CN115894622A - 一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于活性肽领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其制备方法与应用。所述葛根多肽的氨基酸序列为YLWVGA，即Tyr‑Leu‑Trp‑Val‑Gly‑Ala。本发明的多肽YLWVGA对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤具有显著保护作用，并且通过降低ALT、AST和LDH释放量，提高抗氧化酶的活力来抑制乙醇诱导的氧化应激，进而发挥保护HepG2细胞氧化损伤活性。本发明提供的天然多肽YLWVGA具有抗氧化活性强，分子量小，易于消化吸收等优点，能够应用于缓解氧化应激损伤的功能食品或保健品中。

Description

一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其应用

技术领域：

本发明属于活性肽领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其制备方法与应用。

背景技术：

葛根,为豆科植物野葛的干燥根,其始载于我国汉代的《神农本草经》,具有降血压、降血糖、抗肿瘤、解酒护肝等功效。2002年葛根被国家卫生部正式批准成为首批药食同源植物，市场上出现了大批含有葛根的保健食品，具有较高的经济价值和应用价值。目前的研究人员主要研究葛根黄酮类、三萜类、香豆素类化合物等成分的功效作用，但关于葛根蛋白及葛根多肽的制备及抗氧化活性的研究报道较为少见，尤其是具有抗氧化活性的多肽氨基酸，目前尚未报道。

葛根蛋白作为一种属于豆科植物蛋白的食源性蛋白，富含人体不能合成的必需氨基酸。但由于蛋白质具有结构复杂且分子量大的特点，摄入人体后难以发挥其营养价值。因此，以葛根为原料，通过定向酶解及分离纯化将葛根蛋白制备成易于消化吸收的具有抗氧化活性的多肽，对葛根蛋白深入研究及产品开发具有重要意义，同时对提升葛根蛋白的附加价值和拓展产品应用领域具有现实意义。

发明内容：

本发明的首要目的在于提供一种具有抗氧化活性的葛根多肽，所述葛根多肽的氨基酸序列为YLWVGA，即Tyr-Leu-Trp-Val-Gly-Ala，其分子量为708.37Da。

本发明的另一目的在于提供上述YLWVGA多肽的应用，特别是在作为抗氧化剂或在制备抗氧化产品中的应用，更特别的是在制备具有抗氧化功效的功能食品或保健品中的应用。

本发明提供的葛根多肽YLWVGA，可以采用固相化学合成技术合成获得。也可以以葛根为原料，通过酶解和分离纯化获得，具体地，包括以下步骤：

(1)葛根蛋白提取：采用酶法水解提取葛根蛋白，具体流程如下，将葛根粉过60目筛去除杂物，按照质量体积比1:20加入去离子水，加入葛根粉质量2％(w/w)的纤维素酶，调pH值至5.0，酶解温度为50℃，酶解时间为2h，酶解完成后100℃灭酶10min。后将pH值调至8.0-9.0，50℃水浴振荡浸提1-2h得提取液，将提取液4000r/min离心10min，将所得的上清液调节pH值至3.5-4.5，静置后取沉淀，冷冻干燥获得葛根蛋白。

(2)葛根蛋白酶解：将葛根蛋白加入去离子水进行溶解，葛根蛋白浓度为2-4％，加入葛根蛋白质量4-6％(w/w)的蛋白酶，酶解时间为4-6h，酶解温度为55℃，pH值为8.0；酶解结束后100℃灭酶10min，离心后取上清液为葛根蛋白酶解液。

(3)葛根多肽分离纯化：对葛根蛋白酶解液进行超滤分离，对超滤处理后分子量<3kDa的组分依次采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱和DEAE-52阴离子交换层析柱进行下一步分离纯化。收集合并成多个洗脱峰组分，选择抗氧化活性较强组分进行反向高效液相色谱纯化，收集各个洗脱峰组分，冷冻干燥-20℃保存备用。

(4)葛根多肽序列鉴定：收集反向高效液相色谱分离的具有最佳抗氧化活性的洗脱峰组分，采用液相色谱-串联质谱法进行氨基酸序列测定，获得可信度较高的肽段，氨基酸序列分别为YLWVGA、LLVYY、DVLPLA和VLSALP。采用固相化学合成技术，依次合成肽段，比较各个合成肽段的抗氧化活性。

