CN115843746A - Ush2a基因人源化小鼠模型及其建立方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种USH2A基因人源化小鼠模型及其建立方法和应用,涉及基因工程技术领域。该建立方法包括:将小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,建立得到USH2A基因人源化小鼠模型;敲入区域包括人USH2A外显子13,人USH2A外显子13的基因包括致病突变c.2802T>G。该建立方法通过将小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,建立得到包括致病突变c.2802T>G的USH2A基因人源化小鼠模型,能够更加客观、准确地评估USH2A外显子13的剔除效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,特别是涉及USH2A基因人源化小鼠模型及其建立方法和应用。
背景技术
Usher综合征(Usher Syndrome)是一类遗传性疾病,又称耳聋-色素性视网膜炎综合征,其特征是不同程度的先天性感音神经性耳聋,以及色素性视网膜炎(RP)引起的进行性视力丧失。在临床上Usher综合征可分为3种类型:I型Usher综合征,患者在听力方面会有先天性重深度感音神经性耳聋,前庭反应消失,视力方面会在青春期前出现色素性视网膜炎,逐渐致盲,关联基因为MYO7A、CDH23、USH1C、PCHD15等;II型Usher综合征,患者在听力方面会有先天性中重度感音神经性耳聋,前庭反应正常,青春期出现色素性视网膜炎,逐渐致盲,关联基因为USH2A、GPR98、WHRN等;III型Usher综合征,患者在听力方面会有进行性感音神经性耳聋,前庭反应正常,青春期末出现色素性视网膜炎,逐渐致盲,关联基因为CLRN1等。其中,II型占Usher综合症的比例超过50%。而USH2A基因突变是Usher综合征II型的最常见原因,涵盖超过50%的Usher综合征患者。同时,USH2A基因的突变也是导致非综合征性视网膜色素变性(NSRP)的重要原因之一。
USH2A定位于1q41,其在基因组中的跨度超过800kb,编码一个大型跨膜蛋白Usherin,其锚定在视网膜感光细胞和内耳毛细胞的质膜上,是纤毛发育和维持必不可少的组分。在视网膜中,Usherin是USH2复合物的重要部分,被认为在稳定光感受器的外节段发挥作用。USH2A具有2个亚型,在视网膜细胞中主要的亚型含有72个Exon,编码区长度约为15.6kb。Usherin蛋白的胞外部分包含许多重复的结构域,包括10个Laminin EGF-like(LE)结构域和35个Fibronectin type 3(FN3)结构域。人USH2A外显子13长度为642bp,编码着第723~936位氨基酸,为Usherin蛋白中10个LE结构域中的4个。
USH2A基因的第13号外显子13、第50号外显子和第40号内含子的突变会引发Usher综合征。迄今为止已经鉴定出超过1000个分布在整个USH2A基因中的致病性突变,其中的外显子13是USH2A基因中突变最频繁的外显子,约占35%。USH2A基因第13号外显子的突变,包括c.2802T>G(p.Cys934Trp,中国患者频率最高突变)、c.2299delG(p.E767SfsX21,欧美患者频率最高突变)、c.2276G>T(氨基酸变化:p.C759F)、c.2522C>A(p.S841Y)、c.2242C>T(p.Gln748X)、c.2541C>A(C847X)、c.2761delC(Leu921fs)和c.2776C>T(p.R926C)、c.2209C>T、c.2310delA、c.2391_2392deITG、c.2431A>T、c.2431_2432delAA、c.2440C>T、c.2525dup、c.2610C>A、c.2755C>T、c.2176T>C、c.2236C>G、c.2296T>C、c.2332G>T。
USH2A编码区长度约为15.6kb,常规的基因治疗递送方法(如重组慢病毒、重组腺相关病毒等)难以包装如此庞大的编码序列,因此难以通过直接递送USH2A进行治疗。
现有技术通过CRISPR/Cas系统进行基因组DNA的编辑直接删除外显子13,或者破坏RNA剪接相关的位点;通过使用单碱基编辑器修改上述剪接相关位点的关键碱基,亦可促进外显子跳读;通过反义寡核苷酸(AONs,Antisense oligonucleotides)靶向干扰pre-mRNA剪接,促进外显子跳读的效率较高。然而,根据现有技术的研究数据,c.2299delG突变的USH2A基因人源化小鼠无法准确模拟药物对c.2802T>G突变USH2A外显子13剪接跳跃的功效
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种USH2A基因人源化小鼠模型的建立方法,该建立方法通过将小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,建立得到包括致病突变c.2802T>G的USH2A基因人源化小鼠模型,能够更加客观、准确地评估USH2A外显子13的剔除效率。
