CN115873670B - 一种消除核酸污染的生物酶清除剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种消除核酸污染的生物酶清除剂及其制备方法，所述生物酶消除剂的组分包括全能核酸酶、缓冲液、辅助因子和稳定剂，在上述各组分的协同作用下，所述生物酶清除剂具有无强氧化性、无腐蚀性、无毒性的特点，不会伤害到人体或破坏物体表面；施用操作简单，无需分两步操作，一管式喷洒即可清除核酸污染；相比现有技术中的核酸酶清除剂，本发明所述生物酶清除剂，施用一段时间后会自动降解，不会造成残留或二次污染；本发明所述生物酶清除剂不仅可以在常温下高效发挥作用，还可以应用在低温环境，从而能够适用于各种环境温度下的核酸清除。

Description

一种消除核酸污染的生物酶清除剂及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种消除核酸污染的生物酶清除剂及其制备方法。

背景技术

自1985年首次发表关于引物介导的DNA序列酶促扩增以来，核酸扩增技术逐渐应用于动植物、微生物等的检测。相比于传统的免疫学和分离培养技术，核酸检测技术研发周期短，具有更好的灵敏度和特异性，准确性高，重复性好，可短时间内实现模板百万倍扩增。PCR已成为目前应用最广泛的核酸检测技术，近几年还开发了其他核酸扩增方法，例如连接酶链反应、转录介导的扩增、链置换扩增等。

核酸检测技术是优点之一即超高灵敏度，但这种核酸扩增检测的优点同时也是一个缺点，因为即使是最少量的污染DNA或RNA也可以被扩增。这种污染DNA或RNA的扩增则会导致假阳性结果，影响检测的准确性。核酸污染的发生体现在整个检测环节的全过程，如核酸抽提过程中的产物泄露，检测环节扩增产物泄露形成的气溶胶等，这些污染都会粘附至仪器或衣服表面，随着人员流动污染物料、试剂，从而污染整个实验室。核酸污染发生后极难清除，因此防止和消除核酸污染是分子生物实验室的重点。

防止核酸污染的方法主要包括物理隔离法和化学消除法。物理隔离法主要是通过分区对核酸污染进行隔绝，且逐级负压，但实际操作中不能完全阻隔污染，防不胜防，只能减缓污染的发生。化学消除法中通常实现消除污染核酸的方法是辐射、次氯酸、盐酸羟胺，或活性氧自由基。紫外线辐照机制基于碱基的氧化、单链和双链断裂的诱导以及相邻嘧啶碱基之间环丁烷环的形成。环丁烷环形成链内嘧啶二聚体，抑制聚合酶介导的链延长。但辐照对于小片段核酸的消除效果较差，且在消除干燥DNA方面的效果要差得多，此外还可能会影响PCR试剂的活性。次氯酸利用其强氧化性可直接将核酸降解。盐酸羟胺是一种诱变剂，会破坏正常的核酸配对。盐酸羟胺修饰的PCR产物似乎不会结合和修饰其他PCR试剂。但两种方法都存在一定的安全性，且清除能力受到多方面因素的影响，效果参差不齐。活性氧自由基方法主要通过过氧化氢与金属离子的作用消化核酸污染。该方法主要是解决常温下物品表面的核酸污染问题，不适用解决气溶胶污染。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种消除性能好、无强氧化性和腐蚀性、安全无毒消除核酸污染的生物酶清除剂及其制备方法。本发明所述生物酶清除剂不仅可以在常温下高效发挥作用，还可以应用在低温环境，能够快速清除物体表面的核酸及气溶胶污染。本发明所述清除剂的残余物待风干后一段时间自动降解，不会残留在表面对机器等造成影响，无毒性，有效避免对操作者的伤害，污染清除率高，应用范围广阔。

本发明所采用的技术方案为：

一种消除核酸污染的生物酶清除剂，包括以下组分：

全能核酸酶，0.01-50U/μl；

缓冲液，5-40mM；

辅助因子，0.2-20mM；

稳定剂，0.01％-50％；

水，余量。

所述全能核酸酶(BenzoNμclease)是一种经基因工程改造的核酸内切酶，可降解双链、单链、线状、环状的DNA和RNA，完全将核酸降解成3-5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。因其能高效降解任何形式的DNA和RNA，在科研和医药领域也有着广泛应用。

所述生物酶清除剂的pH值为7-9。

所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)中的一种或几种的混合物。

所述辅助因子为氯化钠、氯化镁、醋酸镁中的一种或几种的混合物。

所述稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)、吐温20、TritonX-100中的一种或几种的混合物。