优选地，得到氨基酸序列为YLWVGA的多肽具有最优的抗氧化活性，其在2mg/mL浓度下的DPPH自由基清除率为74.57±0.72％，ABTS自由基清除率为68.53±0.61％，羟自由基清除率为75.73±0.79％；并且YLWVGA干预对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤有较好的保护作用，尤其在提高细胞存活率，降低ALT、AST和LDH释放量，提高CAT、GSH-Px和SOD活力方面效果显著。

进一步地，步骤(2)所述蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的一种以上。优选地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比为3:1组成的复合蛋白酶。

优选地，步骤(2)酶解条件为：底物浓度为3％，加酶量为5％，pH值为8.0，酶解温度为55℃，酶解时间为5h。

进一步地，步骤(3)所述Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱分离，洗脱液为去离子水，流速为1mL/min，检测波长为220nm，每管收集5mL；收集并测定各个洗脱组分抗氧化活性。

进一步地，步骤(3)所述DEAE-52阴离子交换层析柱分离，采用0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.4mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，每管收集5mL；收集并测定各个洗脱组分抗氧化活性。

本发明的有益效果为：

(1)本发明采用纤维素酶辅助提取葛根蛋白，提高了蛋白提取率，提取率达42.05％。

(2)本发明采用超滤分离、凝胶柱层析和反向高效液相色谱技术协同对葛根多肽分离纯化，所得到的多肽纯度更高。并且以HepG2细胞存活率作为判别指标筛选活性较强的组分，能精准用于具有抗氧化活性的葛根多肽的制备，方法简单，实用性强。

(3)本发明的多肽YLWVGA对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤具有显著保护作用，并且通过降低ALT、AST和LDH释放量，提高抗氧化酶的活力来抑制乙醇诱导的氧化应激，进而发挥保护HepG2细胞氧化损伤活性。

(4)本发明提供的天然多肽YLWVGA具有抗氧化活性强，分子量小，易于消化吸收等优点，能够应用于缓解氧化应激损伤的功能食品或保健品中。

附图说明：

图1为不同蛋白酶对葛根蛋白水解度的示意图；

图2为葛根蛋白酶解物各超滤组分的DPPH自由基清除能力示意图；

图3为<3k超滤组分的Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱洗脱曲线图；

图4为Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱不同组分对HepG2细胞存活率的影响图；

图5为G1组分的DEAE-52阴离子交换层析柱洗脱曲线图；

图6为DEAE-52阴离子交换层析柱不同组分对HepG2细胞存活率的影响图；

图7为G1D1组分的反向高效液相色谱图；

图8为反向高效液相不同组分对HepG2细胞存活率的影响图；

图9为反向高效液相F5组分的总离子色谱图；

图10为肽段YLWVGA的二级质谱图；

图11为肽段YLWVGA对HepG2细胞存活率的影响图。

具体实施方式：

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1葛根蛋白提取

将葛根粉过60目筛去除杂物，按照质量体积比1:20加入去离子水，加入葛根粉质量2％(w/w)的纤维素酶，调pH值至5.0，酶解温度为50℃，酶解时间为2h，酶解完成后100℃灭酶10min。后将pH值调至8.0，50℃水浴振荡浸提1h，将提取液4000r/min离心10min分离得上清液，将所得上清液调节pH值至3.5，静置30min后，4000r/min离心15min，收集沉淀冷冻干燥获得葛根蛋白。经测定，该条件下葛根蛋白的提取率为42.05％，表明该方法可有效提取葛根蛋白。

实施例2葛根蛋白酶解

将葛根蛋白按质量体积比1:40加入去离子水进行溶解，加入葛根蛋白质量4％(w/w)的蛋白酶(分别为(1)中性蛋白酶，(2)碱性蛋白酶，(3)由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比为3:1组成的复合蛋白酶，(4)胰蛋白酶，(5)木瓜蛋白酶))，55℃，pH为8.0，酶解4h，以水解度为指标对蛋白酶种类进行筛选。

比较不同蛋白酶对葛根蛋白酶解液水解度的影响。结果如图1所示，5种蛋白酶酶解液的水解度各不相同，其中由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比为3:1组成的复合蛋白酶对葛根蛋白的水解效果最好，考虑工艺化生产以及经济效益，选择复合蛋白酶对葛根蛋白进行水解。