本发明提供了一种USH2A基因人源化小鼠模型的建立方法,该建立方法包括:将小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,建立得到USH2A基因人源化小鼠模型;所述敲入区域包括人USH2A外显子13,所述人USH2A外显子13的基因包括致病突变c.2802T>G。
上述致病突变c.2802T>G表示人USH2A基因的第2802位碱基由T变成G,因此,上述敲入区域序列位于该位点的碱基为G。
现有技术中的c.2299delG突变的USH2A基因人源化小鼠,因为c.2299delG存在明显自发剪接跳跃,可能会发生假阳性或者效率与实际情况不匹配的情况,因此,无法准确模拟药物对c.2802T>G突变USH2A外显子13剪接跳跃的功效,而本发明人在研究过程中发现,之所以会出现无法准确模拟的问题,是因为人USH2A内含子片段和鼠USH2A的内含子片段组合可能会形成新的剪接位点,或影响原有剪接位点的作用,导致非正常剪接。因此,本发明人采用上述方法构建USH2A基因人源化小鼠模型,并通过比较药物在c.2299delG人源化小鼠和c.2802T>G人源化小鼠中的诱导剪切跳跃的效率,验证了包括致病突变c.2802T>G的USH2A基因人源化小鼠模型,能够更加客观、准确地评估USH2A外显子13的剔除效率,从而更加有效筛选特异性高效诱导c.2802T>G USH2A外显子13剪接跳跃的药物。同时,上述建立方法得到的小鼠模型,其中的人USH2A内含子片段和鼠USH2A的内含子片段组合可模拟人鼠外显子的RNA剪接,还可模拟c.2802T>G突变存在的自发剪接跳跃现象。
本发明可广泛用于评估不同的“USH2A外显子13剔除”技术的剔除效率,如基因敲除、RNA干扰等。所述基因敲除表示在USH2A中对外显子13进行大片段切除、或破坏剪接供体/受体位点等剪接相关位点导致外显子13在基因、RNA或蛋白水平剔除。所述RNA干扰表示通过靶向USH2A外显子13敲除剪接供体/受体位点等剪接相关位点,诱导外显子13的剪接跳跃,促使外显子13在RNA水平剔除。而且,本发明对于不同的“诱导USH2A外显子13剔除”技术都可以实现精准的剔除效率定量和对比。
在其中一个实施例中,所述敲入区域包括依次连接的人USH2A内含子12、人USH2A外显子13和人USH2A内含子13的基因。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥490bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥703bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1500bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1600bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1599bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度为1611bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度为1599bp的基因片段。
本发明选择了更长的人USH2A内含子片段,提供了更多的候选靶位点,扩展了可评估药物的范围。
在其中一个实施例中,利用CRISPR/Cas9系统将所述敲除区域替换为所述敲入区域,所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9和gRNA,所述gRNA的靶向结构域靶向所述敲除区域,所述敲除区域包括鼠Ush2a外显子12。
小鼠USH2A的外显子12与人USH2A外显子13同源,长度均为642bp,移除该外显子并没有造成后续的移码突变,而敲除了小鼠USH2A的外显子12后,Usherin依然能够正确定位并且行使正常的功能,因此,本发明人以鼠外显子12为敲除区域。
在其中一个实施例中,所述敲除区域包括依次连接的鼠Ush2a内含子11、鼠Ush2a外显子12和鼠Ush2a内含子12的基因;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度≥490bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度≥703bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度≥1500bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1600-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1500-15079bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600-15079bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述建立方法包括以下步骤:
构建靶向载体:构建得到依次包含5’同源臂、重组位点、人源USH2A基因序列的敲入区域和3’同源臂的靶向载体;
显微注射:将所述靶向载体、Cas9 mRNA和gRNA混合,注射入受精卵细胞中,得到阳性F0代小鼠;