所述的消除核酸污染的生物酶清除剂，包括A液和B液，所述A液与B液的体积之比为1：9；

所述A液的组成包括全能核酸酶、MgCl₂、NaCl、Tris-HCl、甘油和水；

所述B液的组成包括MgCl₂、NaCl、Tris-HCl、BSA和水。

所述A液的组成为：

终浓度为0.1-50U/μl的全能核酸酶，终浓度为0.2-3mM的MgCl₂，终浓度为1-20mM的NaCl，终浓度为5-40mM的Tris-HCl，终浓度为10-50％的甘油，终浓度为0.01％-1％的BSA，余量的水。

所述B液的组成为：

终浓度为0.2-3mM的MgCl₂，终浓度为1-20mM的NaCl，终浓度为5-40mM的Tris-HCl，终浓度为0.01％-1％的BSA，余量的水。

所述消除核酸污染的生物酶清除剂的制备方法，具体如下：

分别配制A液和B液，按照体积比1：9取A液和B液并进行充分混匀，即得所述生物酶清除剂。

本发明的有益效果为：

本发明所述的消除核酸污染的生物酶清除剂，组分包括全能核酸酶、缓冲液、辅助因子和稳定剂，在上述各组分的协同作用下，所述生物酶清除剂具有无强氧化性、无腐蚀性、无毒性的特点，不会伤害到人体或破坏物体表面；施用操作简单，无需分两步操作，一管式喷洒即可清除核酸污染；相比现有技术中的核酸酶清除剂，本发明所述生物酶清除剂，施用一段时间后会自动降解，不会造成残留或二次污染；本发明所述生物酶清除剂不仅可以在常温下高效发挥作用，还可以应用在低温环境，从而能够适用于各种环境温度下的核酸清除。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示为本发明所述生物酶清除剂对不同类型核酸的清除效果图；

图2A显示为不同核酸清除剂对人基因组DNA中核酸的清除效果对比图；

图2B显示为不同核酸清除剂对019质粒中核酸的清除效果对比图；

图2C显示为不同核酸清除剂对人293细胞抽提RNA中核酸的清除效果对比图；

图2D显示为不同核酸清除剂对体外转录ssRNA中核酸的清除效果对比图；

图3A显示为春季室温下(25℃±5℃)生物酶清除剂的核酸清除效果图；

图3B显示为冬季室温下(4℃±5℃)生物酶清除剂的核酸清除效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种消除核酸污染的生物酶清除剂，所述生物酶清除剂为一管式混合液，由A液和B液组成，具体采用如下方法制备得到：

(1)配制A液：全能核酸酶(Novoprotein，M056)终浓度为1U/μl，MgCl₂的终浓度为1mM，NaCl的终浓度为2mM，Tris-HCl的终浓度为20mM，甘油的终浓度为50％，BSA的终浓度为0.01％，采用试剂用水(高温高压蒸汽灭菌处理过的超纯水)定容至50ml；

(2)配制B液：MgCl₂的终浓度为1mM，NaCl的终浓度为2mM，Tris-HCl的终浓度为20mM，BSA的终浓度为0.01％，采用试剂用水定容至450ml；

(3)核清除剂制备：将50ml A液与450ml B液完全混合，即得所述生物酶清除剂。

实施例2

本实施例提供一种消除核酸污染的生物酶清除剂，所述生物酶清除剂为一管式混合液，由A液和B液组成，具体采用如下方法制备得到：

(1)配制A液：全能核酸酶终浓度为0.5U/μl，MgCl₂的终浓度为1.5mM，NaCl的终浓度为2mM，Tris-HCl的终浓度为25mM，甘油的终浓度为50％，BSA的终浓度为0.02％，采用试剂用水(高温高压蒸汽灭菌处理过的超纯水)定容至50ml；

(2)配制B液：MgCl₂的终浓度为1.5mM，NaCl的终浓度为2mM，Tris-HCl的终浓度为25mM，BSA的终浓度为0.02％，采用试剂用水定容至450ml；

(3)核清除剂制备：将50ml A液与450ml B液完全混合，即得所述生物酶清除剂。

实施例3

本实施例提供一种消除核酸污染的生物酶清除剂，所述生物酶清除剂为一管式混合液，由A液和B液组成，具体采用如下方法制备得到：

(1)配制A液：全能核酸酶终浓度为2U/μl，MgCl₂的终浓度为2.5mM，NaCl的终浓度为1.5mM，Tris-HCl的终浓度为20mM，甘油的终浓度为40％，BSA的终浓度为0.01％，采用试剂用水(高温高压蒸汽灭菌处理过的超纯水)定容至50ml；

(2)配制B液：MgCl₂的终浓度为2.5mM，NaCl的终浓度为1.5mM，Tris-HCl的终浓度为20mM，BSA的终浓度为0.01％，采用试剂用水定容至450ml；

