如，在将GDP-(F)m-(L)n-P或GDP-(F)m-(L)n-Y1转移至抗体或Fc-融合蛋白方面，包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的Hpα-1,3-岩藻糖基转移酶可以显示出比包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的人α-1,3-岩藻糖基转移酶高得多的效率。例如，在将GDP-(F)m-(L)n-P或GDP-(F)m-(L)n-Y1转移至抗体-G2(F)或抗体-(Galβ1,4)GlcNAc方面，Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)显示出比人FT6(SEQ ID NO:5)高得多的效率。例如，在将GDP-FAmP4生物素转移至曲妥珠单抗-G2F方面，Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)显示出比人FT6(SEQ ID NO:5)高得多的效率，如图18所示。3小时后，Hp-α(1,3)-FucT达到了10％的转化率，而人FT6达到了未检测到的转化率水平。16小时后，人FT6只达到了4％的转化率。相比之下，Hp-α(1,3)-FucT达到了69％的转化率。
在本申请中，通过使用Q-Fuc*’和α-1,3-岩藻糖基转移酶，包含直接与氨基酸残基(例如，Asn)接连的-GlcNAc-Gal的蛋白质被转化成包含
的蛋白质偶联物的效率比包含与糖(例如甘露糖)连接的-GlcNAc-Gal的蛋白质被转化成包含
的蛋白质偶联物的效率高。例如，α-1,3-岩藻糖基转移酶可以显示出将GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P转移至抗体-(Galβ1,4)GlcNAc的效率高于转移至抗体-G2(F)的效率。例如，Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)显示出将GDP-FAmP4生物素转移至曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc的效率高于转移至曲妥珠单抗-G2F的效率，如图16A所示。2小时后，曲妥珠单抗-GlcNAc-Gal达到了88％的转化率。相比之下，曲妥珠单抗-G2F即使在6小时后也只达到了27％的转化率。
在本申请中，通过使用Q-Fuc*’和α-1,3-岩藻糖基转移酶，包含-GlcNAc-Gal的蛋白质被转化成包含
的蛋白质偶联物的效率比具有
的蛋白质被转化成包含
的蛋白质偶联物的效率更高。在本申请中，通过使用Q-Fuc*’和α-1,3-岩藻糖基转移酶，包含与Asn直接连接的-GlcNAc-Gal的蛋白质被转化成包含
的蛋白质偶联物的效率可以比包含与Asn直接连接的
的蛋白质被转化为包含
的蛋白质偶联物的效率更高。例如，通过使用Q-Fuc*’和α-1,3-岩藻糖基转移酶，包含与Asn直接连接的-GlcNAc-Gal的抗体或Fc融合蛋白被转化成包含
的抗体偶联物或Fc融合偶联物的效率可以比包含与Asn直接连接的
的抗体或Fc融合蛋白被转化成包含
的抗体偶联物或Fc融合偶联物的效率更高。例如，Hpα-1,3-岩藻糖基转移酶可显示出将GDP-Fuc-(F)m-(L)n-Y1或GDP-Fuc-(F)m-(L)n-P转移至抗体-GlcNAc-Gal的效率高于转移至抗体-((Fuc)α1,6)GlcNAc-Gal的效率。例如，在Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO 4)和GDP-FAmSucMMAE存在的情况下，曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)GlcNAc-Gal达到>90％的转化率所花的时间比曲妥珠单抗-GlcNAc-Gal达到>90％的转化率所花的时间更长。
另一方面，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法。
在一些实施方案中，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法，所述蛋白质偶联物包含4个
或4个
或4个
其中，Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。例如，蛋白质是抗体，并且的GlcNAc与
的甘露糖连接。例如，蛋白质偶联物具有与相应抗体的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。例如，该组合物的平均MAR约为2.4-4。例如，该组合物的平均MAR约为2.8-4。例如，该组合物的平均MAR约为3.2-4。例如，该组合物的平均MAR约为3.6-4。例如，该组合物的平均MAR约为3.8-4。例如，该组合物的平均MAR约为4。
在一些实施方案中，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法，所述蛋白质偶联物包含2个
或2个
或2个
在一些实施方案中，本申请提供了用于制备包含蛋白质偶联物的组合物的方法，所述蛋白质偶联物包含2个
2个
或2个
其中(Fuc)是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖，Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。例如，蛋白质是抗体，并且GlcNAc直接与抗体的N297连接。例如，蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。例如，蛋白质偶联物用于治疗疾病。例如，蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。例如，该组合物的平均MAR约为0.5-2。例如，该组合物的平均MAR约为1-2。例如，该组合物的平均MAR约为1.5-2。例如，该组合物的平均MAR约为1.8-2。例如，该组合物的平均MAR约为2。
另一方面，本申请提供了蛋白质偶联物，其由本申请的方法中获得。
另一方面，本申请提供了组合物，其由本申请的方法获得。
另一方面，本申请提供了本申请的Q-Fuc*’在制备所述蛋白质偶联物中的用途。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请的蛋白质偶联物和任选的药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请的组合物和任选的药学上可接受的载体。
除了上述组合物和蛋白质偶联物之外，本发明还提供了许多可以利用本申请的化合物和蛋白质偶联物实施的方法。使用本申请的蛋白质偶联物的方法可以包括：杀伤肿瘤细胞或癌细胞或抑制其生长或复制、治疗癌症、治疗癌前疾病、杀伤表达自身免疫抗体的细胞或抑制其生长或复制、治疗自身免疫疾病、治疗传染病、防止肿瘤细胞或癌细胞增殖、预防癌症、防止表达自身免疫抗体的细胞增殖、预防自身免疫性疾病以及预防传染病。这些使用方法包括向有需要的动物诸如哺乳动物或人施用有效量的蛋白质偶联物。
药物组合物在制造和贮存条件下通常必须是无菌和稳定的。该药物组合物可被配制成适合施用的形式。该药物组合物可被配制成溶液、乳剂、冻干制剂、微乳剂、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”通常指药学上可接受的佐剂、赋形剂或稳定剂，其在所施用的剂量和浓度下对暴露于它们的细胞或受试者无毒。通常，药学上可接受的载体可以是水溶液。药学上可接受的载体的实例可包括缓冲剂、抗氧化剂、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白质、亲水聚合物、单糖、二糖和其它碳水化合物、螯合剂、糖醇、成盐抗衡离子诸如钠；非离子表面活性剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂和/或分散剂。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗疾病的方法，其包括施用本申请的蛋白质偶联物和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗疾病的方法，其包括施用本申请的组合物和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了蛋白质偶联物和/或药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药剂中的用途。
另一方面，本申请提供了组合物和/或药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药剂中的用途。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗疾病的蛋白质偶联物和/或药物组合物。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗疾病的组合物和/或药物组合物。
另一方面，本申请还提供如下实施方案：
1.一种蛋白质偶联物，其包含含有N-乙酰乳糖胺(LacNAc)的第一部分和含有岩藻糖或岩藻糖衍生物Fuc和活性部分的第二部分，其中所述Fuc通过共价键与所述LacNAc的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)连接。
2.实施方案1所述的蛋白质偶联物，其中所述第一部分包含N-糖基化链，并且所述LacNAc位于所述N-糖基化链上。
3.实施方案1-2中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述第一部分包含Fc片段，并且所述LacNAc位于所述Fc片段的N-糖基化链上。
4.实施方案3所述的蛋白质偶联物，其中所述LacNAc与所述N-糖基化链的甘露糖连接。
5.实施方案1所述的偶联物，其中所述LacNAc与所述第一部分的氨基酸直接连接。
6.实施方案1-5中任一项所述的偶联物，其中所述LacNAc是Gal-β(1,4)-GlcNAc，并且GlcNAc任选地被岩藻糖修饰。
7.实施方案1-6中任一项所述的偶联物，其中所述第一部分包含分离的蛋白质。
8.实施方案1-7中任一项所述的偶联物，其中所述第一部分包含抗体及其具有Fc的片段。
9.实施方案1-8中任一项所述的偶联物，其中所述活性部分包含0至500,000道尔顿的分子量。
10.实施方案1-9中任一项所述的偶联物，其中所述活性部分包含分子量为0-20,000道尔顿的小分子、肽、多肽、聚合物、蛋白质或寡核苷酸。
11.实施方案1-10中任一项所述的偶联物，其中所述活性部分包含第一反应基团(Y1)。
12.实施方案1-11中任一项所述的偶联物，其中所述活性部分包含所述第一反应性基团(Y1)与第二反应性基团(Y2)反应后的剩余基团。
13.实施方案12所述的偶联物，其中所述Y2与活性分子连接。
14.实施方案12-13所述的偶联物，其中所述Y1和/或Y2包含生物正交反应基团。
15.实施方案12-14所述的偶联物，其中所述Y1和/或Y2包含选自以下组的生物正交反应基团：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇和马来酰亚胺。
16.实施方案12-15所述的偶联物，其中所述Y1和/或Y2包含选自以下组的生物正交反应基团：
其中所述R1和R2独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，烷基任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选地被取代。
17.实施方案12-16中任一项所述的偶联物，其中所述Y1包含
并且所述Y2包含
18.实施方案12-17中任一项所述的偶联物，其中所述Y1包含
所述Y2包含
其中所述R1和R2独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，烷基任选被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选地被取代。
19.实施方案12-18中任一项所述的偶联物，其中所述Y1包含
其中所述R1和R2独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C1-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，烷基任选地被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选地被取代，并且所述Y2包含
20.实施方案12-19中任一项所述的偶联物，其中所述Y1包含
并且所述Y2包含
其中所述R1和R2独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，所述烷基任选被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选地被取代。
21.所述第二部分中实施方案1-20中任一项所述的偶联物，其中所述活性部分直接或间接与所述Fuc连接。
22.实施方案1-21中任一项所述的偶联物，其中所述活性部分通过连接单元W与所述Fuc连接。
23.实施方案22所述的偶联物，其中所述连接单元W包含间隔子FL。
24.实施方案22-23中任一项所述的偶联物，其中所述间隔子FL包含多肽、聚乙二醇、烷基和/或其衍生物。
25.实施方案22-24中任一项所述的偶联物，其中所述连接单元W包含
和/或
其中n是为0-200的整数。
26.一种制备实施方案1-25中任一项所述的偶联物的方法，其包括在能够将所述Fuc转移至所述LacNAc的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的合适条件下，使包含N-乙酰乳糖胺(LacNAc)的第一分子与包含岩藻糖或岩藻糖衍生物Fuc和活性部分的第二分子(Q-Fuc*’)接触。
27.根据实施方案26中任一项所述的方法，其中所述合适的条件是在能够将所述Fuc转移至所述LacNAc的所述GlcNAc的催化剂存在的情况下。
28.实施方案27所述的方法，其中所述催化剂是岩藻糖基转移酶。
29.实施方案28所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶是α-1,3-岩藻糖基转移酶。
30.实施方案28-29中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶源自细菌、线虫、吸虫或哺乳动物。
31.实施方案29-30中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶源自幽门螺杆菌。
32.实施方案28-31中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶包含如GenBank登录号AAD07710.1中所示的氨基酸序列
33.实施方案28-30中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶源自人。
34.实施方案33所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶包含如Uniprot登录号P51993中所示的氨基酸序列。
35.实施方案26-34中任一项所述的方法，其中所述第二分子(Q-Fuc*’)包含能够与所述Fuc连接的试剂。
36.实施方案35所述的方法，其包括将所述Fuc和所述活性部分从所述试剂转移至所述第一分子。
37.实施方案35-36中任一项所述的方法，其中所述试剂包含二磷酸核糖核苷酸。
38.实施方案35-37中任一项所述的方法，其中所述试剂选自以下组：二磷酸尿苷(UDP)、二磷酸鸟苷(GDP)和二磷酸胞苷(CDP)。
39.实施方案35-38中任一项所述的方法，其中所述试剂包含二磷酸鸟苷(GDP)。
40.实施方案26-39中任一项所述的方法，其包括使实施方案11-20中任一项所述的偶联物的所述Y1与实施方案12-20中任一项所述的偶联物的所述Y2反应。
41.实施方案1-25中任一项所述的偶联物在制备抗体-药物偶联物中的用途。
42.实施方案1-25中任一项所述的偶联物在制备药物中的用途。
43.实施方案42所述的用途，其中所述药剂用于治疗肿瘤。
44.一种药物组合物，其包含实施方案1-25中任一项所述的偶联物和药学上可接受的载体。
实施例
阐述以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是他们的发明的范围，也不旨在表示下面的实验是所进行的所有或唯一实验。已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一定的实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压强是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌内注射(地)；i.p.，腹膜内注射(地)；s.c.，皮下注射(地)；等等。
实施例1GDP-FAz的合成
根据报道的方法(Wu P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009,106,16096)合成了GDP-FAz，并通过Bio-Gel P-2凝胶柱(Biorad)对其进行了纯化。C16H24N8O15P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为629.0764，实测值为629.0785。
实施例2GDP-FAm的合成
向100mg(0.16mmol)GDP-FAz的8.75mL MeOH/ddH2O(1:1.5)的澄清溶液中加入5mgPd/C(10％)。通过抽真空和再填充将空气置换为H2，将H2压力保持在0.28MPa。反应搅拌4小时，并通过0.22μM过滤器进行过滤。旋转蒸发并冻干得到白色固体的产物(84.8mg，产率为88％)。C16H26N6O15P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为603.0859，实测值为603.0874。1HNMR(400MHz,D2O)δ8.10(s,1H),5.92(d,J＝6.1Hz,1H),4.97(t,J＝7.6,1H),4.76-4.73(m,1H),4.51(dd,J＝5.2,3.4Hz,1H),4.37-4.34(m,1H),4.23-4.21(m,2H),3.96(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H),3.92-3.91(m,1H),3.70(dd,J＝10.0,3.3Hz,1H),3.63(dd,J＝10.0,7.6Hz,1H),3.31(dd,J＝13.4,9.6Hz,1H),3.24(dd,J＝13.4,3.1Hz,1H)。
实施例3GDP-FAzP4生物素的合成
将400μL GDP-FAz(50mM于ddH2O中)、400μL CuSO4/BTTP(5mM/10mM于ddH2O中)、210μL炔丙基-PEG4-生物素(点击化学工具(Click Chemistry Tools))(100mM于MeOH中)、40μL抗坏血酸钠(250mM于ddH2O中)和2.95mL ddH2O混合在一起。允许反应在室温下搅拌5小时，并通过TLC监测。然后，加入2mM BCS(磺酸盐巴妥卡因(bathocuproine sulphonate))以淬灭反应，并通过减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物。(14.4mg，产率为66％)。C37H59N11O21P2S(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1086.3010，实测值为1086.3040。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.15(s,1H),8.11(s,1H),5.89(d,J＝6.0Hz,1H),4.94-4.90(m,1H),4.77-4.76(m,1H),4.73-4.68(m,1H),4.65(d,J＝3.1Hz,2H),4.62-4.59(m,1H),4.58-4.56(m,1H),4.53-4.51(m,1H),4.38(dd,J＝8.0,4.4Hz,1H),4.34-4.31(m,1H),4.25-4.16(m,2H),4.05-4.02(m,1H),3.82(s,1H),3.72-3.65(m,14H),3.61(t,J＝5.3Hz,2H),3.37(t,J＝5.2Hz,2H),3.30-3.25(m,1H),2.96(dd,J＝13.1,5.0Hz,1H),2.77-2.72(m,1H),2.24(t,J＝7.3Hz,2H),1.74-1.49(m,4H),1.40-1.32(m,2H)。
实施例4GDP-FAzP4Tz的合成
向将500μL GDP-FAz(50mM于ddH2O中)溶于ddH2O/MeOH(1.45mL/2.24mL)的溶液中加入500μL CuSO4/BTTP(5mM/10mM于ddH2O中)、260μL炔丙基-PEG4-Tz(点击化学工具(ClickChemistry Tools))(100mM于MeOH中)，并加入50μL抗坏血酸钠(250mM于ddH2O中)。允许反应在室温下搅拌5小时，并通过TLC监测。然后，加入2mM BCS来淬灭反应，并减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈粉红色固体的产物(12.5mg，产率为45％)。C40H57N13O21P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1116.3194，实测值为1116.3212。
实施例5GDP-FAzP4MMAE的合成
向将200μL GDP-FAz(50mM)溶于ddH2O/MeOH(580μL/790μL)的溶液中加入200μLCuSO4/BTTP(5mM/10mM)、210μL炔丙基-PEG4-vc-PAB-MMAE(联宁生物(Levena Biopharma))(50mM于MeOH中)，并加入20μL抗坏血酸盐(250mM于ddH2O中)。允许反应在室温下搅拌5小时，并通过TLC监测。然后，加入2mM BCS来淬灭反应，并减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(7.6mg,38％)。C86H136N18O32P2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI-)为996.4449，实测值为996.4463。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.19(s,1H),8.09(s,1H),7.49-7.47(m,2H),7.38-7.29(m,6H),7.21-7.12(m,1H),5.88(d,J＝5.8Hz,1H),5.25-5.09(m,1H),5.08-4.96(m,1H),4.91(s,1H),4.76-4.75(m,1H),4.70-4.66(m,2H),4.62(s,2H),4.59-4.54(m,1H),4.52-4.50(m,1H),4.47-4.45(m,2H),4.33-4.32(m,2H),4.20-4.15(m,5H),4.03-4.00(m,1H),3.80(s,1H),3.74-3.71(m,2H),3.68-3.58(m,16H),3.49-3.39(s,1H),3.35(s,1H),3.31-3.27(m,5H),3.18(s,1H),3.07-3.06(m,3H),2.92(d,J＝15.3Hz,3H),2.84-2.79(m,1H),2.62-2.37(m,4H),2.20-1.99(m,3H),1.85-1.77(m,5H),1.65-1.51(m,4H),1.37-1.22(m,4H),1.21-1.12(m,2H),1.08(d,J＝6.4Hz,2H),0.96-0.67(m,26H),0.52-0.51(m,1H)。
实施例6GDP-FAmP4生物素的合成
向将500μL GDP-FAm(100mM于ddH2O中)溶于1.5mL ddH2O溶液中加入500μLNaHCO3(200mM)，1.95mL THF和550μL NHS-PEG4-生物素(点击化学工具(Click ChemistryTools))(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(20.5mg,38％)。C37H61N9O22P2S(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1076.3054，实测值为1076.3068。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.12(s,1H),5.92(d,J＝6.1Hz,1H),4.93(t,J＝7.8Hz,1H),4.78-4.77(m,1H),4.59(dd,J＝7.9,4.6Hz,1H),4.53(dd,J＝5.2,3.4Hz,1H),4.39(dd,J＝7.9,4.4Hz,1H),4.35-4.34(m,1H),4.22(dd,J＝5.4,3.4Hz,2H),3.87(d,J＝3.1Hz,1H),3.76(t,J＝6.3Hz,2H),3.69-3.66(m,14H),3.63-3.60(m,3H),3.59-3.56(m,1H),3.38(t,J＝5.3Hz,2H),3.32-3.26(m,2H),2.97(dd,J＝13.1,5.0Hz,1H),2.77(d,J＝13.0Hz,1H),2.56(t,J＝6.2Hz,2H),2.26(t,J＝7.3Hz,2H),1.74-1.51(m,4H),1.42-1.34(m,2H)。
实施例7GDP-FAmP4Tz的合成
向将200μL GDP-FAm(100mM)溶于600uL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3(200mM)，780μL THF和220μL NHS-PEG4-Tz(点击化学工具(Click Chemistry Tools))(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈粉红色固体的产物(9.9mg，产率为48％)。C36H52N10O21P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1021.2711，实测值为1021.2725。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.17-8.13(m,2H),8.00(s,1H),7.06-7.02(m,2H),5.76(d,J＝5.6Hz,1H),4.91(t,J＝7.7Hz,1H),4.67(t,J＝5.4Hz,1H),4.49(dd,J＝5.1,3.7Hz,1H),4.30-4.28(m,1H),4.27-4.25(m,2H),4.21-4.19(m,2H),3.95-3.93(m,2H),3.84-3.83(m,1H),3.80-3.78(m,2H),3.74-3.71(m,2H),3.70-3.57(m,13H),3.51(dd,J＝14.1,4.2Hz,1H),3.24(dd,J＝14.0,8.6Hz,1H),3.00(s,3H),2.49(t,J＝6.3Hz,2H)。
实施例8GDP-FAmP8Tz的合成
向将200μL GDP-FAm(100mM)溶于600μL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3(200mM)，加入780μL THF和220μL NHS-PEG8-Tz(西安点化生物科技)(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈粉红色固体的产物(9.2mg，产率38％)。C44H68N10O25P2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI-)为598.1844，实测值为598.1880。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.28-8.24(m,2H),8.02(s,1H),7.16-7.12(m,2H),5.81(d,J＝6.0Hz,1H),4.92(t,J＝7.8Hz,1H),4.72(t,J＝5.6Hz,1H),4.50(dd,J＝5.2Hz,3.5,1H),4.32-4.29(m,3H),4.21-4.19(m,2H),3.97-3.95(m,2H),3.85(d,J＝3.0Hz,1H),3.81-3.78(m,2H),3.75-3.59(m,32H),3.27(dd,J＝14.1,8.7,1H),3.02(s,3H),2.53(t,J＝6.2Hz,2H)。
实施例9GDP-FAmP4BCN的合成
向将200μL GDP-FAm(100mM)溶于600μL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3(200mM)，加入560μL THF和440μL NHS-PEG4-BCN(西安点化生物科技)(50mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(7.4mg，产率为36％)。C38H59N7O22P2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI-)为512.6522，实测值为512.6532。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.17(s,1H),5.92(d,J＝5.9Hz,1H),4.93(t,J＝7.8Hz,1H),4.78-4.75(m,1H),4.52(dd,J＝5.1,3.5Hz,1H),4.36-4.32(m,1H),4.22(dd,J＝5.4,3.4Hz,2H),4.14(d,J＝8.2Hz,2H),3.86(d,J＝2.3Hz,1H),3.75(t,J＝6.3Hz,2H),3.69-3.64(m,14H),3.62-3.58(m,4H),3.31(t,J＝5.3Hz,2H),3.29-3.26(m,1H),2.55(t,J＝6.2Hz,2H),2.29-2.15(m,6H),1.54-1.51(m,2H),1.39-1.31(m,1H),0.92(t,J＝9.8Hz,2H)。