交配得到子代鼠:将上述阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠,将F1代杂合子小鼠交配,鉴定筛选,得到纯合子的USH2A人源化基因敲入小鼠。
在其中一个实施例中,所述gRNA的靶向结构域序列如下所示:
ATTCCTAACGATACTCGCAG(SEQ ID NO:4),和TCCACAATGCTCTTACTTCC(SEQ ID NO:5)。
本发明还提供了一种USH2A基因人源化小鼠模型,小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,所述敲入区域包括人USH2A外显子13,所述人USH2A外显子13的基因包括致病突变c.2802T>G。
在其中一个实施例中,所述敲入区域包括依次连接的人USH2A内含子12、人USH2A外显子13和人USH2A内含子13的基因;所述敲除区域包括依次连接的鼠Ush2a内含子11、鼠Ush2a外显子12和鼠Ush2a内含子12的基因。
在其中一个实施例中,所述所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥490bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥703bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度≥1500bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1500bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1600-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1500-15079bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1600bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1599bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600-15079bp的基因片段。
在其中一个实施例中,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度为1611bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度为1599bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600bp的基因片段。
本发明还提供了所述的USH2A基因人源化小鼠模型在评估USH2A外显子13剔除效率,或评估用于诱导USH2A突变的药物的疗效中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的一种USH2A基因人源化小鼠模型的建立方法,该建立方法通过将小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,建立得到包括致病突变c.2802T>G的USH2A基因人源化小鼠模型,能够更加客观、准确地评估USH2A外显子13的剔除效率。
附图说明
图1为实施例1中MINIGENE-V1的结构示意图。
图2为实施例1中MINIGENE-V2的结构示意图。
图3为实施例1中MINIGENE-V3的结构示意图。
图4为实施例1中MINIGENE-V4的结构示意图。
图5为实施例1中在MINIGENE体系中评估不同突变、不同宿主细胞、不同内含子片段对外显子13自发剪接跳跃、转染效率影响的结果图。其中,左侧的泳道1:USH2A MinigeneV1转染293T;泳道2:USH2A Minigene V2转染293T,没有检测到明显的外显子跳跃迹象(野生型USH2A-13外显子);泳道3:USH2A Minigene V3转染293T,检测到少量外显子跳跃迹象(含c.2802T>G突变);泳道4:USH2A Minigene V4转染293T,没有检测到明显的外显子跳跃迹象;泳道5:pCMV-EGFP转染293T;泳道6:USH2A Minigene V1转染N2A;泳道7:USH2AMinigene V2转染N2A,没有检测到明显的外显子跳跃迹象;泳道8:USH2A Minigene V3转染N2A,检测到明显的外显子跳跃迹象(含c.2299delG突变);泳道9:USH2A Minigene V4转染N2A,没有检测到明显的外显子跳跃迹象;泳道10:pCMV-EGFP转染N2A;右侧的泳道M:GL DNAMarker 10000。
图6为实施例1中泳道9电泳条带DNA测序的结果图。
图7为实施例2中荧光显微镜检测不同的突变对外显子13自发剪接跳跃影响的结果图。
图8为实施例2中流式细胞技术检测检测不同的突变对外显子13自发剪接跳跃影响的结果图。
图9为实施例3中将携带c.2802T>G突变的人USH2A外显子13及其两侧序列替换小鼠Ush2a外显子12及其两侧序列的基因人源化小鼠构建示意图。
图10为实施例3中靶向载体的线性化示意图。
