CN115704031A

CN115704031A - 评估ush2a外显子13剔除效率的mini-rep基因及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN115704031A
Application number: CN202110884031.8A
Authority: CN
Inventors: 梁峻彬; 欧家裕; 徐辉
Original assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2023-02-17

Abstract

本发明涉及评估USH2A外显子13剔除效率的MINI‑REP基因及其表达载体和应用，涉及基因工程技术领域。该MINI‑REP基因包括报告基因和小基因，所述报告基因为行使报告功能的基因，所述小基因包括依次连接的USH2A内含子12、外显子13和内含子13的基因；所述小基因插入所述报告基因，将所述报告基因分割成断裂报告基因，所述断裂报告基因单独表达均不发挥报告功能，串联完整表达则发挥报告功能。所述MINI‑REP基因可应用于现有技术中所有用于诱导USH2A外显子13剔除的相关技术的效率评估，可用于新型技术的研发、效果检测盒高效筛选，可用于USH2A外显子13剔除效率的快速、直观、高效、高灵敏度的定性和定量分析。

Description

评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因及其表达载体和应用。

背景技术

Usher综合征(Usher Syndrome)是一类遗传性疾病，又称耳聋-色素性视网膜炎综合征，其特征是不同程度的先天性感音神经性耳聋，以及色素性视网膜炎(RP)引起的进行性视力丧失。在临床上Usher综合征可分为3种类型：1、Ⅰ型Usher综合征，患者表现出先天性重深度感音神经性耳聋，前庭反应消失，青春期前出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为MYO7A、CDH23、USH1C、PCHD15等；2、Ⅱ型Usher综合征，患者表现出先天性中重度感音神经性耳聋，前庭反应正常，青春期出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为USH2A、GPR98、WHRN等；3、Ⅲ型Usher综合征，患者表现出进行性感音神经性耳聋，前庭反应正常，青春期末出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为CLRN1等。

其中，II型占Usher综合症的比例超过50％。而USH2A基因突变是Usher综合征II型的最常见原因，涵盖超过50％的Usher综合征患者。同时，USH2A基因的突变也是导致非综合征性视网膜色素变性(NSRP)的重要原因之一。

USH2A定位于1q41，其在基因组中的跨度超过800kb，编码一个大型跨膜蛋白Usherin，其锚定在视网膜感光细胞和内耳毛细胞的质膜上，是纤毛发育和维持必不可少的组分。在视网膜中，Usherin是USH2复合物的重要部分，被认为在稳定光感受器的外节段发挥作用。USH2A具有2个亚型，在视网膜细胞中主要的亚型含有72个Exon，编码区长度约为15.6kb。Usherin蛋白的胞外部分包含许多重复的结构域，包括10个Laminin EGF-like(LE)结构域和35个Fibronectin type 3(FN3)结构域。人USH2A外显子13长度为642bp，编码着第723～936位氨基酸，为Usherin蛋白中10个LE结构域中的4个。

USH2A基因的第13号外显子13、第50号外显子和第40号内含子的突变会引发Usher综合征。迄今为止已经鉴定出超过1000个分布在整个USH2A基因中的致病性突变，其中的外显子13是USH2A基因中突变最频繁的外显子，约占35％。USH2A基因第13号外显子的突变，包括c.2802T>G(p.Cys934Trp，中国患者频率最高突变)、c.2299delG(p.E767SfsX21，欧美患者频率最高突变)、c.2276G>T(氨基酸变化:p.C759F)、c.2522C>A(p.S841Y)、c.2242C>T(p.Gln748X)、c.2541C>A(C847X)、c.2761delC(Leu921fs)和c.2776C>T(p.R926C)、c.2209C>T、c.2310delA、c.2391_2392deITG、c.2431A>T、c.2431_2432delAA、c.2440C>T、c.2525dup、c.2610C>A、c.2755C>T、c.2176T>C、c.2236C>G、c.2296T>C、c.2332G>T。

USH2A编码区长度约为15.6kb，常规的基因治疗递送方法(如重组慢病毒、重组腺相关病毒等)难以包装如此庞大的编码序列，因此难以通过直接递送USH2A进行治疗。现有技术通过CRISPR/Cas系统进行基因组DNA的编辑直接删除外显子13，或者破坏RNA剪接相关的位点；通过使用单碱基编辑器修改上述剪接相关位点的关键碱基，亦可促进外显子跳读；通过反义寡核苷酸(AONs，Antisense oligonucleotides)靶向干扰pre-mRNA剪接，促进外显子跳读的效率较高。

现有技术报道的用于评估USH2A外显子剪接跳跃的常规细胞学方法，是在含有野生型USH2A的细胞系(如Weri-Rb1细胞)或病人来源的原代细胞、诱导多能干细胞等，通过RT-PCR和WESTERN BLOT评估剪接跳跃效率。然而，该评估体系涉及繁杂而费时的RNA/蛋白提取、转录、电泳等大量实验流程，且主要主要通过RT-PCR进行定性/半定量评估，若需要定量评估则需要通过qRT-PCR，耗时更长、更为复杂，且涉及细节较多，因细节可能发生的误差也较大，灵敏度不足，特别是细微的差异较难体现。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因，可应用于现有技术中所有用于诱导USH2A外显子13剔除的相关技术的效率评估，可用于新型技术的研发、效果检测盒高效筛选，可用于USH2A外显子13剔除效率的快速、直观、高效、高灵敏度的定性和定量分析。

本发明提供了一种评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因，包括报告基因和小基因，所述报告基因为行使报告功能的基因，所述小基因包括依次连接的USH2A内含子12、外显子13和内含子13的基因；所述小基因插入所述报告基因，将所述报告基因分割成断裂报告基因，所述断裂报告基因单独表达均不发挥报告功能，串联完整表达则发挥报告功能。

上述MINI-REP基因引入了断裂报告基因，简化了评估流程，且能实现USH2A外显子13剔除效率的快速、直观、高效、高灵敏度的定性和定量分析。

本发明人对USH2A进行了调查研究，发现小鼠USH2A的外显子12与人USH2A外显子13同源，长度均为642bp，移除该外显子并没有造成后续的移码突变。有研究显示，在敲除了小鼠USH2A的外显子12后，Usherin依然能够正确定位并且行使正常的功能。因此，对于包含致病性突变的人USH2A外显子13，可以利用一系列手段使其发生跳读进行治疗。

