CN115844874B - 一种药物组合物及其在制备治疗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种药物组合物及其在制备治疗肝纤维化药物中的应用。将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素制备成纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备方法为：将槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中，得到含药溶液；将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物溶解于50‑60％的乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加含药溶液并进行搅拌，滴毕超声20‑30min，喷雾干燥后即得。所制得的两溶性的肝靶向药物组合物纳米颗粒便于制剂及储存，具有抗纤维化作用，可明显抑制CCl₄诱导肝脏氧化应激、肝星状细胞活化、炎症反应和凋亡。本发明所提供的药物组合物中，槲皮素和番茄红素联合用药不仅明显降低了槲皮素的使用剂量，而且治疗效果更优。

Description

一种药物组合物及其在制备治疗肝纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种药物组合物及其在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

背景技术

肝疾病作为对机体健康造成严重危害的疾病之一。作为各种慢性肝脏疾病共同病理特征的肝纤维化。肝脏的持续性损伤会募集炎症细胞并激活炎症反应，引起细胞外基质的过度增生与沉积，诱发肝纤维化。如果不及时治疗会导致肝功能的衰竭甚至发展为肝硬化或者肝癌。肝纤维化以肝结构破坏、肝星状细胞活化、炎症和细胞外基质积聚为主要特征。氧化应激水平的升高与慢性肝病诱发纤维化密切相关。一方面，受损的肝细胞、浸润的炎症细胞、活化的肝星状细胞是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的主要来源；另一方面，ROS水平的升高会进一步诱导肝星状细胞的活化与炎症反应，最终形成恶性循环。此外，细胞凋亡也参与了肝纤维化的发生与发展过程，肝细胞凋亡小体能够触发肝星状细胞的增殖与活化。现阶段治疗肝纤维化的药物较为缺少，且多数存在比较明显的副作用。因此，寻找安全有效的抗纤维化药物显得尤为迫切。

槲皮素(Quercetin)，其化学名是3,3,4,5,7-五羟基黄酮，是一种多羟基黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中。槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤、抗菌等药理作用。近年来的研究发现，槲皮素在防治肝纤维化方面具有良好的作用，但高剂量的槲皮素却有着较强的毒性，槲皮素的亲脂性强，水溶性差，质量不稳定，因此很有必要开发一种稳定性好、便于制剂及储存的含槲皮素的药物组合物，在可以降低槲皮素使用剂量的同时，也可以对肝纤维化有着较好地治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种药物组合物及其在制备治疗肝纤维化药物中的应用，将槲皮素与番茄红素制备成两溶性的肝靶向药物组合物纳米颗粒，便于制剂及储存，具有良好的抗肝纤维化疗效，可用于制备治疗肝纤维化的药物。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种药物组合物，将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素制备成纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备方法为：将槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中，得到含药溶液；将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物溶解于50-60％的乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加含药溶液并进行搅拌，滴毕超声20-30min，喷雾干燥后即得。

进一步地，所述有机溶剂为丙酮或75-95％的乙醇；所述番茄红素与有机溶剂的固液比为1g∶15-20mL；所述羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与番茄红素的质量比为3∶1，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与50-60％的乙醇的固液比为1g∶60-70mL。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的制备方法为：

S1、将羧甲基壳聚糖加入到50-60％的乙醇溶液中，滴加环氧氯丙烷，然后升温至40-50℃，搅拌4-5h，再加入十二烷基二甲基叔胺，升温至80-90℃，继续反应8-12h，得到羧甲基壳聚糖季铵盐；

S2、将羧甲基壳聚糖季铵盐溶于水溶液中，并用三乙胺将pH调节至8.0；另将乳糖酸溶于水溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5h，然后滴加到含羧甲基壳聚糖季铵盐的水溶液中，升温至30-40℃，反应12-24h，得到羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物。

进一步地，步骤S1中所述羧甲基壳聚糖、环氧氯丙烷、十二烷基二甲基叔胺的质量比为1∶0.5-0.8∶1.0-1.1；步骤S2中所述羧甲基壳聚糖季铵盐、乳糖酸的质量比为1∶1.0-1.1；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的用量均为乳糖酸摩尔量的2倍。

进一步地，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的合成路线为：

本发明提供了一种固体口服制剂，包含上述方案所述药物组合物，其中所述固体口服制剂为片剂、胶囊剂或颗粒剂。

本发明还提供了上述方案所述药物组合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，该药物组合物通过抑制CCl₄诱导的肝脏损伤和肝脏纤维结缔组织增生、肝脏氧化应激、肝星状细胞活化、炎症反应和凋亡，进而起到治疗肝纤维化的作用。