图11为实施例3中通过限制性酶切鉴定靶向载体的结果图,其中,泳道1:SspI酶切载体获得正确的3.9/2.8/2.1/1.1/0.7/0.3/0.1/0.1kb条带;泳道2:SacI酶切获得正确的5.5/3.4/1.1/0.8/0.4/0.2kb条带;泳道3:DrdI酶切获得正确的6.6/1.9/1.5/1.2kb条带;泳道4:NotI酶切获得11.2kb条带。
图12为实施例3中USH2A EXON13c.2802T>G纯合子人源化小鼠的基因鉴定结果图,其中,纯合子:一个带594bp;杂合子:两个带594bp和619bp;野生型等位基因:一个带619bp;M:表示Thermo Scientific GeneRuler 2000bp DNA Ladder#MK001。
图13为实施例3中纯合子测序的结果图。
图14为实施例4中RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳图。
图15为实施例4中嵌合Ush2ac.2802T>G的pre-mRNA正常剪接条带的测序结果图。
图16为实施例4中嵌合Ush2ac.2802T>G的pre-mRNA自发跳跃条带的测序结果。
图17为实施例5中AON通过玻璃体注射诱导USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠视网膜细胞hUSH2A外显子13剪接跳跃的频率的结果图。
图18为实施例5中视网膜组织RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
来源:
GL DNA Marker 10000(Accurate Biology,货号:#AG11909),SteadyPureAgarose Gel DNA Purification Kit(Accurate Biology,货号:#AG21005),HiScript IIOne Step RT-PCR Kit(诺唯赞#P611-01),表达载体pX601(Addgene公司,货号:#61591)。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明,均为市售来源;实验方法如无特殊说明,均为本领域的常规实验方法。
实施例1
MINIGENE细胞实验。
本实施例在MINIGENE体系中评估不同突变、不同宿主细胞、不同内含子片段对外显子13自发剪接跳跃、转染效率的影响,具体检验方法如下所示。
本实施例构建4个MINIGENE(小基因):
MINIGENE-V1:mExon11-mExon12-mExon13(m表示小鼠,h表示人),基因结构为小鼠的USH2A外显子11、小鼠内含子11的5’端204bp、小鼠内含子11的3’端490bp、小鼠的外显子12、小鼠内含子12的5’端703bp、小鼠内含子12的3’端216bp、小鼠的外显子13,按照5’到3’的顺序串联而成;如图1所示。
MINIGENE-V2:mExon11-hExon13-mExon13,载体结构为:小鼠外显子11、小鼠内含子11的5’端192bp、人内含子12的3’端1611bp、人外显子13、人内含子13的5’端1599bp、小鼠内含子12的3’端216bp、小鼠的外显子13,按照5’到3’的顺序串联而成,如图2所示。
MINIGENE-V3:mExon11-hExon13(c.2299delG)-mExon13,载体结构与MINIGENE-V2相同,仅人外显子13引入了c.2299delG突变,如图3所示。
MINIGENE-V4:mExon11-hExon13(c.2802T>G)-mExon13,载体结构与MINIGENE-V2相同,仅人外显子13引入了c.2802T>G突变,如图4所示。
通过全基因合成的方式获得MINIGENE-V(1-4)基因序列,通过AgeI+EcoRI酶切pX601获得线性化载体。PCR扩增合成的片段,同时PCR引物中5’加入与线性化的pX601末端20bp同源的序列;回收上述2个片段,产物使用DNA组装预混液进行重组,然后转移至冰上,转化感受态细胞,涂板、挑单克隆、验证,则将合成的MINIGENE-V1-4基因序列无缝插入到pCMV-EGFP载体中,获得pCMV-EGFP-MINIGENE-V(1-4)载体。该载体使EGFP与MINIGENE在CMV启动子的驱动下同时转录表达。
MINIGENE-V1/V2/V3/V4载体通过Lipofectamine 2000试剂分别转染293T细胞、N2A细胞,同时以转染CMV-EGFP载体作为对照。转染后24小时-72小时收获细胞,提取其总RNA,通过RT-PCR分析MINIGENE中外显子13的pre-RNA剪接情况。
结果显示(如图5所示),USH2A MINIGENE V3(人源化外显子13,c.2299delG)转染293T细胞、N2A细胞后有发生明显的跳跃迹象,c.2299delG突变确实导致了USH2A外显子13的显著自发剪接跳跃,表明MINI-REP基因体系确实可准确反映突变对外显子13自发剪接跳跃的影响。
此外,通过MINIGENE-V1和V2转染效率的对比,发现增加内含子片段长度对转染效率影响不显著,但增加了更多的潜在靶位点。
