CN115894531A - 间位吡啶季铵盐取代的bodipy化合物及其制备方法和药用用途 - Google Patents

Abstract

本发明属药物合成技术领域，涉及间位吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物及其制备方法和药用用途，具体涉及meso位3‑吡啶季铵盐取代BODIPY化合物及其制备方法和应用。本发明的化合物通过光敏化效率以及体外体内抑菌活性测试显示，所述的化合物具有良好的抗菌活性，可用于制备新型含吡啶季铵盐的氟硼二吡咯(BODIPY)类光敏剂，及进一步制备新的抗菌药物。

Description

间位吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物及其制备方法和药用用途

技术领域

本发明属药物合成技术领域，涉及间位吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物及其制备方法和药用用途，具体涉及meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物及其制备方法和应用。所述meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物可用于制备新型含吡啶季铵盐的氟硼二吡咯(BODIPY)类光敏剂。

背景技术

现有技术公开了，几十年来抗生素曾经对致命的感染极寒中拯救了无数人的生命。但由于在实践中的过度使用或误用，致使有些抗生素正迅速失去效力，这种现象被称为抗生素耐药性。业内认为国际社会若不紧急采取行动，世界将进入“后抗生素时代”，许多传染病可能变得无法控制。其中一个特殊例子就是常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，据报道，MRSA不仅仅对甲氧西林有耐药性，对其他氨基糖苷类、大环内酯类、四环素、氯霉素以及林可酰胺类抗菌药物均有极高的耐药性。但是，更严重的威胁来自于“泛耐药性”的革兰氏阴性菌，其低渗透的外膜屏障和高效的多药外排泵使得这些革兰氏阴性致病菌基本对所有可用抗菌药物都有耐药性。相较于可应用于细菌的抗生素数量，能够应对真菌感染的药物是更为有限的，且随着长期的药物暴露，不断有耐药真菌出现以及治疗后感染持续。

近年来，一系列抗菌新方法正在被开发。抗微生物光动力疗法(Antimicrobialoptical dynamic therapy，aPDT)被认为是治疗由革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌、支原体和寄生原生动物引起的感染的一种有前途和创新的方法。光动力抗菌因其机制而具有区别于抗生素或其他抗菌策略的优势，其一，具有光靶向性，仅在光照射的部位产生细胞毒性；其二，独特的氧化损伤机制，不易诱导微生物产生耐药性；其三，理论上具有广谱抗菌的潜力，治疗用途十分宽广，但是，受限于人体组织一定的光学窗口波长以及光波能够透过组织的深度，光动力抗菌一般只应用于局部感染，如口腔、皮肤等。

从机制上而言，光动力抗菌应当具有良好的广谱抗菌能力，但实际研究发现，不同的微生物对光敏剂敏感性完全不同，这主要是由于微生物细胞结构差异。革兰氏阳性菌包膜结构由高电荷密度的外壁区(outer wall zone，OWZ)和内膜(inner membrane，IM)组成。革兰氏阴性菌结构较革兰氏阳性菌而言更为复杂。革兰氏阴性菌细胞壁由外膜(outermembrane，OM)，肽聚糖层(peptidoglycan)以及内膜(inner membrane，IM)组成。革兰氏阴性菌的肽聚糖层相较于革兰氏阳性菌，层薄而致密，且位于肽聚糖层之外含有革兰氏阳性菌不具备的外膜结构。真菌细胞包膜主要由共价连接的β-葡聚糖(β-glucans)、几丁质(chitin)以及甘露糖蛋白(mannoproteins)构成。高度组织化的外膜(OM)的存在阻碍了光敏剂在抗菌剂中的应用。特别是中性或带负电荷的光敏剂对革兰氏阴性菌的活性非常差，因为革兰氏阴性菌外膜是一种高度复杂的多层结构，其外表面是被Mg²⁺和Ca²⁺中和的聚阴离子。因此，抗菌光敏剂往往带正电荷，与聚阴离子表面的负电荷位点紧密相互作用，从而提高光失活过程的效率。