实施例10GDP-FAmP4TCO的合成
向将400μL GDP-FAm(100mM)溶于1.4mL ddH2O的溶液中加入400uL NaHCO3缓冲液(200mM)，1.36mL THF和440μL NHS-PEG4-TCO(点击化学工具)(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(8.2mg，产率为20％)。C36H59N7O22P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1002.3116，实测值为1002.3134。
实施例11GDP-FAmAz的合成
向将200μL GDP-FAm(100mM)溶于600μL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3(200mM)，780μL THF和220μL NHS-叠氮(西安点化生物科技)(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌过夜，并用通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(8.7mg，产率为63％)。C18H27N9O16P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为686.0978，实测值为686.1002。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.10(s,1H),5.92(d,J＝6.0Hz,1H),4.92(t,J＝7.9Hz,1H),4.78-4.76(m,1H),4.52(dd,J＝5.2,3.4Hz,1H),4.35-4.34(m,1H),4.23-4.21(m,2H),4.00(s,2H),3.87(d,J＝3.2Hz,1H),3.71(dd,J＝8.8,3.9Hz,1H),3.66(dd,J＝10.0,3.3Hz,1H),3.62-3.57(m,2H),3.32(dd,J＝14.0,8.6Hz,1H)。
实施例12GDP-FAmP2Az的合成
向将200μL GDP-FAm(100mM)溶于600μL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3缓冲液(200mM)，然后加入780μL THF和220μL NHS-PEG2-叠氮(西安点化生物科技)(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌过夜，并用通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的GDP-FAmP2Az(5.4mg，产率为34％)。C23H37N9O18P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为788.1659，实测值为788.1671。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.10(s,1H),5.91(d,J＝6.0Hz,1H),4.91(t,J＝7.3Hz,1H),4.77-4.68(m,1H),4.52(t,J＝3.8Hz,1H),4.33-4.32(m,1H),4.20-4.08(m,2H),3.85(d,J＝3.1Hz,1H),3.76-3.73(m,2H),3.72-3.62(m,8H),3.61-3.54(m,2H),3.45(t,J＝4.8Hz,2H),3.27(dd,J＝14.0,8.5Hz,1H),2.53(t,J＝6.0Hz,2H)。
实施例13GDP-FAmP4Az的合成
向将200μL GDP-FAm(100mM)溶于600μL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3缓冲液，然后加入780μL THF和220μL NHS-PEG4-叠氮(西安点化生物科技)(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌过夜，并用通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的GDP-FAmP4Az(9.0mg，产率为51％)。C27H45N9O20P2(M-H+)的计算HRMS(ESI-)为876.2183，实测值为876.2187。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.14(s,1H),5.90(d,J＝6.0Hz,1H),4.90(t,J＝7.8Hz,1H),4.75(t,J＝5.5Hz,1H),4.50(dd,J＝5.0,3.5Hz,1H),4.33-4.32(m,1H),4.21-4.19(m,2H),3.84(d,J＝3.2Hz,1H),3.73(t,J＝6.2,2H),3.70-3.61(m,16H),3.60-3.53(m,2H),3.47-3.45(m,2H),3.26(dd,J＝14.0,8.6Hz,1H),2.53(t,J＝6.2Hz,2H)。
实施例14GDP-FAmP4MCP的合成
向将220μL GDP-FAm(100mM)溶于690μL ddH2O的溶液中加入200μL NaHCO3(200mM),690μL THF和200μL NHS-PEG4-MCP(西安点化生物科技)(100mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌6小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的所需产物(7.8mg,40％)。C33H53N7O22P2(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为960.2646，实测值为960.2638。
实施例15GDP-FAmGGG的合成
根据报道的方法(Miravet J.F.，等人Eur.J.Org.Chem.2014,16,3372)合成了Cbz-GGG-OH。
Cbz-GGG-NHS。向将200mg(0.62mmol)Cbz-GGG-OH溶于1.5mL无水DMF中的溶液中加入82mg(0.71mmol)NHS和148mg(0.82mmol)EDC·HCl。将反应物在室温下搅拌3小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。将残余物溶解在80mL DCM中，分别用水、饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到无需进一步纯化就用于下一步骤的粗产物。
GDP-FAmGGG-Cbz。将上述获得的粗产物(Cbz-GGG-NHS)溶解在5.4mL H2O中，然后加入40.5mg(0.48mmol)NaHCO3和115.0mg(0.19mmol)GDP-FAm。将反应物在室温下搅拌过夜，并用通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末的GDP-FAmGGG-Cbz(135.6mg，两步的产率为24％)。
GDP-FAmGGG。向21mg(0.023mmol)GDP-FAmGGG-Cbz的澄清溶液中加入2mL H2O和15mg Pd/C(10％)。通过真空和再填充将空气气氛改变为H2。将H2压力保持在0.28MPa。将反应物在室温下搅拌1小时，并通过0.22μm过滤器进行过滤。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末的GDP-FAmGGG(15.2mg，产率为85％)。C22H35N9O18P2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI-)为386.5715，实测值为386.5717。
实施例16GDP-FAmP4MMAE的合成
向将200uL GDP-FAm(100mM)溶于600uL ddH2O的溶液中加入200uL NaHCO3(200mM)，然后加入560uL THF和440uL OSu-PEG4-vc-PAB-MMAE(联宁生物)(50mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的所需产物(13.2mg,33％)。C86H138N16O33P2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI-)为991.4471，实测值为991.4502。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.19(s,1H),7.48-7.42(m,2H),7.41-7.28(m,6H),7.22-7.16(m,1H),5.90(d,J＝6.0Hz,1H),5.28-5.14(m,1H),5.03(t,J＝11.0Hz,1H),4.90(t,J＝7.8Hz,1H),4.64-4.58(m,1H),4.51-4.49(m,1H),4.44-4.38(m,2H),4.34-4.28(m,2H),4.21-4.16(m,3H),4.11(t,J＝7.2Hz,2H),3.83(d,J＝3.2Hz,1H),3.75-3.70(m,4H),3.69-3.64(m,3H),3.63-3.56(m,14H),3.34(s,1H),3.30-3.25(m,6H),3.19-3.14(m,2H),3.11-3.06(m,4H),2.95-2.83(m,4H),2.62-2.44(m,6H),2.16-1.97(m,4H),1.92-1.71(m,6H),1.65-1.43(m,5H),1.35-1.21(m,4H),1.17-1.14(m,3H),1.06(d,J＝6.7Hz,2H),0.96(d,J＝6.4Hz,2H),0.93-0.89(m,8H),0.83-0.78(m,10H),0.71-0.66(m,2H),0.50-0.48(m,2H)。
实施例17GDP-FAmSucMMAE的合成
按照报道的方法(Tang,F.，等人Org.Biomol.Chem.2016,14,9501)合成了NH2-vc-PAB-MMAE。
Suc-vc-PAB-MMAE.向将NH2-vc-PAB-MMAE(833mg,0.74mmol)溶于DMF(15mL)和THF(15mL)的溶液中加入琥珀酸酐(120mg,1.12mmol)。将混合物在室温下搅拌5小时，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色泡沫状的Suc-vc-PAB-MMAE(683mg，产率为75.3％)。C62H98N10O15(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1221.7140，实测值为1221.7146。
OSu-Suc-vc-PAB-MMAE.向将Suc-vc-PAB-MMAE(683mg,0.559mmol)溶于DCM(10mL)和THF(10mL)的溶液中加入NHS(644mg,5.596mmol)和EDC·HCl(1284mg,6.698mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末的OSu-Suc-vc-PAB-MMAE(565mg，产率为76.6％)。C66H101N11O17(M+Na+)的计算的HRMS(ESI+)为1342.7269，实测值为1342.7283。
GDP-FAmSucMMAE.向将GDP-FAm(190mg,0.315mmol)溶于30mL ddH2O的溶液中加入400uL DIPEA，然后加入溶于12mL DMF中的OSu-Suc-vc-PAB-MMAE(346mg,0.262mmol)。将混合物在室温下搅拌5小时，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化该产物，得到呈白色粉末的GDP-FAmSucMMAE(104.3mg，产率为22.0％)。C78H122N16O29P2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI-)为903.3947，实测值为903.3959。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.16(s,1H),7.48-7.40(m,3H),7.37-7.28(m,5H),7.22-7.14(m,1H),5.9(d,J＝6.0Hz,1H),5.30-5.14(m,1H),5.06-5.00(m,1H),4.76-4.68(m,2H),4.63-4.59(m,1H),4.51-4.49(m,1H),4.46-4.30(m,4H),4.21-4.04(m,6H),3.76-3.63(m,2H),3.57-3.53(m,2H),3.45-3.14(m,14H),3.11-3.05(m,4H),2.94-2.90(m,3H),2.66-2.44(m,6H),2.16-2.01(m,3H),1.94-1.76(m,4H),1.68-1.47(m,4H),1.36-1.14(m,8H),1.06(d,J＝6.6Hz,2H),0.97-0.89(m,10H),0.85-0.77(m,10H),0.66(t,J＝7.8Hz,2H),0.48(d,J＝6.6Hz,1H)。
实施例18GDP-FAmAzP4MMAE的合成
向将200μL GDP-FAmAz(50mM)溶于ddH2O/MeOH(580μL/790μL)的溶液中加入200μLCuSO4/BTTP(5mM/10mM)、210μL炔丙基-PEG4-vc-PAB-MMAE(l联宁生物)(50mM于MeOH中)，并加入20μL抗坏血酸盐(250mM于ddH2O中)。允许将反应物在室温下搅拌5h，并通过TLC监测。然后，加入2mM BCS来淬灭反应，并减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(16.8mg,82％)。C88H139N19O33P2(M+2Na+)/2的计算的HRMS(ESI+)为1048.9521，实测值为1048.9533。
实施例19GDP-FAmP4AzP4MMAE的合成
向将200μL GDP-FAmP4Az(50mM)溶于ddH2O/MeOH(580μL/790μL)的溶液中加入200μL CuSO4/BTTP(5mM/10mM)、210μL炔丙基-PEG4-vc-PAB-MMAE(联宁生物)(50mM于MeOH中)，并加入20μL抗坏血酸盐(250mM于ddH2O中)。允许将反应物在室温下搅拌5h，并通过TLC监测。然后，加入2mM BCS来淬灭反应，并减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(17.0mg,76％)。C97H157N19O37P2(M+2Na+)/2的计算的HRMS(ESI+)为1144.0124，实测值为1144.0086。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.16(s,1H),8.04(s,1H),7.49-7.42(m,3H),7.39-7.30(m,5H),7.25-7.21(m,1H),5.91(d,J＝5.9Hz,1H),5.30-5.17(m,1H),5.05(t,J＝10.8Hz,1H),4.95-4.90(m,1H),4.76-4.70(m,1H),4.65(s,2H),4.59(t,J＝5.0Hz,2H),4.52-4.49(m,1H),4.46-4.39(m,2H),4.36-4.32(m,1H),4.26-4.18(m,3H),4.14(t,J＝6.7Hz,2H),3.93(t,J＝5.1Hz,2H),3.85(d,J＝3.0Hz,1H),3.76-3.55(m,35H),3.47-3.42(m,1H),3.37-3.36(m,1H),3.32-3.24(m,6H),3.21-3.17(m,1H),3.13-3.06(m,4H),2.97-2.90(m,3H),2.85-2.67(m,1H),2.66-2.38(m,6H),2.35-1.99(m,4H),1.93-1.76(m,5H),1.65-1.51(m,5H),1.31-1.20(m,4H),1.18-1.14(m,2H),1.08(d,J＝6.8Hz,2H),0.99(d,J＝6.4Hz,2H),0.94-0.90(m,8H),0.87-0.78(m,12H),0.73-0.67(m,2H),0.52-0.51(m,1H)。
实施例20GDP-FAmAzP4DXd的合成
根据报道的方法(Yamaguchi,T.等人，EP3677589A1)合成了GGFG-酸。
炔丙基-PEG4-向将GGFG-酸(98.4mg,0.23mmol)溶于DMF(5ml)的溶液加入DIPEA(0.2ml)和炔丙基-PEG4-OSu(99.6mg,0.28mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的所需产物(114.8mg,75.0％)。C30H43N5O12(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为664.2835，实测值为664.2808。
炔丙基-PEG4-GGFG-DXd。向将炔丙基-PEG4-GGFG-酸(66.6mg,0.1mmol)溶于DMF(5ml)的溶液中加入DIPEA(0.1ml)、伊西替康(43.5mg,0.1mmol)和PyBOP(104.9mg,0.2mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈浅黄色固体的所需产物(70.6mg,65.2％)。C54H63FN8O15(M+Na+)的计算的HRMS(ESI+)为1105.4289，实测值为1105.4255。
GDP-FAmAzP4DXd。向将200μL GDP-FAmAz(50mM)溶于ddH2O/MeOH(580μL/790μL)的溶液中加入200μL CuSO4/BTTP(5mM/10mM)、210μL炔丙基-PEG4-GGFG-DXd(50mM于MeOH中)，并加入20μL抗坏血酸盐(250mM于ddH2O中)。允许反应在室温下搅拌5小时，并通过TLC监测。然后，加入2mM BCS来淬灭反应，并减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的产物(12.1mg,68.5％)。HRMS(ESI-)calcd for C72H90FN17O31P2(M-2H+)/2883.7651,found 883.7651.1H NMR(400MHz,D2O)δ7.97(s,2H),7.21(s,1H),7.11-7.03(m,4H),6.86(d,J＝7.0Hz,2H),5.68(d,J＝5.7Hz,1H),5.59-5.55(m,1H),5.45-5.40(m,1H),5.29-5.25(m,1H),5.20(s,1H),4.95-4.91(m,2H),4.70-4.53(m,7H),4.46(t,J＝4.1Hz,1H),4.37-4.31(m,2H),4.26-4.17(m,4H),3.86-3.57(m,26H),3.34-3.28(m,1H),3.10-3.06(m,1H),2.97-2.88(m,1H),2.78-2.73(m,1H),2.56-2.50(m,3H),2.39-2.29(m,1H),2.09(s,3H),1.93-1.82(m,2H),0.94(t,J＝7.3,3H)。
实施例21GDP-FAmDM4
向200uL GDP-FAm(100mM)的溶液中加入600uL ddH2O、200uL NaHCO3(200mM)、560uL THF和440uL OSu-SPDB-DM4(联宁生物)(50mM于THF中)。将反应物在室温下搅拌4小时，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过制备型HPLC系统进一步纯化粗产物，得到呈白色固体的所需产物(9.2mg,62％)。C58H84ClN9O26P2S2(M-2H+)/2的计算的HRMS(ESI)为740.6994，实测值为：740.7004。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.20(s,1H),7.13(s,1H),6.62-6.54(m,3H),5.90(d,J＝5.6Hz,1H),5.65-5.60(m,1H),5.38-5.37(m,1H),4.93(t,J＝7.8Hz,1H),4.71(t,J＝5.4Hz,1H),4.60-4.57(m,1H),4.52-4.50(m,1H),4.31(s,1H),4.25-4.22(m,3H),3.94(s,3H),3.87-3.86(m,1H),3.70-3.48(m,7H),3.35(s,3H),3.30-3.26(m,1H),3.23-3.18(m,4H),3.08(d,J＝9.4Hz,1H),2.83(s,3H),2.69-2.62(m,1H),2.52-2.49(m,3H),2.39-2.37(m,1H),2.26-2.23(m,3H),1.88-1.79(m,2H),1.74-1.67(m,2H),1.59-1.51(m,4H),1.36-1.33(m,1H),1.26(d,J＝6.6Hz,3H),1.21-1.19(m,6H),1.11(s,3H),0.78(s,3H)。
实施例22TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的合成
向将NH2-vc-PAB-MMAE(30.0mg,0.027mmol)溶于DMF(1.5mL)的溶液中加入DIPEA(100μL)和NHS-PEG4-TCO(西安点化生物科技)(16.5mg,0.032mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末的TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(21.7mg，产率为53％)。C78H127N11O19(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1520.9237，实测值为1520.9277。
实施例23Az-PEG4-vc-PAB-MMAE的合成
向将NH2-vc-PAB-MMAE(30.0mg,0.027mmol)溶于DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(100μL)和NHS-PEG4-叠氮(西安点化生物科技)(12.4mg,0.032mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末形式的Az-PEG4-vc-PAB-MMAE(25.7mg，产率为67％)。C69H113N13O17(M+Na+)的计算的HRMS(ESI+)为1418.8270，实测值为1418.8262。
实施例24DBCO-PEG4-vc-PAB-seco-DUBA(24-12)的合成
按照上述路线合成了DBCO-PEG4-vc-PAB-seco-DUBA。
(2-((2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(24-3)。向将(2-氨基乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(24-1)(5.2g，30mmol)溶于THF(60mL)的溶液中加入5g TEA。然后将2-(2-溴乙氧基)乙醇(24-2)(1.7g，10mmol)逐步滴加到混合物中。将混合物在室温下搅拌5h，并通过TLC监测。减压除去溶剂，得到粗产物24-3。
(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(24-4)。在室温下向将所有粗产物24-3溶于THF(30mL)和NaOH水溶液(80mL,1N)的溶液中加入Fmoc-Cl(7.8g,30.2mmol)。将混合物在室温下搅拌1h，并通过TLC监测。然后减压除去溶剂。将残余物溶解在200ml乙酸乙酯中，分别用饱和NaHCO3溶液和水洗涤，然后用Na2SO4干燥。通过柱色谱进一步纯化粗产物，得到呈浅黄色液体的24-4(3.5g，两步的产率72％)。
(2-(2-羟基乙氧基)乙基)(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(24-5)。向将24-4(3.4g,7.0mmol)溶于DCM(15mL)的溶液中加入20ml TFA。将混合物在室温下搅拌4h，并通过TLC监测。减压除去溶剂。通过柱色谱进一步纯化粗产物，得到呈无色液体的24-5(0.88g，产率为33％)。C22H28N2O4(M+H+)的计算的HRMS(ESI+)为385.2122，实测值为385.2109。
(2-((2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(24-8)。向将24-6Boc-VC-PAB-PNP(上海陶素生化科技(Tsbiochem))(1.5g，2.3mmol)溶于DMF(5mL)的溶液中加入DIPEA(1.3mL)和24-5(880mg，2.3mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。然后向混合物中加入3ml哌啶，再搅拌4h。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色固体的24-8(736mg，产率为48％)。C31H53N7O9(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为666.3832，实测值为666.3837。
(2-(((((S)-1-(氯甲基)-3-(6-(4-(甲氧基甲氧基)苯甲酰胺基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羰基)-9-甲基-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氧基)羰基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(24-10)根据报道的方法(Beusker P.H.等人，Mol.Pharmaceutics 2015,12,1813)合成了PNP-seco-DUBA(24-9)。向将24-9(125mg,0.17mmol)溶于DMF(5mL)的溶液中加入了130μL TEA和136mg 24-8(0.20mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色固体的24-10(71mg，产率为33％)。C63H78ClN11O15(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1262.5295，实测值为1262.5287。
(2-(((((S)-1-(氯甲基)-3-(6-(4-羟基苯酰胺基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羰基)-9-甲基-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氧基)羰基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)(甲基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(24-11)。向将24-10(71mg,0.056mmol)溶于DCM(2mL)的溶液中加入3ml TFA。将混合物在室温下搅拌3h，并通过TLC监测。减压除去溶剂，得到粗产物24-11(58mg)，而无需进一步纯化。
DBCO-PEG4-vc-PAB-seco-DUBA(24-12).向将粗产物24-11(25mg)溶于DMF(1.5mL)的溶液中加入100μL TEA和20mg NHS-PEG4-DBCO酯(‘西安点化生物科技)(0.03mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物。浓缩并冻干，得到呈白色粉末的24-12(15.2mg)。C86H100ClN13O19(M-H+)的计算的HRMS(ESI-)为1653.6908，实测值为1653.6948。
实施例25GDP-FAmSucMMAE(无可切割的连接子)的合成。
根据上述路线表合成了GDP-FAmSucMMAE(无可切割的连接子)。
酸-Suc-MMAE.向将MMAE(59mg,0.082mmol)溶于DMF(4mL)的溶液中加入琥珀酸酐(24.7mg,0.25mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末形式的酸-Suc-MMAE(52mg，产率为77.4％)。
OSu-Suc-MMAE.向将酸-Suc-MMAE(80.5mg,0.098mmol)溶于DCM(4mL)的溶液中加入NHS(45.3mg,0.394mmol)和EDC·HCl(113.2mg,0.59mmol)。将混合物在室温下搅拌3h，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末的OsU-Suc-MMAE(68mg，产率为75.6％)。