为了确认USH2A MINIGENE V4(人源化外显子13,c.2802T>G)在宿主细胞内的RNA剪接情况,从琼脂糖凝胶上切下泳道9的条带,使用SteadyPure Agarose Gel DNAPurification Kit进行胶回收,回收产物以EGFP-F进行Sanger测序。部分测序结果如图6所示,小鼠USH2A外显子11与人USH2A外显子13相接。从USH2A MINIGENE V4(人源化外显子13,c.2802T>G)转染N2A细胞后RT-PCR以及测序结果可以看出,USH2A MINIGENE V4的pre-RNA剪接情况符合理论预测,即选择更长的内含子片段不仅不影响效率,而且比短内含子片段涵盖的人内含子原始剪接相关位点更多,更利于模拟人外显子13的剪接。
实施例2
基于MINI-REP细胞评估不同的突变对外显子13剪接的影响。
为了评估不同的突变对USH2A外显子13剪接的影响,通过合成含有不同突变的MINI-REP基因,并构建对应的MINI-REP基因报告载体,并通过流式细胞技术分析含有不同突变的外显子13在本发明MINI-REP基因体系中剪接跳跃的情况。
构建外显子13的MINIGENE小基因和表达载体:EXON13mut表示包含致病突变的USH2A外显子13,及其上下游内含子序列,即含有突变的MINIGENE,mut表示突变(mutation),外显子13的MINIGENE(小基因)为包含USH2A内含子12(选择内含子5’端长度为192bp的基因片段串联3’端长度为1611bp的基因片段)-外显子13-内含子13(选择内含子5’端长度为1599bp的基因片段串联3’端长度为216bp的基因片段)的基因。合成外显子13的MINIGENE小基因后,将其插入报告基因EGFP中,获得MINI-REP基因结构为EGFPleft-Exon13mut-EGFPright。通过全基因合成的方式获取MINI-REP基因,同时合成基因序列两端设置对应的酶切位点AgeI和EcoRI,通过酶切连接方式整合入表达载体pX601中,构建MINI-REP基因报告载体pCMV-EGFPleft-Exon13mut-EGFPright载体。
在本实施例中,MINI-REP基因中外显子13含有的突变分别为c.2802T>G、c.2299delG,内含子12片段选择5’端192bp串联3’端1611bp,内含子13片段选择5’端1599bp串联3’端216bp,并构建对应的MINI-REP基因载体pCMV-EGFPleft-Exon13c.2802T>G-EGFPright、pCMV-EGFPleft-Exon13c.2299delG-EGFPright。依据实施例1的瞬时转染方法,使用转染试剂Lipofectamine2000,将两个MINI-REP基因载体分别转染宿主细胞,在本实施例中,宿主细胞选用293T细胞。以不含有突变的MINI-REP基因载体为阴性对照,以不含有外显子13的MINI-REP基因载体为阳性对照。转染24小时后,通过荧光显微镜观察各组细胞中发EGFP绿色荧光的细胞情况,结果如图7所示,通过流式细胞技术检测不同突变实验组的EGFP阳性细胞比例,结果如下表所示。其中,通过流式细胞技术检测c.2802T>G、c.2299delG突变实验组中自发剪接跳跃(EGFP阳性)细胞的比例分别为9.4%和41.7%,如图8所示。
表1通过流式细胞技术检测不同突变实验组的EGFP阳性细胞比例
实验组 | EGFP阳性率(%) |
pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>WT</sup>-EGFP<sub>right</sub> | 7.6 |
pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>c.2802T>G</sup>-EGFP<sub>right</sub> | 9.4 |
pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>c.2299delG</sup>-EGFP<sub>right</sub> | 41.7 |
pCMV-EGFP<sub>left</sub>-EGFP<sub>right</sub> | 89.6 |
结果显示,c.2802T>G、c.2299delG均会导致外显子13进行自发剪接跳跃,c.2299delG存在明显自发剪接跳跃,显著高于c.2802T>G。因此用于评估诱导剪接跳跃的治疗时,含有c.2299delG突变可能会发生假阳性或者效率与实际情况不匹配的情况,会对后续检测诱导USH2A外显子13剔除的药物效果的准确性产生影响。
实施例3
携带c.2802T>G突变的USH2A外显子13人源化小鼠(USH2A EXON13c.2802T>G)的构建和验证。
小鼠USH2A基因(NCBI参考序列:NM_021408.3)位于小鼠染色体1上,共鉴定出71个外显子,其中ATG起始密码子位于外显子1,TGA终止密码子位于外显子71。在基因敲入模型中,将小鼠USH2A基因外显子12+部分侧翼序列[第12外显子上游(即小鼠第11内含子3’端)约1670bp至第12外显子下游(即小鼠第12内含子5’端)约1600bp],替换为人类USH2A基因外显子13+部分侧翼序列[第13外显子上游(即人第12内含子3’端)约1611bp至第13外显子下游(即人第13内含子5’端)约1599bp]+插入序列,其中,小鼠第11内含子与人第12内含子之间的插入序列为:5’-AGTACTGATATCACGTAAACGGCCACAAGTTCGATT-3’(SEQ ID NO:1);人第13内含子与小鼠第12内含子之间的插入序列为:5’-TGTCAGACTGGTCCGAATCCACGGTACCCCTCAGG-3’(SEQ ID NO:2),这两段序列引入的酶切位点和鉴定引物序列,便于在载体构建的过程中快速而准确地进行鉴定。而c.2208T to G被引入到人USH2A外显子13中,携带c.2802T>G突变的USH2A外显子13人源化小鼠(USH2A EXON13c.2802T>G)的构建示意图如图9所示。