而在对现有技术中用于评估USH2A外显子13剔除效率的方法进行研究的过程中，本发明人发现虽然通过MINIGENE(小基因，USH2A内含子12的3’端-外显子13-内含子13的5’端)替换小鼠的外显子12及两侧相关片段，能够构建人鼠基因嵌合小鼠模型，进而在小鼠体内评估AON诱导USH2A外显子13剪接跳跃的效率，但该小鼠模型的构建耗时0.5-2年，技术要求高，成本高。不仅如此，该模型的内含子长度为外显子两侧的100bp左右，无法应用于新技术方案“通过Cas9双靶点切除外显子13”的效率评估，因Cas9受限于核酸切割机制PAM位点，外显子13两侧100bp以内的内含子可选的高效位点有限，因此不适用。而且，USH2A外显子13剪接相关位点并未发掘完成，现有技术MINIGENE体系并未含有内含子12的5’端和内含子13的3’端，外显子13两侧100bp以外也存在外显子13剪接相关位点，例如现有技术报道的内含子12剪接沉默位点，位于内含子12的5’端，靶向该位点的AON可促进USH2A外显子13的高效剪接跳跃，然而该现有技术无法评估外显子13两侧100bp以外的位点靶向效果。现有技术虽然延长了外显子13两侧的内含子片段至1500bp，以拓展Cas9的靶点选择，然而，构建嵌合基因人源化小鼠需要替换的基因长度超过3642bp，超了3倍，难度系数指数增长，小鼠品系构建难度更大，时间周期更长。

因此，本发明构建一种可准确地定性定量评估将USH2A外显子13从USH2A基因、RNA或蛋白水平剔除的效率的MINI-REP基因，及其表达载体、病毒或细胞和应用。本发明通过序列优化的MINIGENE基因和序列优化的断裂REPORTER报告基因的组合，实现了简单、便捷、精准地定性定量评估将USH2A外显子13从USH2A基因、RNA或蛋白水平剔除的效率。

本发明可广泛用于评估不同的“USH2A外显子13剔除”技术的剔除效率，如基因敲除、RNA干扰等。所述基因敲除表示在USH2A中对外显子13进行大片段切除、或破坏剪接供体/受体位点等剪接相关位点导致外显子13在基因、RNA或蛋白水平剔除。所述RNA干扰表示通过靶向USH2A外显子13敲除剪接供体/受体位点等剪接相关位点，诱导外显子13的剪接跳跃，促使外显子13在RNA水平剔除。而且，本发明对于不同的“诱导USH2A外显子13剔除”技术都可以实现精准的剔除效率定量和对比。

在其中一个实施例中，所述内含子12的基因和所述内含子13的基因为缩短的基因片段。

在其中一个实施例中，所述内含子12的基因和所述内含子13的基因由内含子5’端的片段和内含子3’端的片段串联而成。

在其中一个实施例中，所述内含子12的基因由内含子12的5’端长度为50-200bp的基因片段和3’端长度为200bp-1700bp的基因片段按照5’-3’顺序串联得到，所述内含子13的基因由内含子13的5’端长度为200bp-1700bp的基因片段和3’端长度为50-200bp的基因片段按照5’-3’顺序串联得到。

上述内含子片段包括内含子12的5’端和内含子13的3’端，因此囊括了这两个区域中协同外显子13剪接跳跃的位点；同时，上述内含子片段使构建得到的MINI-REP基因能够评估外显子两侧100bp以外的剪接相关位点的效果，有利于Cas9双切外显子13以及其他用于诱导USH2A外显子13剔除相关技术的效率评估，且能用于新型技术的研发、效果监测和高效筛选。

在其中一个实施例中，所述内含子12的基因5’段片段长度为192-204bp，3’端片段长度为490-1611bp，所述内含子13的基因5’段片段长度为706-1599bp，3’端片段长度为216bp。

选择上述长度的序列片段，内含子5’和3’端序列连接不会形成新的剪接供体或剪接受体等剪接相关位点，不会对外显子13的剪接造成影响，能够更精准地模拟USH2A外显子13的剪接跳跃。

在其中一个实施例中，所述内含子12的基因包括以下区域及相似性≥90％的序列：内含子12的剪接沉默子ISS、外显子13的剪接的分支位点BP、外显子13的剪接受体SA、外显子13的剪接供体SD或外显子13的剪接增强子ESE；

所述内含子13的基因包括以下区域及相似性≥90％的序列：内含子13的剪接增强子ISE或内含子13的聚嘧啶束。

以上述序列为靶点，具有剔除或协同剔除外显子13的效果，因此优化了内含子12和内含子13的基因片段选择，选择上述序列片段构建得到的MINI-REP基因，其评估USH2A外显子13剔除效率的灵敏度高。

在其中一个实施例中，所述报告基因选自：荧光蛋白基因或酶标记基因。上述基因为常规报告基因，简单易得。

在其中一个实施例中，所述报告基因为绿色荧光基因EGFP。采用上述报告基因，能简化流程，且评估结果直观、高效。

在其中一个实施例中，将所述小基因插入所述报告基因内连续2个G碱基之间。根据人pre-mRNA的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点效率保守性，选择报告基因内连续2个G碱基之间作为断裂位点。

在其中一个实施例中，将所述小基因插入绿色荧光基因EGFP序列AGGT的2个G碱基之间。

在其中一个实施例中，将所述小基因插入绿色荧光基因EGFP正义链序列“AGGT”的2个G碱基之间。

在其中一个实施例中，将所述小基因插入绿色荧光基因EGFP正义链序列的第一个“AGGT”的2个G碱基之间。

上述的第一个“AGGT”将EGFP基因分为长度相对近似的两半，并且经本发明实施例验证该位点分割后的EGFP两部分，其中任意的单独一部分均不具备绿色荧光功能的蛋白。

