CN115850429A - 一种诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白、多克隆抗体及制备方法 - Google Patents
一种诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白、多克隆抗体及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种一种诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白、多克隆抗体及制备方法，解决了目前国内外没有较好的特异性识别Rhox10蛋白的抗体的问题。包括，构建编码小鼠Rhox10蛋白的重组质粒pET‑28a‑Rhox10；将该重组质粒导入表达大肠杆菌中诱导表达原核蛋白；纯化后获得pET‑28a‑Rhox10小鼠原核表达蛋白；将该pET‑28a‑Rhox10小鼠原核表达蛋白复性后作为抗原免疫新西兰大白兔；采血，收集抗血清，获得小鼠Rhox10多克隆抗体。利用本方法可以获得特异性识别Rhox10蛋白的多克隆抗体，为深入研究Rhox10在小鼠精子发生过程中的作用及分子机制奠定了实验基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及到一种诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白、多克隆抗体及制备方法。
背景技术
小鼠Rhox10是人类RhoxF1基因的直系同源基因，定位于X染色体，特异性表达于睾丸、附睾、胎盘和卵巢组织；在雄性小鼠睾丸中，Rhox10表达于精原细胞和减数分裂早期精母细胞，其为核质穿梭表达蛋白。
Rhox10蛋白具有特异性亚细胞定位和阶段性表达模式，核质穿梭表达于各个阶段的精原细胞以及大部分精母细胞。Rhox10作为一种关键的转录因子，它将精原细胞置于适当的壁龛中，调节精原细胞池最初的产生和维持，但是具体的作用机制仍然不清楚。
为了更好地研究其在精子发生中的作用及机制，需要获得其特异性抗体。目前国内外没有较好的特异性识别Rhox10蛋白的商品化抗体。
因此，本领域亟需一种特异性识别Rhox10蛋白的抗体，以期为深入研究Rhox10在小鼠精子发生进程中的分子机制奠定基础。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白，包括，
其氨基酸序列如SEQ ID：4所示。
作为本发明所述的抗原蛋白一种优选方案，其中：所述抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID：3所示。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗原蛋白的制作方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗原蛋白的制作方法，包括，
构建含有核苷酸序列如SEQ ID：3所示的表达载体；
将表达载体导入大肠杆菌表达态细胞诱导表达；
纯化、复性后获得诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白。
本发明的第三个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种含有抗原蛋白基因的重组表达载体。
作为本发明所述的重组表达载体一种优选方案，其中：所述将所述的基因插入到大肠杆菌表达载体中获得。
作为本发明所述的重组表达载体一种优选方案，其中：所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。
本发明的第四个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到的转基因重组菌。
作为本发明所述的转基因重组菌的一种优选方案，其中：所述的大肠杆菌为E.coli BL21。
本发明的第五个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的制备方法，将所述的抗原蛋白免疫新西兰大白兔制得。
作为本发明所述的小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的制备方法的一种优选方案，其中：包括：
将小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白免疫新西兰白兔；
免疫后采血，获取抗血清；
利用抗原亲纯化法获得小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体。
本发明有益效果：
本发明提供一种诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白、多克隆抗体及制备方法，与现有技术相比，发明人首次通过克隆获得了用于诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列；
发明人首次成功克隆了编码上述蛋白的基因，并构建了相应的表达载体；通过体外诱导的方式获得了大量的抗原蛋白；将抗原蛋白面议新西兰大白兔后制得了多克隆抗体；并确定了抗体效价；该抗体能够特异性识别原核表达的小鼠Rhox10蛋白；基于此，可以定位小鼠Rhox10蛋白在睾丸中的表达，为研究Rhox10在小鼠精子发生进程中的分子机制奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是本发明中PCR扩增结果，目标条带大小为597bp；
图2是本发明中重组质粒与Rhox10抗原蛋白基因对比，无突变，说明重组质粒构建成功；Query为重组质粒，Sbjct为Rhox10抗原蛋白；
图3是本发明中pGEM-T-Easy-Rhox10重组质粒EcoRⅠ酶切鉴定图，目的片段597bp；
图4是本发明中pET-28a-Rhox10重组质粒EcoRⅠ和XhoI双酶切鉴定，目的片段597bp；
图5是本发明中表达蛋白的SDS-PAGE检测，结果表明蛋白主要在沉淀中；
图6是本发明中SDS-PAGE 检测纯化及洗脱；洗脱效率最高为100 mmol/L 咪唑洗脱；