采用高保真Taq DNA聚合酶从BAC克隆中扩增出含有同源臂(HAs)的小鼠基因组片段,并与重组位点和选择标记依次组装成靶向载体,靶向载体的线性化示意图如图10所示,通过限制性酶切鉴定靶向载体的结果如图11所示。
靶向载体(即供体模板载体)序列(11203bp)如下SEQ ID NO:3所示。
将靶向小鼠USH2A基因的两个gRNA(导向序列分别为SEQ ID NO:4:ATTCCTAACGATACTCGCAG;SEQ ID NO:5:TCCACAATGCTCTTACTTCC)、含有“人类Ush2a外显子13+部分侧翼序列(外显子13上游~1611bp至下游~1599bp)”的靶向载体和Cas9 mRNA共注入小鼠受精卵中产生靶向敲入小鼠后代。
通过PCR鉴定F0代小鼠,并进行序列分析基因型。基因型鉴定引物对1如下所示(退火温度60.0℃):
F1:5'-taagagattagcaaccgtcctcg-3'(SEQ ID NO:6),R1:5'-caagaactccaatgaaggcaagtt-3'(SEQ ID NO:7),条带大小为594bp;
基因型鉴定引物对2如下所示(退火温度60.0℃):
F2:5'-tcctcgctgaagattacctcctta-3'(SEQ ID NO:8),R2:5'-gggcactggatatggagaaaagta-3'(SEQ ID NO:9),条带大小为619bp。
将F0代小鼠与野生型小鼠杂交,获得F1代杂合子小鼠,并完成基因型鉴定。杂交杂合子F1小鼠交配产生纯合子F2小鼠,完成基因型鉴定验证,结果如图12所示。
进一步通过测序引物对3(SEQ ID NO:10:5’-TCCTCGCTGAAGATTACCTCCTTA-3’;SEQID NO:11:5’-ACCTGTGGGAATCCCTTTAACATT-3’)和突变序列引物(F1)对纯合子的基因进行测序检验,结果如图13所示。
实施例4
USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠的嵌合USH2A的pre-mRNA剪接和自发剪接跳跃。
一、USH2A EXON13 c.2802T>G人源化小鼠纯合子的视网膜总RNA提取。
将纯合子USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠的视网膜样品放到离心管中,加入500μlTrizol试剂和少量1mm RNase-free氧化锆研磨珠,使用高速低温组织研磨仪进行研磨,研磨条件为:-10℃,70Hz,每次研磨90seconds,每5次就暂停30seconds;研磨后的样品加入100μl 1-Bromo-3-chloropropane(BCP),剧烈震荡后室温放置5min,随后12000g,4℃离心15分钟。
离心后液体分层,将上层的液体吸取200μl到新的离心管,加入400μl异丙醇,上下颠倒几次混匀,置于冰上孵育10分钟;离心后RNA沉淀聚集于管底,将液体吸去,加入800μl75%乙醇,随后7500g,4℃离心10分钟;离心后RNA沉淀聚集于管底,将液体尽量吸去,开盖晾干。RNA沉淀加入50μl的RNase-free water溶解,即获得纯合子USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠的视网膜RNA。
二、RT-PCR扩增目标区域与sanger测序。
视网膜RNA的样品各取400ng使用HiScript II One Step RT-PCR Kit进行一步法RT-PCR,RT-PCR的试剂和条件如下表所示。
表2 RT-PCR的试剂和条件
将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,可见2条带,如图14所示。
将图14中的上方条带和下方条带从凝胶上分离,使用SteadyPure Agarose GelDNA Purification Kit进行纯化,上方条带的纯化产物以mUSH2A-RTPCR-F2(SEQ ID NO:12:TGAAGGGCCTCAGTGTGATCG)、mUSH2A-RTPCR-R2(SEQ ID NO:13:AGTTCCATTCGAGGCTCCTGC)、hExon13-R(SEQ ID NO:14:CTTATCACAGTTGCAAGGCAGAC)进行sanger测序确认序列,下方的条带以mUSH2A-RTPCR-F2、mUSH2A-RTPCR-R2进行sanger测序确认序列。正常剪接条带测序结果显示(如图15所示),USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠的嵌合USH2Ac.2802T>G的pre-mRNA剪接跳跃正常,并未因本发明的嵌合内含子产生新的剪接位点(未引入新的外显子),也未影响正常外显子的剪接(未切除正常的人或鼠外显子),可模拟USH2A pre-mRNA的正常剪接。同时,自发跳跃条带测序结果显示(如图16所示),USH2AEXON13c.2802T>G人源化小鼠的嵌合USH2Ac.2802T>G的pre-mRNA存在一定程度的自发剪接跳跃,表明该小鼠模型可模拟携带c.2802T>G突变的人USH2A外显子13的自发剪接跳跃,而该基因嵌合小鼠的自发剪接跳跃概率远远低于携带c.2299delG突变的外显子13的基因嵌合小鼠的自发剪接跳跃概率,前期实验中嵌合人源化小鼠的自发跳跃概率超过50%,接近60%。