GDP-FAmSucMMAE(无可切割的连接子)。向将GDP-FAm(30mg,0.05mmol)溶于3mLddH2O的溶液中加入26uL DIPEA，然后加入将OSu-Suc-MMAE(90.9mg,0.099mmol)溶于3mLDMF的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，并通过TLC监测。通过制备型HPLC系统进一步纯化产物，得到呈白色粉末的GDP-FAmSucMMAE(无可切割的连接子)(10mg，产率为14.3％)。1HNMR(400MHz,D2O)δ8.17(s,1H),7.31-7.22(m,5H),5.85(d,J＝6.0Hz,1H),4.84(t,J＝8.0Hz,1H),4.65-4.55(m,1H),4.53-4.35(m,4H),4.30-4.20(m,2H),4.15-3.98(m,4H),3.78-3.77(m,1H),3.63-3.58(m,2H),3.56-3.55(m,1H),3.53-3.51(m,1H),3.35-2.30(m,1H),3.27-3.12(m,10H),3.06-3.04(m,2H),2.98-2.96(m,2H),2.86-2.79(m,1H),2.72-2.57(m,3H),2.50-2.35(m,4H),2.26-1.92(m,4H),1.75-1.51(m,4H),1.46-1.48(m,1H),1.22-1.21(m,2H),1.16-1.14(m,1H),1.07-1.06(m,1H),1.00-0.98(m,2H),0.93-0.70(m,20H)。
实施例26使用人β(1,4)-GalT1(Y285L)制备抗体-G2F
将抗体(10mg/mL)与UDP-半乳糖(5mM)和人β(1,4)-GalT1(Y285L)(SEQ ID NO:1)(0.5mg/mL)在含有10mM MnCl2的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中于30℃孵育12至36小时。用蛋白A树脂(金斯瑞)纯化反应混合物，得到抗体-G2F。质谱分析显示抗体分别完全转化为曲妥珠单抗-G2F(实测值为148711Da)、贝伐单抗-G2F(实测值为149853Da)利妥昔单抗-G2F(实测值为147741Da)。
实施例27使用牛β(1,4)-GalT1(Y289L)产生曲妥珠单抗-G2F
将曲妥珠单抗(10mg/mL)与UDP-半乳糖(5mM)和牛β(1,4)-GalT1(Y289L)(SEQ IDNO:2)(0.5mg/mL)在含有10mM MnCl2的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中于30℃孵育过夜。用蛋白A树脂纯化经修饰的曲妥珠单抗。质谱分析显示生成了一个主峰(实测值为148713Da)。
实施例28曲妥珠单抗-G2F-Az偶联物的产生
将曲妥珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAz或GDP-FAmAz或GDP-FAmP4Az(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中于37℃孵育过夜至48h。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-Az偶联物。质谱分析显示分别完全转化为曲妥珠单抗-G2F-FAz(实测值为149459Da,MAR 4)(图6B)、曲妥珠单抗-G2F-FAmAz(实测值为149688,MAR 4)(图8A)和曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az(实测值为150449,MAR 4)(图8B)。
实施例29曲妥珠单抗-FAz的产生
将曲妥珠单抗(5mg/mL)与GDP-FAz(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)(0.5mg/mL)于含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃下孵育过夜。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-FAz偶联物(MAR 0、MAR 1、MAR 2和MAR 3的混合物)(图6A)。偶联物的组合物的平均MAR低于1.2。
实施例30使用人FT6产生曲妥珠单抗-G2F-FAz
将曲妥珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAz(5mM)和人FT6(SEQ ID NO:5)(0.8mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育48小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAz偶联物。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为149461Da，MAR 4)。
实施例31曲妥珠单抗-G2F-FAz的“一锅法”合成
将曲妥珠单抗(5mg/mL)与UDP-半乳糖(5mM)、GDP-FAz(5mM)、人β(1,4)-GalT1(Y285L)(0.5mg/mL)、Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2和10mM MnCl2的25mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于30℃孵育过夜。用蛋白A树脂纯化经修饰的曲妥珠单抗。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为149461Da，MAR 4)。
实施例32曲妥珠单抗-G2F-FAzP4生物素的产生
将曲妥珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAzP4生物素(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育72小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAzP4生物素。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为151289Da，MAR 4)(图8D)，其中4个FAzP4生物素基团被添加到一个曲妥珠单抗-G2F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0。
实施例33曲妥珠单抗-G2F-FAmP4生物素的产生
将曲妥珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAmP4生物素(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育48小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAmP4生物素。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为151250Da)(图8E)，其中四个FAmP4生物素基团被添加到一个曲妥珠单抗-G2F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例34曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz的产生
将曲妥珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAmP4Tz(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育48小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为151037Da)(图8C)，其中四个FAmP4Tz基团被添加一个曲妥珠单抗-G22F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例35贝伐单抗-G2F-FAz的产生
将贝伐单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAz(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育过夜。用蛋白A纯化反应混合物，得到贝伐单抗-G2F-FAz。质谱分析显示完全转化为贝伐单抗-G2F-FAz(实测值为150610Da(图8G))，其中四个FAz基团添加到一个贝伐单抗-G2F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例36贝伐单抗-G2F-G2F-FAzP4生物素的产生
将贝伐珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAzP4生物素(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育72小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到贝伐单抗-G2F-FAzP4生物素。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为152436Da)(图8H)，其中四个FAzP4生物素基团添加到一个贝伐单抗-G2F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例37贝伐单抗-G2F-FAmP4生物素的产生
将贝伐珠单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAmP4生物素(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育48小时。用蛋白A纯化反应混合物，得到贝伐单抗-G2F-FAmP4生物素。质谱分析显示生成一个峰产物(实测值为152396Da)(图8I)，其中四个FAmP4生物素基团被添加到一个贝伐单抗-G2F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例38贝伐单抗-G2F-FAm的产生
将贝伐单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAm(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育过夜。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到贝伐单抗-G2F-FAm。质谱分析显示完全转化为贝伐单抗-G2F-FAm(实测值为150499Da)(图8J)，其中四个FAm基团被添加到一个贝伐单抗-G2F分子中。
实施例39贝伐单抗-G2F-FAmP4Tz的产生
将贝伐单抗-G2F经受实施例34中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为152173Da)(图8K)，其中四个FAmP4Tz基团被添加到一个贝伐单抗-G2F分子上。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例40贝伐单抗-G2F-FAmP4TCO的产生
将贝伐单抗-G2F(5mg/mL)与GDP-FAmP4TCO(1mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育48小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到贝伐单抗-G2F-FAmP4TCO。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为152099Da)(图8L)，其中四个FAmP4TCO基团被添加到一个贝伐单抗-G2F分子中。由于在MS谱分析过程中TCO键联的断裂，又出现了一个小峰。对于下列含有TCO键联的抗体偶联物，也出现了类似的碎片。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例41利妥昔单抗-G2F-FAz的产生
对利妥昔单抗-G2F进行了实施例28中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为148482Da)(图8F)，其中四个FAz基团被添加到一个利妥昔单抗-G2F分子中。偶联物的组合物的平均MAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的MAR为4。
实施例42曲妥珠单抗-G2F-AzDBCO-GGG偶联物的产生
叠氮基修饰的曲妥珠单抗-G2F(曲妥珠单抗-G2F-FAz和曲妥珠单抗-G2F-FAmAz，1mg/mL)与100μM DBCO-PEG5-GGG在PBS缓冲液中室温下孵育过夜。然后用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-GGG和曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-GGG偶联物。(图10)
实施例43曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE的产生
将曲妥珠单抗-G2F(3mg/mL)与GDP-FAzP4MMAE(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育72小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE。质谱分析显示一个主峰(实测值为154922Da)的形成，其中四个MMAE被添加到一个曲妥珠单抗-G2F分子中(图11)。在MS质谱分析中，PABA连接子会断裂，从而产生一个小峰(实测值为154161Da)，在下列含有PABA连接子的抗体-药物偶联物中出现了相似的碎片。偶联物的组合物的平均DAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的DAR为4。
实施例44曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE的产生
将曲妥珠单抗-G2F-FAz(1.5mg/mL)与DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(150μM)(联宁生物(Levena Biopharma)fffffffffff)在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温孵育48小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE。质谱分析显示为一个主峰(实测值为156093Da)，其中四个MMAE被添加到一个曲妥珠单抗-G2F-FAz分子中(图11)。偶联物的组合物的平均DAR为3.6-4.0，其中超过90％的偶联物的DAR为4。
实施例45曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE和曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE分别对SK-Br-3(Her2+)和MDA-MB-231(Her2-)细胞的体外效果
将SK-Br-3(Her2+)和MDA-MB-231(Her2-)细胞分别在McCoy’s 5A培养基(Gibco)和含有10％ FBS(Invitrogen)的DMEM(Gibco)中培养。将细胞以每孔5000个细胞铺在96孔板中，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时。移去培养基后，将抗体样品(曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE和曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE)加入培养基至一系列终浓度(100nM、10nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.001nM和0nM)并分别加入到平板中。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育72小时，并使用
Luminescent细胞活力检测试剂盒(Promega)以检测细胞活力。曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE和曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE都显示出对Her2阳性细胞系SK-Br-3的高杀伤细胞效力，但未显示出对Her2阴性细胞系MDA-MB-231的高杀伤细胞效力(图12)。
实施例46曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc的产生
将曲妥珠单抗(10mg/mL)与EndoS(SEQ ID NO:6)(0.05mg/mL)在50mM Tris-HClpH 8.0中于37℃孵育1小时，然后用蛋白A进行纯化。质谱分析显示了曲妥珠单抗-(Fuc)α1,6)GlcNAc(实测值为145867Da)的一个主峰的形成。将曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)GlcNAc(10mg/mL)进一步与UDP-半乳糖(5mM)和人β(1,4)-GalT1(Y285L)(0.5mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl pH 8.0中于30℃孵育48小时。反应混合物用蛋白A树脂纯化，得到曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为146192Da)，其中两个半乳糖被添加到一个曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)GlcNAc分子中。
实施例47曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAz的产生
对曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc进行实施例28中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为146568Da，MAR 2)(图14A)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例48曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz的产生
对曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc进行实施例28中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为146683Da，MAR 2)(图14B)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例49曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCN的产生
将曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc(5mg/mL)与GDP-FAmP4BCN(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/ml)在20mM MgCl2和50mM Tris-HCl pH 7.5中于37℃孵育48小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCN。质谱分析显示生成一个主峰(147366Da,MAR 2)(图14C)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例50曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4TCO的产生
对曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc(5mg/mL)进行实施例40中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为147319Da，MAR 2)(图14D)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例51曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz的产生
对曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc进行实施例34中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为147356Da，MAR 2)(图14E)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例52曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4生物素的产生
对曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc进行实施例33中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为147465Da，MAR 2)(图14F)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例53抗体-(Galβ1,4)GlcNAc的产生
将抗体((10mg/mL)与EndoS(0.05mg/mL)和Alfc(1.5mg/mL)(SEQ ID NO:7)在50mMTris-HCl pH 8.0中于37℃孵育24小时，然后用蛋白A纯化。质谱分析显示分别形成曲妥珠单抗-GlcNAc(实测值为145583Da)、利妥昔单抗-GlcNAc(实测值为144599Da)和hRS7-GlcNAc(实测值为145426Da)。将抗体-GlcNAc(10mg/mL)进一步与UDP-半乳糖(5mM)和人β(1,4)-GalT1(Y285L)(0.5mg/mL)在10mM MnCl2和25mM Tris-HCl pH 8.0中于30℃孵育24小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示分别完全转化为曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc(实测值为145907Da)、利妥昔单抗-(Galβ1,4)GlcNAc(实测值为144926Da)和hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc(实测值为145750Da)。
实施例54抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-Az的产生
对抗体-(Galβ1,4)GlcNAc进行实施例28中所述的方法。质谱分析显示分别完全转化为曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz(实测值为146289Da,MAR 2)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为46387Da,MAR 2)(Fig.15A)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az(实测值为146777,MAR 2)、利妥昔单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz(实测值为145300Da,MAR 2)、利妥昔单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为145414Da,MAR 2)(Fig.15E)和hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为146239Da,MAR 2)。偶联物的所有组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例55曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCN的产生
对曲妥珠单抗(Galβ1,4)GlcNAc(5mg/mL)进行实施例49中描述的方法。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为147074Da，MAR 2)(图15B)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例56抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz的产生
对抗体-(Galβ1,4)GlcNAc(5mg/mL)进行实施例34所述的方法。质谱分析显示分别为曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(实测值为147063Da,MAR 2)(图15C)、利妥昔单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(实测值为146082Da,MAR 2)(图15F)的一个主峰的形成。
实施例57曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmGGG的产生
曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc(5mg/mL)与GDP-FAmGGG(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/ml)在20mM MgCl2和50mM Tris-HCl pH 7.5中于37℃孵育24小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmGGG。质谱分析显示生成一个主峰(实测值为146564Da，MAR 2)(图15D)。偶联物的组合物的平均MAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR为2。
实施例58Hp-α(1,3)-FucT对GDP-FAzX衍生物和GDP-FAmX衍生物的催化效率的比较
将曲妥珠单抗-G2F(2mg/mL)与GDP-FAzP4生物素(1mM)或GDP-FAmP4生物素(1mM)和Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)(0.5mg/mL)在含有5mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中于30℃孵育6小时。将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc(2mg/mL与GDP-FAzP4生物素(1mM)或GDP-FAmP4生物素(1mM)和Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)(0.5mg/mL)在含有5mMMgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于30℃孵育2小时。将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc(2mg/mL)与GDP-FAzP4MMAE(1mM)或GDP-FAmP4生物素(1mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有5mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于30℃孵育2小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，然后分别通过LC-MS进行分析。对于曲妥珠单抗-G2F，转化率％＝平均MAR/4*100％。对于曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc，转化率％＝平均MAR/2*100％。结果表明，在将活性分子转移到抗体-G2F和抗体-(Galβ1,4)GlcNAc中时，Hp-α(1,3)-FucT显示出对GDP-FAmX衍生物的催化效率显著高于对GDP-FAzX衍生物的催化效率(图16)。
实施例59Hp-α(1,3)-FucT和人FT6在曲妥珠单抗-G2F上对GDP-FAmP4生物素的催化效率的比较
将曲妥珠单抗-G2F(2mg/mL)与GDP-AmP4生物素(1mM)和Hp-α(1,3)-FucT(SEQIDNO:4)(0.5mg/mL)或人FT6(SEQ ID NO:5)(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的40mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于30℃孵育6小时和16小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物，然后分别通过LC-MS进行分析。对于曲妥珠单抗-G2F，转化率％＝平均MAR/4*100％。结果显示，与人FT6相比，Hp-α(1，3)-FucT在将FAmP4生物素转移至抗体-G2F方面显示出显著更高的对GDP-FAmP4生物素的催化效率(图18)。3小时后，Hp-α(1,3)-FucT达到了10％的转化率，而人FT6的转化率未达到检测限水平。16小时后，Hp-α(1,3)-FucT达到69％的转化率，而人FT6仅达到4％的转化率。
实施例60抗体G2F-FAmAzDBCO-MMAE的产生
