CN115896115A - 靶向npm蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向NPM蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用。本发明公开了四个靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列,亲和性高、特异性强,动物实验显示其具有抗肿瘤生长、抑制肝纤维化等功能。因此,本发明极具应用价值。本发明通过双分子荧光互补技术,从高通量文库中筛选获得了靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子;利用免疫共沉淀技术,确定了能靶向结合NPM蛋白的特异肽适配子;利用靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列,体外合成了能透膜进入细胞的小分子多肽药物sp10和sp177;利用肝癌细胞的皮下移植瘤技术,确证了sp10具有抗肿瘤生长的作用;利用肝星状细胞模型和肝纤维化小鼠模型,证实了sp177具有抑制肝星状细胞迁移能力、抑制小鼠肝纤维化进展的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及到筛选和确定靶向结合NPM蛋白的具有抗肿瘤作用或抗肝纤维化作用的肽适配子。
背景技术
双分子荧光互补技术是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中定位和相互作用的技术,该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达。如果荧光蛋白活性恢复,则表明两目标蛋白发生了相互作用。该技术已用于不同蛋白间相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作。
适配子技术是指利用筛选的适配子对靶标进行定位、检测和功能生物学研究的技术。适配子具有长的半衰期、无毒且能通过无免疫原性的靶分子筛选获得的特性,而且它们也可以很容易通过化学合成或表达系统产生。肽适配子是指从随机蛋白表达文库中筛选针对蛋白质靶标的短肽分子,这些从高容量的文库中筛选获取的短肽分子能特异地与靶标结合,从而影响靶标的功能,可应用于靶标及其复合物功能的干预研究。经典的肽适配子筛选主要通过酵母双杂交技术从随机肽表达文库中筛选获得。为了稳定源自于随机表达文库的肽适配子的构象,可将一系列编码肽适配子的可变阅读框架插入至一个支架蛋白框架(通常是细菌的硫氧还蛋白)以形成融合蛋白,借此,融合的肽适配子能形成特定的蛋白构象以利于肽适配子和靶分子之间的相互结合。
NPM蛋白(核仁磷酸蛋白)是一个强大的增殖促进因子,在多个肿瘤的恶性进程(如肿瘤发生、肿瘤细胞增殖,迁移,侵袭转移,肿瘤干细胞特性维持、化疗药物抗性等)具有促进作用。因此,获得能靶向该蛋白的小分子药物不仅可以为NPM蛋白功能分析提供一个有效工具,而且经过修饰,可能由此获得能对特定肿瘤、肝纤维化等细胞增殖相关疾病具有一定疗效的肽适配子药物。
发明内容
本发明的目的是提供靶向NPM蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用,提供了一组能靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列,进而合成能抑制细胞增殖相关疾病的肽适配子药物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是:
靶向NPM蛋白的肽适配子,包括S10、S34、S140或S177中的至少一种;其中:
S10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,S10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
S34的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,S34的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;
S140的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,S140的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示;
S177的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,S177的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
具体地,本发明鉴定出的四种能靶向NPM蛋白的肽适配子,其编号、核苷酸序列和氨基酸序列分别如下:
编号 | 核苷酸序列 | 肽适配子的肽段序列 |
S10 | TTCTTAATTTTTTCTTATTTTTTATTTTTTTCG | FLIFSYFLFFS |
S34 | TGTGCACGTTTTTTAGGTATATCTTTTTTTTTG | CARFLGISFFI |
S140 | CTCACATACATTCTTTTAGTTTTTTCTTCTGTG | LTYILLVFSSV |
S177 | TTTTTGCATACTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTG | FLHTNVFFFFL |