本发明具有如下有益效果：

本发明以良好的生物相容性、生物降解性、抗菌及缓释作用的羧甲基壳聚糖为起始原料，先对其引入同时具有亲水、疏水作用的季铵盐结构，再引入具有肝靶向作用的配体乳糖酸，得到了两亲性羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物，实验结果表明，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物对细胞没有明显的毒性，可以作为药用辅料应用于生物医学领域。将所制得的羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物用于药物载体，能够改善槲皮素水溶性差、质量不稳定的缺点，通过超声法制备得到了含有槲皮素和番茄红素的药物组合物纳米颗粒，该药物组合物纳米颗粒具有肝靶向性，有助于提高槲皮素和番茄红素的疗效，还具有良好的水溶性、脂溶性及稳定性，便于加工制备成不同剂型及药物储存；同时还能够持续、长久起效，其体外释放行为较为缓慢、持久。

本发明通过建立CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型，观察肝靶向药物组合物纳米颗粒对小鼠肝纤维化的治疗作用。实验结果表明，含有槲皮素和番茄红素的肝靶向药物组合物纳米颗粒，可有效改善肝脏功能和结构的损伤，降低肝胶原纤维沉着，缓解肝脏的氧化应激，降低肝巨噬细胞和中性粒细胞的浸润、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体的活化以及炎性因子的分泌水平，减弱肝脏凋亡水平和肝星状细胞的活化，进而起到治疗肝纤维化的作用。本发明将槲皮素和番茄红素联合使用，在显著降低槲皮素使用剂量的同时，其抗肝纤维化疗效优于单独使用槲皮素、番茄红素的疗效。

附图说明

图1羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物对HepG2细胞毒性的影响；

图2药物组合物纳米颗粒在释放介质中的释放曲线；

图3各组小鼠血清ALT和AST水平对比图；

图4各组小鼠肝脏HE染色对比图(×200)；

图5各组小鼠肝纤维化Masson染色对比图(×200)；

图6Western Blot检测各组小鼠肝脏α-SMA表达水平对比图；

图7各组小鼠肝脏组织中ROS变化和SOD2表达水平对比图；

图8各组小鼠肝脏组织中TUNEL阳性细胞数和Cleaved Caspase-3表达水平对比图；

图9各组小鼠肝脏组织中巨噬细胞和中性粒细胞的聚集情况对比图；

图10免疫荧光检测各组小鼠肝脏组织的NLRP3表达水平对比图；

图11ELISA法测定各组小鼠血清中炎性因子水平对比图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

下述实施例、对比例及相关实验中所用原料均为普通市售产品。羧甲基壳聚糖(MW＝8.5kDa，脱乙酰度＝90％，羧甲基化度＝85％)，药用级；槲皮素CAS号117-39-5；番茄红素CAS号502-65-8；环氧氯丙烷CAS号106-89-8；十二烷基二甲基叔胺CAS号112-18-5；乳糖酸CAS号96-82-2。

实施例1

1.羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的制备

羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的合成路线为：

S1、将羧甲基壳聚糖加入到50％的乙醇溶液中，滴加环氧氯丙烷，然后升温至40℃，搅拌5h，再加入十二烷基二甲基叔胺，升温至85℃，继续反应12h，盐酸调节pH为7-8，用丙酮沉淀，过滤，取滤渣，依次用正己烷和丙酮-水(体积比为80∶15)洗涤，于45℃真空干燥24h，得到羧甲基壳聚糖季铵盐；其中羧甲基壳聚糖、环氧氯丙烷、十二烷基二甲基叔胺的质量比为1∶0.5∶1.0；通过元素分析法测定羧甲基壳聚糖季铵盐中季铵盐结构的取代度为11.8％。

S2、将羧甲基壳聚糖季铵盐溶于水溶液中，并用三乙胺将pH调节至8.0；另将乳糖酸溶于水溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5h，然后滴加到含羧甲基壳聚糖季铵盐的水溶液中，升温至40℃，反应24h，反应结束后，使用蒸馏水透析3天，冻干后得到羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物；其中羧甲基壳聚糖季铵盐、乳糖酸的质量比为1∶1.1；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的用量均为乳糖酸摩尔量的2倍；通过元素分析法测定羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物中乳糖酸的取代度为12.5％。