实施例5
利用USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠评估药物诱导外显子13剪接跳跃的效果。
通过玻璃体注射剂量为15μg(1μL)的AON(在SEQ ID NO:15:5′-TGATCACACCTAAGCCCTAAA-3′的基础上,将每个碱基增加2′-O-甲氧基修饰和硫代磷酸化,SEQ ID NO:15所示序列为RNA序列,其中T为WIPO Sequence序列表中的字母规范表示,实际为尿嘧啶U,得到5′-MU*MG*MA*MU*MC*MA*MC*MA*MC*MC*MU*MA*MA*MG*MC*MC*MC*MU*MA*MA*MA*-3′,“M”表示2′-O-甲氧基修饰,“*”表示硫代磷酸化)分别注射到hUSH2A EXON13c.2802T>G基因敲入人源化小鼠、hUSH2AEXON13c.2299delG基因敲入人源化小鼠眼部,以不做处理的小鼠作为空白组(nontreated)。注射3周后,处死实验小鼠,取小鼠视网膜组织,提取RNA,并逆转录为cDNA,并通过下表中的对应引物进行RT-PCR实验和qRT-PCR实验,检测同一AON分别用于USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠和USH2AEXON13c.2299delG人源化小鼠诱导剪接跳跃的效果的差异。
表3 RT-PCR引物和qRT-PCR探针列表
结果如图17、图18、下表所示,结果显示,USH2A EXON13c.2802T>G人源化小鼠可用于模拟和评估AON等体内靶向诱导USH2Ac.2802T>G外显子13剪接跳跃的效果。AON在USH2AEXON13c.2802T>G人源化小鼠中诱导人USH2A外显子13剪接跳跃的效率,接近AON在野生型小鼠中诱导人USH2A外显子13剪接跳跃的预估效率,说明EXON13c.2802T>G人源化小鼠hUSH2A外显子13的自发跳跃背景干扰(对剪接跳跃药物评估的干扰)并不显著;尽管AON在USH2AEXON13c.2802T>G、USH2A EXON13c.2299delG两种人源化小鼠中均能诱导人USH2A外显子13剪接跳跃,但是,诱导效果具有显著差异。而AON在hUSH2A EXON13c.2802T>G基因敲入人源化小鼠中诱导剪接跳跃的效果显著低于在USH2A EXON13c.2299delG人源化小鼠呈现的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (21)
1.一种USH2A基因人源化小鼠模型的建立方法,其特征在于,该建立方法包括:将小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,建立得到USH2A基因人源化小鼠模型;所述敲入区域包括人USH2A外显子13,所述人USH2A外显子13的基因包括致病突变c.2802T>G。
2.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述敲入区域包括依次连接的人USH2A内含子12、人USH2A外显子13和人USH2A内含子13的基因。
3.根据权利要求2所述的建立方法,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥490bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥703bp的基因片段。
4.根据权利要求3所述的建立方法,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1500bp的基因片段。
5.根据权利要求4所述的建立方法,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1600bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1599bp的基因片段。
6.根据权利要求5所述的建立方法,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度为1611bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度为1599bp的基因片段。
7.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,利用CRISPR/Cas9系统将所述敲除区域替换为所述敲入区域,所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9和gRNA,所述gRNA的靶向结构域靶向所述敲除区域,所述敲除区域包括鼠Ush2a外显子12。