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是:
多肽,包括sp10或sp177中的至少一种;其中:
所述多肽sp10的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示,即:
YGRKKRRQRRRCGPVWFLIFSYFLFFSISLARGPC(C12-C35);第12和第35个氨基酸(半胱氨酸)进行交联;
所述多肽sp177的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示,即:
YGRKKRRQRRRCGPVWFLHTNVFFFFLISLARGPC(C12-C35);第12和第35个氨基酸(半胱氨酸)进行交联。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是:
本发明鉴定出的靶向NPM蛋白的肽适配子(尤其是编号S10、S177)及其体外合成的小分子肽sp10、sp177具有抗增殖性细胞生长活性。因此,本发明同时提供了:
所述靶向NPM蛋白的肽适配子S10、S34、S140或S177在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。
所述的多肽sp10或多肽sp177在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。
具体地,所述NPM蛋白相关疾病包括肿瘤,例如肝癌等。
具体地,所述NPM蛋白相关疾病还包括肝纤维化。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是:
一种靶向NPM蛋白的肽适配子的筛选鉴定方法,利用基于双分子荧光互补的肽适配子文库,以pBiFc-VN173-NPM为靶标,筛选获得靶向结合NPM的候选肽适配子;通过表达载体构建和免疫共沉淀技术,从候选肽适配子中鉴定能特异高亲和结合NPM的肽适配子;利用体外合成方法,合成含有肽适配子序列的小分子多肽药物;通过体内或体外实验验证其活性,例如利用肝癌细胞的皮下移植瘤实验,鉴定了含有肽适配子的小分子多肽药物的抗肿瘤作用。
其中,利用克隆技术和载体构建技术,将经过PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的NPM开放阅读框定向插入至pBiFc-VN173中,获得pBiFc-VN173-NPM表达载体。
其中,所述的靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子,统称为TrxA-peptide-TrxA,peptide为包含11个随机氨基酸的短肽,特别指上述四种不同的肽适配子的氨基酸序列,通过位于TrxA中的半胱氨酸形成二硫键,以形成固定的构象,特异短肽位于TrxA表达框中。
其中,利用体外合成技术,合成了含有该肽适配子序列的小分子多肽药物,用于NPM表达导致的细胞增殖相关的疾病治疗。
在本发明的一个具体的实施例中,靶向NPM蛋白的肽适配子筛选和功能鉴定方法,包括以下步骤:
1)应用设计引物,以双分子荧光互补获取的候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA为模板,对TrxA-peptide-TrxA进行高保真PCR扩增;
2)利用酶切连接方法将候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA转移入pcDNA3.1-myc-HisC表达载体,获得pcDNA3.1-myc-HisC-TrxA-peptide-TrxA表达载体;
3)利用酶切连接方法将NPM转移入pcDH-Puro表达载体,获得pcDH-Puro-NPM表达载体;
4)利用共转染方法,以分组形式分别将pcDNA3.1-myc-His-C-TrxA-peptide-TrxA和pcDH-Puro-NPM转染入HEK293T细胞,利用Flag抗体进行免疫共沉淀并联合利用Myc标签抗体鉴定,获得能特异高亲和结合NPM蛋白的肽适配子;
5)利用化学合成方法将候选肽适配子进行体外合成,并在两端加上骨架序列,N端加上透膜肽序列,合成小分子多肽药物;通过体内或体外实验验证其活性。
例如,以候选肽适配子S10的序列(SEQ ID No.1,SEQ ID No.2)为基础合成了小分子多肽药物sp10,序列如下(SEQ ID No.9):YGRKKRRQRRRCGPVWFLIFSYFLFFSISLARGPC(C12-C35);第12和第35个氨基酸(半胱氨酸)进行交联。利用皮下移植瘤技术,将肝癌细胞系SK-HEP-1细胞进行小鼠的皮下移植瘤种植,待肿瘤形成后,进行sp10药物的瘤体注射,每三天一次,每次100μL(浓度为50μM);每三天测量一次肿瘤体积,分析肽适配子药物sp10对肿瘤生长的抑制作用。
又如,以候选肽适配子S177的序列(SEQ ID No.7,SEQ ID No.8)为基础合成了小分子多肽药物sp177,序列如下(SEQ ID No.10):YGRKKRRQRRRCGPVWFLHTNVFFFFLISLARGPC(C12-C35);第12和第35个氨基酸(半胱氨酸)进行交联。利用细胞实验和小鼠体内实验验证了sp177具有抗肝纤维化活性。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等,除有特别说明外,均为常规设备、试剂、工艺、参数等,不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明的有益效果在于:
(1)构建了pBiFc-VN173-NPM表达载体,NPM蛋白与VENUS蛋白的1-172氨基酸残基进行融合表达;
(2)利用双分子荧光互补技术,从高容量的肽适配子表达文库中筛选获得了4个靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子;
(3)构建了pcDNA3.1-myc-His-C-TrxA-peptide-TrxA、pcDH-Puro-NPM表达载体,使目标蛋白与Flag或Myc标签蛋白进行融合表达;
(4)在测序结果正确的基础上,利用去内毒素质粒抽提试剂盒将相应的表达载体进行抽提,将它们按组合的方式共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀结果表明,有四种肽适配子能与NPM蛋白特异并高亲和结合,肽适配子的氨基酸序列为:FLIFSYFLFFS(编号S10),CARFLGISFFI(编号S34),LTYILLVFSSV(编号S140),FLHTNVFFFFL(编号S177)。
(5)利用靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列,体外合成了具有透膜进入细胞的小分子多肽药物sp10和sp177。
(6)利用肝癌细胞的皮下移植瘤技术,确证了靶向NPM蛋白的肽适配子药物sp10具有抗肿瘤生长的作用。
(7)利用肝星状细胞和肝纤维化小鼠模型,证实了sp177具有抑制肝星状细胞迁移能力、抑制小鼠肝纤维化进展的作用。
附图说明
图1为双分子荧光互补筛选与NPM蛋白特异结合的肽适配子示意图。
图2为免疫共沉淀鉴定与NPM蛋白特异结合的肽适配子示意图(肽适配子S10、S34、S140和S177在图2中分别记为S-10、S-34、S-140和S-P177)。
图3为皮下移植瘤实验揭示靶向NPM蛋白的肽适配子药物sp10具有抗肿瘤生长作用的示意图(肽适配子药物sp10在图3中记为sp-10)。
图4中A为细胞实验验证sp177具有抑制小鼠肝星状细胞系JS-1迁移能力的作用,B为四氯化碳(CCL4)诱导的小鼠纤维化肝组织的免疫印迹(Western blot)实验验证sp177具有抑制肝纤维化标志物α-SMA、I型胶原和TGF-β2蛋白表达的作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行描述。显然,以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例,本领域所获得的涉及本发明揭示的肽适配子序列及体外合成肽适配子药物的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中的实验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂销售店获取。以下实施例中的定量实验,均设置为独立的三次重复实验,结果取平均值。
本发明实施例涉及的序列如表1所示:
表1本发明实施例涉及的序列汇总
实施例1
基于双分子荧光互补技术的NPM融合表达载体构建和特异肽适配子筛选包括以下步骤:
1)pBiFc-VN173-NPM表达载体构建:以人肝星状细胞系LX-2的RNA反转录的cDNA为模板,设计引物对NPM基因进行高保真PCR扩增,并使用限制性内切酶EcoRI和KpnI对扩增产物进行酶切后,将其插入pBiFc-VN173载体,以形成pBiFc-VN173-NPM表达载体。
扩增引物序列如下:
正向引物(SEQ ID No.12):5’-cgcgaattcagaagattcgatggacatggaca-3’(5’末端为EcoRI酶切位点);
反向引物(SEQ ID No.13):5’-actggtaccgaaagagacttcctccactgcc-3’(末端为KpnI酶切位点)。
经酶切鉴定和测序结果表明:获得了预期的表达NPM靶标并可用于双荧光互补的载体(图1)。
PCR反应条件如下:
反应体系
2)使用去内毒素质粒提取试剂盒抽提测序正确的pBiFc-VN173-NPM。随机挑取若干个肽适配子文库质粒pBiFc-VC155-TrxA-peptide-TrxA,使用Sofast转染试剂,将10ng随机挑取的pBiFc-VC155-TrxA-peptide-TrxA文库质粒及10ng pBiFc-VN173-NPM载体分别形成若个不同组合共转染于96孔板的HEK293T细胞中。
pBiFc-VC155-TrxA-peptide-TrxA文库质粒构建过程如下:
人工合成TrxA蛋白的部分编码区的核苷酸序列,并在TrxA蛋白的Pro-Val-Cys-Trp序列之后,插入11个随机的氨基酸的序列(通过随机合成33个核苷酸的方式)。将上述合成的编码序列片段(命名为TrxA-peptide-TrxA),通过分子生物学方法,插入pBiFC-VC155质粒(来自Addgene)的VC155蛋白编码区前面(HA标签序列之后),形成重组蛋白序列,从而构建了文库质粒pBiFC-VC155-TrxA-peptide-TrxA。
3)将转染的HEK293T细胞放置于细胞培养箱中培养24小时后,在荧光显微镜下观察到荧光的出现。初步结果表明其中4个肽适配子能特异与NPM蛋白特异结合,从而快速初步筛选获得靶向特异结合NPM蛋白的肽适配子(图1),候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA中peptide相应的氨基酸序列见表2,列表中序列不包含侧翼的TrxA序列。