在其中一个实施例中，所述外显子13的基因包括不含突变的天然野生型序列或含有突变的基因序列。

在其中一个实施例中，所述含有突变的外显子13基因序列包括天然存在突变或致病性突变的基因序列。

在其中一个实施例中，所述外显子13的基因包括以下致病突变中的至少一种：c.2802T>G(p.Cys934Trp)、c.2299delG(p.E767SfsX21)、c.2276G>T(p.C759F)、c.2522C>A(p.S841Y)、c.2242C>T(p.Gln748X)、c.2541C>A(C847X)、c.2761delC(Leu921fs)和c.2776C>T(p.R926C)、c.2209C>T、c.2310delA、c.2391_2392deITG、c.2431A>T、c.2431_2432delAA、c.2440C>T、c.2525dup、c.2610C>A、c.2755C>T、c.2176T>C、c.2236C>G、c.2296T>C和c.2332G>T。

在其中一个实施例中，所述外显子13的致病突变包括c.2802T>G或c.2299delG。因为c.2802T>G是中国患者频率最高的突变，c.2299delG是欧美患者频率最高的突变，选择上述两种致病突变的外显子13基因，构建得到的MINI-REP基因更具代表性。

在其中一个实施例中，所述外显子13的致病突变为c.2802T>G。因为本发明发现c.2299delG存在明显自发剪接跳跃，远高于c.2802T>G，所以选择c.2802T>G以避免c.2299delG突变可能会发生假阳性或者效率与实际情况不匹配的情况，并对后续检测诱导(含有c.2802T>G突变)USH2A外显子13剔除的药物效果的准确性产生影响。

本发明还提供了一种表达所述MINI-REP基因的表达载体。

在其中一个实施例中，所述表达载体以酶切连接方式整合了所述MINI-REP基因。

构建所述表达载体的目的在于，所述报告基因中插入了包含致病突变的人USH2AEXON13^mut序列，破坏了报告基因的结构，分割成两部分，并且提前产生了终止密码子，使报告基因不再产生报告功能；但若在PreRNA剪接的过程中跳读外显子13，或切除外显子13的基因，则可形成成熟的报告基因mRNA，可正常发挥报告功能。

在其中一个实施例中，所述表达载体包括瞬时表达载体或稳定表达载体。

在其中一个实施例中，所述瞬时表达载体采用的载体为pX601、pCDNA3.1或pCMV-M1。

在其中一个实施例中，所述稳定表达载体为将携带的基因序列整合在宿主(细胞)基因组，或在辅助载体或包装病毒的手段的情况下，将携带的基因序列整合入宿主(细胞)基因组。

在其中一个实施例中，所述稳定表达载体采用的载体为慢病毒表达载体pLenti或Piggybac转座子载体。

本发明还提供了一种包括所述表达载体的报告基因评估细胞，该评估细胞由所述表达载体瞬时转染和/或稳定转染宿主细胞构建得到。

在其中一个实施例中，所述瞬时转染为将所述表达载体直接转染所述宿主细胞；所述稳定转染为将所述MINI-REP基因整合入转座子载体或慢病毒载体后，稳定整合入宿主细胞基因组。

在其中一个实施例中，所述瞬时转染为将所述表达载体直接转染所述宿主细胞的同时，共转染Cas9相关质粒载体或加入AON。

在其中一个实施例中，通过流式细胞技术分选EGFP阴性的宿主细胞，排除报告基因自发跳跃的细胞。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞选自细胞系、原代细胞及其分化或转分化的细胞中的至少1种。

在其中一个实施例中，所述细胞系为人体细胞系，所述原代细胞为人源原代细胞。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞为293T、N2A、WERI、人视网膜细胞或人内耳细胞。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞为293T细胞。

本发明还提供了一种包括所述报告基因评估细胞的动物模型。

本发明还提供了所述MINI-REP基因、所述表达载体、所述报告基因评估细胞或所述动物模型在评估USH2A外显子13剔除效率中的应用。

在其中一个实施例中，所述USH2A外显子13剔除通过剪接跳跃或基因切除实现。

在其中一个实施例中，所述剪接跳跃为：构建靶向USH2A基因PreRNA的gRNA，所述gRNA的靶向结构域与USH2A基因PreRNA序列互补，所述gRNA通过与USH2A基因PreRNA结合而使外显子13被剪接跳跃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因，通过优化内含子基因片段的选择，引入断裂报告基因，从而简化了评估USH2A外显子13剔除效率的评估流程，且可应用于现有技术中所有用于诱导USH2A外显子13剔除的相关技术的效率评估，可用于新型技术的研发、效果检测和高效筛选，实现USH2A外显子13剔除效率的快速、直观、高效、高灵敏度的定性和定量分析。

附图说明

图1为EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right、EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right基因结构示意图；

图2为瞬时MINI-REP基因报告载体图谱(pCMV-EGFP_left-Exon13-EGFP_right)；

图3为pLenti-CMVie-IRES-BlastR图谱；

图4为pLenti-CMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right-BSD载体图谱；

图5为pLenti-CMV-EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right-BSD载体图谱图；

图6为荧光显微镜检测不同的突变对外显子13自发剪接跳跃影响的结果图；

图7为流式细胞技术检测检测不同的突变对外显子13自发剪接跳跃影响的结果图；

图8为实施例5中构建的MINIGENE-V1图谱；

图9为实施例5中构建的MINIGENE-V2图谱；

图10为实施例5中构建的MINIGENE-V3图谱；

图11为实施例5中构建的MINIGENE-V4图谱；

图12为在MINIGENE体系中评估不同突变、不同宿主细胞、不同内含子片段对外显子13自发剪接跳跃、转染效率的影响的结果图，

其中，泳道1：USH2A Minigene V1转染293T；泳道2：USH2AMinigene V2转染293T，没有检测到明显的外显子跳跃迹象(野生型USH2A-13外显子)；泳道3：USH2AMinigene V3转染293T，检测到少量外显子跳跃迹象(含c.2299delG突变)；泳道4：USH2AMinigene V4转染293T，没有检测到明显的外显子跳跃迹象(含c.2802T>G突变)；泳道5：pCMV-EGFP转染293T；泳道6：USH2AMinigene V1转染N2A；泳道7：USH2A Minigene V2转染N2A，没有检测到明显的外显子跳跃迹象；泳道8：USH2AMinigene V3转染N2A，检测到明显的外显子跳跃迹象(含c.2299delG突变)；泳道9：USH2AMinigene V4转染N2A，没有检测到明显的外显子跳跃迹象(含c.2802T>G突变)；泳道10：pCMV-EGFP转染N2A；泳道M：GL DNAMarker 10000；