将葛根蛋白加入去离子水进行溶解，加入蛋白酶(由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比为3:1组成的复合蛋白酶)，底物葛根蛋白浓度为2-4％，加酶量为4-6％，酶解时间为4-6h。所述酶解温度为55℃，pH值为8.0。采用响应面试验分析底物浓度、加酶量和酶解时间对水解度的影响，以取得最优酶解参数。试验设计的因素水平见表1。

表1响应面试验因素与水平编码

葛根蛋白酶解响应面试验结果如表2所示，对试验结果利用DesignExpert.V8.0.6.1软件进行多元回归拟合，得到的回归方程为：

水解度＝30.71-0.34A-0.025B+0.23C+0.76AB-0.36AC-0.23BC-1.37A²-1.55B²-1.5C²，回归模型方差分析见表3，该模型R²为0.9796，表明实验结果与该模型的具有良好的吻合性。由表3所示的F值可得出影响葛根蛋白酶解因素依次为：底物浓度>酶解时间>加酶量，确定葛根蛋白酶解最佳工艺条件为：底物浓度为3％，加酶量为5％，pH值为8.0，酶解温度为55℃，酶解时间为5h。在此最佳条件下水解度预测值为30.75％。利用优化的条件进行验证试验，得出的水解度为31.14％，与预测值相近，证明最佳工艺参数数据具有实际价值。

表2响应面试验设计与结果

表3回归模型方差分析结果

实施例3葛根多肽分离纯化

1.超滤分离

将实施例1最佳条件下酶解结束后100℃灭酶10min，离心后取上清液为葛根蛋白酶解液，葛根蛋白酶解液依次经过截留分子量为3、10kDa的超滤膜，得到分子量<3kDa、3 -10kDa、>10kDa三个超滤组分，将各组分分别调节至0.5,1,2,4,6,8,10mg/mL后测定比较各超滤组分的抗氧化能力(DPPH自由基清除能力)。结果如图2所示，在0.5-10mg/mL浓度范围内，<3kDa超滤组分的DPPH自由基清除能力最强，其中在8.0mg/mL的浓度时DPPH自由基清除率最高达89.19％，具有良好的抗氧化活性。因此选择<3kDa超滤组分进行下一步纯化。

2.Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱分离

经Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱纯化，洗脱液为去离子水，流速为1mL/min，检测波长为220nm，每管收集5mL，洗脱曲线如图3所示，<3kDa的超滤组分被分离为两个峰组分，分别命名为G1和G2。

建立乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤模型，检测不同浓度的G1和G2组分对HepG2细胞的保护作用。具体实验如下：

取对数生长期的HepG2细胞悬液100μL接种于96孔板，密度为1×10⁴/孔，在37℃培养箱孵育24h，之后分别设置空白组、模型组和样品组，每组3个复孔。以不含细胞的新鲜培养基作为空白孔。分组如下：

吸弃原有培养基，空白组(加入100μL新鲜培养基，培养30h)、模型组(加入100μL培养基培养24h后，吸弃培养基，加入100μL的乙醇终浓度为500mM的新鲜培养基培养6h)、样品组(加入100μL含不同浓度的多肽的培养基干预24h后，吸弃培养基，加入100μL的乙醇终浓度为500mM的新鲜培养基培养6h)。采用CCK8法测定细胞存活率：培养结束后取出孔板，吸弃培养基，每孔加入90μL新鲜培养基和10μL CCK8试剂，在37℃培养箱内孵育2-3h后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。其中模型组和样品组的吸光值为A；空白孔的吸光值为A0；空白组的吸光值为A1。细胞存活率按下列公式计算：

细胞存活率(％)＝(A-A0)/(A1-A0)×100

不同浓度的G1和G2组分对HepG2细胞的保护作用如图4所示，模型组细胞存活率为55.29％，约为空白组细胞存活率的一半，说明建模成功。与模型组相比，在浓度为25-100μg/mL时，G1实验组的细胞存活率显著高于模型组(P<0.01)，呈剂量依赖性。当浓度为100μg/mL时，具有最高的细胞存活率为82.52％，结果表明G1组分可以显著保护HepG2细胞免受乙醇诱导的氧化损伤。

