CN115887762B - 一种微流控静电纺纤维膜微球及其制备方法与在血管修复方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流控静电纺纤维膜微球及其制备方法与在血管修复方面的应用，包括以下步骤：(1)将壳层溶液与芯层溶液通过同轴静电纺制备具有壳‑芯结构的复合纳米纤维，并在接收滚筒上形成薄膜；所述壳层溶液包含可生物降解纤维基质、壳聚糖与PEG相变材料，所述芯层溶液为液态金属镓或镓基合金；所述PEG相变材料的相变温度为36～37℃；(2)在36～37℃下，将步骤(1)制备的薄膜在外部磁力吸引下通过内径逐渐减小的螺旋通道，形成微球形状，冷却固定得到所述纤维膜微球。本发明制备的纤维膜微球可作为载体负载药物，具有良好的生物相容性和抗菌抑菌效果，在磁力驱动技术下可定向移动至靶向部位，因相变转化为薄膜贴合在伤口处，实现药物的靶向缓释。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种微流控静电纺纤维膜微球及其制备方法与在血管修复方面的应用。
背景技术
人体某些器官组织出现损伤，血管难以及时修复，容易出现细菌感染，影响正常体内供血，甚至某些血管系统疾病会威胁到人类的生命，因此如何高效修复血管损伤的问题引起了学者的广泛关注。
目前，针对血管修复的医用材料已经有了一定的进展，尤其在静电纺丝方面，例如专利CN102058450A公开了一种针对血管破裂修复的超疏水血管支架的制备方法，该血管支架可以在破裂的血管处于治疗阶段时，提供止血药物，采用了血管支架植入，保证附近其他血管的正常供血。专利CN107898533A公开了一种人工载药同轴再生血管支架及其复合工艺制备方法，采用同轴电纺成形工艺，制备了三层载药血管支架，降低了人工血管在移植后的感染率，提高了再生血管的组织相容性。专利CN110755174A公开了一种生物混合型人工血管及其制备方法，该种人工血管内层由PCL静电纺，外层为包封了Sca-1+血管干细胞的GelMA水凝胶，具有良好的血液相容性和生物相容性。专利CN107899086A公开了一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及其制备方法，该新型透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白静电纺丝纤维膜，有良好的促血管内皮化增殖效果。专利CN111603267A公开了一种同轴静电纺丝磁吻合人工血管的制作，以肝素钠溶液为芯层溶液，PLCL溶液为壳层溶液，并进行3D打印，制备吻合过程方便、具有良好微观形貌的人工血管。但是目前大多集中在血管支架和体外培养人工血管方面，而关于体内血管修复方面还有待进一步研究探索。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种微流控静电纺纤维膜微球及其制备方法与在血管修复方面的应用，本发明采用微流控与同轴静电纺相结合的方法制备得到可促进血管生成的纤维材料，并利用材料的相变性质制成纤维膜微球，该纤维膜微球便于注射至体内，且在磁力驱动技术下可移动至靶向部位展开并贴合在伤口处，实现药物的靶向缓释，为血管修复提供适合细胞生长的微环境，起到抗菌和组织再生的作用，促进血管快速修复。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种微流控静电纺纤维膜微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳层溶液与芯层溶液通过同轴静电纺制备具有壳-芯结构的复合纳米纤维，并在接收滚筒上形成薄膜；所述壳层溶液包含可生物降解纤维基质、壳聚糖与PEG相变材料，所述PEG相变材料的相变温度为36～37℃；所述芯层溶液为液态金属镓或镓基合金；
(2)在36～37℃下，将步骤(1)制备的薄膜在外部磁力吸引下通过内径逐渐减小的螺旋通道，在出口处降温冷却得到所述纤维膜微球。
进一步地，步骤(1)中，所述壳层溶液中可生物降解纤维基质、壳聚糖与PEG相变材料的质量比为4～5:0.1～1:1。
进一步地，步骤(1)中，所述可生物降解纤维基质为再生丝素蛋白、聚己内酯、丝蛋白中的一种或多种。