图13为实施例5中的泳道9电泳条带DNA测序结果图；

图14为在MINI-REP基因细胞体系中评估不同剂量的AON诱导外显子13剪接跳跃的效率的荧光显微镜图；

图15为荧光显微镜观察MINI-REP细胞体系中双靶点Cas9技术和AON技术诱导USH2A外显子13剔除效果的结果图；

图16为不同gRNA引导的dCasRx诱导USH2A外显子13剪接效率(EGFP阳性率)的结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

定义：

本发明所述的报告基因：指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因。

材料来源：

pX601(Addgene公司，货号：#61591)、pLenti CMVie-IRES-BlastR(addgene#119863)、Piggybac转座子载体(Addgene，货号92078)、Piggybac转座子载体(Addgene，货号92078)、psPAX2(Addgene，货号12260)、pMD2.G(Addgene，货号12259)、Lipofectamine2000(Thermo公司)、NEB#E2621

高保真DNA组装预混液、GL DNAMarker 10000(Accurate Biology，货号：#AG11909)、SteadyPure Agarose Gel DNA Purification Kit(Accurate Biology，货号：#AG21005)、BpiI(THERMO FISHER)。

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

实施例1

设计和合成外显子13的MINIGENE小基因及其和断裂报告基因组合的MINI-REP基因。

1、设计并合成外显子13的MINIGENE小基因。

EXON13^mut表示包含致病突变的USH2A外显子13，及其上下游内含子序列，即含有突变的MINIGENE，mut表示突变(mutation)，MINIGENE(小基因)为包含USH2A内含子12-外显子13-内含子13的基因。在本发明实施例中，所述的USH2A外显子13致病突变为c.2802T>G、c.2299delG，即获得的MINI-REP基因分别为EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right、EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right。

EXON13^mut下游内含子序列的片段选择为内含子12基因片段由5’端的长度为50-200bp的片段和3’端长度为200bp-1700bp的片段按照5’-3’顺序串联而成，内含子13基因片段由5’端的长度为200bp-1700bp的片段和3’端长度为50-200bp的片段按照5’-3’顺序串联而成。在本实施例中，内含子12基因片段选择5’端长度为204bp的基因片段串联3’端长度为490bp的基因片段，内含子13基因片段选择5’端长度为703bp的基因片段串联3’端长度为216bp的基因片段；同时，本实施例还在内含子12基因片段选择5’端长度为192bp的基因片段串联3’端长度为1611bp的基因片段，内含子13基因片段选择5’端长度为1599bp的基因片段串联3’端长度为216bp的基因片段，如图1所示。

选择上述长度的序列片段，内含子5’和3’端序列连接不仅不会形成新的剪接供体或剪接受体等剪接相关位点，而且序列延长，为不同的“USH2A外显子13剔除”技术提供更多的靶位点，并且相对于短的MINIGENE载体，转染效率并未降低。

2、合成和断裂报告基因组合的MINI-REP基因。

设计并合成外显子13的MINIGENE小基因后，将其插入报告基因(RG，reportergene)，使所述报告基因分割成断裂报告基因RG_left和RG_right，RG_left表示没有报告功能的报告基因5’端前半部分，RG_right表示没有报告功能的报告基因3’端后半部分，RG_left和RG_right串联表达可正常行使完整报告基因功能。在本实施例中，所述报告基因为绿色荧光基因EGFP，则所述MINI-REP基因结构为EGFP_left-Exon13^mut-EGFP_right。

实施例2

构建MINI-REP基因报告载体。

将实施例1中设计得到的MINI-REP基因序列通过全基因合成的方式获取，同时合成基因序列两端设置对应的酶切位点，通过酶切连接方式整合入表达载体中，构建MINI-REP基因报告载体，所述载体可以是瞬时表达载体或者稳定表达载体。

1、瞬时MINI-REP基因报告载体的设计和构建。

采用限制性内切酶AgeI和EcoRI切割合成基因和pX601，酶切后，电泳、切胶回收线性化片段，因此按照T4连接体系依次加入酶切后质粒及含粘性末端的合成基因，及DNALigation Kit Ver.2.1在PCR仪内16℃孵育1小时，使合成的基因序列与线性化的载体骨架完成连接，得到的T4连接的反应产物，即pCMV-EGFP_left-Exon13-EGFP_right载体(其中EXON13是含有突变的USH2A外显子13)，结构如图2所示。在本实施例中，为pCMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right载体和pCMV-EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right载体。

2、稳定MINI-REP基因报告载体的设计和构建。

采用限制性内切酶XhoI和NheI切割合成基因和慢病毒表达载体pLenti CMVie-IRES-BlastR，结构如图3所示。酶切后，电泳、切胶回收，因此按照T4连接体系依次加入酶切后质粒及含粘性末端的合成基因，及DNA Ligation Kit Ver.2.1在PCR仪内16℃孵育1小时，使合成的基因序列与线性化的载体骨架完成连接，得到的T4连接的反应产物，即Plenti-CMV-EGFP_left-Exon13-EGFP_right-BSD载体(其中EXON13是含有突变的USH2A外显子13)。在本实施例中，为Plenti-CMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right-BSD载体和Plenti-CMV-EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right-BSD载体，结构如图4和图5所示。

3、质粒载体转化。

在超净台内，将上述得到的全部T4连接的反应产物迅速加入到1管(50微升)大肠杆菌Stbl3感受态细胞内，然后将其放冰上孵育30分钟。将孵育后的感受态细胞浸入42℃水浴锅中热击90秒，再放回冰上孵育2分钟。然后在超净台内，向菌液加入400μl不含抗生素的LB培养基，随后将其放到细菌摇床内，37℃下200rpm培养复苏45分钟。复苏期间，开启生化培养箱，将含适量氨苄青霉素的LB琼脂平板放入使其干燥。菌液室温12000rpm离心1分钟，吸取移除大部分上清液，保留约50μl后充分重悬沉淀。吸取菌液滴到含氨苄青霉素LB琼脂平板的边缘，使用移液器吸头在平板上划线。随后将平板倒置放入生化培养箱中，继续培养16-18小时。

