CN115894286A - 一种小分子多胺类抗菌纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小分子多胺类抗菌纳米材料及其制备方法和应用，涉及生物医药材料领域。该小分子多胺类抗菌纳米材料的制备方法，包括以下步骤：(1)多胺类化合物和小分子醛类化合物在有机溶剂中进行亚胺键连接反应，得到反应液；(2)所述反应液在超纯水中自组装，得所述小分子多胺类抗菌纳米材料。本发明利用小分子之间的动态共价化学反应，通过将多胺类化合物和小分子醛类化合物在有机溶剂中以亚胺键相结合，制备成一种具有两亲性的小分子化合物，并在溶液中自组装成纳米材料，本发明制备得到的小分子多胺类抗菌纳米材料可用于龋病的治疗，其对变形链球菌具有杀灭作用，还可抑制生物被膜的生长，并具有解离生物被膜的作用。

Description

一种小分子多胺类抗菌纳米材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药材料领域，特别是涉及一种小分子多胺类抗菌纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术

龋齿，亦称之为蛀牙，是世界范围内最流行的慢性病之一。龋齿通常是由细菌发酵食物中的碳水化合物产生酸性副产物来破坏牙齿硬组织造成的。但致龋的过程实际上是在覆盖了牙齿表面的细菌生物膜(牙菌斑)内开始的，而且牙釉质的早期变化难以用传统临床和影像学方法检测到。此外，蛀牙还受到唾液流动和成分、膳食糖的摄入以及个体预防行为的影响。这种疾病最初是可逆的，只要牙齿上的生物膜被移除，即使牙本质或珐琅质被破坏时，牙齿也能够恢复过来。口腔作为一个复杂的微生态环境，被证实有超过25000中不同的细菌定植。变形链球菌(S.mutans)是导致龋病的主要因素。漱口水作为一种新型的口腔保健品，能够有效减少口腔治病生物的数量，补充了机械性控制菌斑办法的不足。目前市场上常见的漱口水有氯己定，氟化物和普通抗生素，但是如果长时间使用传统药物不仅会引起牙面和黏膜着色，还有可能引起味觉异常。抗生素对成熟生物膜的作用不佳，并且长期使用抗生素使细菌的耐药性增加。因此，寻求具有经济便宜、安全有效和不易产生耐药性以及能抗生物膜的致龋药物是研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种小分子多胺类抗菌纳米材料及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备得到的小分子多胺类抗菌纳米材料可用于龋病的治疗，其对变形链球菌具有杀灭作用，还可抑制生物被膜的生长，并具有解离生物被膜的作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种小分子多胺类抗菌纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)多胺类化合物和小分子醛类化合物在有机溶剂中进行亚胺键连接反应，得到反应液；

(2)所述反应液在超纯水中自组装，得所述小分子多胺类抗菌纳米材料。

进一步地，所述多胺类化合物选自亚精胺、3,3'-二氨基二丙胺、二乙烯三胺、聚乙烯亚胺和精胺中的至少一种。

进一步地，所述小分子醛类化合物为反-2-辛烯醛。

进一步地，所述有机溶剂为无水乙醇或无水甲醇。

进一步地，在步骤(1)中，所述反应的温度为0-15℃，时间为8-16h。

进一步地，在步骤(2)中，所述自组装的温度为0-25℃，时间为1-6h。

进一步地，在步骤(2)中，所述反应液在超纯水中的体积分数为0.5-5％。

本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的小分子多胺类抗菌纳米材料。

本发明还提供上述的小分子多胺类抗菌纳米材料在制备抑制变形链球菌的药物中的应用。

本发明还提供上述的小分子多胺类抗菌纳米材料在制备治疗龋齿的药物中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用小分子之间的动态共价化学反应，通过将多胺类化合物和小分子醛类化合物在有机溶剂中以亚胺键相结合，制备成一种具有两亲性的小分子化合物，并在溶液中自组装成纳米材料，本发明制备得到的小分子多胺类抗菌纳米材料可用于龋病的治疗，其对变形链球菌具有杀灭作用，还可抑制生物被膜的生长，并具有解离生物被膜的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中制备的小分子多胺类抗菌纳米材料的合成路线示意图。