将抗体-G2F-FAmAz(1.5mg/mL)与DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(100μM)(LevenaBiopharma)在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温孵育16小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示分别为曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为156322Da,DAR4)(图17A)和利妥昔单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为155341Da,DAR 4)(图17C)的一个主峰的形成。偶联物的所有组合物的平均DAR为3.6-4，其中超过90％的偶联物的DAR为4。
实施例61利妥昔单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE的产生
对利妥昔单抗-G2F-FAz(1.5mg/mL)进行实施例60中所述的方法。质谱分析显示利妥昔单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE(实测值为155113Da,DAR 4)的一个主峰的形成。偶联物的组合物的平均DAR为3.6-4，其中超过90％的偶联物的DAR为4。
实施例62曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAF的产生
将G2F-FAmAz(1.5mg/mL)与DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAF(100μM)(Levena Biopharma)在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温孵育16小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAF(实测值为156378Da,DAR 4)的一个主峰的形成(图17B)。偶联物的组合物的平均DAR为3.6-4，其中超过90％的偶联物的DAR为4。
实施例63抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE的产生
对抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(1.5mg/mL)进行实施例60中所述的方法。质谱分析显示分别为(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为149708Da,DAR 2)(图17D)和hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为149555Da,DAR 2)(图17J)的一个主峰的形成。偶联物的所有组合物的平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例64曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAF的产生
对曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(1.5mg/mL)进行实施例62中描述的方法。质谱分析显示曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAF(实测值为149736Da,DAR2)(图17E)的一个主峰的形成，其中两个MMAF被添加到一个曲妥珠单抗分子中。偶联物的组合物的平均DAR为1.8-2，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例65曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA的产生
将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az(1.5mg/mL)与DBCO-PEG4-vc-PAB-seco-DUBA(100μM)在含有45％丙二醇的PBS(pH 7.4)中于室温孵育16小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA(实测值为150081Da，DAR2)的一个主峰的形成，其中两个seco-DUBA被添加到一个曲妥珠单抗分子中(图17F)。偶联物的组合物的平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例66曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzBCN-MMAE的产生
将曲妥珠单抗-((Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(1.5mg/mL)与BCN-PEG4-vc-PAB-MMAE(100μM)(BroadPharm)在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温孵育16小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzBCN-MMAE(实测值为149486Da,DAR2)的一个主要峰的形成，其中两个MMAE被添加到一个曲妥珠单抗分子中(图17G)。偶联物的组合物的平均DAR为1.8-2，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例67曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCNAz-MMAE的产生
将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCN(1.5mg/mL)与Az-PEG4-vc-PAB-MMAE(100μM)在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温孵育16小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCNAz-MMAE(实测值为149863Da,DAR2)的一个主要峰的形成，其中两个MMAE被添加到一个曲妥珠单抗分子中(图17H)。偶联物的组合物的平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例68曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4TzTCO-MMAE的产生
将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(1.5mg/mL)与TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(100μM)在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温孵育2小时。用蛋白A树脂纯化反应混合物。质谱分析显示曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4TzTCO-MMAE(实测值为150051Da,DAR2)的一个主峰的形成，其中两个MMAE被添加到一个曲妥珠单抗分子中。由于质谱分析过程中TCO键联的断裂，又出现了一个小峰(实测值为148637Da)(图17I)。偶联物的组合物的平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例69“一步”法产生曲妥珠单抗-药物偶联物
将曲妥珠单抗-G2F(3mg/mL)或曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc(3mg/mL)与从实施例16-21和25获得的GDP-Fuc衍生物(GDP-FAmP4MMAE、GDP-FAmSucMMAE、GDP-FAmAzP4MMAE、GDP-FAmP4AzP4MMAE、GDP-FAmAzP4DXd、GDP-FAmDM4或GDP-FAmSucMMAE(不可裂解的连接子))(5mM)和Hp1,3-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育24至48h。利用蛋白A树脂纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-药物偶联物。质谱分析显示分别生成了一个主峰曲妥珠单抗-G2F-FAmP4MMAE(实测值为154879Da,DAR4)(图17K)、曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE(实测值为154177Da,DAR4)(图17L)、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4MMAE(实测值为155147Da,DAR4)(图17M)、曲妥珠单抗-G2F-FAmP4AzP4MMAE(实测值为155908Da,DAR4)(图17N)、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4DXd(实测值为153967Da,DAR4)(图17Q)、曲妥珠单抗-G2F-FAmDM4(实测值为152877Da,DAR4)(图17R)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4MMAE(实测值为148989Da,DAR2)(图17O)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(实测值为148634Da,DAR2)(图17P)和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP4DXd(实测值为148561Da,DAR2)(图17S)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(不可裂解的连接子)(实测值为147873Da,DAR2)。曲妥珠单抗-G2F-Fuc*偶联物的所有组合物的平均DAR为3.6-4，其中超过90％的偶联物的DAR为4。曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物的所有组合物的平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例70“一步”法产生hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-药物偶联物的
对hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc(3mg/mL)进行实施例69中所述的处理。质谱分析显示分别由hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc形成一个主峰至hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(实测值为148484Da,DAR2)(图17T)，以及hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP4MMAE(实测值为148969Da,DAR2)(图17U)。偶联物的组合物平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例71曲妥珠单抗-(Fucα1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE的产生
将曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc(5mg/mL)与GDP-FAmSucMMAE(5mM)和Hp-α(1,3)-FucT(0.5mg/mL)在含有20mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中于37℃孵育72小时。用蛋白A纯化反应混合物，得到曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE。质谱分析显示形成一个主峰(实测值为148940Da，DAR2)，其中两个MMAE被添加到一个曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc分子中。偶联物的组合物平均DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的DAR为2。
实施例72抗体-FAz、抗体-FAmAz和抗体-FAmP4Az对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性和抗体-FAmP4Tz对TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性
将曲妥珠单抗-G2F-FAz、曲妥珠单抗-G2F-FAmAz、曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az(2mg/mL)与DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(133μM)一起孵育，将曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz(2mg/mL)与TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(133μM)一起孵育，在含有10％ DMSO的PBS(pH 7.4)中于室温分别孵育2、4和16小时。将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az与DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(80μM)一起孵育，将曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(2mg/mL)与TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE(80μM)一起孵育，在含有10％ DMSO的PBS(pH 7)中于室温孵育1、2和4小时。对于曲妥珠单抗-G2F-药物偶联物，转化率％＝平均DAR/4*100％。对于曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-药物偶联物，转化率％＝平均DAR/2*100％。结果表明，曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az和曲妥珠单抗-G2F-FAmAz显示对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性显著高于曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az对DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE的反应性。同时，TCO-PEG4-vc-PAB-MMAE对曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz的反应速率远快于DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE对所有三种类型的曲妥珠单抗-G2F-Az偶联物的反应速率(图19A)。在曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAz、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Az和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz中观察到类似的结果(图19B)。
实施例73曲妥珠单抗-G2F-Fuc*的“一锅法”合成
将曲妥珠单抗(5mg/mL)与UDP-半乳糖(5mM)、与GDP-Fuc衍生物(5mM)(GDP-FAmAz、GDP-FAmP4Tz、GDP-FAmSucMMAE或GDP-FAmAzDXd)、人β(1,4)-GalT1(Y285L)(0.5mg/mL)、Hp-α(1,3)-FucT(0.7mg/mL)在含有20mM MgCl2和10mM MnCl2的(25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中于30℃孵育过夜至72小时。用蛋白A树脂纯化经修饰的曲妥珠单抗。质谱分析显示分别为曲妥珠单抗-G2F-FAmAz(实测值为151041Da,MAR 4)、曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz(实测值为154177Da,MAR 4)、曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE(实测值为154033Da,DAR 4)、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDXd(实测值为154033Da,DAR 4)的一个主峰的形成。曲妥珠单抗-G2F-Fuc*偶联物的所有组合物的平均MAR或DAR为3.6-4，其中超过90％的偶联物的MAR或DAR为4。
实施例74曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*的“一锅法”合成
将曲妥珠单抗(10mg/mL)与EndoS(0.05mg/mL)和Alfc(1.5mg/mL)在50mM Tris-HCl pH7.0中于37℃孵育24小时，然后与UDP-半乳糖(5mM)、GDP-Fuc衍生物(5mM)(GDP-FAmAz,GDP-FAmP4Tz、GDP-FAmSucMMAE或GDP-FAmAzDXd)、人β(1,4)-GalT1(Y285L)(0.5mg/mL)、Hp-α(1,3)-FucT(0.7mg/mL)在含有20mM MgCl2和10mM MnCl2的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中于30℃孵育过夜至48小时。用蛋白A树脂纯化经修饰的曲妥珠单抗。质谱分析显示分别为曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为146388Da,MAR 2)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(实测值为147060Da,MAR 2)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(实测值为148634Da,DAR 2)、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDXd(实测值为148561Da,DAR 2)的一个主峰的形成。曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物的所有组合物的平均MAR或DAR为1.8-2.0，其中超过90％的偶联物的MAR或DAR为2。
实施例75完整蛋白质质量分析
对于LC-MS分析，在配备有电喷雾电离(ESI)源结合Waters Acuqity UPLC I级plus的Xevo G2-XS QTOF MS系统(Waters Corporation)上进行分析纯化的蛋白质。分离和脱盐在waters ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱(
1.7μm,2.1mm x 100mm)上进行。流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈。使用0.2ml/min的恒定流速。使用Waters Unify软件分析数据。使用Unify软件(版本1.9.4，Waters Corporation)进行质谱去卷积。一些结果如图6、图8、图10、图11、图14、图15和图17所示。
图6显示了A)曲妥珠单抗(148062Da G0F，148224Da G0F-G1F,148384Da G1F-G1F或G0F-G2F和148546Da G1F-G2F)向曲妥珠单抗-FAz(148065Da MAR 0,148414Da MAR 1,148763Da MAR 2和149110Da MAR 3)转化的MS分析。B)曲妥珠单抗-G2F(148711Da)向曲妥珠单抗-G2F-FAz(149459Da MAR 4)的转化。MAR：MOI与抗体的比率。
图8显示了通过用Hp-α(1,3)-FucT和GDP-Fuc衍生物处理G2F-抗体产生的抗体-G2F-Fuc*偶联物的MS分析。A)曲妥珠单抗-G2F-FAmAz(实测值为149688Da，MAR 4)。B)曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Az(实测值为150449Da,MAR 4)。C)曲妥珠单抗-G2F-FAmP4Tz(实测值为151037Da,MAR 4)。D)曲妥珠单抗-G2F-FAzP4生物素(实测值为151289Da,MAR 4)。E)曲妥珠单抗-G2F-FAmP4生物素(实测值为151250Da,MAR 4)。F)利妥昔单抗-G2F-FAz(实测值为148482Da,MAR 4)。G)贝伐单抗-G2F-FAz(实测值为150610,MAR 4).H)贝伐单抗-G2F-FAzP4生物素(实测值为152436Da,MAR 4)。I)贝伐单抗-G2F-FAmP4生物素(实测值为152396,MAR4)。J)贝伐单抗-G2F-FAm(实测值为150499Da,MAR 4)。K)贝伐单抗-G2F-FAmP4Tz(实测值为152173,MAR 4)。L)贝伐单抗G2F-FAmP4TCO(实测值为152099,MAR 4)。MAR：MOI与抗体的比率。
图10曲妥珠单抗-G2F-GGG偶联物的MS分析。A)曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-GGG(实测值为152415Da,MAR 4)。B)曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-GGG(实测值为152639Da,MAR 4)。MAR：MOI与抗体的比率。
图11显示了分别由“一步”和“两步”法制备的曲妥珠单抗-G2F-MMAE偶联物的MS分析。对于“一步”法，曲妥珠单抗-G2F直接用GDP-FAzP4MMAE修饰生成曲妥珠单抗-G2F-FAzP4MMAE(实测值为154922，DAR 4)。对于“两步”法，曲妥珠单抗-G2F首先用GDP-FAz修饰生成曲妥珠单抗-G2F-FAz(实测值为149459，MAR 4)，然后与DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAE反应生成曲妥珠单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE(实测值为156093，DAR 4)。
图14显示了通过用Hp-α(1,3)-FucT和GDP-Fuc衍生物处理抗体-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc对抗体-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物进行的MS分析。A)曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAz(实测值为146568,MAR 2)。B)曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为146683,MAR 2)。C)曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCN(实测值为147366,MAR 2)。D)曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4TCO(实测值为147319,MAR 2)。E)曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(实测值为147356,MAR 2)。F)曲妥珠单抗-((Fuc)α1,6)(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4生物素(实测值为147465,MAR 2)。MAR：MOI与抗体的比率。
图15显示了通过用Hp-α(1,3)-FucT和GDP-Fuc衍生物处理抗体-(Galβ1,4)GlcNAc，对抗体-(Galβ1,4)GlcNAc-Fuc*偶联物进行的MS分析。A)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为146387,MAR 2)。B)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCN(实测值为147074,MAR2)。C)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(实测值为147063,MAR 2)。D)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmGGG(实测值为146564,MAR 2)。E)利妥昔单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAz(实测值为145414,MAR 2)。F)利妥昔单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4Tz(实测值为146082,MAR 2)。MAR：MOI与抗体的比率。
图17显示了分别由“一步”和“两步”法制备的抗体-药物偶联物的MS分析。对于“两步”法：A)曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为156322,DAR 4)。B)曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAF(实测值为156378,DAR 4)。C)利妥昔单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为155341,DAR 4)。D)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为149708,DAR2)。E)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAF(实测值为149736,DAR 2)。F)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA(实测值为150081,DAR 2)。G)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzBCN-MMAE(实测值为149486,DAR 2)。H)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4BCNAz-MMAE(实测值为149863,DAR 2)。I)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4TzTCO-MMAE(实测值为150051,DAR 2)。J)hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE(实测值为149555,DAR 2)。对于“一步”法：K)曲妥珠单抗-G2F-FAmP4MMAE(实测值为154879,DAR 4)。L)曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE(实测值为154177,DAR 4)。M)曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4MMAE(实测值为155147,DAR 4)。N)曲妥珠单抗-G2F-FAmP4AzP4MMAE(实测值为155908,DAR 4)。O)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4MMAE(实测值为148989,DAR 2)。P)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(实测值为148634,DAR 2)。Q)曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4DXd(实测值为153967,DAR 4)。R)曲妥珠单抗-G2F-FAmDM4(实测值为152877,DAR4)。S)曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP4DXd(实测值为148561,DAR 2)。T)hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(实测值为148484,DAR 2)。U)hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP4MMAE(实测值为148969,DAR 2)。
实施例76结合亲和力测定