4、阳性克隆鉴定。

在超净台内使用1-10μl移液器吸头分别挑取7个单克隆到50μl含氨苄青霉素LB培养基中，吹打数次使菌体与LB培养基混匀。吸取2μl菌液加入到菌落PCR反应液(如下表所示)中，混合均匀后瞬时离心使液体聚集于管底，随后进行PCR反应。剩余菌液置于生化培养箱中继续培养。pCMV-EGFP_left-Exon13-EGFP_right正向引物序列(EGFP-F)：ACCACTACCTGAGCACCCAG(SEQ ID NO:1)，反向引物序列(f1ori-R)：GCTGGCAAGTGTAGCGGTCA(SEQ ID NO:2)。慢病毒载体，正向引物序列：(EGFP-F)：ACCACTACCTGAGCACCCAG(SEQ IDNO:3)，反向引物序列为：(BSD-R)：GCCCAGCACCACGAGTTCTG(SEQ ID NO:4)。

表1 PCR扩增反应体系

反应总体积	30μl
		2X Accurate Taq Master Mix	15μl
正向引物	0.6μl
		反向引物	0.6μl
菌液	1μl
		去离子水	12.8μl

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取电泳条带大小正确、单一、亮度正常的克隆视为阳性克隆。取10μl菌液送Sanger测序。剩余菌液用于质粒提取，操作流程按照Accurate质粒提取试剂盒的说明书，最后用50μl Elution Buffer洗脱。按Qubit4Fluorometer的操作方法，用Qubit dsDNA BR Assay Kit测定浓度。每个质粒选取一个阳性克隆，提供5-10μl用于Sanger测序，选择测序比对正确的质粒。

该载体的目的在于，在报告基因如EGFP基因中间插入了包含致病突变如c.2802T>G的人USH2A EXON13mut序列，破坏了报告基因如EGFP的结构，分割成两部分，并且提前产生了终止密码子，使报告基因不再产生报告功能如发出荧光等；但若在PreRNA剪接的过程中跳读外显子13，或切除外显子13的基因，则可形成成熟的报告基因mRNA，可正常发挥报告功能如发出荧光等。

根据人pre-mRNA的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点效率保守性，选取报告基因内的连续2个G碱基作为备选的断裂位点，例如报告基因中部的区域。在本实施例中选用的报告基因为EGFP，则EGFP基因中部的断裂位点选择了AG-GT。

EGFP-LEFT序列为SEQ ID NO:5序列所示，EGFP-RIGHT序列为SEQ ID NO:6序列所示。

实施例3

MINI-REP基因报告载体转染宿主细胞-报告基因细胞评估体系的构建。

所述报告基因细胞分为稳定转染细胞和瞬时转染细胞。

1、瞬时转染细胞的构建。

瞬时转染是通过MINI-REP基因载体直接转染宿主细胞获得。按照Life Tech公司Lipofectamine 2000试剂使用步骤，转染293T细胞。转染前一天，将状态良好的293T细胞按1×10⁵/孔接种至24孔板。转染当天，分别取相应体积的MINI-REP基因质粒100ng加入50μlOPTI-MEM，各取1μl Lipofactamine 2000加入50μl OPTI-MEM培养基，混匀后室温静置5mins，然后将稀释后的质粒DNA与Lipofactamine2000混匀，室温静置15分钟，接着将100μl质粒DNA复合物加入24孔板的每孔细胞中，轻轻晃动培养板混匀。放置37℃培养24小时。转染24小时后，置于荧光显微镜-绿色荧光下进行观察，或通过流式细胞技术分析EGFP阳性细胞的比例。

2、稳定转染细胞的构建。

稳定转染细胞的构建，将MINI-REP基因整合入Piggybac转座子载体或者慢病毒载体pLenti CMVie-IRES-BlastR等中，通过常规的转座子或慢病毒转基因技术流程在宿主细胞中进行转基因。通过转座子系统转染的，则目的基因转座子载体与Piggybac转座酶表达载体共同转染宿主细胞。通过慢病毒载体感染，则首先在293T细胞中加入整合目的基因的慢病毒载体和辅助载体psPAX2和pMD2.G包装病毒，回收上清、浓缩获得表达MINI-REP基因的病毒，在本实施例中为Plenti-CMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right-BSD病毒和Plenti-CMV-EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right-BSD病毒。在宿主细胞中加入病毒进行感染。其后，更换培养基培养宿主细胞48小时后，加入稳定MINI-REP基因报告载体中携带的抗性基因对应的抗生素，在本实施例中为Blasticidin(杀稻瘟菌素)，终浓度20μg/ml进行细胞筛选，存活的细胞即为MINI-REP基因稳定转染细胞，如EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right稳定表达细胞和pWPXLd-EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right稳定表达细胞。

MINI-REP基因稳定转染细胞可扩增、保种，稳定转染细胞的体外使用时间最优为分选后两个月内，以防细胞自身对异常基因/蛋白的降解机制屏蔽报告基因的表达。两个月后，则建议使用保种冻存细胞，或重新转染、分选获得新的MINI-REP基因稳定转染细胞。选择状态良好、处于增长指数期的MINI-REP稳转细胞，加入待评估技术相关药物或试剂进行处理。其后，可通过荧光显微镜观察或者流式细胞仪器检测报告基因如EGFP表达的比例，在本实施例中采用流式细胞仪器检测，对相关诱导USH2A外显子13剔除(剪接跳跃/切除)药物/制剂进行作用效果评估。

宿主细胞的选择应该根据转染效率高、剪接情况模拟人体眼部或耳部来源的细胞等方面进行综合考虑。在本实施例中，宿主细胞为293T细胞(人胚胎肾细胞系)和N2A细胞(小鼠来源神经瘤母细胞)。

实施例4

基于MINI-REP细胞评估不同的突变对外显子13剪接的影响。

为了评估不同的突变对USH2A外显子13剪接的影响，通过合成含有不同突变的MINI-REP基因，并构建对应的MINI-REP基因报告载体，并通过流式细胞技术分析含有不同突变的外显子13在本发明MINI-REP基因体系中剪接跳跃的情况。