表2与NPM蛋白特异结合的候选肽适配子的测序结果及氨基酸序列
实施例2
靶向结合NPM蛋白的肽适配子的鉴定包括以下步骤:
1)用于表达候选肽适配子的真核表达载体构建【TrxA-peptide-TrxA-Myc,peptide指11个氨基酸的短肽】
设计特异引物对TrxA-peptide-TrxA进行高保真PCR扩增,peptide分别指S10,S34,S140,S177。使用限制性内切酶EcoRI和BamHI对扩增产物进行酶切后,将这4个候选肽适配子的酶切片段分别插入pcDNA3.1-myc-hisC载体中,获得pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-peptide-TrxA载体,这些载体可以表达与Myc标签序列融合表达的肽适配子,分别为pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S10-TrxA,pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S34-TrxA,pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S140-TrxA,pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S177-TrxA(图1)。
扩增引物序列如下:
正向引物(SEQ ID No.14):5’-CGCGGATCCGCCACCATGAGCGATAAAATTATTCAC-3’(末端为BamHI酶切位点);
反向引物(SEQ ID No.15):5’-CGGAATTCCCAGGTTAGC GTCGAGGAA-3’(末端为EcoRI酶切位点)。
PCR反应条件如下:
反应体系
2)用于表达NPM蛋白的真核表达载体构建(Flag-NPM)
设计特异引物对NPM进行高保真PCR扩增,使用限制性内切酶EcoRI和BamHI对扩增产物进行酶切后,将酶切片段插入pcDH-Puro载体,获得了Flag与NPM融合表达的pcDH-Puro-NPM表达载体,该载体表达的融合蛋白Flag-NPM用于后续的免疫共沉淀实验。
引物序列如下:
正向引物(SEQ ID No.16):5’-CGCGAATTCAGaagattcgatggacatg-3’(末端为EcoRI酶切位点);
反向引物(SEQ ID No.17):5’-GGCGGATCCTCAaagagacttcctccactgc-3’(末端为BamHI酶切位点)。
PCR反应条件如下:
反应体系
3)免疫共沉淀验证肽适配子与NPM蛋白的特异结合
将下述融合表达载体组合配对:
pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S10-TrxA和pCDH-Puro-NPM,
pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S34-TrxA和pCDH-Puro-NPM,
pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S140-TrxA和pCDH-Puro-NPM,
pcDNA3.1-myc-hisC-TrxA-S177-TrxA和pCDH-Puro-NPM。
分别使用转染试剂PEI将这两组载体共转入HEK293T细胞,收获蛋白并使用Flag标签抗体做免疫共沉淀,用Myc和Flag标签抗体做免疫印迹实验验证,由图2可知,NPM与四种肽适配子结合,尤其是和TrxA-S10-TrxA紧密结合。
实施例3
动物模型证实肽适配子药物sp10具有抗肿瘤生长作用的鉴定,包括以下步骤:
1)肽适配子药物sp10的体外合成。
由免疫沉淀实验结果显示,适配子序列s10和NPM蛋白具有高强度的结合作用。为此,本实施例利用体外化学合成多肽的方法,合成了一个小分子多肽sp10,序列如下(SEQID No.9):YGRKKRRQRRRCGPVWFLIFSYFLFFSISLARGPC(C12-C35)。其中YGRKKRRQRRR为透膜肽序列,FLIFSYFLFFS为s10肽适配子的氨基酸序列,s10两侧为骨架序列,其中12位和35位的半胱氨酸可进行氧化交联,将s10氨基酸的构型进行固定。同时合成未含有肽适配子序列的多肽分子,作为阴性对照多肽药物(Control),序列如下(SEQ ID No.11):YGRKKRRQRRRCGPVW-ISLARGPC(C12-C24)。
2)肝癌细胞移植瘤模型的构建
利用NSG小鼠,将肝癌细胞系SK-HEP-1细胞200万个与50μL的基质胶进行混合后(总体积100μL),进行皮下注射。待瘤体积生长至150~180立方毫米后,随机分组为对照组(control)和药物处理组(sp10)。
3)sp10注射和抗肿瘤作用鉴定
以含有20% DMSO的水溶液溶解sp10和对照小分子肽药物control。每三天对小鼠的肿瘤瘤体进行药物注射,每次100μL(浓度为50μM)。每次注射前用游标卡尺测量肿瘤的长宽,计算瘤体体积,绘制肿瘤体积的生长曲线(图3)。
实施例4