3.DEAE-52阴离子交换层析柱分离

使用DEAE-52阴离子交换层析柱对G1组分进行下一步分离，采用0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.4mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，每管收集5mL。洗脱曲线如图5所示，在220nm下检测到四个明显的洗脱峰，分别命名为G1D1、G1D2、G1D3和G1D4。采用上述步骤2同样的方法测定不同洗脱峰组分对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤模型的保护作用，结果由图6可知，随着浓度的增加，各个组分对HepG2细胞存活率均有不同程度的升高。在相同浓度下，G1D1组分的细胞存活率均高于其他三个组分，并且呈剂量依赖性，表明G1D1组分对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤保护作用较强。

4.反向高效液相色谱分离

选择G1D1组分，采用C-18色谱柱进行纯化。流动相A：0.1％三氟乙酸-水，流动相B：0.1％三氟乙酸-乙腈。梯度洗脱条件：0-5min，95％A；5-15min，95％-80％ A；15-20min，80％-95A。流速为21mL/min，洗脱时间为24min，检测波长为280nm，按照出峰时间收集目标组分并冷冻干燥。

得到的反向高效液相色谱如图7所示，检测出八个主要吸收峰，分别命名为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7和F8。采用上述步骤2同样的方法将八个组分对HepG2细胞进行干预，测定不同分离峰组分对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤模型的保护作用，结果如图8所示，当各组分浓度为100μg/mL时，F5组分的细胞存活率高于其他组分，最高达86.45％。因此选择F5组分进行氨基酸序列鉴定。

实施例4葛根多肽序列鉴定

液相色谱-串联质谱法具体方法为：液相为Easy nLC 1200纳升液相系统，样品在预柱上脱盐保留后再经分析柱分离，分析柱规格是C18反相色谱柱，实验所用梯度为60min内流动相B(80％乙腈，0.1％甲酸)由5％升高至38％。质谱采用ThermoFisher Q Exactive系统结合纳升喷雾Nano Flex离子源，喷雾电压为1.9kV，离子传输管加热温度为275℃。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(DDA，Data Dependent Analysis)，一级质谱扫描分辨率为70000，扫描范围100-1500m/z，最大注入时间100ms。每次DDA循环下最多采集20个电荷为1+到3+的二级图谱，二级质谱离子最大注入时间为50ms。碰撞室能量(高能碰撞诱导解离,HCD)设定为28eV，适用于所有前体离子，动态排除设置为6秒。质谱采集到的原始raw图谱文件，采用PEAKS Studio 8.5软件进行数据加工处理和检索分析，数据库为NCBI下载的Pueraria lobata物种蛋白数据库，检索参数设置如下：一级质谱质量容差为10ppm，二级质谱为0.05Da。

通过液相色谱-串联质谱法进行氨基酸序列测定，获得可信度较高的肽段，氨基酸序列分别为YLWVGA、LLVYY、DVLPLA和VLSALP。图9为反向高效液相F5组分的总离子色谱图。

采用固相化学合成技术对上述4条多肽进行多肽合成(图10为肽段YLWVGA的二级质谱图)，通过测定对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的清除能力，比较上述合成肽段的抗氧化活性，具体方法为：

(1)DPPH自由基清除能力测定：将2mg/mL的多肽样品2.0mL与0.1mmol/L DPPH自由基溶液2.0mL混合，充分振荡，避光孵育30min，于517nm测得混合溶液的吸光值Ai；对照组用2.0mL蒸馏水替代多肽样品溶液测得吸光值A0；空白组以2.0mL无水乙醇替代DPPH溶液测得吸光值Aj。DPPH自由基清除率按下列公式计算：

DPPH自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100

(2)ABTS自由基清除能力测定：配制含有7mmol/L ABTS和2.45mmol/L过硫酸钾的ABTS试剂，在室温下孵育12～16小时。在734nm下用无水乙醇稀释为吸收值为0.700±0.005得ABTS自由基阳离子工作液。取ABTS自由基阳离子工作液3.9mL与0.1mL的2mg/mL的多肽样品溶液混合，充分振荡，避光孵育6min，于734nm处的吸光值Ai，无水乙醇代替多肽样品溶液做空白对照测得吸光值A0。ABTS自由基清除率按下列公式计算：