在本实施例中，MINI-REP基因中外显子13含有的突变分别为c.2802T>G、c.2299delG，内含子12片段选择5’端192bp串联3’端1611bp，内含子13片段选择5’端1599bp串联3’端216bp，并构建对应的MINI-REP基因载体pCMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right、pCMV-EGFP_left-Exon13^c.2299delG-EGFP_right。依据实施例3的瞬时转染方法，使用转染试剂Lipofectamine2000，将两个MINI-REP基因载体分别转染宿主细胞，在本事实例中，宿主细胞选用293T细胞。以不含有突变的MINI-REP基因载体为阴性对照，以不含有外显子13的MINI-REP基因载体为阳性对照。转染24小时后，通过荧光显微镜观察各组细胞中发EGFP绿色荧光的细胞情况，结果如图6所示，通过流式细胞技术检测不同突变实验组的EGFP阳性细胞比例，结果如下表所示。其中，通过流式细胞技术检测c.2802T>G、c.2299delG突变实验组中自发剪接跳跃(EGFP阳性)细胞的比例分别为9.4％和41.7％，如图7所示。

结果显示，c.2802T>G、c.2299delG均会导致外显子13进行自发剪接跳跃，c.2299delG存在明显自发剪接跳跃，显著高于c.2802T>G。因此用于评估诱导剪接跳跃的治疗时，含有c.2299delG突变可能会发生假阳性或者效率与实际情况不匹配的情况，会对后续检测诱导USH2A外显子13剔除的药物效果的准确性产生影响。

表1通过流式细胞技术检测不同突变实验组的EGFP阳性细胞比例

实验组	EGFP阳性率(％)
		pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>WT</sup>-EGFP<sub>right</sub>	7.6
pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>c.2802T>G</sup>-EGFP<sub>right</sub>	9.4
		pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>c.2299delG</sup>-EGFP<sub>right</sub>	41.7
pCMV-EGFP<sub>left</sub>-EGFP<sub>right</sub>	89.6

实施例5

基于表达MINIGENE小基因的不同细胞验证不同的突变对外显子13剪接的影响。

本实施例设置了MINIGENE细胞实验以检验基于MINI-REP基因细胞评估不同的突变对外显子13剪接的影响结果。本实施例构建4个MINIGENE(小基因)，具体如下：

MINIGENE-V1：mExon11-mExon12-mExon13(m表示小鼠，h表示人)，基因结构为小鼠的USH2A外显子11、小鼠内含子11的5’端204bp、小鼠内含子11的3’端490bp、小鼠的外显子12、小鼠内含子12的5’端703bp、小鼠内含子12的3’端216bp、小鼠的外显子13，按照5’到3’的顺序串联而成，如图8所示。

MINIGENE-V2：mExon11-hExon13-mExon13，载体结构为：小鼠外显子11、小鼠内含子11的5’端192bp、人内含子12的3’端1611bp、人外显子13、人内含子13的5’端1599bp、小鼠内含子12的3’端216bp、小鼠的外显子13，按照5’到3’的顺序串联而成，如图9所示。

MINIGENE-V3：mExon11-hExon13(c.2299delG)-mExon13，载体结构与MINIGENE-V2相同，仅人外显子13引入了c.2299delG突变，如图10所示。

MINIGENE-V4：mExon11-hExon13(c.2802T>G)-mExon13，载体结构与MINIGENE-V2相同，仅人外显子13引入了c.2802T>G突变，如图11所示。

通过全基因合成的方式获得MINIGENE-V(1-4)基因序列，通过AgeI+EcoRI酶切pX601获得线性化载体。PCR扩增合成的片段，同时PCR引物中5’加入与线性化的pX601末端20bp同源的序列；回收上述2个片段，产物使用DNA组装预混液进行重组，然后转移至冰上，转化感受态细胞，涂板、挑单克隆、验证，则将合成的MINIGENE-V1-4基因序列无缝插入到pCMV-EGFP载体中，获得pCMV-EGFP-MINIGENE-V(1-4)载体。该载体使EGFP与MINIGENE在CMV启动子的驱动下同时转录表达。

MINIGENE-V1/V2/V3/V4载体通过Lipofectamine 2000试剂分别转染293T细胞、N2A细胞，同时以转染CMV-EGFP载体作为对照。转染后24小时-72小时收获细胞，提取其总RNA，通过RT-PCR分析MINIGENE中外显子13的pre-RNA剪接情况，结果如图12所示。

结果显示，USH2AMINIGENE-V3(人源化外显子13，c.2299delG)转染293T细胞后有发生明显的跳跃迹象，转染N2A细胞后的外显子跳跃迹象更明显，c.2299delG突变确实导致了USH2A外显子13的显著自发剪接跳跃(与实施例4显示结果一致)，表明MINI-REP基因体系确实可准确反映突变对外显子13自发剪接跳跃的影响。

而转染N2A细胞的自发剪接跳跃概率明显高于293T细胞，主要是由于不同种属来源的宿主细胞的剪接相关位点或识别灵敏度可能存在差异，但是在不同种属宿主细胞中反映含有不同突变的外显子13的自发剪接跳跃趋势是一致的(即，c.2299delG突变导致自发跳跃、而c.2802T>G突变不存在自发跳跃)。

而考虑到本发明是使用MINIGENE基因体系去评估人USH2A外显子13剔除效率的，从本实施例结果看，人体细胞中的剪接系统更利于模拟人USH2A外显子13的剪接，因此在表达MINIGENE基因的人体细胞中进行剔除效率评估会比小鼠细胞更精准。

此外，通过MINIGENE-V1和V2转染效率的对比，发现增加内含子片段长度对转染效率影响不显著，因此，在不影响转染效率的情况下，选择更长的内含子片段，即V2中人外显子13两侧的内含子片段。

为了确认USH2AMINIGENE-V4(人源化外显子13，c.2802T>G)在宿主细胞内的RNA剪接情况，从琼脂糖凝胶上切下泳道9的条带，使用SteadyPure Agarose Gel DNAPurification Kit进行胶回收，回收产物以EGFP-F进行Sanger测序。部分测序结果如下图13所示，小鼠USH2A外显子11与人USH2A外显子13相接。从USH2A MINIGENE-V4(人源化外显子13，c.2802T>G)转染N2A细胞后RT-PCR以及测序结果可以看出，USH2A MINIGENE-V4的pre-RNA剪接情况符合理论预测，即选择更长的内含子片段不仅不影响效率，而且不会产生新的剪接相关位点(影响外显子13的正常剪接)。