(3)核清除剂制备：将50ml A液与450ml B液完全混合，即得所述生物酶清除剂。

实验例

1、实施例1所述生物酶消除剂用于消除不同类型核酸污染

准备12个相同的0.2ml EP管，分别记为1-12号管。1-2号管中加入0.5μgLambdaDNA酶切片段，3-4号管中加入0.5μg PμC19酶切片段，5-6号管中加入0.5μg 800bp PCR产物，7-8号管中加入0.5μg pBAD质粒，9-10号管中加入0.5μg Lambda DNA酶切片段，11-12号管中加入0.5μg 800bp PCR产物。向双号管中加入10μL生物酶清除剂，静置60min；同时，向单号管中补加10μl试剂用水作为对照。

分别用1％琼脂糖胶电泳检测12个EP管中的样品，在凝胶成像仪下观察图像，结果如图1所示。

图1显示了本发明实施例1所述生物酶清除剂对不同类型核酸的清除效果图。泳道M：DNA Ladder 2000；泳道1：Lambda DNA酶切片段；泳道2：Lambda DNA酶切片段+生物酶清除剂；泳道3：PUC19酶切片段；泳道4：PUC19酶切片段+生物酶清除剂；泳道5：PUC19质粒；泳道6：PUC19质粒+生物酶清除剂；泳道7：pBAD质粒；泳道8：pBAD质粒+生物酶清除剂；泳道9：Lambda DNA；泳道10：Lambda DNA+生物酶清除剂；泳道11：800bp PCR产物片段；泳道12：800bp PCR产物片段+生物酶清除剂。从图1中可以看出：单号管中各类型核酸仍旧存在，而加入了生物酶清除剂的双号管中未观察到任何亮带，表明双号管中核酸消化完全，从而说明所述生物酶清除剂适用于质粒、酶切片段、扩增产物等不同类型核酸的消除。

2、本发明所述生物酶消除剂与市售核酸消除酶的核酸消除效果对比

准备0.2ml EP管。管中分别加入0.5μg样品、不同类型的核酸清除剂10μl，试剂用水补充至20μl。同时设置不加核酸清除剂的阴性对照组。室温静置30-60min。

分别用1％琼脂糖胶电泳检测EP管中的样品，在凝胶成像仪下观察图像，并通过RT-qPCR检测核酸残留量，检测结果如图2A-图2D所示。

qPCR反应体系、qPCR反应程序分别如表1、表2所示。

表1-qPCR反应体系

表2-qPCR反应程序

图2A-图2D显示了不同类型核酸清除剂的清除效果图。A：加入样品为人基因组DNA；B：加入样品为019质粒；C：加入样品为人293细胞抽提RNA；D：加入样品为体外转录ssRNA。图2A-图2D中，“1”代表样品与本发明实施例1所述核酸清除剂孵育；“2”代表样品与市售活性氧自由基类型核酸清除剂孵育；“3”代表样品单独孵育，无核酸清除剂。结果表明本发明实施例1所述生物酶核酸清除剂与市售活性氧自由基类型核酸清除剂效果一致，能有效去除DNA或RNA样本。

3、实施例1所述生物酶消除剂用于实际环境下核酸污染的清除效果

将500ml本发明实施例所述生物酶清除剂装入干净的喷壶中，对实验室台面、地面、墙面、金属仪器表面、门把手等进行喷洒。静置60min，使用无菌棉签进行取样，取样后的棉签置于1ml RNase Free Water中浸泡20min，取10ul进行RT-qPCR检测核酸残留量，结果如图3A和图3B所示。

qPCR反应体系、qPCR反应程序分别如表3、表4所示。

表3-qPCR反应体系

表4-qPCR反应程序

图3A和图3B显示了不同环境温度下生物酶清除剂用于实际环境的核酸清除效果图。A；春季室温环境(25℃±5℃)B：冬季室温环境(4℃±5℃)。结果表明，环境温度的变化不影响生物酶清除剂的核酸清除效果；且生物酶清除剂处理后可消除各种物体表面的核酸环境污染。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种消除核酸污染的生物酶清除剂，其特征在于，包括A液和B液，所述A液与B液的体积之比为1：9；

所述A液的组成为：

终浓度为0.1-50U/μl的全能核酸酶，终浓度为0.2-3mM的MgCl₂，终浓度为1-20mM的NaCl，终浓度为5-40mM的Tris-HCl，终浓度为10-50%的甘油，终浓度为0.01%-1%的牛血清白蛋白，余量的水；

所述B液的组成为：

终浓度为0.2-3mM的MgCl₂，终浓度为1-20mM的NaCl，终浓度为5-40mM的Tris-HCl，终浓度为0.01%-1%的牛血清白蛋白，余量的水。

2.根据权利要求1所述的消除核酸污染的生物酶清除剂，其特征在于，所述生物酶清除剂的pH值为7-9。

3.根据权利要求1-2任一项所述的消除核酸污染的生物酶清除剂的制备方法，其特征在于，具体如下：

分别配制A液和B液，按照体积比1：9取A液和B液并进行充分混匀，即得所述生物酶清除剂。