图7是本发明中SDS-PAGE 检测梯度复性效率；
图8是本发明中ELISA检测免疫后的抗血清，结果显示2-4号新西兰大白兔均有免疫性，且效价均能达到1∶1 000 000；
图9是本发明中Western blot法检测Rhox10多克隆抗体特异性，说明是特异性识别的rhox10蛋白。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
小鼠Rhox10基因获取及表达载体的构建
从NCBI网站获取小鼠Rhox10基因的开放阅读框序列，使用Gene Runner软件设计特异性引物，Rhox10前向引物核苷酸序列如SEQ ID：1所示；其中酶切位点为“GAATTC”。
反向引物核苷酸序列如SEQ ID：2所示；其中酶切位点为“CATATG”。
取新鲜成年小鼠的睾丸组织，去白膜，称取50~100mg，液氮研磨成粉末，加入TRIzol试剂提取其总RNA。测总RNA浓度，利用TaKaRa逆转录试剂盒，合成cDNA。以成年小鼠睾丸组织cDNA为模板，利用Rhox10特异性引物，进行PCR 扩增。PCR反应体系为：每50μl反应混合液包含终浓度为10×Buffer 5μl、25nmol MgCl2 4μl、 10nmol F 3μl、10nmol R 3μl、10μmol dNTP 1.5μl、5U Taq酶0.5μl、cDNA 2μl，无菌水补充至50μ；PCR 反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，58℃退火1min，72℃延伸40 s，反应35个循环； 72℃终止延伸10 min，16℃ 保存扩增产物。
如图1所示，目的条带大小597bp。
1.2%琼脂糖凝胶电泳分离 PCR扩增产物并切胶纯化。
步骤如下：（1）紫外灯下切胶、称重；（2）加入3个凝胶体积的buffer DE-A 75℃水浴混匀；（3）加入0.5个buffer DE-A体积的buffer DE-B混匀；（4）吸取混合液转移至DNA制备管，2ml，12000g离心1min，弃滤液；（5）加入500μl buffer W1 12000g离心30s 弃滤液；（6）加入700μl buffer W2 12000g离心30s 弃滤液；（7）加入700μl buffer W2 12000g离心1min 弃滤液；（8）空转 12000离心1min；（9）将制备管放置于新的1.5ml制备离心管中，在制备膜中央加入25μl 、65℃无菌水，静置1min；（10）12000g离心1min；（11）测浓度、标记。
将纯化产物与pGEM-T-Easy克隆载体相连接，将连接产物转化入感受态细胞中，挑选目标质粒。
步骤如下：（1）利用T4 DNA连接酶将纯化产物与pGEM-T-Easy克隆载体相连接，16℃空气浴过夜；（2）将连接产物转移至E.coli JM109感受态细胞中；（3）采用蓝白斑筛选法，挑选白色单克隆菌落，摇均过夜，提取质粒后，使用限制性内切酶 EcoRⅠ酶切，37℃水浴过夜。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，选取质粒送至华大基因进行测序鉴定，无突变，获得pGEM-T-Easy-Rhox10重组质粒。如图2所示，重组质粒与Rhox10抗原蛋白基因对比，无突变，说明重组质粒构建成功。如图3所示，pGEM-T-Easy-Rhox10重组质粒EcoRⅠ酶切鉴定图，目的片段597bp。
pET-28a表达载体和 pGEM-T-Easy-Rhox10重组质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和XhoI双酶切后，1.2%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段，将回收的Rhox10目的片段、Rhox10表达载体相连接，转化到感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的LB固体平板上培养。挑选单克隆菌落，经限制性内切酶 EcoRⅠ和XhoI双酶切后，挑选出阳性的pET-28a-Rhox10重组质粒。
如图3所示pET-28a-Rhox10重组质粒EcoRⅠ和XhoI双酶切鉴定，目的片段597bp。
实施例2：
小鼠Rhox10蛋白的表达
将pET-28a-Rhox10重组质粒导入E.coli BL21 感受态细胞中，在卡那霉素抗性的LB 固体培养基上培养。具体步骤如下：（1）将感受态冰上融化；（2）分别加入1μl与4μl pET-28a-Rhox10质粒，冰浴30min；（3）42℃热休克90s，迅速取出后冰浴2min；（4）没之中加入950μl SOC培养基，37摄氏度；225rpm，摇1h10min；（5）10000rpm 10-30s，去上清，刘50~100μl重悬沉淀， 涂布于卡那霉素抗性的LB固体平板上37摄氏度培养过夜。挑选阳性单克隆菌落于5 m L卡那霉素抗性的LB液中，37℃，225 r/min，培养过夜。
次日，将所有菌液加入 500 m L卡那霉素抗性的 LB 液中，37℃，225 r/min，培养3 h。取1 m L菌液于试管中，作为阴性对照，向剩余菌液中加入诱导剂 IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，225 r/min，诱导 4 h。SDS-PAGE检测阴性对照、诱导后菌液，判断原核蛋白是否表达。
诱导后的菌液表达蛋白，离心收集菌体并加入60 m L重悬缓冲 液 ( 50 mmol /L Tris-HCl、1 mmol / L EDTA、250 m L / L 蔗糖、10 mmol / L DTT，pH = 8.0) 充分重悬。重悬后加入4.2 mL细菌裂解液（ 1 mg /m L 溶菌酶、5 mmol/L MgCl2、0.05 mg/mLDNaseⅠ、10 m L / L Triton X-100、10 mmol / m L DTT） ，磁力搅拌仪半速旋转裂解30min。裂解后的菌液冰浴超声3次，收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE检测。
如图5所示表达蛋白的SDS-PAGE检测，结果表明蛋白主要在沉淀中。
实施例3：