重组Her2胞外结构域(HER2，近岸蛋白(novoprotein))用包被缓冲液稀释至终浓度为250ng/mL，并在4℃下铺在96孔板(100μL/孔)上过夜。除去包被液后，用3％(v/v)牛血清白蛋白在PBS中于37℃封闭平板2h。用PBST(含0.03％tween-20的PBS)洗涤3次后，将曲妥珠单抗(阳性对照)和“两步”产生的曲妥珠单抗-药物偶联物(曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4TzTCO-MMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA)加入到PBST(在PBS中含有1％(v/v)牛血清白蛋白)中，得到至一系列终浓度(3000ng/mL、1000ng/mL、333.33ng/mL、111.11ng/mL、37.04ng/mL、12.35ng/mL、4.12ng/mL、1.37ng/mL、0.46ng/mL、0.15ng/mL、0ng/mL)，并分别加入到平板中。孵育1.5h后，用PBST洗涤平板3次，然后向每个孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG抗体，并在37℃孵育1h。最后，每个孔用PBST洗涤3次，然后共处理四甲基联苯胺底物以产生用于可视化的颜色。在室温下孵育5min后，通过加入100μL 3M HCl停止每个孔中的反应。在SynergyTM Lx平板读取器上读取450nm处的吸光度。对曲妥珠单抗(阳性对照)和“一步”产生的曲妥珠单抗-药物偶联物(曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4MMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzP4DXd、曲妥珠单抗-G2F-FAmDM4)进行上述方法。结果显示曲妥珠单抗与曲妥珠单抗-药物偶联物之间具有相似的HER2结合亲和力(图20)。
实施例77HIC-HPLC测定
通过使用利用TSKgel丁基-NPR柱(4.6mm×35mm,2.5μm；TOSOH)的Agilent1260HPLC系统的HIC-HPLC分析，在以下条件下对一些曲妥珠单抗-药物偶联物进行了评估：(1)缓冲液A：20mM磷酸钠、1.5M硫酸铵(pH 6.9)；(2)缓冲液B：75％(v/v)20mM磷酸钠、25％(v/v)异丙醇(pH 6.9)；(3)流速：0.4mL/min；(4)梯度：从100％缓冲液A至100％缓冲液B(在1–13min内)；以及(5)柱温为25℃。HIC-HPLC分析显示曲妥珠单抗-药物偶联物的高度均一性(图21)。
实施例78体外血浆稳定性测定
将人血浆用蛋白A树脂处理以除去IgG。然后将除尽IgG的血浆通过0.22μM过滤器进行过滤灭菌。将曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE,、曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4MMAE在37℃和5％ CO2下与血浆一起孵育至终浓度为100μg/mL。在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天取样，并用蛋白A纯化，然后进行MS分析。MS分析显示，对应于抗体药物偶联物的峰没有随时间减少，也没有检测到对应于降解产物的新峰，表明偶联物在人血浆中至少稳定8天(图22)。
实施例79一些曲妥珠单抗-MMAE或曲妥珠单抗-MMAF偶联物对SK-Br-3、BT-474和MDA-MB-231细胞的体外效果。
将SK-Br-3(Her2+)和BT-474(Her2+)在含有10％ FBS(Gibco)的RPMI 1640培养基中进行培养。将MDA-MB-231(Her2-)细胞在含有10％ FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中进行培养。将细胞以每孔5000个细胞铺在96孔板中，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时。移除培养基后，将样品
曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAF、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4MMAE和利妥昔单抗-G2F-FAzDBCO-MMAE加入培养基中，得到一系列终浓度(100nM、10nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.001nM和0nM)，并分别加入到平板中。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育72小时，并使用
Luminescent细胞活力检测试剂盒(Promega)以检测细胞活力。曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAF、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmAzDBCO-MMAE和曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4MMAE显示出对Her2阳性细胞系的高杀伤细胞效力，但对Her2阴性细胞系MDA-MB-231未显示出高杀伤细胞效力(图23)。
实施例80曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA对SK-Br-3、NCI-N87和BT-474细胞的体外效果
将SK-Br-3(Her2+)、NCI-N87(Her2+)和BT-474(Her2+)在含有10％ FBS(Gibco)的RPMI1640培养基中进行培养。将MDA-MB-231(Her2-)细胞在含有10％ FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中进行培养。将细胞以每孔5000个细胞铺在96孔板中，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时。移除培养基后，将样品加入培养基，得到一系列终浓度(100nM、10nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.001nM和0nM)，并分别加入平板。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育72小时，并使用
Luminescent细胞活力检测试剂盒(Promega)以检测细胞活力。曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmP4AzDBCO-seco-DUBA显示出对Her2阳性细胞系的高杀伤细胞效力，但未显示出对Her2阴性细胞系MDA-MB-231的高杀伤细胞效力(图24)。
实施例81一些曲妥珠单抗-药物偶联物对NCI-N87和MDA-MB-231细胞的体外效果
将NCI-N87(Her2+)细胞在含有10％ FBS(Gibco)的RPMI 1640培养基中进行培养。将MDA-MB-231(Her2-)细胞在含有10％ FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中进行培养。将细胞以每孔3000个细胞铺在96孔板中，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时。移除培养基后，将样品曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4DXd和曲妥珠单抗-G2F-FAmDM4加入培养基中，得到一系列终浓度(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.001nM、0.0001nM、0.00001nM和0nM)，并分别加入到平板中。将细胞在37℃和5％CO2下孵育6天，并使用
Luminescent细胞活力检测试剂盒(Promega)以检测细胞活力。曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzDBCO-MMAE、曲妥珠单抗-G2F-FAmAzP4DXd和曲妥珠单抗-G2F-FAmDM4显示出对Her2阳性细胞系的高杀伤细胞效力，但未显示出对Her2阴性细胞系MDA-MB-231的高杀伤细胞效力(图25)。
实施例82hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE的体外效果
将JIMT-1(Trop2高表达)和MDA-MB-231(Trop2低表达)细胞在含有10％ FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中进行培养。将细胞以每孔5000个细胞铺在96孔板中，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时。移除培养基后，将hRS7和hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE加入到培养基中，得到一系列终浓度(100nM、10nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.001nM和0nM)，并分别加入到平板中。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育72小时，并使用
Luminescent细胞活力检测试剂盒(Promega)以检测细胞活力。hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE显示出对Trop2高表达细胞系JIMT-1的高杀伤细胞效力，但未显示出对Trop2低表达细胞系MDA-MB-231的高杀伤细胞效力(图26)。
实施例83曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE对人胃癌细胞NCI-N87的裸鼠异种移植瘤模型的体内效力
用1×106个重悬于50％ PBS(pH 7.4)和50％基质胶(BD)中的NCI-N87(Her2+)细胞接种给雌性BALB/c裸鼠(4～5周龄)。当肿瘤平均尺寸达到150-200mm3时，将PBS、曲妥珠单抗(5mg/kg)、
(5mg/kg)和曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE(5mg/kg)分别通过一次尾静脉注射给不同组(n＝6只小鼠/组)一次。动物研究的总时间长度为35天，在整个研究期间，每周监测小鼠的肿瘤尺寸和体重两次。肿瘤体积根据公式：肿瘤体积(mm3)＝π×长径×(短径)2/6来确定。曲妥珠单抗-G2F-FAmSucMMAE对NCI-N87肿瘤表现出高的抑制肿瘤生长的效果(图27)。所有动物研究均按照机构动物护理和使用委员会指南进行，并在杭州医学院进行。
实施例84hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE对人乳腺癌细胞JIMT-1的裸鼠异种移植瘤模型的体内效果
接种用1×106个重悬于50％ PBS(pH7.4)和50％基质胶(BD)中的JIMT-1(trop2高表达)细胞接种雌性BALB/c裸鼠(4～5周龄)。当肿瘤平均尺寸达到150-200mm3时，将PBS、hRS7(5mg/kg)和hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE(5mg/kg)分别通过尾静脉注射给不同组(n＝6只小鼠/组)一次。动物研究的总时间长度为37天，在整个研究期间，每周监测小鼠的肿瘤尺寸和体重两次。肿瘤体积根据公式：肿瘤体积(mm3)＝π×长径×(短径)2/6来确定。hRS7-(Galβ1,4)GlcNAc-FAmSucMMAE显示出针对JIMT-1肿瘤的抑制肿瘤生长的高效率(图28)。所有动物研究均按照机构动物护理和使用委员会指南进行，并在杭州医学院进行。
实施例85人β1,4-GalT1(Y285L)的克隆和表达
在PUC57载体(金斯瑞)中合成人β1,4-GalT1(Uniprot登录号P15291)Y285L突变型基因，通过重叠延伸PCR法从含有编码催化结构域(63-398)的序列的该构建体中扩增人GalT Y285L突变型基因。用以下的一对引物扩增第一插入的DNA片段：Fw:(AAAAAGCAGGCTCTGAAAACTTGTACTTTCAAGGCGGCTCG(SEQ ID NO:19))和Rw:(TTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAGCTCGGTGTCCCGATGTC(SEQ ID NO:20))。用以下一对引物从哺乳动物表达载体PGEN2 DEST(NatChem.Biol.2018,14,156)扩增了载体DNA片段：寡聚物载体Fw：(GACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTG(SEQ ID NO:21))和寡聚物载体Rw：(GTTTTCAGAGCCTGCTTTTTTGT(SEQ ID NO:22))。通过使用
II(Vazyme:C112-01)将GalT Y285L突变DNA片段克隆到载体PGEN2 DEST中。根据由Moremen K.W等人报道的程序(Moremen K.W等人,Nat.Chem.Biol.2018,14,156)进行人GalT1(Y285L)(SEQ ID No:1)的表达和纯化。
实施例86牛β1,4-GalT1(Y289L)、Hp-α(1,3)-FucT、EndoS、Alfc和人FT6的克隆、表达和纯化
牛β1,4-GalT1(Y289L)(SEQ ID NO:2)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)EndoS(SEQ ID NO:6)，干酪乳杆菌(Lactobacillus case)α-1,6-岩藻糖苷酶(AlfC)(SEQID NO:7)、幽门螺杆菌Hp-α(1,3)-FucT(SEQ ID NO:4)和人FT6(SEQ ID NO:5)的克隆、表达和纯化分别按照由Qasba，P.K.等人(Prot.Expr.Fur..2003,30,219)(J.Biol.Chem.2002,277,20833.)，由Collin,M.等人(EMBO J.2001,20,3046；Infect.Immun.2001,69,7187),由Wang L.等人(Methods Mol.Biol.2018,19,367)，由Wu P.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009,106,16096)以及由Moremen K.W等人(Nat Chem.Biol.2018,14,156)报道的方法进行。
实施例87hRS7的克隆、表达和纯化
hRS7抗体轻链和重链的序列参考了专利(US 7,238,785 B2)。合成编码hRS7的轻链和重链的基因，并交由金斯瑞公司分别克隆到PPT5载体中。然后，将FreeStyle 293F细胞生长至约2.5×106个细胞/ml的密度，并通过向悬浮培养物中直接添加0.37μg/ml和0.66μg/ml的轻链和重链表达质粒DNA以及2.2μg/ml的聚乙烯亚胺(线性25kDa PEI，聚合科学(Polysciences),Inc,沃灵顿,Pa)来进行转染。转染后24小时，用含有4.4mM丙戊酸(终浓度为2.2mM)的Freestyle 293表达培养基以1:1稀释培养物，并在37℃下继续蛋白质生产，再进行4至5天。蛋白质生产后，按照制造商的说明，通过蛋白质琼脂糖纯化抗体。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说，显然此类实施方案仅仅是作为实例提供的。本发明不旨在受说明书中提供的具体实例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但本文中对实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文根据各种条件和变量阐述的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明也将涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构由此而被涵盖。
序列表
<110> 岩唐生物科技（杭州）有限责任公司
<120> 位点特异性抗体偶联物及其制备方法
<130> 0186-PA-004CN
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 β1,4-GalT1 (63-398; Y285L )
<400> 1
Gly Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu Arg
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln Pro
20 25 30
Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro
35 40 45
Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser
50 55 60
Leu Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu
65 70 75 80
Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln Asn
85 90 95
Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser
100 105 110
Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His
115 120 125
Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln
130 135 140
Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe
145 150 155 160
Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp
165 170 175
Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met
180 185 190
Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser
195 200 205
Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Leu Phe
210 215 220
Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly
225 230 235 240
Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe
245 250 255
Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val
260 265 270
Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu
275 280 285
Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met
290 295 300
Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln
305 310 315 320
Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser
325 330 335
<210> 2
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛 β1,4-GalT1(Y289L) (130-402; Y289L; C342T ) 带有N端标签
<400> 2
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile
20 25 30
Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Val Glu Gln Gln Asn Pro
35 40 45
Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys Ile Ser Pro
50 55 60
His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu
65 70 75 80
Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Ile Leu Gln Arg Gln Gln Leu
85 90 95
Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser Met Phe Asn
100 105 110
Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu Lys Asp Tyr
115 120 125
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130 135 140
Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val
145 150 155 160
Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Leu Phe Gly
165 170 175
Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile Asn Gly Phe
180 185 190
Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Tyr Asn
195 200 205
Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn Ala Val Ile
210 215 220
Gly Lys Thr Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro
225 230 235 240
Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu
245 250 255
Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu Val Gln Arg
260 265 270
Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser
275 280 285
<210> 3
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 幽门螺杆菌 α(1,3)-岩藻糖基转移酶 (1-392)
<400> 3
Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ser Ala Ser Ile Glu
1 5 10 15
Lys Met Val Ser Lys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val Ala
20 25 30
Asn Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Lys Ser Val Leu
35 40 45
Tyr Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Ala Ile Thr Leu His Gln Asn Pro
50 55 60
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Lys Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Thr Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu
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100 105 110
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Lys Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His His
145 150 155 160
Phe Lys Glu Asn His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Ser
165 170 175
Asp Leu Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Ala Asn
180 185 190
Ala Pro Met Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu Pro
195 200 205
Val Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Lys Val Gly
210 215 220
Asn Lys Ser Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu
225 230 235 240
Asn Ser Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Leu Asp Ala Tyr
245 250 255
Phe Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Lys
260 265 270
Asp Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Asn Asn Phe
275 280 285
Asp Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Pro Asn Ala
290 295 300
Tyr Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly Lys
305 310 315 320
Ala Tyr Phe Tyr Gln Asp Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Asp Phe Phe
325 330 335
Lys Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asn Asn Pro Phe Ile
340 345 350
Phe Tyr Arg Asp Leu His Glu Pro Leu Ile Ser Ile Asp Asp Leu Arg
355 360 365
Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn
370 375 380
Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr
385 390
<210> 4
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hp α(1,3)-岩藻糖基转移酶 (1-392) 与C-末端His标签融合
<400> 4
Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ser Ala Ser Ile Glu
1 5 10 15
Lys Met Val Ser Lys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val Ala
20 25 30
Asn Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Lys Ser Val Leu
35 40 45
Tyr Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Ala Ile Thr Leu His Gln Asn Pro
50 55 60
Asn Glu Ser Ser Asp Leu Val Phe Ser Asn Pro Leu Gly Ala Ala Arg
65 70 75 80
Lys Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Thr Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu
85 90 95
Asn Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp
100 105 110
Glu Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr Ala
115 120 125
His Leu His Tyr Glu Ala Glu Leu Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro Tyr
130 135 140
Lys Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His His
145 150 155 160
Phe Lys Glu Asn His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Ser
165 170 175
Asp Leu Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Ala Asn
180 185 190
Ala Pro Met Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu Pro
195 200 205
Val Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Lys Val Gly
210 215 220
Asn Lys Ser Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu
225 230 235 240