2.羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的细胞毒性实验

将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物分别配制成0.01、0.1、1mg/mL的纳米粒溶液，配制方法为：将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物溶解于蒸馏水溶液中，在120W的超声功率下，超声10min，即得。

将人肝癌HepG2细胞接种在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37C，5％CO2培养箱中培养，取对数生长期的HepG2细胞，用0.25％胰酶消化贴壁的细胞，用含10％小牛血清的DMEM培养液配制细胞混悬液，以5000cells/wel的密度将HepG2细胞接种到96孔培养板中，在37C、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜后，加入不同浓度的空白纳米粒溶液。实验组为羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的纳米粒溶液，空白对照组加培养液，每组样品平行5孔，然后在37℃，5％CO2培养箱中培养。48h后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT液15uL，37C继续培养4h后，终止培养，弃去上清液，每孔加入150uL的DMSO溶液，避光振荡10min充分溶解结晶物。

通过酶标仪检测吸光度值(检测波长为570nm，参比波长为630nm)，计算得到细胞的存活率如图1所示，向细胞中加入浓度分别为0.01、0.1、1mg/mL的羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的纳米粒溶液48h后，HepG2细胞的生长未受明显的抑制，细胞存活率均在90％以上，说明所制备的羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物对细胞没有明显的毒性，可以作为药用辅料应用于生物医学领域。

实施例2

药物组合物的制备，包括以下步骤：

将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素制备成纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备方法为：将槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中，得到含药溶液；将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物溶解于50％的乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加含药溶液并进行搅拌，滴毕超声30min，喷雾干燥后即得，所制得的纳米颗粒外观圆整，大小均匀，粒径为285±8nm。其中有机溶剂为95％的乙醇，番茄红素与有机溶剂的固液比为1g∶15mL；羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与番茄红素的质量比为3∶1，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与60％的乙醇的固液比为1g∶60mL；超声功率为120W。

实施例3

药物组合物的制备，包括以下步骤：

将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素制备成纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备方法为：将槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中，得到含药溶液；将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物溶解于60％的乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加含药溶液并进行搅拌，滴毕超声20min，喷雾干燥后即得，所制得的纳米颗粒外观圆整，大小均匀，粒径为290±7nm。其中有机溶剂为75％的乙醇，番茄红素与有机溶剂的固液比为1g∶20mL；羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与番茄红素的质量比为3∶1，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与60％的乙醇的固液比为1g∶70mL；超声功率为120W。

所述有机溶剂为丙酮或75-95％的乙醇；所述番茄红素与有机溶剂的固液比为1g∶15-20mL；所述羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与番茄红素的质量比为3∶1，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与50-60％的乙醇的固液比为1g∶60-70mL。

对比例1

药物组合物的制备，与实施例2相比，使用含羧甲基壳聚糖的载体溶液，包括以下步骤：

将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素制备成纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备方法为：将槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中，得到含药溶液；将羧甲基壳聚糖溶解于50％的乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加含药溶液并进行搅拌，滴毕超声30min，喷雾干燥后即得，所制得的纳米颗粒外观不圆整，大小不均匀，粒径为460±6nm。其中有机溶剂为95％的乙醇，番茄红素与有机溶剂的固液比为1g∶15mL；羧甲基壳聚糖与番茄红素的质量比为3∶1，羧甲基壳聚糖与60％的乙醇的固液比为1g∶60mL；超声功率为120W。

对比例2

药物组合物的制备，与实施例2相比，不使用含有羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的载体溶液，直接物理混合槲皮素与番茄红素，包括以下步骤：

将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中进行搅拌，超声30min，喷雾干燥后即得。其中有机溶剂为95％的乙醇，番茄红素与有机溶剂的固液比为1g∶15mL。

相关实验

一、药物组合物纳米颗粒的溶解性、稳定性及体外释放实验

1.药物组合物的溶解性、稳定性实验

对实施例2-3、对比例1-3制备的药物组合物纳米颗粒进行溶解性测试，水溶性测试将样品与水按20mg/mL比例混合，油溶性测试将样品与有机混合溶剂(苯、乙醚、四氯化碳、石油醚体积比1∶1∶1∶1)按20mg/mL比例混合，室温下每隔5min振摇30s，30min后观察溶解情况，在高温(60℃)、高湿(RH90％)条件下放置10天后观察溶液稳定性，测试结果如表1所示。