结合实施例4和实施例5的结果来看，同样是评估不同的USH2A外显子13突变对外显子自发剪接跳跃的影响，尽管两者结果都可以表明c.2299delG存在明显自发剪接跳跃，且显著高于c.2802T>G，但MINIGENE体系无法精准定量两者之间的强弱差值，甚至由于c.2802T>G自发剪接跳跃较弱，无法显示出来。而本发明的MINI-REP体系则可检测出来，可见MINI-REP体系的灵敏度和精准度都更高。

实施例6

基于MINI-REP基因细胞评估同一技术、不同剂量诱导外显子13剔除(剪接跳跃/切除)的效果。

在MINI-REP基因细胞体系中，进行不同剂量的AON处理，通过不同剂量AON诱导的剪接编辑效率评估，检验本发明MINI-REP体系的灵敏度。人源宿主细胞按1×10⁵/孔接种至24孔板，在本实施例中选用的293T细胞。参照实施例3或严格试剂盒按照说明书，通过Lipofectamine 2000试剂将pCMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right转染293T细胞的同时，分别加入10pmol和50pmol的反义寡核苷酸(AON，Antisense Oligonucleotide)。转染24小时后，通过荧光显微镜观察各组细胞中发EGFP绿色荧光的细胞情况，结果如图14所示。并通过流式细胞技术检测不同突变实验组中自发剪接跳跃(EGFP阳性)细胞的比例，结果如下表所示。本实施例所使用的反义寡核苷酸AON为金斯瑞合成的，其5’到3’序列和修饰如下：5’-MA*MG*MC*MU*MU*MC*MG*MG*MA*MG*MA*MA*MA*MU*MU*MU*MA*MA*MA*MU*MC-3’，“M”(大写)表示2’-O-甲氧基乙基修饰。

表1通过流式细胞技术检测不同剂量AON实验组的EGFP阳性细胞比例

实验组	EGFP阳性率(％)
		10pmol AON+pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>c.2802T>G</sup>-EGFP<sub>right</sub>	50.4
50pmol AON+pCMV-EGFP<sub>left</sub>-Exon13<sup>c.2802T>G</sup>-EGFP<sub>right</sub>	32.5

结果显示，不同剂量的AON在转染了MINI-REP基因的293T细胞中诱导USH2A 外显子13剪接跳跃的效果差异，并发现更高剂量(50pmol)的AON并未诱导更高效的剪接跳跃，由于高剂量的AON对细胞存在毒性，存在一定的细胞死亡情况。

而本实施例的结果表明，在本发明MINI-REP基因细胞体系中，通过荧光显微镜观察和流式细胞技术的方法可以快速获得USH2A外显子13剪接跳跃的情况，且流式细胞技术检测可以明确不同剂量组的具体效率数值差别，结果直观，灵敏度高。

实施例7

评估CRISPR/Cas9技术切除外显子13的效率。

本实施例在EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right稳定表达细胞中检验CRISPR/Cas9技术通过双gRNA分别靶向外显子13的两侧内含子，即内含子12和内含子13，从而切除外显子13的效率。本实施例选用的分别靶向内含子12、内含子13的gRNA靶向序列分别为GAAATTAAATGATATGCCTTAG(SEQ ID NO:7)和GCATGGCCCAATTATCCTAGG(SEQ ID NO:8)，将合成的gRNA连接入PX601载体，分别获得2个AAV-SaCas9-sagRNA质粒。

首先，将培养在T25的EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right稳定表达细胞(流式细胞仪器分选的EGFP阴性细胞亚群)按常规方法进行胰酶消化以及终止，300g室温离心5分钟去除上清，使用5ml培养基重悬细胞沉淀，取20μl进行细胞计数。进行转染实验，Lipofectamine2000试剂用量为每孔1.5μl，细胞量为3×10⁵/孔，实验组1加入2个AAV-SaCas9-sagRNA质粒500ng(不同gRNA对应的质粒比为1：1)；实验组2加入实施例6所述反义寡核苷酸AON，剂量为10pMOL；以加入pAAV-EGFP质粒500ng作为阳性对照；以不加任何制剂处理的EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right稳定表达细胞为空白对照。将转染后的转染混合物与细胞混匀，置于37℃培养箱中继续培养。将转染后72小时，通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况(GFP曝光800ms)，结果如图15所示。

结果显示，在MINI-REP稳转细胞体系中，双靶点SaCas9可成功切除USH2A外显子13，但其效果低于AON。本发明体系不仅能够同时检验不同技术诱导USH2A外显子13剔除的效果，而且可以简单、方便、快捷、精准地比对不同技术之间的效果差异。

实施例8

基于MINI-REP细胞体系，研发、评估和筛选可剔除外显子13的新技术。

利用本发明MINI-REP基因体系，发现dCas13也可以导致USH2A外显子13的剪接跳跃，而且通过本发明MINI-REP基因体系可以快速筛选到dCas13诱导剪接跳跃的高效靶位点。Cas13具有独特的核酸酶活性，可特异性地靶向切割RNA。通过活性位点突变可产生无核酸酶活性但可与靶RNA特异性结合的dCas13(dead Cas13)。现有技术通过dCas13组合碱基编辑蛋白如腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶的催化结构域，修正pre-mRNA中的致病性突变；或通过与RNA的结合可能在空间上抑制剪接体与转录本的相互作用。但尚未报道dCas13靶向USH2A外显子13是否可以诱导外显子13的剪接跳跃。

本实施例所用的dCas13为CRISPR/dCasRx，CRISPR/dCasRx载体是在PX601的基础上改造的。CRISPR/dCasRx载体主要元件为：AAV-2ITR序列、U6启动子、PregRNA、启动子(PolII)、dCasRx、PolyA信号和AAV-2ITR序列。其中PregRNA结构为RfxCas13dDR36-gRNA-RfxCas13d DR36，dCasRx包括上下游的NLS信号，以及下游的HA标签。进行细胞水平实验时，本实施例启动子(Pol II)选用了CMV启动子和增强子组合，gRNA序列如下表所示。

表3 dCas13-gRNA列表、靶向区域

根据表中的gRNA序列对应的转录前DNA序列，分别合成对应的Oligo DNA正义链和反义链，正义链为靶序列的反向互补序列，并且5’加AAAC，反义链为靶序列5’加CTTG。将Oligo DNA正义链和反义链混合、退火反应形成带粘性末端的双链DNA。与BpiI酶切、回收的线性化dCasRx连接。进一步通过转化大肠杆菌感受态细胞、挑单克隆、PCR和测序验证，获得不同gRNA对应的CRISPR/dCasRx质粒载体，即pAAV-dCasRx-gRNA。