图2为实施例1和2制备的小分子多胺类抗菌纳米材料的粒径尺寸；

图3为实施例1和2制备的小分子多胺类抗菌纳米材料的zeta表面电位；

图4为实施例1中制备的小分子多胺类抗菌纳米材料的透射电镜图；

图5为实施例3制备的小分子多胺类抗菌纳米材料及原料的核磁结果；

图6为实施例3制备的小分子多胺类抗菌纳米材料及原料的红外光谱；

图7为实施例1中制备的小分子多胺类抗菌纳米材料对浮游细菌的杀菌效果；

图8为实施例1中制备的小分子多胺类抗菌纳米材料抑制生物被膜成长效果；

图9为实施例1中制备的小分子多胺类抗菌纳米材料对成熟生物被膜的解离效果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中用到的多胺的结构式如下：

实施例1

将0.75μM反-2-辛烯醛((E)-oct-2-enal，A)和3.75μM亚精胺(speridim，B5)溶于483.4μL无水乙醇中，在4℃下搅拌12小时，得到反应液(反应温度为0-15℃，反应时间为8-16小时均可发生反应，其中以4℃，12h最有助于两亲性化合物的形成)。随后将100μL反应液，慢慢滴入10mL超纯水中(反应液在超纯水的体积分数为0.5-5％可达相同效果)，在25℃继续搅拌2小时(0～25℃下搅拌1～6小时均可实现自组装，其中25℃，2小时最有助于完成自组装)，之后冻干即得到小分子多胺类抗菌纳米材料(编号为AB5)。合成路线如图1所示。

该小分子多胺类抗菌纳米材料的化合物结构式如下：

实施例2

同实施例1，区别仅在于，将亚精胺分别替换为不同的多胺化合物：3，3'-二氨基二丙胺(Bis(3-aminopropyl)amine，B1)，二乙烯三胺(diethylenetriamine，B2)，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，B3)和精胺(sperimine，B4)，得到小分子多胺类抗菌纳米材料(依次编号为AB1、AB2、AB3和AB4)。

材料表征：

测定实施例1和2制备的小分子多胺类抗菌纳米材料的粒径尺寸和zeta表面电位，结果见图2和图3。测试步骤如下：用超纯水将小分子多胺类抗菌纳米材料稀释10倍后，利用纳米粒度仪得到粒径尺寸和zeta表面电位。

结果显示，实施例1和2的醛类化合物和多胺类化合物反应后，自组装得到的小分子多胺类抗菌纳米材料为带正电荷的粒径约100-180nm的纳米材料。

图3为实施例1中制备的小分子多胺类抗菌纳米材料的透射电镜图，从图4中可以看到该小分子多胺类抗菌纳米材料大小为120nm左右的纳米材料。

实施例3

同实施例1，区别仅在于，将无水乙醇替换为氘代甲醇，得到反应液。反应体系直接用于测定核磁氢谱。体系及原料的核磁结果如附图5。与原料相比较，体系中胺的活泼氢消失，而在化学位移为8.00ppm左右处出现了新形成的亚胺氢的特征峰，表明亚胺键形成。

上述反应体系冻干成粉末，测定其在400-4000cm^-1波段的红外光谱图。结果如图6所示，原料A和B5位于1684cm^-1处的C＝O官能团特征峰及在3340cm^-1处的N-H官能团特征峰在组装体中消失，另一方面，组装体在1636cm^-1处出现一个新的C＝N的特征峰，进一步证明氨基与醛基形成了亚胺键。