ABTS自由基清除率(％)＝(A0-Ai)/A0×100

(3)羟自由基清除能力测定：将2mL的2mg/mL的多肽样品溶液置于10mL具塞试管中，再加入2mL的过氧化氢溶液(6mmol/L)和2mL硫酸亚铁(6mmol/L)溶液，充分振荡后在避光处静置30min，再向管中加入刚配制好的2mL水杨酸溶液(6mmol/L)，振荡混匀后静置10min，于510nm处测定反应混合溶液的吸光度值Ai，空白对照用蒸馏水代替多肽样品溶液测得吸光度值A0，蒸馏水代替水杨酸溶液测得吸光度值为Aj。羟自由基清除率按下列公式计算：

羟自由基清除率(％)＝(A0+Aj-Ai)/A0×100

如表4所示，肽段YLWVGA的抗氧化活性高于其他氨基酸序列，其DPPH自由基清除率为74.57±0.72％，ABTS自由基清除率为68.53±0.61％，羟自由基清除率为75.73±0.79％。

表4合成肽段的抗氧化活性比较

实施例5YLWVGA对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤保护作用

取对数生长期的HepG2细胞悬液1mL接种于12孔板，密度为2×10⁵/孔，在37℃培养箱孵育24h后，分别设置空白组、模型组和样品组，每组3个复孔：吸弃原有培养基，空白组(仅加入1mL新鲜培养基，培养30h)、模型组(加入1mL新鲜培养基培养24h后，吸弃培养基，加入1mL的乙醇终浓度为500mM的新鲜培养基培养6h)、样品组(加入1mL含不同浓度YLWVGA的新鲜培养基干预24h后，吸弃培养基，加入1mL的乙醇终浓度为500mM的新鲜培养基培养6h)。培养结束后，测定细胞存活率，同时用细胞裂解液裂解细胞，参考试剂盒说明书测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)含量；测定过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。

如图11所示，与模型组相比，YLWVGA干预后细胞存活率显著提高(P<0.01)，其中在100μg/mL浓度时保护作用最大，细胞存活率为88.68％。说明在25-100μg/mL浓度范围内，YLWVGA可以保护细胞免受氧化损伤。

由表5可知，模型组中的ALT、AST和LDH释放量增加，提示细胞受损，而在YLWVGA干预后，三种酶的释放量均显著降低(P<0.05)，表明YLWVGA可修复细胞膜的完整性以抑制胞质转氨酶及LDH释放到细胞外。

表5YLWVGA对乙醇诱导HepG2细胞损伤ALT、AST和LDH释放量的影响

由表6可知，YLWVGA干预后，与模型组相比，CAT、GSH-Px和SOD活力显著提高(P<0.05)，表明YLWVGA可通过提高抗氧化酶的活力来抑制乙醇诱导的氧化应激，进而发挥保护HepG2细胞氧化损伤活性。

表6YLWVGA对乙醇诱导HepG2细胞损伤氧化应激相关指标的影响

综上所述，本发明采用复合蛋白酶有效水解葛根蛋白，通过超滤对葛根蛋白酶解液进行分离，获得具有较强自由基清除能力的<3kDa的超滤组分；采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱、DEAE-52阴离子交换层析柱和反向高效液相色谱进行下一步分离，收集和合并个洗脱峰组分。经过活性筛选和序列鉴定，合成得到4条(YLWVGA、LLVYY、DVLPLA和VLSALP)抗氧化活性较强的肽段，其中YLWVGA分子量为708.37Da，对自由基的清除率均高于其他3条肽段。同时YLWVGA干预对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤有较好的保护作用，尤其在提高细胞存活率，降低ALT、AST和LDH释放量，提高CAT、GSH-Px和SOD活力方面。表明本发明提供的多肽YLWVGA具有较强的抗氧化活性，可应用于制备具有抗氧化功效的功能食品或保健品中。

以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种具有抗氧化活性的葛根多肽，其特征在于，所述葛根多肽的氨基酸序列为YLWVGA，即Tyr-Leu-Trp-Val-Gly-Ala。

2.权利要求1所述葛根多肽的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是所述葛根多肽在作为抗氧化剂或在制备抗氧化产品中的应用。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是所述葛根多肽在制备具有抗氧化功效的功能食品或保健品中的应用。

Images