表1药物组合物纳米颗粒的溶解性、稳定性测试结果

由表1结果可知，与对比例1(使用羧甲基壳聚糖)、对比例2(物理混合)相比，实施例2-3制备的药物组合物纳米颗粒具有良好的水溶性和脂溶性，而且在高温高湿条件下放置10天后均未出现分层沉淀现象，通过超声法能够将槲皮素与羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物通过分子间氢键结合的更加紧密，具有良好的稳定性，说明使用羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物，将槲皮素与番茄红素制备成两溶性的纳米颗粒，能够明显改善药物的水溶性、稳定性，便于药物储存及加工制备成不同剂型。

2.药物组合物纳米颗粒的体外释放实验

通过透析法进行药物组合物纳米颗粒的体外释放实验，采用高效液相色谱法测量释放介质中槲皮素的含量，色谱柱为Diamonsil C18(250×4.6mm)，流动相为以甲醇-0.2％磷酸溶液(体积比为55∶45)，流速为1.0mL/min，进样量为10μL，柱温为30℃，检测波长(λ)为370nm；其中释放介质为pH为7.4含0.2％SDS的PBS缓冲液。

分别称取20mg实施例2、实施例3制备的纳米颗粒，加入到1mL的水中，分别置于透析袋内(MWCO＝3500Da)，密封好后浸入含30mL释放介质的锥形瓶中，放入37℃恒温水浴震荡器中，转速为100r/min。在预设时间点取样1mL，并同时补充同体积新鲜的释放介质。样品经0.22um微孔滤膜过滤，经高效液相色谱法测量槲皮素的含量，然后计算累计释放量，作累计释放量与时间的曲线，即体外释药曲线，如图2所示，由释放曲线可知，实施例2、实施例3制备的纳米颗粒的释放行为基本一致，均较为缓慢、持久，突释现象不明显，在第100h，两者在释放介质中的累计释放百分率均能达到60％以上。

二、药物组合物纳米颗粒对CCl₄诱导的肝纤维化模型小鼠的影响实验

实验模型的构建：8周龄左右的SPF级雄性C57BL/6小鼠(武汉赛维尔)，饲喂于温度21-25℃，相对湿度45％-55％，12h明暗交替的环境中，经过一周的适应性喂养后开始实验，将80只小鼠随机均分为对照组(A)、模型组(B)、槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)，每组16只小鼠。

肝纤维化造模：模型组(B)和各给药组(C、D、E)按照1ml/kg·d予以腹腔注射20％的CCl₄溶液(CCl₄∶橄榄油＝1∶3)，每周2次，连续8周，构建所需小鼠体内肝纤维化模型。对照组(A)按照1ml/kg·d腹腔注射橄榄油，每周2次，连续8周。

药物处理：从造模第3周开始，对照组(A)和模型组(B)每日给予等量橄榄油灌胃，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)分别灌胃给予60mg/kg药物组合物纳米颗粒(由实施例2制得，含有质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素)、100mg/kg的槲皮素、10mg/kg的番茄红素，每日1次，持续6周；与此同时继续给予CCl₄腹腔注射6周，每周2次。

样本的获取与处理：造模结束后将小鼠禁食16h，腹腔注射200mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉。收集血液，静置2h，之后在3000rpm条件下离心15min，收集上层血清，放置于-80℃进行冻存。获取肝脏组织，将肝脏分为三部分：一部分用于冰冻切片的制作；一部分固定于4％多聚甲醛中；剩余部分冻存于液氮中，用于分子和蛋白实验。

统计学分析：数据的分析采用GraphPad Prism 8.0软件，结果采用均数±标准差表示。对于两组间的比较，方差齐性采用t检验；如果方差不齐，则采用Mann-Whitney U秩和检验。对于多组间的比较，对于方差齐性和方差不齐的检验方式分别为单因素方差分析和Kruskal-Wallis test分析，其中**表示P<0.01，有显著统计学差异。

1.药物组合物纳米颗粒对CCl₄致肝纤维化小鼠肝功能的保护作用

肝脏功能检测：将收集到的血清，按照试剂盒的说明书检测肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平。

结果如图3所示，通过模型组(B)与对照组(A)的比较，CCl₄处理后小鼠血清中ALT和AST水平明显上升，同时对比槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)可以发现，槲皮素联合番茄红素组(C)中的药物组合能显著降低血清中ALT和AST水平，且效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