小鼠Rhox10蛋白的复性与纯化
上述沉淀用 15 m L洗涤液 ( 50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、1 mmol /L EDTA、10 mmol / m L DTT，pH = 8.0) 洗涤，最终溶于10 m L 8 mol/L 尿素，4℃过夜。次日离心，收集上清。
上清液用Ni-NTA 亲和层析柱纯化，( 25、50、100、200) mmol / L咪唑分别洗脱层析柱，收集过柱上清液和洗脱液，SDS-PAGE 检测纯化及洗脱效率。将洗脱效率最高的100mmol/L 咪唑洗脱液装入处理好的透析袋中，置入尿素溶液中梯度复性，收集蛋白溶液，SDS-PAGE检测复性效率。
如图6所示，SDS-PAGE 检测纯化及洗脱效率：洗脱效率最高为100 mmol/L 咪唑洗脱。如图7所示显示梯度复性效率。
实施例4：
小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体制备与鉴定
选取4只新西兰大白兔作为试验对象，1号图作为免疫前取血作为对照组；2-4号兔进行免疫，具体步骤如下；BCA 法测定复性后的Rhox10蛋白溶液，1mL/L PBS稀释至1mg/mL，与等体积Freund完全佐剂或不完全佐剂混合，冰上乳化，最终浓度为0.5mg/mL，分5点背部皮下注射，每只兔子注射0.5mg蛋白。
第一次免疫，抗原剂量为0.5mg，使用完全弗氏佐剂；第一次免疫一周后进行第二次免疫，抗原剂量为0.25mg，使用不完全弗氏佐剂；第二次免疫两周后进行第三次免疫，抗原剂量为0.25mg，使用不完全弗氏佐剂；第三次免疫两周后进行第四次免疫，抗原剂量为0.25mg，使用不完全弗氏佐剂；第四次免疫两周后进行第五次免疫，抗原剂量为0.25mg，使用不完全弗氏佐剂。
第五次免疫后7天，取耳缘静脉血测效价，效价达标后取全血大量制备抗血清；纯化复性获得多克隆抗体。
ELISA 检测Rhox10多克隆抗体效价
BCA 法测定纯化的 Rhox10 蛋白溶液浓度，包被液（ 碳酸盐缓冲液） 将其稀释至5ug /m L，96孔酶标板每孔包被100 μL，放入湿盒中，4℃过夜。次日，去除包被液，扣干，0.5ml/L PBS-T溶液洗涤5min×3次，每孔加入150μL含1g/L脱脂奶粉的PBS-T溶液，37℃封闭1h。去除封闭液，扣干，0.5mL/LPBS-T溶液洗涤5min×3次。
加入免疫前稀释比例为1∶10～1∶1000000血清、稀释比例为1∶10～1∶1000000的抗血清、PBS溶液（空白对照），每孔100μL，37℃孵育70min。每孔加入200μL，0.5mL/L PBS-T溶液洗涤5min×3次；每孔加入100μL HＲP标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育50min。去除二抗，0.5ml/L PBS-T溶液洗涤5min×3次，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光反应25min，每孔加入50μL 1mol/L盐酸，终止反应。酶标仪测定450nm处各孔吸光度值，阳性反应的最大稀释度为抗血清的效价。
如图8所示，ELISA检测免疫后的抗血清，结果显示2-4号新西兰大白兔均 有免疫性，且效价均能达到1∶1 000 000。
Western blot法检测Rhox10多克隆抗体特异性
将Rhox10敲除的小鼠睾丸和野生型小鼠睾丸经SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入兔抗Rhox10多克隆抗体(1∶2000) ，4℃冰箱过夜；1 mL/L TBS-T洗膜15 min×3 次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶2500)，室温孵育1h；1mL/LTBS-T洗膜20min×3次，ECL显影。如图9所示，说明是特异性识别的rhox10蛋白。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种用于诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白，其特征在于：包括，
其氨基酸序列如SEQ ID：4所示。
2.如权利要求1所述的抗原蛋白，其特征在于：所述抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID：3所示。
3.如权利要求1所述的抗原蛋白的制作方法，其特征在于：包括，
构建含有核苷酸序列如SEQ ID：3所示的表达载体；
将表达载体导入大肠杆菌表达态细胞诱导表达；
纯化、复性后获得诱导小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白。
4.一种含有如权利要求2所述的抗原蛋白基因的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：将所述的基因插入到大肠杆菌表达载体中获得。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。
7.一种转基因重组菌，其特征是：所述重组菌是将权利要求5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到的转基因重组菌。
8.根据权利要求7所述的转基因重组菌，其特征是：所述的大肠杆菌为E.coli BL21。
9.一种小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征是：将权利要求1所述的抗原蛋白免疫新西兰大白兔制得。
10.权利要求9所述的小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的制备方法，包括：
将小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体的抗原蛋白免疫新西兰白兔；
免疫后采血，获取抗血清；
利用抗原亲纯化法获得小鼠Rhox10蛋白多克隆抗体。
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