氟硼二吡咯(BODIPY)类光敏剂因其具有高摩尔消光系数、高的单线态氧产率、抗光漂白性以及高的光-暗毒性比等优点已成为近年来光动力治疗领域的研究热点。BODIPY类光敏剂通过适当修饰可使其最大吸收峰调节至近红外区域，有效增加在PDT中的组织穿透性。重原子能增强自旋轨道耦合，从而易化系间蹿跃并增加单线态氧的产率，这称为“重原子效应”。另外，碘原子显示出比其他卤素更加有效的重原子效应。

还有研究报道了meso位4-吡啶季铵盐BODIPY结构抗菌光敏剂A和B，二者结构上的区别在于季铵盐基团的差别。通过对木糖葡萄球菌和大肠杆菌的光动力活性测试，研究者发现A与B均具有较强的光动力抑菌活性，在较低的光剂量和较低光敏剂浓度条件下便可以杀灭细菌。总体而言，光敏剂A的活性强于B，在之后的报道中，A被广泛应用于与多种抗微生物相关的研究中。

已报道的BODIPY光敏剂A和B虽然具有较为优秀的抗微生物活性，但BODIPY骨架易在生理环境中聚集。另外由于光诱导电子转移(photo induced electron transfer，PET)效应导致光敏剂A单线态氧产率较低，这些性质一定程度限制了其在抗菌光敏剂中的应用。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY类光敏剂的制备方法和用途，本申请提供的meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY光敏剂较已被广泛研究和应用的光敏剂A，具有生理环境溶解度增强，单线态氧产率提高，抗菌光毒性增强的优势，并且在体内研究中发现制备的光敏剂能够有效杀伤感染创面的微生物，加速伤口愈合，有望发展成为一种新型的抗菌治疗手段。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供具有良好微生物细胞杀伤作用的meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY光敏剂，其主要优点包括在生理环境溶解度好，单线态氧产率高，与微生物细胞结合能力强等。

具体的，本发明提供了meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物及其制备方法和在用于制备新型含吡啶季铵盐的氟硼二吡咯(BODIPY)类光敏剂中的用途。

本发明的meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物具有下式所示结构：

其中：

R独立地选自C1～12烷基、C1～12烷基取代的苯基、C1～12烷氧基取代的苄基、卤素取代的苄基、羟基取代的苄基。

本发明中，所述的化合物具有下述化合物1、2、3的结构：

本发明的进一步目的是提供上述meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物的制备方法。

本发明的化合物通过如下的过程制备：

本发明所述的化合物通过体外光敏化效率测试结果显示，化合物1，2，3均具有较好的单线态氧产率，数值结果显示，3-吡啶季铵盐取代化合物1，2，3的单线态氧产率约为4-吡啶季铵盐取代化合物A的三倍。

本发明中，生理盐水中光敏剂的溶解度试验结果显示，3-甲基吡啶季铵盐取代化合物1在生理环境中溶解度最佳，在4–24μM的浓度范围内未发现有明显聚集行为，而4-甲基吡啶季铵盐取代化合物A则出现明显聚集。

本发明中，微生物细胞摄取试验结果表明，S.aureus，E.coli和C.albicans均在15min内实现对本发明化合物的较好摄取，特别是对于化合物2、3，其摄取结果优于化合物A。

本发明中，体外细胞水平测试结果显示，本发明的化合物对微生物细胞S.aureus，E.coli，C.albicans和MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)均显示出良好的抑菌活性，特别是化合物1，其对所测微生物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)均优于4-吡啶季铵盐取代化合物A。

本发明的meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物可用于制备新型含吡啶季铵盐的氟硼二吡咯(BODIPY)类的抗菌光敏剂。

本发明基于体外实验结果，化合物1被用于体内测试。鼠S.aureus-感染伤口模型显示，在化合物1作为光敏剂的光动力治疗后，小鼠伤口微生物基本被全部杀伤，并且伤口愈合程度加快。

本发明的meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY化合物可进一步研制开发为新型meso位3-吡啶季铵盐取代BODIPY抗微生物感染药物。所述的微生物感染是无特异性的广泛感染，所述的微生物类型包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体感染，感染部位包括人体皮肤、口腔、呼吸道、肠道和生殖道。