8.根据权利要求7所述的建立方法,其特征在于,所述敲除区域包括依次连接的鼠Ush2a内含子11、鼠Ush2a外显子12和鼠Ush2a内含子12的基因;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度≥490bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度≥703bp的基因片段。
9.根据权利要求8所述的建立方法,其特征在于,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度≥1500bp的基因片段。
10.根据权利要求9所述的建立方法,其特征在于,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1600-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1500-15079bp的基因片段。
11.根据权利要求10所述的建立方法,其特征在于,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600-15079bp的基因片段。
12.根据权利要求11所述的建立方法,其特征在于,所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600bp的基因片段。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:
构建靶向载体:构建得到依次包含5’同源臂、重组位点、人源USH2A基因序列的敲入区域和3’同源臂的靶向载体;
显微注射:将所述靶向载体、Cas9 mRNA和gRNA混合,注射入受精卵细胞中,得到阳性F0代小鼠;
交配得到子代鼠:将上述阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠,将F1代杂合子小鼠交配,鉴定筛选,得到纯合子的USH2A人源化基因敲入小鼠。
14.根据权利要求13所述的建立方法,其特征在于,所述gRNA的靶向结构域序列如下所示:
ATTCCTAACGATACTCGCAG(SEQ ID NO:4),和TCCACAATGCTCTTACTTCC(SEQ ID NO:5)。
15.一种USH2A基因人源化小鼠模型,其特征在于,小鼠USH2A基因序列的敲除区域替换为人源USH2A基因序列的敲入区域,所述敲入区域包括人USH2A外显子13,所述人USH2A外显子13的基因包括致病突变c.2802T>G。
16.根据权利要求15所述的USH2A基因人源化小鼠模型,其特征在于,所述敲入区域包括依次连接的人USH2A内含子12、人USH2A外显子13和人USH2A内含子13的基因;所述敲除区域包括依次连接的鼠Ush2a内含子11、鼠Ush2a外显子12和鼠Ush2a内含子12的基因。
17.根据权利要求16所述的USH2A基因人源化小鼠模型,其特征在于,所述所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥490bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥703bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度≥1500bp的基因片段。
18.根据权利要求17所述的USH2A基因人源化小鼠模型,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1500bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1500bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1600-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1500-15079bp的基因片段。
19.根据权利要求18所述的USH2A基因人源化小鼠模型,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度≥1600bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度≥1599bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670-3586bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600-15079bp的基因片段。
20.根据权利要求19所述的USH2A基因人源化小鼠模型,其特征在于,所述人USH2A内含子12的基因包括人USH2A内含子12的3’端长度为1611bp的基因片段,所述人USH2A内含子13的基因包括人USH2A内含子13的5’端长度为1599bp的基因片段;
所述鼠Ush2a内含子11的基因包括鼠Ush2a内含子11的3’端长度为1670bp的基因片段,所述鼠Ush2a内含子12的基因包括鼠Ush2a内含子12的5’端长度为1600bp的基因片段。
21.权利要求15-20中任一项所述的USH2A基因人源化小鼠模型在评估USH2A外显子13剔除效率,或评估用于诱导USH2A突变的药物的疗效中的应用。
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