进一步地，步骤(1)中，所述再生丝素蛋白(RSF)的制备过程如下：将蚕茧剥成数层，放入煮沸的0.6wt％的Na2CO3水溶液，经一系列处理，如脱胶、稀释、离心等步骤，获得质量分数为33wt％的RSF水溶液。
进一步地，步骤(1)中，所述壳层溶液的制备过程如下：将33wt％的RSF水溶液与3wt％的壳聚糖溶液以质量比为97:3混合，得到混合溶液，加入PEG相变材料得到所述壳层溶液；所述PEG相变材料加入量为混合溶液的8wt％。
本发明采用具有再生丝素蛋白的壳层溶液制备的纤维具有三维网状结构，降解产物无酸碱性，能够被组织吸收，且具有良好的机械强度，后续挤压成型过程不影响纤维膜的性能。此外，纺丝溶液中引入壳聚糖可提高纤维的生物相容性和抗菌抑菌的效果；引入具有与人体体温相近的相变温度且易降解的PEG相变材料，赋予纤维智能形变特性。
进一步地，步骤(1)中，所述壳层溶液还包含VEGF生长因子、基质细胞衍生因子-1α、肝素中的一种或多种；VEGF生长因子可以增加血管通透性，诱导血管生成，同时为血管中的神经再生提供足够的营养物质。
进一步地，步骤(1)中，所述壳层溶液中VEGF生长因子的浓度为25μg/mL。
本发明可通过在壳层溶液中引入生长因子或需负载的其它药物，将携带药物的纤维膜微球注入人体内，可实现药物的靶向缓释。
进一步地，步骤(1)中，所述液态镓基合金为镓锡合金，所述镓锡合金中的镓与锡的质量比为85:15。
进一步地，步骤(1)中，所述PEG相变材料由PEG1000-2和PEG1500以质量比6:1复配得到PEG相变微胶囊，相变温度为36.5℃。
进一步地，步骤(1)中，所述复合纳米纤维的直径为280～400nm，壳层的厚度为100±15nm，芯层的直径为140±30nm。
进一步地，所述薄膜的厚度为10μm～14μm。
进一步地，步骤(2)中，所述薄膜为抗菌处理后的薄膜。
进一步地，上述所述抗菌处理具体为：将步骤(1)制备的薄膜浸渍于铜氨溶液中，干燥处理后得到所述抗菌处理后的薄膜。
进一步地，所述铜氨溶液的浓度为0.01mol/L。
进一步地，步骤(2)中，所述螺旋通道的入口半径为50mm～60mm，出口半径为1mm～1.5mm。
进一步地，步骤(2)中，所述降温冷却的温度为-5～0℃。
本发明利用磁力吸引薄膜中的液态金属，在磁力的驱动下使薄膜在螺旋通道中碰撞挤压，形成微球形状，在螺旋通道的出口处经降温冷却，得到形状固定的纤维膜微球。
进一步地，所述纤维膜微球的平均粒径为250μm～600μm。
本发明第二方面提供了一种第一方面所述制备方法制备得到的微流控静电纺纤维膜微球。
本发明第三方面提供了一种第二方面所述的微流控静电纺纤维膜微球在血管修复方面的应用。
进一步地，将分散有纤维膜微球的溶液注射到体内损伤血管位置，利用磁力引导至待修复血管处，微球在体内逐渐展开为纤维膜，并在磁力引导下贴合在受损血管处。
本发明采用可促进血管生成的纤维材料作为纤维基质，加速血管愈合和组织再生，同时通过引入相变温度点与人体温度相近的相变材料，使静电纺制备的纤维膜可先升温变形，冷冻固定纤维膜的内应力，温度升高或注入人体后，内应力约束消失，材料恢复成原来的形状。此外，利用具有良好导电性、人体可代谢的液态金属镓作为纤维芯层结构，赋予纤维膜微球可被磁力吸引的性质，使纤维膜微球在磁力引导下可有序进入体内目标位置，结合纤维皮层相变材料的相变作用，纤维膜微球在体内恢复成薄膜贴合在损伤血管处，长期缓慢释放药物，为血管修复提供适合细胞生长的微环境，起到抗菌和组织再生的作用，促进血管的快速修复。
本发明的有益效果在于：
1.本发明利用同轴静电纺技术制备得到具有同轴结构的纤维，直接在接收滚筒上形成纤维膜，可将生长因子或药物通过原位静电纺或浸渍、涂覆等后处理方式负载至纤维膜上，并利用材料的相变性质在磁力作用下形成小粒径纤维膜微球，便于注射至体内，使纤维膜可无痛无害进入体内；纤维膜以纤维膜微球的形式注射至损伤位置，在外加磁场的作用下移动到靶向部位，而纤维膜微球通过纤维中的相变材料在体内接近相变温度的条件下，逐渐恢复为纤维膜，贴合在伤口处，以内置敷料的形式缓释药物已达到快速修复血管的作用。