Asn Ser Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Leu Asp Ala Tyr
245 250 255
Phe Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Lys
260 265 270
Asp Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Asn Asn Phe
275 280 285
Asp Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Pro Asn Ala
290 295 300
Tyr Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly Lys
305 310 315 320
Ala Tyr Phe Tyr Gln Asp Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Asp Phe Phe
325 330 335
Lys Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asn Asn Pro Phe Ile
340 345 350
Phe Tyr Arg Asp Leu His Glu Pro Leu Ile Ser Ile Asp Asp Leu Arg
355 360 365
Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn
370 375 380
Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Leu Glu His His His His His His
385 390 395 400
<210> 5
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 FT6 催化结构域 (40-359) 具带有N末端G
<400> 5
Gly Asp Pro Thr Val Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Phe Pro Asp Ser Thr
1 5 10 15
Gly Thr Pro Ala His Ser Ile Pro Leu Ile Leu Leu Trp Thr Trp Pro
20 25 30
Phe Asn Lys Pro Ile Ala Leu Pro Arg Cys Ser Glu Met Val Pro Gly
35 40 45
Thr Ala Asp Cys Asn Ile Thr Ala Asp Arg Lys Val Tyr Pro Gln Ala
50 55 60
Asp Ala Val Ile Val His His Arg Glu Val Met Tyr Asn Pro Ser Ala
65 70 75 80
Gln Leu Pro Arg Ser Ser Arg Arg Gln Gly Gln Arg Trp Ile Trp Phe
85 90 95
Ser Met Glu Ser Pro Ser His Cys Trp Gln Leu Lys Ala Met Asp Gly
100 105 110
Tyr Phe Asn Leu Thr Met Ser Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Ile Phe Thr
115 120 125
Pro Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Trp Ser Gly Gln Pro Ala His Pro Pro
130 135 140
Leu Asn Leu Ser Ala Lys Thr Glu Leu Val Ala Trp Ala Val Ser Asn
145 150 155 160
Trp Gly Pro Asn Ser Ala Arg Val Arg Tyr Tyr Gln Ser Leu Gln Ala
165 170 175
His Leu Lys Val Asp Val Tyr Gly Arg Ser His Lys Pro Leu Pro Gln
180 185 190
Gly Thr Met Met Glu Thr Leu Ser Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Ala Phe
195 200 205
Lys Asn Ser Leu His Pro Asp Tyr Ile Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn
210 215 220
Ala Leu Glu Ala Trp Ala Val Pro Val Val Leu Gly Pro Ser Arg Ser
225 230 235 240
Asn Tyr Glu Arg Phe Leu Pro Pro Asp Ala Phe Ile His Val Asp Asp
245 250 255
Phe Gln Ser Pro Lys Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gln Glu Leu Asp Lys
260 265 270
Asp His Ala Arg Tyr Leu Ser Tyr Phe Arg Trp Arg Glu Thr Leu Arg
275 280 285
Pro Arg Ser Phe Ser Trp Ala Leu Ala Phe Cys Lys Ala Cys Trp Lys
290 295 300
Leu Gln Glu Glu Ser Arg Tyr Gln Thr Arg Gly Ile Ala Ala Trp Phe
305 310 315 320
Thr
<210> 6
<211> 1006
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化脓性链球菌 内糖苷酶S（37-995）与N末端标签融合
<400> 6
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ile Glu Gly Arg Glu
35 40 45
Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro Ser Ile Asp Ser Leu
50 55 60
His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Glu Leu Ser
65 70 75 80
Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Lys Ala
85 90 95
Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Met Lys Ile Pro
100 105 110
Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro Leu Tyr Gly Gly Tyr
115 120 125
Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Thr Glu Lys Asp Lys
130 135 140
Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala Phe Ile
145 150 155 160
Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Lys Glu Leu Ala
165 170 175
Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val Ile Arg
180 185 190
Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp Asn Ser Gly Ile Ala
195 200 205
Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp Gly
225 230 235 240
Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln Val Phe Glu Glu Ile
260 265 270
Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys Ser Arg Leu Phe Ile
275 280 285
Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu Arg Gly
290 295 300
Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ser Gln Gly
305 310 315 320
Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg Pro Glu Lys Thr Met
325 330 335
Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu Gln Tyr
340 345 350
Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gln Glu Gly Asn Leu
355 360 365
Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp Lys Ala Asn Gly Ile
370 375 380
Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Arg Trp Gln
385 390 395 400
Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala Ile Asp
405 410 415
Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr Ala Lys Gln Lys Glu
420 425 430
Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser Asp Tyr Ser Val Ser
435 440 445
Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ile
450 455 460
Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala Val Met Ala
465 470 475 480
Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn Gly Thr Leu
485 490 495
Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu Gly Leu Asn Lys Phe
500 505 510
Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu Ser Arg Ile Thr Lys
515 520 525
Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys Pro Gly Lys Asp Thr
530 535 540
Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp Asn Lys Glu Glu Pro
545 550 555 560
Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Gly Leu Thr Gly Leu
565 570 575
Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu Thr Leu Ala Gly Leu
580 585 590
Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp Ile Ser Gly Asn
595 600 605
Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg Gln Ile Phe Asp Thr
610 615 620
Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser Asn Glu Gln Thr Val
625 630 635 640
Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro Asp Thr Tyr Gly
645 650 655
Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu Lys Val Asp Leu Gln
660 665 670
Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln Gly Thr Leu Ile Asn
675 680 685
Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His Lys Ile Ala Gly Arg
690 695 700
Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn Phe Lys Val Ser Tyr
705 710 715 720
Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr Leu Gly Thr Thr Thr
725 730 735
Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr Tyr Lys Val Asp Phe
740 745 750
Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His Thr Ala Lys Val Ile
755 760 765
Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu Ala Glu Gly Ala Thr
770 775 780
Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala Arg Lys Val Phe Asp
785 790 795 800
Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser Leu Gly Trp Asp Ser
805 810 815
Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp Gly Leu Ile Lys His
820 825 830
Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro Glu Thr Thr Asn Lys
835 840 845
Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Asn
850 855 860
Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe Asp Asp Glu Lys Tyr
865 870 875 880
Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Ala Thr Ala
885 890 895
Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys Tyr Trp Arg Val Val
900 905 910
Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro Val Val Pro Glu Leu
915 920 925
Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp Thr Ile Met Lys Thr
930 935 940
Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys Asp Lys Phe Ser Gln
945 950 955 960
Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met Ala Leu Glu Thr Ser
965 970 975
Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile Asn Ala Asn Ala Gly
980 985 990
Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu Leu Lys Lys
995 1000 1005
<210> 7
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 干酪乳杆菌α1,6-岩藻糖苷酶（1-344）与C末端的CPD标签和his标签融合
<400> 7
Met Asn Asp Asn Val Ala Trp Phe Lys Gln Ala Lys Tyr Gly Met Met
1 5 10 15
Ile His Trp Gly Leu Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Glu Tyr Arg Gly Glu
20 25 30
Ser Ser Ser Ala Tyr Ala Glu Trp Ile Gln Ser Lys Phe Gln Ile Pro
35 40 45
Asn Ala Glu Tyr Gly Asn Leu Ala Thr Ala Phe Asn Pro Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Lys Lys Ile Val Ala Leu Ala Lys Gln Cys Gly Met Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Val Val Thr Thr Lys His His Asp Gly Phe Ala Met Tyr His Ser
85 90 95
Lys Val Asp Ala Tyr Asn Val Tyr Asp Ala Thr Pro Phe His Arg Asp
100 105 110
Ile Ile Gly Glu Leu Ala Glu Ala Cys Gln Lys Ala Gly Leu Lys Phe
115 120 125
Gly Leu Tyr Tyr Ser Gln Asp Leu Asp Trp His Asp Pro Asn Gly Gly
130 135 140
Gly Tyr Lys Ser Asn Asp Val Glu Thr Ala Gly Thr Thr Trp Asp Asn
145 150 155 160
Ser Trp Asp Phe Pro Asp Glu Asp Gln Lys Asn Phe Asp Leu Cys Phe
165 170 175
Asp Asn Lys Ile Leu Pro Gln Ile Lys Glu Ile Met Ser Asn Tyr Gly
180 185 190
Asp Ile Ala Thr Ala Trp Phe Asp Val Pro Met Thr Leu Ser Glu Ala
195 200 205
Gln Ser Gln Thr Ile Tyr Asp Thr Val Arg Glu Leu Gln Pro Asn Cys
210 215 220
Leu Ile Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Lys Tyr Asp Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Gly Asp Asn Glu Ile Pro Lys Asn Lys Glu Asp Met Asn Lys Thr Asp
245 250 255
Val Asp Tyr Asn Glu Ile Thr Gly Phe Lys Pro Ser Pro Leu Gly Leu
260 265 270
Tyr Glu Thr Ala Gly Thr Ile Asn Asp Ser Trp Gly Phe Ser Tyr His
275 280 285
Asp Gln Asn Trp Lys Thr Pro Arg Thr Leu Tyr Arg Tyr Lys Gln His
290 295 300
Leu Asn Asp Phe Gly Ile Asn Tyr Leu Leu Asn Val Gly Leu Asp Pro
305 310 315 320
Leu Gly Arg Val Pro Met Met Ala Glu Glu Asn Leu Leu Ala Ala Lys
325 330 335
Ala Leu Glu Asp Glu Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp Gly Lys Ile Leu
340 345 350
His Asn Gln Asn Val Asn Ser Trp Gly Pro Ile Thr Val Thr Pro Thr
355 360 365
Thr Asp Gly Gly Glu Thr Arg Phe Asp Gly Gln Ile Ile Val Gln Met
370 375 380
Glu Asn Asp Pro Val Val Ala Lys Ala Ala Ala Asn Leu Ala Gly Lys
385 390 395 400
His Ala Glu Ser Ser Val Val Val Gln Leu Asp Ser Asp Gly Asn Tyr
405 410 415
Arg Val Val Tyr Gly Asp Pro Ser Lys Leu Asp Gly Lys Leu Arg Trp
420 425 430
Gln Leu Val Gly His Gly Arg Asp His Ser Glu Thr Asn Asn Thr Arg
435 440 445
Leu Ser Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Leu Ala Val Lys Leu Ala Lys Phe
450 455 460
Gln Gln Ser Phe Asn Gln Ala Glu Asn Ile Asn Asn Lys Pro Asp His
465 470 475 480
Ile Ser Ile Val Gly Cys Ser Leu Val Ser Asp Asp Lys Gln Lys Gly
485 490 495
Phe Gly His Gln Phe Ile Asn Ala Met Asp Ala Asn Gly Leu Arg Val
500 505 510
Asp Val Ser Val Arg Ser Ser Glu Leu Ala Val Asp Glu Ala Gly Arg
515 520 525
Lys His Thr Lys Asp Ala Asn Gly Asp Trp Val Gln Lys Ala Glu Asn
530 535 540
Asn Lys Val Ser Leu Ser Trp Asp Ala Gln Gly His His His His His
545 550 555 560
His
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗 LC
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗 HC
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 10
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗 LC
<400> 10
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗 HC
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗 LC
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐单抗 HC
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hRS7 LC
<400> 14
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hRS7 HC
<400> 15
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
20 25 30
Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly
35 40 45
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 16
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛 β1,4-GalT1(Y289L) (130-402; Y289L; C342T ) 无N端标签
<400> 16
Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met
1 5 10 15
Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Val Glu Gln Gln
20 25 30
Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys Ile
35 40 45
Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu
50 55 60
His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Ile Leu Gln Arg Gln
65 70 75 80
Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser Met
85 90 95
Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu Lys
100 105 110
Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro
115 120 125
Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile
130 135 140
Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Leu
145 150 155 160
Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile Asn
165 170 175
Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile
180 185 190
Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn Ala
195 200 205
Val Ile Gly Lys Thr Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn
210 215 220
Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr
225 230 235 240
Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu Val
245 250 255
Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro
260 265 270
Ser
<210> 17
<211> 959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化脓性链球菌内糖苷酶S（37-995）
<400> 17
Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro Ser Ile Asp Ser
1 5 10 15
Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Glu Leu
20 25 30
Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Met Lys Ile
50 55 60
Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro Leu Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala Phe
100 105 110
Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Lys Glu Leu
115 120 125
Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val Ile