附图说明

图1：化合物在生理盐水(含0.2％DMSO)中的聚集情况。

图2：化合物1的抗菌剂量依赖实验结果。

图3：实验动物伤口愈合情况。

图4：实验动物创面微生物计数情况。

具体实施方式

实施例1：合成化合物1

1)合成1，3，5，7-四甲基-8-(3-吡啶基)-4，4'-二氟硼二吡咯

470mg 3-吡啶甲醛和920mg 2，4-二甲基吡咯溶于250mL干燥DCM中，加入催化量的TFA，氩气保护，室温搅拌24小时。减压蒸去部分DCM至溶液体积为70mL，加入1.5g 2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌，氩气保护，室温搅拌2小时。加入7mL三乙胺和7mL三氟化硼乙醚溶液，氩气保护，室温搅拌过夜。减压除去溶剂，将残余固体溶于150mL DCM中，水洗涤三遍，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，柱层析纯化DCM/PE＝1/3得橘黄色固体328mg。产率：23％。¹HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.77(d,J＝4.8Hz,1H),8.59(s,1H),7.67(d,J＝7.7Hz,1H),7.48(dd,J＝7.6,5.0Hz,1H),6.03(s,2H),2.58(s,6H),1.40(s,6H)。¹³C NMR(151MHz,CDCl3)δ155.75,149.58,147.89,142.16,136.64,135.39,130.87,130.67,123.11,121.15,14.37,14.02。MS(ESI)m/z([M+H]⁺):326.2。

2)合成2，6-二碘-1，3，5，7-四甲基-8-(3-吡啶基)-4，4'-二氟硼二吡咯

化合物1，3，5，7-四甲基-8-(3-吡啶基)-4，4'-二氟硼二吡咯(100mg)，置于25mL茄形瓶中，加入HOAc/DCM＝1/3(6ml)溶解。加入340mg N-碘代丁二酰亚胺，室温搅拌1h，TLC监测反应完全。加入20mL饱和硫代硫酸钠溶液洗涤，20mL水洗涤，20mL饱和NaHCO₃水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，柱层析PE:EA＝1:1，得褐色固体161mg。产率：91％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(d,J＝3.3Hz,1H),8.56(s,1H),7.65(d,J＝8.0Hz,1H),7.52(t,J＝8.4Hz,1H),2.66(s,6H),1.40(s,6H)。¹³C NMR(151MHz,CDCl3)δ157.31,149.33,146.96,144.23,136.07,135.74,130.94,130.69,123.63,85.84,17.03,15.54。MS(ESI)m/z([M+H]⁺):578.0。

3)合成化合物1

将化合物2，6-二碘-1，3，5，7-四甲基-8-(3-吡啶基)-4，4'-二氟硼二吡咯(58mg)溶于碘甲烷(3mL)中，回流反应10h。待反应结束后，减压旋干溶剂，将粗产物溶于适量甲醇，以乙醚为不良溶剂，重结晶得到褐色化合物62mg，产率86％。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.29(s,1H),9.24(d,J＝6.2Hz,1H),8.85(d,J＝8.0Hz,1H),8.40-8.33(m,1H),4.43(s,3H),2.59(s,6H),1.43(s,6H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ157.78,146.95,145.44,144.85,144.72,132.85,131.93,130.45,128.24,88.27,48.45,18.00,15.87.HRMS(ESI)m/z([M-I]^-):591.9722.。

实施例2：合成化合物2

将化合物2，6-二碘-1，3，5，7-四甲基-8-(3-吡啶基)-4，4'-二氟硼二吡咯(58mg,0.1mmol)和苄溴(240μL,2mmol)溶于5mL乙腈中，90℃密封管回流。12h后，减压蒸馏除去溶剂，以DCM/MeOH(10:1,v/v)为洗脱剂，硅胶柱层析纯化，得到红棕色化合物61mg，产率81％。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.60(s,1H),9.55(d,J＝5.4Hz,1H),8.89(d,J＝7.8Hz,1H),8.43(t,J＝7.0Hz,1H),7.66-7.60(m,2H),7.47(m,3H),5.94(s,2H),2.58(s,6H),1.22(s,6H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ157.79,146.29,146.03,144.37,144.14,133.98,133.65,131.74,130.45,129.54,129.30,129.13,129.02,88.28,64.08,17.58,15.86.HRMS(ESI)m/z([M-Br]^-):668.0042。