2.本发明制备的纤维膜微球具有良好的生物相容性和抗菌抑菌效果，具有微观三维网络结构的纤维和宏观三维网络结构的纤维膜，可以药物载体负载大量药物，同时较大的比表面积有利于细胞粘附、分化和增殖，为细胞生长提供细胞外基质，以敷料形式在人体内用于血管的修复，有效促进血管的再生；此外，本发明制备的纤维膜微球在人体内可完全降解或被代谢，保证使用安全性。
附图说明
图1为本发明纤维膜微球制备过程及体内应用流程图；
图2为实施例1中同轴静电纺制备薄膜的装置示意图；
图3为实施例1中对制备的纤维薄膜进行抗菌处理的示意图；
图4为实施例1中制备纤维膜微球的装置示意图；
图5为实施例1中制备纤维膜微球过程中的纤维膜的形状变化示意图。
图6为纤维膜微球注入体内的形状变化示意图。
其中，1、推注泵；2、壳层溶液注射器；3、壳层溶液；4、芯层溶液注射器；5、芯层溶液；6、同轴针头；7、静电纺纤维；8、滚筒；9、静电纺薄膜；10、铜氨溶液；11、圆形螺旋通道；12、微球；13、圆形螺旋通道的梯形横截面；14、磁场；15、轻微变形后的薄膜；16、被挤压出球形的薄膜；17、微球注射器；18、人体皮肤；19、血管；20、血管破损处；21、薄膜修复血管。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，具体制备方法如下：
(1)首先将蚕茧中的蚕蛹除去，放入煮沸的0.6wt％的Na2CO3水溶液中，搅拌35min，用离子水洗涤，直至滑腻感消失，完成脱胶，使用9.0M LiBr水溶液在45℃恒温条件下溶解脱胶丝，静置完全后，再通过稀释、离心、抽滤等步骤，获得质量分数为33wt％的再生丝素蛋白(RSF)水溶液；
将质量分数为33wt％的RSF水溶液与3wt％的壳聚糖(CS)水溶液以质量比为97：3混合制得总浓度为28％的RSF/CS共混水溶液，添加由量比为6:1的PEG1000-2和PEG1500复配而成的PEG相变微胶囊，添加量为共混水溶液的8％。同时加入100mL的VEGF水溶液(25μg/mL)，混合均匀，并浓缩溶液的质量分数为可纺质量分数33wt％，作为壳层溶液；
将壳层溶液，芯层溶液(液态金属镓)通过同轴静电纺进行静电纺丝。纺丝参数为内管外径为0.6mm，内径为0.4mm，外管外径为3.0mm，内径为2.0mm；壳层溶液纺丝流速为0.7mL/h，芯层纺丝速率为0.15mL/h，纺丝电压为20kV，纺丝距离为15cm，辊筒速度为2000rpm，形成壳-芯复合纳米纤维，并在接收滚筒上形成薄膜。
(2)将薄膜放入浓度为0.01mol/L的铜氨溶液进行抗菌处理，将抗菌处理后的薄膜放在温度为36～37℃环境中，利用磁力迅速通过内径逐渐减小的圆形螺旋通道(入口半径为50～60mm，出口半径为1～1.5mm)，形成纤维膜微球并在-5～0℃下冷却固定。该螺旋通道置于一个关于螺旋通道的八极对称的磁场中，薄膜在顺时针旋转的同时通过该螺旋通道，在外界磁力的引导下，薄膜产生一个向外的径向力，以及通道转弯时产生的离心力和惯性效应结合，形成表面均匀的微球，微球粒径的分布范围为300～600μm。电磁力产生装置包括永磁铁、电极等等，永磁铁尺寸为40mm×30mm×20mm，电极直径为4mm、高度为30mm。将制备的微球在室温(～23℃)静置1周，仍保持完整的微球形貌。
实施例2
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：仅置换壳层溶液中的可生物降解纤维基质，将实施例1中的再生丝素蛋白置换为聚己内酯。
实施例3
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：仅置换壳层溶液中的可生物降解纤维基质，将实施例1中的再生丝素蛋白置换为丝蛋白。
实施例4
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：降低了壳层溶液中加入的VEGF水溶性的浓度，由25μg/mL降至20μg/mL。
实施例5
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：将纺丝电压由20kV调整为15kV。
对比例1