130 135 140
Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp Asn Ser Gly Ile
145 150 155 160
Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys Ala
165 170 175
Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp
180 185 190
Gly Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln Val Phe Glu Glu
210 215 220
Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys Ser Arg Leu Phe
225 230 235 240
Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu Arg
245 250 255
Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ser Gln
260 265 270
Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg Pro Glu Lys Thr
275 280 285
Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu Gln
290 295 300
Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gln Glu Gly Asn
305 310 315 320
Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp Lys Ala Asn Gly
325 330 335
Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Arg Trp
340 345 350
Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala Ile
355 360 365
Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr Ala Lys Gln Lys
370 375 380
Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser Asp Tyr Ser Val
385 390 395 400
Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys Ser Tyr Asp Leu
405 410 415
Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala Val Met
420 425 430
Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn Gly Thr
435 440 445
Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu Gly Leu Asn Lys
450 455 460
Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu Ser Arg Ile Thr
465 470 475 480
Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys Pro Gly Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp Asn Lys Glu Glu
500 505 510
Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu Thr Leu Ala Gly
530 535 540
Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp Ile Ser Gly
545 550 555 560
Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg Gln Ile Phe Asp
565 570 575
Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser Asn Glu Gln Thr
580 585 590
Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro Asp Thr Tyr
595 600 605
Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu Lys Val Asp Leu
610 615 620
Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln Gly Thr Leu Ile
625 630 635 640
Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His Lys Ile Ala Gly
645 650 655
Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn Phe Lys Val Ser
660 665 670
Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr Leu Gly Thr Thr
675 680 685
Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr Tyr Lys Val Asp
690 695 700
Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His Thr Ala Lys Val
705 710 715 720
Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu Ala Glu Gly Ala
725 730 735
Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala Arg Lys Val Phe
740 745 750
Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser Leu Gly Trp Asp
755 760 765
Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp Gly Leu Ile Lys
770 775 780
His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro Glu Thr Thr Asn
785 790 795 800
Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
805 810 815
Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe Asp Asp Glu Lys
820 825 830
Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Ala Thr
835 840 845
Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys Tyr Trp Arg Val
850 855 860
Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro Val Val Pro Glu
865 870 875 880
Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp Thr Ile Met Lys
885 890 895
Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys Asp Lys Phe Ser
900 905 910
Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met Ala Leu Glu Thr
915 920 925
Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile Asn Ala Asn Ala
930 935 940
Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu Leu Lys Lys
945 950 955
<210> 18
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 干酪乳杆菌α1,6-岩藻糖苷酶（1-344）
<400> 18
Met Asn Asp Asn Val Ala Trp Phe Lys Gln Ala Lys Tyr Gly Met Met
1 5 10 15
Ile His Trp Gly Leu Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Glu Tyr Arg Gly Glu
20 25 30
Ser Ser Ser Ala Tyr Ala Glu Trp Ile Gln Ser Lys Phe Gln Ile Pro
35 40 45
Asn Ala Glu Tyr Gly Asn Leu Ala Thr Ala Phe Asn Pro Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Lys Lys Ile Val Ala Leu Ala Lys Gln Cys Gly Met Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Val Val Thr Thr Lys His His Asp Gly Phe Ala Met Tyr His Ser
85 90 95
Lys Val Asp Ala Tyr Asn Val Tyr Asp Ala Thr Pro Phe His Arg Asp
100 105 110
Ile Ile Gly Glu Leu Ala Glu Ala Cys Gln Lys Ala Gly Leu Lys Phe
115 120 125
Gly Leu Tyr Tyr Ser Gln Asp Leu Asp Trp His Asp Pro Asn Gly Gly
130 135 140
Gly Tyr Lys Ser Asn Asp Val Glu Thr Ala Gly Thr Thr Trp Asp Asn
145 150 155 160
Ser Trp Asp Phe Pro Asp Glu Asp Gln Lys Asn Phe Asp Leu Cys Phe
165 170 175
Asp Asn Lys Ile Leu Pro Gln Ile Lys Glu Ile Met Ser Asn Tyr Gly
180 185 190
Asp Ile Ala Thr Ala Trp Phe Asp Val Pro Met Thr Leu Ser Glu Ala
195 200 205
Gln Ser Gln Thr Ile Tyr Asp Thr Val Arg Glu Leu Gln Pro Asn Cys
210 215 220
Leu Ile Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Lys Tyr Asp Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Gly Asp Asn Glu Ile Pro Lys Asn Lys Glu Asp Met Asn Lys Thr Asp
245 250 255
Val Asp Tyr Asn Glu Ile Thr Gly Phe Lys Pro Ser Pro Leu Gly Leu
260 265 270
Tyr Glu Thr Ala Gly Thr Ile Asn Asp Ser Trp Gly Phe Ser Tyr His
275 280 285
Asp Gln Asn Trp Lys Thr Pro Arg Thr Leu Tyr Arg Tyr Lys Gln His
290 295 300
Leu Asn Asp Phe Gly Ile Asn Tyr Leu Leu Asn Val Gly Leu Asp Pro
305 310 315 320
Leu Gly Arg Val Pro Met Met Ala Glu Glu Asn Leu Leu Ala Ala Lys
325 330 335
Ala Leu Glu Asp Glu Ala Asn Arg
340
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 19
aaaaagcagg ctctgaaaac ttgtactttc aaggcggctc g 41
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 20
ttgtacaaga aagctgggtc ctagctcggt gtcccgatgt c 41
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸载体正向引物
<400> 21
gacccagctt tcttgtacaa agtg 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸载体反向引物
<400> 22
gttttcagag cctgcttttt tgt 23
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端 LPETGG标签, LPETGG-COOH
<400> 23
Leu Pro Glu Thr Gly Gly
1 5
Claims (226)
1.一种蛋白质偶联物，其包含蛋白质和寡糖，其中所述寡糖包含
的结构，其中：
所述GlcNAc与所述蛋白质的氨基酸直接或间接连接；
所述Gal是半乳糖；
所述(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；
所述Fuc*包含岩藻糖或岩藻糖衍生物和目标分子(MOI)；
所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段。
2.如权利要求1所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖是N-连接的寡糖。
3.如权利要求1-2中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖与所述蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基连接。
4.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖中的所述GlcNAc与所述蛋白质的Asn残基直接连接。
5.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖中的所述GlcNAc与所述寡糖的糖连接。
6.如权利要求5所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖中的所述GlcNAc与所述寡糖的甘露糖连接。
7.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质包含Fc片段。
8.如权利要求1-7中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质包含Fc片段，并且所述寡糖与所述Fc片段连接。
9.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖与所述Fc片段的CH2结构域连接。
10.如权利要求1-9中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述寡糖与所述Fc片段的Asn297连接，所述Fc片段根据Kabat编号系统编号。
11.如权利要求1-10中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质是抗体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质是抗体，并且所述蛋白质偶联物能够与抗原结合，任选地，所述蛋白质偶联物具有与相应抗体相似的对抗原的结合亲和力。
13.如权利要求12所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质偶联物的结合亲和力是所述相应抗体的结合亲和力的约0.1％至约100000％。
14.如权利要求12-13中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质偶联物的结合亲和力是所述相应抗体的结合亲和力的约1％至约10000％。
15.如权利要求12-14中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质偶联物的结合亲和力是所述相应抗体的结合亲和力的约10％至约1000％。
16.如权利要求12-15中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质偶联物的结合亲和力是所述相应抗体的结合亲和力的约50％至约200％。
17.如权利要求11-16中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述抗体是单克隆抗体。
18.如权利要求11-17中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述抗体是IgG抗体。
19.如权利要求11-18中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述抗体是人源化抗体。
20.如权利要求1-19中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc*的岩藻糖或岩藻糖衍生物通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与所述GlcNAc连接。
21.如权利要求1-20中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Gal通过Galβ1,4GlcNAc键联与所述GlcNAc连接。
22.如权利要求1-21中任一项所述的蛋白质偶联物，其中(Fuc)的所述岩藻糖通过α1,6键联与所述GlcNAc连接。
23.如权利要求1-22中任一项所述的蛋白质偶联物，其中Fuc*的所述MOI包含活性部分。
24.如权利要求23所述的蛋白质偶联物，其中所述MOI的所述活性部分包含化学活性部分、酶促活性部分、生物活性部分和/或药学活性部分。
25.如权利要求23-24中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述MOI的所述活性部分包含化学活性部分和/或酶促活性部分。
26.如权利要求23-25中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述MOI的所述活性部分包含能够参与连接反应的官能团Y1。
27.如权利要求26所述的蛋白质偶联物，其中所述Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
28.如权利要求26-27中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y1包含选自以下组的功能性部分：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
29.如权利要求26-28中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y1包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2的每一种独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基各自独立地任选地被取代。
30.如权利要求26-29中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y1包含选自以下组的功能性部分：
31.如权利要求23-24中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述MOI的所述活性部分包含P，并且所述P是生物学和/或药物活性物质。
32.如权利要求31所述的蛋白质偶联物，其中所述P是药学活性物质。
33.如权利要求31-32中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质或其任意组合。
34.如权利要求31-33中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、寡核苷酸、肽、多肽或其任意组合。
35.如权利要求31-34中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂或其任意组合。
36.如权利要求31-32中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含抗肿瘤剂。
37.如权利要求36的蛋白质偶联物，其中所述P包含导致细胞损伤或细胞死亡的物质。
38.如权利要求31-37中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含细胞毒素。
39.如权利要求38所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含选自以下组的细胞毒素：DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂和微管抑制剂。
40.如权利要求38-39中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含选自以下组的细胞毒素：吡咯并苯二氮卓、奥瑞他汀、美登素、多卡霉素、微管溶素、烯二炔、多柔比星、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂、卡利奇霉素、鹅膏蕈碱、喜树碱。
41.如权利要求38-40中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含选自以下组的细胞毒素：MMAE、DXd、MMAF、seco-DUBA和DM4。
42.如权利要求31-41中任一项所述的蛋白质偶联物，所述MOI任选地包含权利要求26-30中任一项所述的所述Y1与官能团Y2之间的连接反应之后的剩余基团Y1Y2。
43.如权利要求42所述的蛋白质偶联物，其中所述Y1Y2位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述P之间。
44.如权利要求42-43中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y2包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
45.如如权利要求42-44中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y2包含选自以下组的功能性部分：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
46.如权利要求42-45中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y2包含选自以下组的功能性部分：
其中R1和R2各自独立地选自以下组：氢、卤素、C1-C22烷基、C5-C22(杂)芳基、C7-C22烷基(杂)芳基和C7-C22(杂)芳基烷基，其中所述烷基各自任选被一个或多个选自以下组的杂原子中断：O、N和S，并且其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳烷基各自独立地任选地被取代。
47.如权利要求42-46中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y2包含选自以下组的功能性部分：
48.如权利要求42-47中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述基团Y1Y2选自以下组：
49.如权利要求42-48中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Y1和所述Y2包含选自以下组的功能性部分：
a)Y1包含
并且Y2包含
b)Y1包含
并且Y2包含、
c)Y1包含
并且Y2包含
以及
d)Y1包含、
并且Y2包含
其中R1和R2是如上定义的。
50.如权利要求1-49中任一项所述的蛋白质偶联物，其中Fuc*的所述MOI任选地包含L，并且L是连接子。
51.如权利要求50所述的蛋白质偶联物，其中所述L是可切割的连接子。
52.如权利要求50-51中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述L是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或蛋白水解可切割的连接子。
53.如权利要求50-52中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述L是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
54.如权利要求50-53中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述L位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述P之间。
55.如权利要求50-53中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述L位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1之间。
56.如权利要求50-53中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述L位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1Y2之间。
57.如权利要求1-56中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc*的所述MOI任选地包含F，并且F是接头。
58.如权利要求57所述的蛋白质偶联物，其中所述F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1，任选地s是1。
59.如权利要求57-58中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1，任选地s是1。
60.如权利要求57-58中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1，任选地s是1。
61.如权利要求58-60中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
62.如权利要求58-61中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述FL具有选自以下组的结构：
63.如权利要求57-62中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述F位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述P之间。
64.如权利要求57-62中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述F位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1之间。
65.如权利要求57-62中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述F位于Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物与所述Y1Y2之间。
66.如权利要求1-65中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc*是Fuc-(F)m-(L)n-Y1,Fuc-(F)m-(L)n-P或Fuc-(F)m-(L)n-Y1Y2-(FL’)m’-(L’)n’-P，其中Fuc是所述Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，Y1是官能团，FL’是与FL相同定义的间隔子，L’是与L相同定义的连接子，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，并且n’是0或1。