动物模型证实肽适配子药物sp177具有抗肝纤维化作用的鉴定,参考实施例3,利用体外化学合成多肽的方法,合成了一个小分子多肽sp177,序列如下(SEQ ID No.10):YGRKKRRQRRRCGPVW-FLHTNVFFFFL-ISLARGPC(C12-C35)。其中YGRKKRRQRRR为透膜肽序列,FLHTNVFFFFL为S177肽适配子的氨基酸序列,S177两侧为骨架序列,其中12位和35位的半胱氨酸可进行氧化交联,将氨基酸的构型进行固定。同时以SEQ ID No.11的阴性对照多肽药物(Control)作为对照,经过细胞实验验证sp177具有抑制肝星状细胞迁移能力的作用(图4中A),以四氯化碳(CCL4)诱导的小鼠肝纤维化模型实验验证sp177具有抑制肝纤维化标志物表达的作用(图4中B)。结果显示,多肽药物sp177具有抗肝纤维化活性。
以上所述,仅为本发明较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.靶向NPM蛋白的肽适配子,其特征在于:包括S10、S34、S140或S177中的至少一种;其中:
所述S10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述S10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述S34的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述S34的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;
所述S140的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述S140的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示;
所述S177的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,所述S177的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
2.权利要求1所述的靶向NPM蛋白的肽适配子在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。
3.多肽,其特征在于:所述多肽包括sp10或sp177中的至少一种;其中:所述sp10的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示;所述sp177的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
4.权利要求3所述的多肽在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。
5.根据权利要求2或4所述的应用,其特征在于:所述NPM蛋白相关疾病包括肿瘤或肝纤维化。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述NPM蛋白相关疾病包括肝癌。
7.一种靶向NPM蛋白的肽适配子的筛选鉴定方法,其特征在于:利用基于双分子荧光互补的肽适配子文库,以NPM蛋白为靶标,筛选获得靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子;通过表达载体构建和免疫共沉淀技术,从候选肽适配子中鉴定能特异高亲和结合NPM蛋白的肽适配子;体外合成含有所述肽适配子序列的小分子多肽药物,通过体内或体外实验验证其活性。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:利用克隆技术和载体构建技术,将经过PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的NPM开放阅读框定向插入至pBiFc-VN173中,获得pBiFc-VN173-NPM表达载体。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述的靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子为TrxA-peptide-TrxA,其中peptide为包含11个随机氨基酸的短肽,通过位于TrxA中的半胱氨酸形成二硫键,以形成固定的构象,肽适配子位于TrxA表达框中。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:包括:
1)应用设计引物,以双分子荧光互补获取的候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA为模板,对TrxA-peptide-TrxA进行高保真PCR扩增;
2)利用酶切连接方法将候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA转移入pcDNA3.1-myc-HisC表达载体,获得pcDNA3.1-myc-HisC-TrxA-peptide-TrxA表达载体;
3)利用酶切连接方法将NPM转移入pcDH-Puro表达载体,获得pcDH-Puro-NPM表达载体;
4)利用共转染方法,以分组形式分别将pcDNA3.1-myc-His-C-TrxA-peptide-TrxA和pcDH-Puro-NPM转染入细胞,利用Flag抗体进行免疫共沉淀并联合利用Myc抗体鉴定,获得能特异高亲和结合NPM蛋白的肽适配子;
5)利用化学合成方法将获得的能特异高亲和结合NPM蛋白的肽适配子进行体外合成,并在两端加上骨架序列,N端加上透膜肽序列,合成小分子多肽药物;通过体内或体外实验验证其活性。
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