2.药物组合物纳米颗粒对CCl₄致肝纤维化小鼠肝脏病理学改变的保护作用

将4％多聚甲醛固定的肝脏组织经过常规石蜡包埋等步骤后，进行素苏木伊红(HE)染色，置于Pannoramic MIDI扫描系统进行扫描，观察肝脏结构。

结果如图4所示，对照组(A)小鼠肝细胞的排列整齐，细胞未见肿胀与炎性浸润。模型组(B)小鼠肝细胞出现明显变形，细胞出现肿胀和胞浆的透明，多数细胞出现坏死且存在炎性细胞浸润。与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)降低了CCl₄诱导的肝细胞损伤。且槲皮素联合番茄红素组(C)小鼠对肝结构损伤的改善作用好于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

3.药物组合物纳米颗粒降低CCl₄诱导的小鼠肝胶原纤维分布

将制备好的石蜡切片经过脱蜡水化后等步骤后，按照马松(Masson)染色步骤，Masson染色可以把胶原纤维染为蓝色，经过切片扫描系统进行图像扫描。采用Image-Proplus 6.0软件对阳性面积的百分比进行定量分析。

结果如图5所示，模型组(B)较对照组(A)小鼠肝组织中可见大量的胶原纤维，且肝纤维化评分较对照组明显升高；与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)降低了CCl₄诱导的肝纤维化程度和纤维化评分。槲皮素联合番茄红素组(C)的抗纤维化效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

4.药物组合物纳米颗粒抑制了CCl₄诱导的肝星状细胞活化

将收集到的肝脏组织用RIPA裂解液裂解提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，之后按照Western Blot操作步骤进行电泳、转膜、抗体孵育、显影等步骤。其中α-SMA和β-actin的抗体孵育浓度为1∶1000和1∶3000。将所获图像采用Quantity One分析系统进行蛋白表达的定量分析。

结果如图6所示，α-SMA表达水平的升高是肝星状细胞活化的特异性分子标志物。模型组(B)小鼠肝脏α-SMA蛋白表达较对照组(A)明显上调；较模型组(B)，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)明显减弱了CCl₄诱导的α-SMA蛋白表达。其中槲皮素联合番茄红素组(C)的抑制效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

5.药物组合物纳米颗粒减弱了CCl₄诱导的肝纤维化模型小鼠氧化应激

氧化应激检测：将采集的新鲜肝脏组织进行快速冷冻来制备冰冻切片。按照DHE探针染色使用说明书进行染色，使用抗荧光猝灭剂进行封片，数字化扫描系统进行扫描，观察肝脏ROS变化；将制备的石蜡切片按照组织免疫荧光染色步骤，检测超氧化物歧化酶2(SOD2)水平。所获图像采用Image-Proplus 6.0对荧光值进行分析比较。

结果如图7所示，(a和b)DHE探针检测各组肝脏ROS水平；(c和d)免疫荧光检测各组肝脏SOD2表达水平；标尺为20μm。模型组(B)小鼠肝脏组织红色荧光强度(ROS)较对照组(A)升高，绿色荧光强度(SOD2)降低；与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)小鼠肝脏红色荧光强度降低，绿色荧光强度升高。槲皮素联合番茄红素组(C)对于氧化应激的抑制效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

6.药物组合物纳米颗粒减弱了CCl₄诱导的肝纤维化模型小鼠肝脏凋亡

细胞凋亡检测：取制备好的常规石蜡切片，按照原位末端标记法(TUNEL)检测试剂盒说明书和组织免疫荧光染色的操作步骤分别检测TUNEL阳性细胞数和凋亡执行蛋白Cleaved Caspase-3表达，将染色完成的切片进行扫描。细胞核显蓝色，TUNEL阳性细胞胞核染成红色。高倍镜下每组随机选取10个视野，计算阳性率。阳性率＝TUNEL阳性细胞数(红)/细胞总数×100％。采用Image-Proplus 6.0软件对Cleaved Caspase-3荧光值进行分析。

结果如图8所示，(a和b)TUNEL法检测细胞凋亡；(c和d)免疫荧光检测各组肝脏Cleaved Caspase-3表达水平；标尺为20μm。模型组(B)较对照组(A)小鼠肝脏TUNEL阳性细胞数和Cleaved Caspase-3表达水平明显升高。与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)小鼠肝脏TUNEL阳性细胞数和Cleaved Caspase-3表达水平明显降低，且槲皮素联合番茄红素组(C)的效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

7.药物组合物纳米颗粒缓解CCl₄诱导的肝纤维化模型小鼠肝巨噬细胞和中性粒细胞的聚集

肝脏免疫荧光染色：石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭、抗体孵育、荧光显色等操作，之后将切片进行图像的扫描。其中F4/80和Ly6G抗体的孵育浓度均为1∶100。在高倍视野下每组随机选取8个视野，对F4/80+阳性(红色)和Ly6G+阳性(红色)细胞数进行定量。