67.如权利要求1-66中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc*是Fuc-Y1、Fuc-F-Y1、Fuc-F-L-P、Fuc-F-P、Fuc-Y1Y2-FL’-L’-P、Fuc-Y1Y2-FL’-P、Fuc-Y1Y2-L’-P，Fuc-F-Y1Y2-L’-P、Fuc-F-Y1Y2-FL’-P或Fuc-F-Y1Y2-FL’-L’-P，其中Fuc是所述Fuc*的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，P是生物活性和/或药学活性物质，Y1是官能团，FL’是与FL相同定义的间隔子，并且L’是与L相同定义的连接子。
68.如权利要求1-67中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc如下式所示
并且所述Fuc*如下式所示
69.如权利要求1-68中任一项所述的蛋白质偶联物，其包含1-20个
70.如权利要求1-3和5-69中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与
的末端LacNAc的GlcNAc连接，
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与核心GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，并且
是抗体或Fc-融合蛋白。
71.如权利要求1-4和7-69中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与
的核心GlcNAc连接，其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与核心GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，
是抗体或Fc-融合蛋白，b是0或1。
72.如权利要求1-3、5-70中任一项所述的蛋白质偶联物，所述蛋白质偶联物包含4个
并且如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，
是甘露糖，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是抗体或Fc-融合蛋白。
73.如权利要求1-4、7-69和71中任一项所述的蛋白质偶联物，所述蛋白质偶联物包含2个
并且如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，
是抗体或Fc-融合蛋白并且b是0或1。
74.如权利要求1-4、7-69、71和73中任一项所述的蛋白质偶联物，所述蛋白质偶联物包含2个
并且如下式所示
其中
是GlcNAc，
是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是抗体或Fc-融合蛋白。
75.如权利要求1-4、7-69、71和73中任一项所述的蛋白质偶联物，所述蛋白质偶联物包含2个
并且如下式所示
其中是
GlcNAc，
是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖(Fuc)，○是通过Galβ1,4GlcNAc键联与GlcNAc连接的半乳糖，Fuc*通过Fuc*α1,3GlcNAc键联与GlcNAc连接，并且
是抗体或Fc-融合蛋白。
76.如权利要求1-75中任一项所述的蛋白质偶联物，其中所述蛋白质偶联物是用于治疗疾病的蛋白质偶联物。
77.如权利要求1-75中任一项所述的蛋白质偶联物，当所述MOI包含Y1时，所述蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
78.一种组合物，其包含权利要求1-77中任一项所述的蛋白质偶联物。
79.如权利要求78所述的组合物，其包含权利要求1-3、5-70、72和76-77中任一项所述的蛋白质偶联物，具有约2.4-4的MOI与抗体的比率(MAR)。
80.如权利要求79所述的组合物，其具有约为3.2-4的平均MAR。
81.如权利要求79-80中任一项所述的组合物，其具有约为3.5-4的平均MAR。
82.如权利要求79-81中任一项所述的组合物，其具有约为4的平均MAR。
83.如权利要求78所述的组合物，其包含如权利要求1-4、7-69、71和73-77中任一项所述的蛋白质偶联物，其具有约为0.5-2的平均MOI与抗体的比率(MAR)。
84.如权利要求83所述的组合物，其具有约为1.6-2的平均MAR。
85.如权利要求83-84中任一项所述的组合物，其具有约为2的平均MAR。
86.一种方法，其用于制备权利要求1-77中任一项所述的蛋白质偶联物或权利要求78-85中任一项所述的组合物。
87.一种用于制备蛋白质偶联物的方法，其包括步骤(a)：在催化剂存在的情况下，使岩藻糖衍生物供体Q-Fuc*’与包含寡糖的蛋白质接触，
其中所述寡糖包含-GlcNAc(Fuc)b-Gal，以获得包含
的蛋白质偶联物，其中：
所述GlcNAc与所述蛋白质的氨基酸直接或间接连接；
所述Gal是半乳糖；
所述(Fuc)是岩藻糖，b是0或1；
所述Fuc*’包含岩藻糖或岩藻糖衍生物和目标分子(MOI’)；
所述蛋白质包含抗原结合片段和/或Fc片段；
所述Q-Fuc*’是包含所述Fuc*’的分子。
88.如权利要求87所述的方法，其包括将获得的包含
的蛋白质偶联物交换到缓冲液中。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述缓冲液是制剂缓冲液或储存缓冲剂。
90.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述催化剂是岩藻糖基转移酶或其功能变体或片段。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶是α-1,3-岩藻糖基转移酶或其功能变体或片段。
92.如权利要求90-91中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶来源于细菌、线虫、吸虫或哺乳动物。
93.如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌。
94.如权利要求90-93中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶包含如GenBank登录号AAD07710.1或其功能变体或片段中所示的氨基酸序列。
95.如权利要求90-94中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶包含如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
96.如权利要求87-95中任一项所述的方法，其中所述寡糖是N-连接的寡糖。
97.如权利要求87-96中任一项所述的方法，其中所述寡糖与所述蛋白质的Asn残基连接。
98.如权利要求87-97中任一项所述的方法，其中所述寡糖中的所述GlcNAc与所述蛋白质的Asn残基直接连接。
99.如权利要求87-98中任一项所述的方法，其中所述寡糖中的所述GlcNAc与所述寡糖的糖连接。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述寡糖中的所述GlcNAc与所述寡糖的甘露糖连接。
101.如权利要求87-100中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含Fc片段。
102.如权利要求87-101中任一项所述的方法，其中所述寡糖与所述Fc片段连接。
103.如权利要求87-102中任一项所述的方法，其中所述寡糖与所述Fc片段的CH2结构域连接。
104.如权利要求87-103中任一项所述的方法，其中所述寡糖与所述Fc片段的Asn297连接，所述Fc片段根据Kabat编号系统编号。
105.如权利要求87-104中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
106.如权利要求87-105中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体，并且所述蛋白质偶联物具有与其对应抗体相似的对抗原的结合亲和力。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述获得的蛋白质偶联物的结合亲和力为所述相应抗体的结合亲和力的约0.1％至约100000％。
108.如权利要求106-107中任一项所述的方法，其中所述获得的蛋白质偶联物的结合亲和力为所述相应抗体的结合亲和力的约1％至约10000％。
109.如权利要求106-108中任一项所述的方法，其中所述获得的蛋白质偶联物的结合亲和力为所述相应抗体的结合亲和力的约10％至约1000％。
110.如权利要求106-109中任一项所述的方法，其中所述获得的蛋白质偶联物的结合亲和力为所述相应抗体的结合亲和力的约50％至约200％。
111.如权利要求105-110中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
112.如权利要求105-111中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgG抗体。
113.如权利要求105-112中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
114.如权利要求87-113中任一项所述的方法，其中所述Gal通过Galβ1,4GlcNAc键联与所述GlcNAc连接。
115.如权利要求87-114中任一项所述的方法，其中所述(Fuc)的所述岩藻糖通过α1,6键联与所述GlcNAc连接。
116.如权利要求87-115中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*'包含核糖核苷酸二磷酸。
117.如权利要求87-116中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*’包含二磷酸尿苷(UDP)、二
磷酸鸟苷(GDP)或二磷酸胞苷(CDP)。
118.如权利要求87-117中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*'是GDP-Fuc*’。
119.如权利要求87-119中任一项所述的方法，其中所述Fuc*的MOI’包含活性部分。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述MOI’的所述活性部分包含化学活性部分、酶促活性部分、生物活性部分和/或药学活性部分。
121.如权利要求119-120中任一项所述的方法，其中所述MOI’的所述活性部分包含化学活性部分和/或酶促活性部分。
122.如权利要求119-121中任一项所述的方法，其中所述MOI’的所述活性部分包含能够参与连接反应的官能团Y1。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述Y1包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
124.如权利要求122-123中任一项所述的方法，其中所述Y1包含选自以下组的功能性部分：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
125.如权利要求122-124中任一项所述的方法，其中所述Y1包含选自以下组的功能性部分：
126.如权利要求122-125中任一项所述的方法，其中所述Y1包含选自以下组的功能性部分：
127.如权利要求87-126中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述Q-Fuc*'与所述蛋白质接触以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Q-Fuc*'是Q-Fuc-(F)m-(L)n-Y1，Fuc是所述Fuc*’的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，L是连接子，Y1是官能团，b是0或1，m是0或1，n是0或1。
128.如权利要求127所述的方法，其中m是1并且n是0。
129.如权利要求119-120中任一项所述的方法，其中所述MOI的所述活性部分包含P，并且P是生物和/或药学活性物质。
130.如权利要求87-120和129中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述Q-Fuc*'与所述蛋白质接触以获得蛋白质偶联物，所述蛋白质偶联物包含
其中Q-Fuc*'是Q-Fuc-(F)m-(L)n-P，Fuc是所述Fuc*'的岩藻糖或岩藻糖衍生物，F是接头，并且L是连接子，b是0或1，m是0或1并且n是0或1。
131.如权利要求130所述的方法，其中m是1并且n是1。
132.如权利要求131所述的方法，其中m是1并且n是0。
133.如权利要求87-132中任一项所述的方法，其还包括步骤(b)：使所述包含
的蛋白质偶联物与Y2-(FL’)m’-(L’)n’-P接触以获得包含
的蛋白质偶联物，其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是官能团Y1与包含能够与Y1反应的功能性部分的官能团Y2之间的连接反应后的剩余基团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，B是0或1，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1，并且P是生物和/或药学活性物质。
134.如权利要求133所述的方法，其中m是1，n是0，m’是1以及n’是1。
135.如权利要求133所述的方法，其中m是1，n是0，m’是1以及n’是0。
136.如权利要求129-135中任一项所述的方法，其中所述P是药学活性物质。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、放射性同位素或放射性核素、金属螯合剂、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质或其任意组合。
138.如权利要求136-137中任一项所述的方法，其中所述P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂、抗病毒剂、抗菌剂、寡核苷酸、肽、多肽或其任意组合。
139.如权利要求136-138中任一项所述的方法，其中所述P包含细胞毒素、激动剂、拮抗剂或其任意组合。
140.如权利要求136所述的蛋白质偶联物，其中所述P包含抗肿瘤剂。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述P包含导致细胞损伤或细胞死亡的物质。
142.如权利要求136-141中任一项所述的方法，其中所述P包含细胞毒素。
143.如权利要求142所述的方法，其中所述P包含选自以下组的细胞毒素：DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂和微管抑制剂。
144.如权利要求142-143中任一项所述的方法，其中P包含选自以下组的细胞毒素：吡咯并苯二氮卓、奥瑞他汀、美登素、多卡霉素、微管溶素、烯二炔、多柔比星、基于吡咯的驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂、卡利奇霉素、鹅膏蕈碱、喜树碱。
145.如权利要求142-144中任一项所述的方法，其中所述P包含选自以下组的细胞毒素：MMAE、DXd、MMAF、seco-DUBA和DM4。
146.如权利要求127-145中任一项所述的方法，其中所述L是可切割的连接子。
147.如权利要求127-146中任一项所述的方法，其中所述L是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或蛋白水解可切割的连接子。
148.如权利要求127-147中任一项所述的方法，其中所述L是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
149.如权利要求133-148中任一项所述的方法，其中所述L’是可切割的连接子。
150.如权利要求133-149中任一项所述的方法，其中所述L’是酸不稳定连接子、氧化还原活性连接子、光活性连接子和/或蛋白水解可切割的连接子。
151.如权利要求133-150中任一项所述的方法，其中所述L’是vc-PAB连接子、GGFG连接子或二硫键连接子。
152.如权利要求127-151中任一项所述的方法，其中所述接头F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1，任选地s是1。
153.如权利要求127-152中任一项所述的方法，其中所述接头F是
其中所述FL是间隔子，并且s是0或1，任选地s是1。
154.如权利要求127-153中任一项所述的方法，其中所述接头F是
其中所述FL是间隔子，s是0或1，任选地s是1。
155.如权利要求152-154中任一项所述的方法，其中所述间隔子FL是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
156.如权利要求152-155中任一项所述的方法，其中所述间隔子FL选自以下组：
157.如权利要求133-156中任一项所述的方法，其中所述间隔子FL’是多肽、PEG、烷基和/或其衍生物或以上的组合。
158.如权利要求133-157中任一项所述的方法，其中所述间隔子FL’选自以下组：
159.如权利要求133-158中任一项所述的方法，其中所述Y2包含能够参与生物正交反应的功能性部分。
160.如权利要求133-159中任一项所述的方法，其中所述Y2包含选自以下组的功能性部分：叠氮、末端炔、环状炔、四嗪、1,2,4-三嗪、末端烯、反式环辛烯、环丙烯、降冰片烯、酮、醛、氨氧基、硫醇、马来酰亚胺及它们的衍生物。
161.如权利要求133-160中任一项所述的方法，其中所述Y2包含选自以下组的功能性部分：
162.如权利要求133-161中任一项所述的方法，其中所述Y2包含选自以下组的功能性部分：
163.如权利要求133-162中任一项所述的方法，其中所述剩余基团Y1Y2选自以下组：
164.如权利要求133-163中任一项所述的方法，其中所述Y1和所述Y2包含选自以下组的功能性部分：
a)Y1包含
并且Y2包含
b)Y1包含
并且Y2包含
c)Y1包含
并且Y2包含
以及
d)Y1包含
并且Y2包含
其中所述R1和R2是如上定义的。
165.如权利要求87-127中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*’具有
的结构，其中所述F是接头，L是连接子，Y1是官能团，m是0或1并且n是0或1，任选地m是1以及n是0。
166.如权利要求165所述的方法，其中所述Q-Fuc*’选自以下组：
167.如权利要求165所述的方法，其中所述Q-Fuc*’如下式所示
168.如权利要求167所述的方法，其中所述Q-Fuc*'选自以下组：
169.如权利要求87-120和129-132中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*’具有
的结构，其中所述F是接头，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1以及n是0或1，任选地m是1以及n是1。
170.如权利要求169所述的方法，其中Q-Fuc*'选自以下组：
171.如权利要求169所述的方法，其中所述Q-Fuc*具有
的结构，其中所述FL是间隔子，L是连接子，P是生物和/或药学活性物质，s是0或1以及n是0或1，任选地s是1以及n是1，任选地s是1以及n是0。
172.如权利要求171所述的方法，其中所述P是药学活性物质。
173.如权利要求171-172中任一项所述的方法，其中所述P是细胞毒素。
174.如权利要求171-173中任一项所述的方法，其中所述Q-Fuc*’选自以下组：
175.如权利要求87-174中任一项所述的方法，其中所述Fuc如下式所示
并且Fuc*'如下式所示
176.如权利要求87-175中任一项所述的方法，其中在蛋白质偶联物中，所述Fuc*’的所述岩藻糖或岩藻糖衍生物通过Fuc*’α1,3键联与所述GlcNAc连接。
177.如权利要求87-176中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含1至20个-GlcNAc(Fuc)b-Gal。
178.如权利要求87-177中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含2个或4个-GlcNAc(Fuc)b-Gal。
179.如权利要求87-97和99-178中任一项所述的方法，其中所述包含所述寡糖的蛋白质是如下式所示
180.如权利要求87-97和99-179中任一项所述的方法，其中所述蛋白质偶联物包含4个
或4个
或4个
其中，Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义为的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1以及n’是0或1。
181.如权利要求87-98和101-178中任一项所述的方法，其中所述包含所述寡糖的蛋白质如下式所示
182.如权利要求87-98、101-178和181中任一项所述的方法，其中所述蛋白质偶联物包含2个
或2个
或2个
其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，m是0或1，n是0或1，m’是0或1，n’是0或1。
183.如权利要求87-98、101-178和181中任一项所述的方法，其中所述蛋白质偶联物包含2个
2个
或2个
其中Fuc是岩藻糖或岩藻糖衍生物，Y1Y2是剩余基团，Y1是官能团，L是连接子，F是接头，L’是与L相同定义的连接子，FL’是与FL相同定义的间隔子，P是生物和/或药学活性物质，(Fuc)是通过α1,6键联与GlcNAc连接的岩藻糖，m是0或1，n是0或1，m’是0或1以及n’是0或1。
184.如权利要求87-183中任一项所述的方法，其还包括步骤(c)：在催化剂存在的情况下使包含含有-GlcNAc(Fuc)b的寡糖的蛋白质与UDP-半乳糖接触，以获得所述含有-GlcNAc(Fuc)b-Gal的蛋白质，其中Gal是半乳糖，(Fuc)是岩藻糖以及b是0或1。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述催化剂是β1,4-半乳糖基转移酶或其功能变体或片段。
186.如权利要求184-185中任一项所述的方法，其中所述催化剂是人β1,4-半乳糖基转移酶、牛β1,4-半乳糖基转移酶或其功能变体或片段。
187.如权利要求184-186中任一项所述的方法，其中所述催化剂是具有Y285L突变的人β(1,4)-GalT1或具有Y289L突变的牛β(1,4)-GalT1。
188.如权利要求184-187中任一项所述的方法，其中所述催化剂包含如SEQ ID NO:1、2和16中的任一个所示的氨基酸。
189.如权利要求184-188中任一项所述的方法，其中所述步骤(c)在步骤(a)之前。
190.如权利要求184-189中任一项所述的方法，其在步骤(c)与步骤(a)之间的不包含纯化过程。
191.如权利要求184-190中任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(c)在同一反应容器中进行。
192.如权利要求184-188和190-191中任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(c)同时进行。
193.如权利要求87-192中任一项所述的方法，其还包括步骤(d)将包含寡糖的蛋白质修饰为包含核心-((Fuc)α1,6)b GlcNAc的蛋白质，其中b是0或1。
194.如权利要求193所述的方法，其中所述步骤(d)在内切糖苷酶或其功能变体或片段存在的情况下进行。
195.如权利要求193-194所述的方法，其中所述步骤(d)在EndoS或其功能变体或片段存在的情况下进行。
196.如权利要求195所述的方法，其中所述EndoS包含如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17中所示的氨基酸。
197.如权利要求193-196所述的方法，其中所述步骤(d)在所述步骤(c)之前。
198.如权利要求87-197中任一项所述的方法，其还包括步骤(e)：将包含核心-((Fuc)α1,6)GlcNAc的蛋白质修饰为包含核心-GlcNAc的蛋白质。
199.如权利要求198所述的方法，其中步骤(e)在核心-α1,6岩藻糖苷酶或其功能变体或片段存在的情况下进行。
200.如权利要求199所述的方法，其中所述核心-α1,6岩藻糖苷酶是Alfc或其功能变体或片段。
201.如权利要求200所述的方法，其中所述Alfc包含如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18中所示的氨基酸。
202.如权利要求198-201中任一项所述的方法，其中步骤(e)在步骤(d)之后且在步骤(c)之前进行。
203.如权利要求198-202中任一项所述的方法，其中步骤(d)和步骤(e)同时进行。
204.如权利要求198-203中任一项所述的方法，其中步骤(d)和步骤(e)在同一反应容器中进行。
205.如权利要求198-204中任一项所述的方法，其在步骤(a)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)之间的不包含纯化过程。
206.如权利要求198-205中任一项所述的方法，其中步骤(a)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)在同一反应容器中进行。
207.如权利要求87-206中任一项所述的方法，其中所述蛋白质偶联物是用于治疗疾病的蛋白质偶联物。
208.如权利要求87-207中任一项所述的方法，当所述MOI’包含Y1时，其中所述蛋白质偶联物用于制备疾病治疗试剂。
209.一种用于制备组合物的方法，其中所述组合物包含权利要求87-208中任一项所述的蛋白质偶联物。
210.如权利要求209所述的组合物的制备方法，其中包含权利要求87-97、99-180和184-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为2.4-4。
211.如权利要求210所述的组合物的制备方法，其中包含权利要求87-97、99-180和184-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为3.2-4。
212.如权利要求210-211中任一项所述的组合物的制备方法，其中包含如权利要求87-97、99-180和184-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为3.5-4。
213.如权利要求210-212中任一项所述的组合物的制备方法，其中包含如权利要求87-97、99-180和184-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为4。
214.如权利要求209所述的组合物的制备方法，其中包含权利要求87-98、101-178和181-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为0.5-2。
215.如权利要求214所述的组合物的制备方法，其中包含权利要求87-98、101-178和181-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为1.5-2。
216.如权利要求214-215中任一项所述的组合物的制备方法，其中包含如权利要求87-98、101-178和181-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为1.8-2。
217.如权利要求214-216中任一项所述的组合物的制备方法，其中包含如权利要求87-98、101-178和181-208中任一项所述的蛋白质偶联物的所述组合物的平均MAR约为2。
218.一种蛋白质偶联物，其是通过根据权利要求87-208中任一项所述的方法获得的。
219.一种组合物，其是通过根据权利要求209-217中任一项所述的方法获得的。
220.一种药物组合物，其包含权利要求1-77和218中任一项所述的蛋白质偶联物，以及任选的药学上可接受的载体。
221.一种药物组合物，其包含权利要求78-85和219中任一项所述的组合物，以及任选的药学上可接受的载体。
222.一种用于预防或治疗疾病的方法，其包括施用权利要求1-77和218中任一项所述的蛋白质偶联物和/或权利要求220所述的药物组合物。
223.一种用于预防或治疗疾病的方法，其包括施用权利要求78-85和219中任一项所述的组合物和/或权利要求221所述的药物组合物。
224.如权利要求1-77、218中任一项所述的蛋白质偶联物和/或如权利要求220所述的药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。
225.如权利要求78-85、219中任一项所述的蛋白质偶联物和/或如权利要求221所述的药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。
226.如权利要求1-77、218中任一项所述的蛋白质偶联物，其具有一种或多种下列性质：
(1)具有为2或4的MAR，
(2)能够与抗原结合，
(3)能够以与其相应抗体相似的结合亲和力与抗原结合，
(4)如质谱分析中所测量的，在血浆中稳定至少1天，
(5)如质谱分析中所测量的，Fuc*的Fuc与-GlcNAc(Fuc)b-Gal的GlcNAc之间的键联在血浆中稳定至少1天，b是0或1，
(6)具有高反应活性，并且/或者
(7)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
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