CN115896142A - 黑牡丹pepc基因序列及其在基于kasp的黑牡丹鉴别中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分类鉴定学领域，特别是涉及分子鉴定方法领域，更为具体的说是涉及黑牡丹PEPC基因序列及其在基于KASP的黑牡丹鉴别中的应用。本发明获得了黑牡丹的PEPC基因，并且发现该PEPC基因具有鉴定黑牡丹的特异性SNP位点。通过设计KASP特异性引物，从而能够准确将黑牡丹与其他同属近缘种区分。通过本试验所设计的引物可以形成明显的基因分型，可以准确鉴定黑牡丹。
Description
技术领域
本发明涉及分类鉴定学领域，特别是涉及分子鉴定方法领域，更为具体的说是涉及黑牡丹PEPC基因序列及其在基于KASP的黑牡丹鉴别中的应用。
背景技术
黑牡丹Ariocarpus kotschoubeyanus属仙人掌科岩牡丹属，原产墨西哥。在世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录中被评为“濒危”级别，同时被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅰ，除有国家机关证明为非商业进出口行为，禁止一切国际间的植株贸易。
黑牡丹属于岩牡丹属内小型品种，形态奇特，花色鲜艳，似岩石却有生命，是受植物爱好者追捧的品种。海关各口岸每年都会查获大量非法入境的濒危植物黑牡丹。
目前对黑牡丹的鉴定以形态学为主，但是形态学鉴定需要有经验的专业鉴定人员。且岩牡丹属中黑牡丹与其他品种在形态上比较相似，特别是黑牡丹幼株与本属其他种类幼株形态上相似度极高，难以区别，加之本属种子较小形态上更加难以鉴定，因此急需开发新的鉴定方法用于快速准确鉴定黑牡丹，为海关口岸查验工作提供技术支撑，对保护濒危野生动植物保护具有重要意义。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)普遍分布在植物基因组中，被广泛应用于性状基因的精细定位、分子辅助育种等。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele-specific PCR，KASP)技术是近些年来发展起来的一种主要基于SNP的高通量基因分型技术。该技术的核心点在于找到稳定的SNP位点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种黑牡丹的生物学鉴定方法，从而缓解对形态鉴定专家的依赖性，为海关口岸黑牡丹的鉴定提供支持。
为了解决上述技术问题，本发明公开了黑牡丹PEPC基因序列，所述PEPC基因序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，本发明还公开了所述黑牡丹PEPC基因序列在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。
同时，在本发明中还公开了一种检测黑牡丹PEPC基因序列中的SNP位点的物质在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用，并限定所述SNP位点为PEPC基因序列中第319号核酸位点，其碱基为C。
进一步地，上述物质为如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1、如SEQ IDNO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2以及如SEQ ID NO:4所述的反向引物PCC-A-kot-r1组成的引物组合。
在本发明中还公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1、如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2以及如SEQ ID NO:4所述的反向引物PCC-A-kot-r1。
并进一步公开了上述试剂盒在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。
最后，在本发明中还公开了一种鉴别或辅助鉴别黑牡丹的方法，包括如下步骤：对待检测样品基因DNA进行PCR扩增，得到待检测PCR扩增产物；然后对PCR扩增产物进行KASP反应，并根据基因分型结果，确定其是否为黑牡丹。当样品结果靠近横轴，则结果为阳性，表明样品种类为黑牡丹(Ariocarpus kotschoubeyanus)；当结果没有出现明显的基因分型簇，检测结果均在纵轴，则结果是阴性，表明样品中不是黑牡丹(Ariocarpuskotschoubeyanus)
并且，进一步在本发明中还公开所述KASP反应采用核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1、如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2以及如SEQID NO:4所述的反向引物PCC-A-kot-r1组成的引物组合。
进一步地，所述如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1的5′端加上GAAGGTGACCAAGTTCATGCT接头序列、如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2的5’端加上GAAGGTCGGAGTCAACGGATT接头序列。
本发明获得了黑牡丹的PEPC基因，并且发现该PEPC基因具有鉴定黑牡丹的特异性SNP位点。利用KASP基因分型技术，通过设计KASP特异性引物，从而能够准确将黑牡丹与其他同属近缘种区分开来。通过本试验所设计的引物可以形成明显的基因分型，可以准确鉴定黑牡丹，实现特异性鉴定黑牡丹的技术目的。
附图说明
图1为利用SNP位点对应的引物，对16份试验材料进行KASP基因分型技术的检测图谱。
图2为SNP位点示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明均为常规实验操作方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1黑牡丹PEPC基因序列的获取
收集岩牡丹属6种13份以及3份仙人掌科共16份试验材料。试验材料来自江苏南京(南京中山植物园)和海关口岸查获，均由相关专家鉴定，采集新鲜植物组织或花瓣进行试验。样品的详细信息见表1。