人源宿主细胞按一定量接种至24孔板，使得24小时后细胞汇合度达到约80％。本实施例选用的人源宿主细胞为293T细胞(人肾上皮细胞系)。选用Lipofectamine2000将pCMV-EGFP_left-Exon13^c.2802T>G-EGFP_right和pAAV-dCasRx-gRNA质粒共转染293T细胞(载体质量比例为100ng：400ng)，使用单独转染报告质粒的293T细胞作为阴性对照，不转染任何质粒的293T细胞作为空白对照。转染后的细胞继续培养48小时，使用胰酶消化成单细胞，随后使用流式细胞仪检测不同gRNA组的GFP阳性率，每个实验组设GFP阳性率如下表和图16所示。

表4 dCas13-gRNA列表、靶向区域和诱导EGFR阳性率

结果显示，本实施例所用的MINI-REP基因体系，不仅可广泛用于现有技术已报道的、可诱导USH2A外显子13剔除(剪接跳跃/切除)技术的效果检验，如AON或Cas9，而且可用于尚未报道的新技术评估；再者，在不同gRNA引导的dCasRx诱导USH2A外显子13剪接跳跃效果相近的情况下，也能简单、快速、灵敏地筛选出最优的位点。由此进一步说明本发明体系操作简单、高效快速、灵敏度高、技术适用范围广的特点。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州瑞风生物科技有限公司

<120> 评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因及其表达载体和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accactacct gagcacccag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctggcaagt gtagcggtca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accactacct gagcacccag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccagcacc acgagttctg 20

<210> 5

<211> 336

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgag 336

<210> 6

<211> 384

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 60

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 120

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 180

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 240

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 300

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 360

ggcatggacg agctgtacaa gtaa 384

<210> 7

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaattaaat gatatgcctt ag 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcatggccca attatcctag g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gauagacgag acacaaacaa ug 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

uaagcccuaa agauaaaaua ua 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcacacacag gcacuggcca cu 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagaugcacu gcccugucuu ag 22

<210> 13

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

guaauacauu ucuuucuuac cuggu 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

uuacacuggc agggcucaca uccaa 25

<210> 15

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cugauuacac cuucuuccuu gacg 24

Claims

1.一种评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因，其特征在于，包括报告基因和小基因，所述报告基因为行使报告功能的基因，所述小基因包括依次连接的USH2A内含子12、外显子13和内含子13的基因；所述小基因插入所述报告基因，将所述报告基因分割成断裂报告基因，所述断裂报告基因单独表达均不发挥报告功能，串联完整表达则发挥报告功能。

2.根据权利要求1所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述内含子12的基因由内含子12的5’端长度为50-200bp的基因片段和3’端长度为200bp-1700bp的基因片段按照5’-3’顺序串联得到，所述内含子13的基因由内含子13的5’端长度为200bp-1700bp的基因片段和3’端长度为50-200bp的基因片段按照5’-3’顺序串联得到。

3.根据权利要求2所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述内含子12的基因5’段片段长度为192-204bp，3’端片段长度为490-1611bp，所述内含子13的基因5’段片段长度为706-1599bp，3’端片段长度为216bp。

4.根据权利要求3所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述内含子12的基因包括以下区域及相似性≥90％的序列：内含子12的剪接沉默子ISS、外显子13的剪接的分支位点BP、外显子13的剪接受体SA、外显子13的剪接供体SD或外显子13的剪接增强子ESE；

5.根据权利要求1所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述报告基因选自：荧光蛋白基因或酶标记基因。

6.根据权利要求5所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述报告基因为绿色荧光基因EGFP。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的MINI-REP基因，其特征在于，将所述小基因插入所述报告基因内连续2个G碱基之间。

8.根据权利要求7所述的MINI-REP基因，其特征在于，将所述小基因插入绿色荧光基因EGFP序列AGGT的2个G碱基之间。

9.根据权利要求1所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述外显子13的基因包括以下致病突变中的至少一种：c.2802T>G(p.Cys934Trp)、c.2299delG(p.E767SfsX21)、c.2276G>T(p.C759F)、c.2522C>A(p.S841Y)、c.2242C>T(p.Gln748X)、c.2541C>A(C847X)、c.2761delC(Leu921fs)和c.2776C>T(p.R926C)、c.2209C>T、c.2310delA、c.2391_2392deITG、c.2431A>T、c.2431_2432delAA、c.2440C>T、c.2525dup、c.2610C>A、c.2755C>T、c.2176T>C、c.2236C>G、c.2296T>C和c.2332G>T。

10.根据权利要求9所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述外显子13的致病突变包括c.2802T>G或c.2299delG。

11.根据权利要求10所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述外显子13的致病突变为c.2802T>G。

12.一种表达权利要求1-11任一项所述MINI-REP基因的表达载体。

13.一种包括权利要求12所述表达载体的报告基因评估细胞，其特征在于，该评估细胞由所述表达载体瞬时转染和/或稳定转染宿主细胞构建得到。

14.根据权利要求13所述的报告基因评估细胞，其特征在于，所述瞬时转染为将所述表达载体直接转染所述宿主细胞；所述稳定转染为将所述MINI-REP基因整合入转座子载体或慢病毒载体后，稳定整合入宿主细胞基因组。

15.根据权利要求13所述的报告基因评估细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自细胞系、原代细胞及其分化或转分化的细胞中的至少1种。

16.根据权利要求15所述的报告基因评估细胞，其特征在于，所述细胞系为人体细胞系，所述原代细胞为人源原代细胞。

17.根据权利要求16所述的报告基因评估细胞，其特征在于，所述宿主细胞为293T、N2A、WERI、人视网膜细胞或人内耳细胞。

18.一种包括权利要求13-17中任一项所述的报告基因评估细胞的动物模型。

19.权利要求1-11任一项所述MINI-REP基因、权利要求12所述表达载体、权利要求13-17任一项所述报告基因评估细胞或权利要求18所述动物模型在评估USH2A外显子13剔除效率中的应用。