结果如图9所示，(a和b)F4/80抗体对小鼠肝脏巨噬细胞进行免疫荧光染色，在高倍视野下对F4/80阳性细胞(红色)进行定量；(c和d)LY6G抗体对小鼠肝脏中性粒细胞进行免疫荧光染色，在高倍视野下对LY6G阳性细胞(红色)进行定量，标尺为20μm。模型组(B)较对照组(A)CCl₄诱导的肝巨噬细胞数(巨噬细胞标志物F4/80)和中性粒细胞的数量(中性粒细胞标志物Ly6G)明显升高。与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)能够显著降低CCl₄诱导的肝巨噬细胞数(巨噬细胞标志物F4/80)和中性粒细胞的数量(中性粒细胞标志物Ly6G)。其中槲皮素联合番茄红素组(C)的作用效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

8.药物组合物纳米颗粒抑制CCl₄诱导的肝纤维化模型小鼠肝脏NLPR3活化

组织免疫荧光双染：将石蜡切片经常规脱蜡、水化、抗原修复、透化、封闭等步骤后进行抗体孵育：NLRP3(1∶100)4℃过夜避光孵育后加入山羊抗兔Alexa

594荧光二抗，室温避光孵育1h；之后于4℃过夜避光孵育β-tubulin(1∶200)，待孵育完成后加入山羊抗鼠Alexa/>

488荧光二抗，室温避光孵育1h；磷酸盐缓冲液洗涤完成后用DAPI染色，进行镜检观察(标尺为20μm)。

结果如图10所示，与对照组(A)比较，模型组(B)小鼠肝脏NLRP3表达水平增加；与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)能够显著降低小鼠肝脏NLRP3表达水平，其中槲皮素联合番茄红素组(C)的作用效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

9.药物组合物纳米颗粒抑制CCl₄致肝纤维化模型小鼠炎性因子表达

ELISA测定炎性因子：使用收集到的血清，按TNF-α、IL-6、IL-1β酶联免疫试剂盒(ELISA)操作说明，检测血清中的炎性因子水平。

结果如图11所示，与对照组(A)比较，模型组(B)CCl₄引起的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高，与模型组(B)比较，槲皮素联合番茄红素组(C)、槲皮素组(D)、番茄红素组(E)能够显著降低CCl₄引起的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，且槲皮素联合番茄红素组(C)的效果优于单一给药槲皮素组(D)和番茄红素组(E)。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种药物组合物，其特征在于，将质量比为2∶1的槲皮素与番茄红素制备成纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备方法为：将槲皮素与番茄红素溶解于有机溶剂中，得到含药溶液；将羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物溶解于50-60%的乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加含药溶液并进行搅拌，滴毕超声20-30 min，喷雾干燥后即得；

所述有机溶剂为丙酮或75-95%的乙醇；所述番茄红素与有机溶剂的固液比为1 g∶15-20 mL；所述羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与番茄红素的质量比为3∶1，羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物与50-60%的乙醇的固液比为1 g∶60-70 mL；

所述羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物的制备方法为：

S1、将羧甲基壳聚糖加入到50-60%的乙醇溶液中，滴加环氧氯丙烷，然后升温至40-50℃，搅拌4-5 h，再加入十二烷基二甲基叔胺，升温至80-90℃，继续反应8-12 h，得到羧甲基壳聚糖季铵盐；所述羧甲基壳聚糖、环氧氯丙烷、十二烷基二甲基叔胺的质量比为1∶0.5-0.8∶1.0-1.1；

S2、将羧甲基壳聚糖季铵盐溶于水溶液中，并用三乙胺将pH调节至8.0；另将乳糖酸溶于水溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5 h，然后滴加到含羧甲基壳聚糖季铵盐的水溶液中，升温至30-40℃，反应12-24 h，得到羧甲基壳聚糖季铵盐衍生物；所述羧甲基壳聚糖季铵盐、乳糖酸的质量比为1∶1.0-1.1；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的用量均为乳糖酸摩尔量的2倍。

2.一种固体口服制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的一种固体口服制剂，其特征在于，所述固体口服制剂为片剂、胶囊剂或颗粒剂。

4.根据权利要求1所述药物组合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物通过抑制CCl₄诱导的肝脏损伤和肝纤维化程度、肝脏氧化应激、肝星状细胞活化、炎症反应和凋亡，进而起到治疗肝纤维化的作用。

Images