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：未将纤维膜进行抗菌处理，制备成纤维膜微球。
对比例2
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：纤维膜通过螺旋通道后形成微球状，未进行冷却固型。在室温(～23℃)静置1d后，微球全部展开。
对比例3
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，制备方法与实施例1的区别在于：将螺旋通道置换为具有直通道的喇叭口，喇叭口通道的入口半径为50～60mm，出口半径为1-1.5mm，得到的产物形状不一且大小不均匀。
对比例4
本实施例涉及一种纤维膜微球的制备，具体制备方法如下：
(1)首先将蚕茧中的蚕蛹除去，放入煮沸的0.6wt％的Na2CO3水溶液中，搅拌35min，用离子水洗涤，直至滑腻感消失，完成脱胶，使用9.0M LiBr水溶液在45℃恒温条件下溶解脱胶丝，静置完全后，再通过稀释、离心、抽滤等步骤，获得质量分数为33wt％的再生丝素蛋白(RSF)水溶液；
将质量分数为33wt％的RSF水溶液与3wt％的壳聚糖(CS)水溶液以质量比为97：3混合制得总浓度为28％的RSF/CS共混水溶液，加入100mL的VEGF水溶液(25μg/mL)，混合均匀，并浓缩溶液的质量分数为可纺质量分数33wt％，作为壳层溶液；
(2)将壳层溶液，芯层溶液(液态金属镓)通过同轴静电喷雾装置进行静电喷雾，以铝箔阴极接地为搜集板。工艺参数：内管外径为0.6mm，内径为0.4mm，外管外径为3.0mm，内径为2.0mm；壳层溶液推进速率0.7mL/h，芯层纺丝推进速率为30μL/h，电压为10kV，接收距离为15cm，形成壳-芯复合微球，微球的粒径范围为300～500μm。
性能测试
对上述实施例1～5以及对比例1、4制备的纤维膜微球进行细胞增殖实验，通过分析细胞潜伏期和指数生长期的贴壁和增殖情况来观察不同实验参数对血管细胞的影响。测试方法如下：
将6组纤维膜微球分别放置在20孔的培养板中。每孔培养板中注入550μL的细胞悬浮液，并放在CO2培养箱中，保持箱内温度为36～37℃。采用MTT比色法检测4d、8d、12d、16d的细胞生长情况(4天更换一次细胞培养液)，有4个平行样品，取平均值。在一定细胞范围内，MTT还原产生的结晶量与活细胞同步增长，所以光吸收系数(A值)可体现活细胞数量，从而间接表现出细胞增殖生长情况。测试结果如下表1所示：
表1细胞增殖情况
| 培养时间 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 对比例1 | 对比例4 |
| 4d | 1.03 | 0.91 | 0.99 | 0.89 | 0.78 | 0.93 | 1.05 |
| 8d | 1.76 | 1.64 | 1.71 | 1.63 | 1.44 | 1.35 | 1.36 |
| 12d | 2.11 | 2.01 | 2.08 | 1.92 | 1.74 | 1.53 | 1.49 |
| 16d | 2.32 | 2.13 | 2.27 | 2.01 | 1.89 | 1.72 | 1.58 |
由表1中细胞增殖结果可知，实施例1～5制备的纤维膜微球培养的细胞的增殖速度相对较快，且实施例1和实施例3制备的纤维膜微球更有利于细胞的增殖，在短期内，细胞的成活率较高；对比例4采用同轴静电喷雾技术直接制备微球，在培养过程中始终保持微球状态，而实施例1～5以及对比例1制备的纤维膜微球，在培养基中逐渐恢复成薄膜状，比表面积增大，更有利于细胞增殖。
本发明进一步研究了实施例1、对比例1以及对比例4制备的微球在37℃下释放生长因子的情况以及生物降解性，并对比实施例1及对比例1制备的纤维膜微球的抗菌活性，具体的测试方法如下：
生长因子缓释量测试：将实施例1、对比例1和对比例4处理后的纤维材料分别置于1mL浓度为0.25g/L的NaN3(以防纤维材料腐败发霉)的PBS缓冲液中，37℃恒温摇床100rpm的环境中进行实验。于4d、8d、12d、16d四个时间点每次取350μL的缓释液，并加入350μL新鲜PBS缓释液，并将取好的缓释样品放在低温中冷藏，利用ELISA试剂盒测试其缓释量；