实施例3：合成化合物3

将化合物2，6-二碘-1，3，5，7-四甲基-8-(3-吡啶基)-4，4'-二氟硼二吡咯(58mg,0.1mmol)和1-碘庚烷(330μL,2mmol)溶于5mL乙腈中，90℃密封管回流。24小时后，减压蒸馏除去溶剂，加入DCM和Et₂O使产物沉淀，过滤得红褐色化合物30mg，产率37％。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.44(s,1H),9.40(d,J＝6.1Hz,1H),8.89(d,J＝8.0Hz,1H),8.45-8.39(m,1H),4.71(t,J＝7.3Hz,2H),2.59(s,6H),1.99(m,2H),1.40(s,6H),1.32(m,2H),1.26(m,6H),0.86(t,J＝6.9Hz,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ157.78,146.20,145.90,144.58,143.95,133.36,131.89,130.48,128.83,88.31,61.39,30.83,30.25,27.77,25.23,21.75,17.84,15.87,13.77.HRMS(ESI)m/z([M-I]^-):676.0686。

实施例4：单线态氧产率测试

将化合物1，2，3，A和Rose Bengal配制成2mL异丙醇溶液(5μM)。吸取单线态氧探针DPBF的异丙醇溶液(100μM)2mL于5种不同化合物溶液中配制成4mL混合溶液，根据紫外可见吸收光谱，选择合适的截止波长滤光片(450nm)。卤素灯与溶液距离30cm，分别于照射时间为10，20，30，40，50s进行紫外可见扫描，记录411nm(DPBF最大吸收波长)处吸光度变化。具体结果见表1。结果表明，本发明中化合物1，2，3均显示出较好的单线态氧产率，以RoseBengal在醇溶液中单线态氧产率为0.76作参比，此发明化合物单线态氧产率数值约为化合物A的4倍。

表1为本发明化合物的单线态氧产率测试结果。

表1

实施例5：生理环境聚集测试

将化合物1，2，3和A分别配制成浓度为24、20、16、12、8和4μM的生理盐水溶液(含0.2％DMSO)，记录其紫外可见光谱。对最大波长处吸光度值-浓度进行拟合，相关系数越接近1代表其在测试浓度范围内越符合朗伯比尔定律，进而代表其溶解越好。结果表明，3-甲基吡啶季铵盐取代化合物1在生理环境中溶解度最佳，在4–24μM的浓度范围内未发现有明显聚集。而4-甲基吡啶季铵盐取代化合物A则出现明显聚集行为。

实施实例7：细胞摄取测试

分别制备细菌细胞密度为10⁹CFU/mL，真菌细胞密度为10⁷CFU/mL的微生物细胞悬液，加入10μM待测化合物。37℃黑暗条件下孵育15min后，取出3mL悬液，其余悬液继续孵育。取出的样品在12000r/min条件下离心3min，记录上清液的紫外-可见吸收光谱。每隔30分钟和60分钟重复上述操作。上清液中剩余的光敏剂表明这些分子没有与微生物细胞结合。试验结果表明，S.aureus，E.coli和C.albicans细胞均在15min内实现对本发明化合物的较好摄取。特别对于化合物2、3，其摄取结果优于化合物A。