效果验证

变形链球菌菌株由温州医科大学第一附属医院所提供。

1.杀菌效果

测试步骤：测试本实施例1制备的小分子多胺类抗菌纳米材料对变形链球菌菌株的杀灭效果，将变形链球菌溶液分离后重悬在无菌PBS中，得到浓度为1×10⁷CFU/mL的菌悬液。然后取300μL菌悬液和300μL的不同材料溶液(A、B5和AB5；等同于醛类化合物浓度，浓度均为0.19μM)置于1.5mL离心管中，放入37℃细菌恒温培养箱中静置培养2h。培养结束后，吸出100μL菌液，分散在900μL无菌PBS中，随之连续稀释，通过平板涂抹法测定溶液中的活菌数量。数据每组重复三次，取平均值。

结果：如图7所示，游离状态下的亚精胺和醛类化合物对变形链球菌并没有抑菌效果，经过化合物处理之后，变形链球菌活细菌数发生了显著性下降，则表现出良好的抑菌效果。

2.抑制生物被膜生长

将800μL的不同材料溶液(A、B5和AB5；等同于醛类化合物浓度，浓度均为0.19μM)加入到共聚焦小皿中，静置0.5小时后，加入800μL变形链球菌溶液(2×10⁸CFU/mL)，在37℃细菌恒温培养箱中继续培养1.0h。随后把上清液吸出，用PBS清洗2遍后。接下来，加入800μL的不同材料溶液(A、B5和AB5；等同于醛类化合物浓度，浓度均为0.19μM)和800μL2倍BHI培养液。在37℃培养箱中孵育16小时后，吸出上清液，每个孔用200μLPBS轻轻地清洗3次，并加入SYTO^TM9和PI染色剂孵育15分钟，利用激光共聚焦观察生物被膜的厚度和生长情况。

结果如图8所示，从PBS组和单组分处理图中观察到大量的绿色蔟，这是由大量活性细胞组成的生物膜。通过组装体处理后生物被膜厚度为8.0μm左右，与PBS组相比较厚度明显减少，同时观察到生物被膜染成红色，说明细菌已死亡或被破坏。因此，小分子多胺类抗菌纳米材料可以杀灭变形链球菌并破坏生物被膜的3D结构。这表明小分子多胺类抗菌纳米材料在杀死变形链球菌时，也可以抑制生物被膜的生长。

3.解离成熟的生物被膜

将800μL变形链球菌溶液(2×10⁸CFU/mL)，在37℃细菌恒温培养箱中继续培养0.5h。随后把上清液吸出，用PBS清洗2遍后。接下来，加入1.600μLBHI培养液。在37℃培养箱中孵育16小时后，吸出上清液，PBS轻轻地清洗3次，再次加入1.600μLBHI培养液继续培养16小时后，吸出上清液，PBS清洗2遍，加入800μL的不同材料溶液(A、B5和AB5；等同于醛类化合物浓度，浓度均为0.38μM)加入到共聚焦小皿中作用4小时。随后吸出上清液，PBS清洗2遍，加入SYTO^TM9和PI染色剂孵育15分钟，利用激光共聚焦观察生物被膜的厚度和生长情况。

结果如图9所示，生长48小时的PBS组中的生物被膜几乎完全被密集的变形链球菌簇覆盖，厚度为22μm左右。经过组装体处理后，形成的生物被膜结构被破坏，其厚度发生明显的减少。这表明小分子多胺类抗菌纳米材料在一定程度上具有解离生物被膜的效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种小分子多胺类抗菌纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)多胺类化合物和小分子醛类化合物在有机溶剂中进行亚胺键连接反应，得到反应液；

(2)所述反应液在超纯水中自组装，得所述小分子多胺类抗菌纳米材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多胺类化合物选自亚精胺、3,3'-二氨基二丙胺、二乙烯三胺、聚乙烯亚胺和精胺中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小分子醛类化合物为反-2-辛烯醛。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水乙醇或无水甲醇。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述反应的温度为0-15℃，时间为8-16h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述自组装的温度为0-25℃，时间为1-6h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应液在超纯水中的体积分数为0.5-5％。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的小分子多胺类抗菌纳米材料。

9.一种如权利要求8所述的小分子多胺类抗菌纳米材料在制备抑制变形链球菌的药物中的应用。

10.一种如权利要求8所述的小分子多胺类抗菌纳米材料在制备治疗龋齿的药物中的应用。

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