生物降解性能：参考测试标准GB/T33616-2017；
抗菌活性：采用菌落计数法和SEM研究来判断抗菌、抑菌性能，选取单大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)为试验菌，放置于培养基中，在37℃的恒温摇床150rpm下震荡培养，利用新鲜培养基和PBS缓冲液调整细菌浓度，放入等量实施例1或对比例1制备的纤维膜微球，继续培养数小时，加入PBS缓冲液超声震荡，均匀涂抹于琼脂板上培养并计数来判断其抗菌能力。
上述性能测试结果如下表2所示：
表2不同纤维膜微球的生长因子缓释量、抗菌活性以及生物降解率
由表2可知，上述实施例及对比例制备的微球均具有良好的生物降解性，其中实施例1与对比例1制备的纤维膜微球可实现药物的长期缓释，且缓释量远高于对比例4采用同轴喷射技术制备的微球，这是由于本发明制备的纤维膜微球在37℃下恢复成纤维膜，与缓冲液相接触的比表面积增大，生长因子缓释量增加。此外，实施例1制备的纤维膜微球通过纤维膜材料本身的抗菌特性结合制备微球前的抗菌处理，表现出优异的抗菌活性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种微流控静电纺纤维膜微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将壳层溶液与芯层溶液通过同轴静电纺制备具有壳-芯结构的复合纳米纤维，并在接收滚筒上形成薄膜；所述壳层溶液包含可生物降解纤维基质、壳聚糖与PEG相变材料，所述PEG相变材料的相变温度为36~37 ℃；所述芯层溶液为液态金属镓或镓基合金；
（2）在36~37 ℃下，将步骤（1）制备的薄膜在外部磁力吸引下通过内径逐渐减小的螺旋通道，在出口处降温冷却得到所述纤维膜微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述壳层溶液中可生物降解纤维基质、壳聚糖与PEG相变材料的质量比为4~5:0.1~1:1；所述可生物降解纤维基质为聚己内酯、丝蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述壳层溶液还包含VEGF生长因子、基质细胞衍生因子-1α、肝素中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述PEG相变材料由PEG1000-2和PEG1500以质量比6:1复配得到PEG相变微胶囊，相变温度为36.5 ℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述复合纳米纤维的直径为280~400 nm，壳层的厚度为100 ± 15 nm，芯层的直径为140 ± 30 nm；所述薄膜的厚度为10 μm ~14 μm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述薄膜为抗菌处理后的薄膜，所述抗菌处理具体为：将步骤（1）制备的薄膜浸渍于铜氨溶液中，干燥处理后得到所述抗菌处理后的薄膜。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述螺旋通道的入口半径为50 mm ~60 mm，出口半径为1 mm ~1.5 mm。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述纤维膜微球的平均粒径为250 μm~600 μm。
9.一种权利要求1~8任一项所述的制备方法制备的微流控静电纺纤维膜微球。
10.一种权利要求9所述的微流控静电纺纤维膜微球在制备血管修复材料方面的应用，其特征在于，将分散有纤维膜微球的溶液注射到体内损伤血管位置，利用磁力引导微球至待修复血管处，微球在体内逐渐展开为纤维膜并贴合在损伤血管处。
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| GR01 | Patent grant | ||
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