表1植物材料及来源
先将供试样品进行表面消毒，用液氮将植物叶片研磨成粉，参照DNeasy PlantMini Kit试剂盒说明书上的步骤方法，提取实验样品基因组DNA。
提取基因组DNA放4℃保存备用。
设计用于扩增岩牡丹属PEPC序列的引物PPC-Ar1F和PPC-Ar2R，引物序列及反应条件见表2；；扩增体系为25μL:Takara rTap酶11μL，引物各0.5μL，模版2μL，灭菌水补足反应体系至25μL。在Takara PCR扩增仪上对提取基因组DNA分别进行扩增反应，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。使用DNASTAR Lasergene软件包中的Seqman程序对测序获得序列进行组装和校对，去除低质量区和引物区，获得岩牡丹属的PEPC序列。
表2所用引物序列及相应PCR反应条件
实施例2SNP位点的开发
使用BioEdit软件比对实施例1中获得的6种岩牡丹属植物PEPC序列，发现在319号核苷酸位点上，黑牡丹存在稳定的SNP位点胞嘧啶(C)，而其他样品该位点均为鸟嘌呤(T)，如图2所示。该位点符合SNP要求，能够用于后续基于PCR引物的开发、黑牡丹基因分型以及黑牡丹鉴别和辅助鉴别。
针对该SNP位点，按照LGC KASPgenotyping试剂盒的使用说明，结合引物设计软件Primer 5设计了特异性的黑牡丹KASP反应引物，引物序列见表3，正向引物PCC-A-fis-f1-1序列的5′端加上接头序列5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′；
正向引物PCC-A-fis-f1-2的序列5′端加上接头序列5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′。
表3黑牡丹KASP技术检测引物
注:□标注的是对应的用于物种鉴定的SNP位点
实施例3KASP检测
将引物PCC-A-kot-f1-1、PCC-A-kot-f1-2、PCC-A-kot-r1浓度分别调整为36μM、36μM、90μM，并按体积比1:1:1配制成引物混合液。
反应体系为：取DNA(调整浓度为5ng.μL-1)5μL，KASP master mix 5μL，Primer mix0.14μL，使用PCR反应板进行KASP，每个反应两个重复；将5.0μL模板DNA替换成5.0μL灭菌双蒸水作为阴性对照(NTC)，操作步骤和反应条件与其它样品一致。
反应程序参照KASP试剂盒说明书进行设置，简述如下:94℃预变性15min；第一步扩增反应:94℃变性20s，61℃-55℃梯度退火并延伸60s(每个循环降低0.6℃)，10个循环；第二步扩增反应:94℃变性20s，55℃退火并延伸60s，26个循环。
以16份供试样品的DNA为模板，利用引物混合液与所述试剂配置成反应液。按编号装入96孔PCR板中，用于扩增检测。
在7500FAST实时荧光定量PCR系统进行KASP反应，按照设定反应条件进行扩增，观察反应体系的特异性。
结果如图1所示。
结合图1可以看到，PEPC序列的SNP位点分子标记能够清晰地将黑牡丹与岩牡丹属其他种进行基因分型；出现在X轴附近的红色圆点是黑牡丹的基因型，Y轴附近的绿色圆点是5种同属近缘种基因型及2种仙人掌科物种花笼、菊水的基因型，坐标轴附近的蓝色圆点是仙人掌科物种乌羽玉的基因型，黑色标记是ddH2O空白对照。通过本试验所设计的引物可以形成明显的基因分型，准确的鉴定黑牡丹，并将其与同属近缘种及其他仙人掌科物种进行区分。需要说明的是，在图1中Y轴上绿色点和蓝色点的两次实验因重复性好，结果较一致，结果有重合。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.黑牡丹PEPC基因序列，其特征在于:所述PEPC基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的黑牡丹PEPC基因序列在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。
3.一种检测黑牡丹PEPC基因序列中的SNP位点的物质在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用，其特征在于，所述SNP位点为PEPC基因序列中第319号核酸位点，其碱基为C。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述物质为如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1、如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2以及如SEQ ID NO:4所述的反向引物PCC-A-kot-r1组成的引物组合。
5.一种试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1、如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2以及如SEQ ID NO:4所述的反向引物PCC-A-kot-r1。
6.权利要求5所述的PCR试剂盒在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。
7.一种鉴别或辅助鉴别黑牡丹的方法，包括如下步骤：对待检测样品基因DNA进行PCR扩增，得到待检测PCR扩增产物；然后对PCR扩增产物进行KASP反应，并根据基因分型结果，确定其是否为黑牡丹。
8.根据权利要求7所述的鉴别或辅助鉴别黑牡丹的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1、如SEQ ID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2以及如SEQ ID NO:4所述的反向引物PCC-A-kot-r1组成的引物组合。
9.根据权利要求7所述的鉴别或辅助鉴别黑牡丹的方法，其特征在于：所述如SEQ IDNO:2所示的正向引物PCC-A-kot-f1-1的5′端加上GAAGGTGACCAAGTTCATGCT接头序列、如SEQID NO:3所示的正向引物PCC-A-kot-f1-2的5’端加上GAAGGTCGGAGTCAACGGATT接头序列。
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