表2为本发明化合物的微生物细胞摄取结果(孵育15min)。

表2

实施实例8：体外抗菌活性测试

复苏和培养：实验选用金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)，大肠杆菌(E.coli,ATCC25922)，白色念珠菌(C.albicans，ATCC90028)以及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA,ATCC43300)，培养基为CAMHB肉汤培养基。将冻存的细菌和真菌滴入CAMHB液体培养基，在摇床上37摄氏度，180rpm/min震荡摇晃18h，而后挑取菌液接种在MHA平板上，置于37℃恒温培养箱培育24小时(真菌培养温度为28℃)。待测化合物溶液的配制：在暗室中，精准称量化合物，溶于少量DMSO中，用CAMHB液体培养基系列稀释至浓度80～0.31μM，每个浓度梯度取50μL，置于九十六孔板，每个浓度三个复孔。菌液的配制：从MHA平板挑取菌落，用PBS缓冲液分散至混悬状态，用比浊仪测量光密度，直至0.5McF，再将菌液用CAMHB液体培养基稀释1000倍，将菌液取50μL，置于已加入化合物的九十六孔板孔中。另外将菌液取50μL，置于已加CAMHB液体培养基50μL的九十六孔板孔中，作为空白对照。孵育：将96孔板置于37摄氏度恒温培养箱孵育15min。光照：孵育结束后，光照组置于90mW/cm²的卤素灯光源下，采用冷却装置隔热，并放置截止波长为450nm的滤光片，照射15min。MIC的确定：光照结束后，将九十六孔板置于37℃恒温培养箱(真菌为28℃)，24h后，观察九十六孔板澄清度，以澄清孔径所对应的最小光敏剂浓度为其最小抑菌浓度。具体结果见表2。结果表明，本发明中化合物显示出较好的抗菌活性。其中化合物1在实验条件下对四种微生物S.aureus，E.coli，C.albicans和MRSA的最小抑制浓度分别为0.63，1.25，0.63和0.63μM。本发明的化合物可以进一步研制开发抗菌光敏剂，作为新型抗感染药物。

表3为本发明化合物的微生物细胞抑制活性结果。(单位：μM)表3

实施实例9：浓度依赖测试

浓度依赖测试：将OD_600nm＝1.0的微生物悬液与系列稀释的化合物1孵育15min，孵育结束后，光照组置于90mW/cm²的卤素灯光源下，采用冷却装置隔热，并放置截止波长为450nm的滤光片，照射15min。,对照组无光照，而后采用平板计数法测量抑菌曲线，结果如图2所示。

实施例9：动物体内抗菌活性测试

含化合物1水凝胶的制备：将干燥的卡波姆940粉末(0.3g)分散于2mL水中，在室温下平衡16h。然后加入三乙醇胺使凝胶的pH值约为6.5。最后，将化合物1(2mg)和Tween 80(20mg)的水溶液(2mL)加入到凝胶中，得到含化合物1水凝胶。

体内活性测试：成年ICR鼠(6-8周龄)，恒温饲养两日，每日见光-黑暗饲养各12小时。采用氯胺酮(80mg/kg)和噻拉嗪(10mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，然后使用毛发电推和脱毛膏脱去小鼠背部毛发。70％酒精消毒后，使用无菌镊子和手术剪在其背部制造一个直径约为0.8cm的伤口。第0天，每个创面分别接种含10⁷CFU金黄色葡萄球菌的PBS溶液，然后用敷料(Tegaderm,3M Health Care,USA)覆盖以制造感染伤口。感染后第2天，将小鼠随机分为两组，小心取去敷料进行观察，包括创面照片和细菌计数评估。随后，光动力治疗组小鼠用10mg含化合物1的水凝胶治疗创面，然后置于90mW/cm²的卤素灯光源下照射，采用冷却装置隔热，并放置截止波长为450nm的滤光片，治疗时间为15min。于治疗后第三天和第六天观察创面微生物生长情况以及伤口愈合情况，结果如图3，图4所示。

Claims (7)

1.具有如下通式结构的meso位3-吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物，

其中：

R独立地选自C1～12烷基、C1～12烷基取代的芳甲基、C1～12烷氧基取代的芳甲基、卤素取代的芳甲基、羟基取代的芳甲基。

2.根据权利要求1所述的meso位3-吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物，其特征在于，所述的化合物为具有下述结构的化合物1，

3.根据权利要求1所述的meso位3-吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物，其特征在于，所述的化合物为具有下述结构的化合物2，

4.根据权利要求1所述的meso位3-吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物，其特征在于，所述的化合物为具有下述结构的化合物3，

5.权利要求1所述的meso位3-吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物在制备抗菌光敏剂中的用途。

6.权利要求1所述的meso位3-吡啶季铵盐取代的BODIPY化合物在制备抗微生物感染药物中的用途。

7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的微生物感染是无特异性的广泛感染，所述的微生物类型包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体感染，感染部位包括人体皮肤、口腔、呼吸道、肠道和生殖道。

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