CN115840045A - 一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用，使用BMP7和TGFβ2作为猪胚胎期毛囊基板前体细胞的标记基因，所述鉴定方法为：将猪胚胎表皮细胞经免疫荧光染色，能够同时检测到BMP7和TGFβ2的细胞是毛囊基板前体细胞。所述猪胚胎为猪胚胎期37天及之前的胚胎。本发明提供了鉴定猪胚胎期毛囊基板前体细胞的关键基因标志基因BMP7和TGFβ2，可利用细胞免疫荧光检测技术，对猪胚胎早期皮肤细胞进行关键标志基因的表达检测，准确高效地筛选出毛囊基板前体细胞，为毛囊发育和再生研究提供一种具有研究价值的猪毛囊相关细胞系。

Description

一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用。

背景技术

人类对遗传性脱发和少发问题十分关注，毛囊（hair follicle，HF）形态结构和功能的稳定是毛发周期正常的关键。毛囊由多种类型的细胞构成，包括角质形成细胞、毛囊干细胞、生黑色素细胞、基底细胞、成纤维细胞和间充质细胞等，其结构复杂，遗传机制尚未完全解析。哺乳动物毛囊发育过程可分为出生前（胚胎期）毛囊形态学发育过程和出生后的周期性发育。胚胎期毛囊的发育是由上皮和间质细胞之间相互作用而产生的，解析胚胎期毛囊形态学发育过程是探究毛发发育和毛发相关复杂疾病的关键所在。在哺乳动物胚胎早期，来自真皮层的信号被认为是诱导表皮角质形成细胞呈直立状态激增的初始信号，在形态学上使得局部上皮细胞呈现聚集，增殖，向真皮内生长，称为毛囊基板（Placode，PC）。毛囊基板的形成是毛囊开始发育的重要形态学标志，决定了毛囊是否能正常形成和发育，同时毛囊基板的数量也决定了出生后的毛发密度。然而，对于毛囊基板形成之前的细胞和分子动力学仍然没有明确的定义。毛囊基板祖细胞的起源以及导致毛囊基板细胞的迁移和增殖的信号尚不清楚，需要更深入的研究。

由于人类毛囊样本，特别是胚胎期毛囊样本的紧缺性和伦理性，制约了对胚胎期毛囊基板形态学和发育机制的深入研究。猪作为人类毛囊发育的可用模型也受到越来越多的关注。猪与人类遗传同源性非常高，其基因组与人类基因组相似、复杂程度和染色体组成也较为一致，人和猪的皮肤在解剖和生理上也具有很高的相似性，我们先前的研究探索了猪的毛囊形态发生发展，相对于小鼠而言，猪在毛囊类型和毛囊形态发生模式上与人具有更高的相似性。然而猪毛囊基板形成过程中关键细胞亚型之间的信号相互作用仍然是未知的，目前尚无猪胚胎期毛囊基板前体细胞标记基因的报道。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提出一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法，目的在于提供一种可靠的猪毛囊基板前体细胞的标记基因，可应用于毛囊发育相关研究。

本发明提供的猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法，使用BMP7和TGFβ2作为猪胚胎期毛囊基板前体细胞的标记基因，所述BMP7在NCBI数据库中的基因编号为492315，所述TGFβ2在NCBI数据库中的基因编号为397084，所述鉴定方法为：将猪胚胎表皮细胞经免疫荧光染色，能够同时检测到BMP7和TGFβ2的细胞是毛囊基板前体细胞。

所述BMP7 (Gene ID: 492315)和TGFβ2 (Gene ID: 397084)的基因序列可见Sscrofa11.1参考基因组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/fasta/sus_scrofa/)。

进一步，所述猪胚胎为毛囊发育重要时期的猪早期胚胎，主要是指猪胚胎期37天及之前的胚胎。

本发明的猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法应用在毛囊发育研究中。

有益效果

1、本发明利用生信分析和分子实验验证，对猪胚胎早期皮肤毛囊发育细胞进行分析以明确猪胚胎毛囊发育的祖细胞起源，筛选出其关键标志物并进行表达检测，准确高效地筛选出毛囊基板前体细胞的重要标记基因BMP7和TGFβ2，为毛囊发育和再生研究提供一种具有研究价值的猪毛囊基板前体细胞关键标记物的筛选方法。

2、本发明提供了鉴定猪胚胎期毛囊基板前体细胞的关键基因标志基因BMP7和TGFβ2，可利用细胞免疫荧光检测技术，对猪胚胎早期皮肤细胞进行关键标志基因的表达检测，准确高效地筛选出毛囊基板前体细胞，为毛囊发育和再生研究提供一种具有研究价值的猪毛囊相关细胞系。

3、在本发明的前期试验中，我们利用单细胞转录组数据和空间转录数据来评估正常猪和无毛猪在不同时期（未开始、诱导期、器官形成期、细胞分化期）毛囊形态发生，鉴定了多种不同的毛囊相关细胞亚型，解析了毛囊形态发生过程中基因表达的时空图谱；阐述了毛囊基板形成的祖细胞起源、细胞信号转导和转录调控网络。基于上述分析，结合细胞实验，提出以BMP7和TGFβ2为标记基因鉴定猪胚胎期毛囊基板前体细胞的最佳时机为猪胚胎期37天及之前。

附图说明

图1为猪胚胎样本表型鉴定及单细胞样品制备示意图；

图2为猪胚胎表皮的细胞聚类示意图；

图3为表皮发育轨迹的细胞比例分析；

图4为细胞轨迹中各个state的细胞类型构成；

图5为实施例2中所述过渡态细胞；

图6为毛囊基板前体细胞分化轨迹；

图7为毛囊基板前体细胞分化的基因动态表达；

图8为毛囊基板前体细胞分化轨迹的关键基因表达；

图9为毛囊基板前体细胞标记基因在E37的表达检测；

图10为实施例3所述TC2关键基因在E41的表达检测。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1、猪胚胎毛囊基板前体细胞的分离时机筛选

利用课题组前期构建的无毛猪资源群体，使用有毛公猪与无毛母猪配种（配种4组），保证遗传背景相同且同组后代会发生性状分离。

根据研究发现，猪胚胎在胚胎期37天（E37）时毛囊发育处于未开始阶段，胚胎期41天（E41）毛囊发育进入诱导期，胚胎期52天（E52）时进入器官发生期，胚胎期85天（E85）时进入细胞分化期。因此在这四个时间点，分别对一头怀孕的母猪药物流产，采集同窝猪胚胎皮肤，通过苏木精-伊红(HE)染色进行表型鉴定，将无毛胎儿与正常胎儿进行分类。毛囊数小于1个/cm2的胚胎为无毛胚胎（Hairless, H），毛囊数大于4个/cm2的胚胎为正常胚胎（Normal, N），而E37毛囊发育未开始，不具毛囊特征性结构，为不确定胚胎（U）。

表型鉴定后，E37采集一个胚胎的皮肤样本，E41、E52和E85各采集无毛和有毛猪胚胎样本一个，4个时间点共取得7个胚胎的皮肤样本用于单细胞转录组测序和空间转录组测序（图1）。

从图1可看出，猪胚胎41天时即可通过表型鉴定可以区分有毛（正常猪）样本和无毛猪样本，而猪胚胎37天时还未见毛囊细胞发育，无法区分，说明要分离猪胚胎毛囊基板前体细胞的最佳时期在猪胚胎37天及之前。

实施例2、单细胞转录组测序及毛囊基板前体细胞候选基因筛选。

对实施例1的4个时间点取得的7个胚胎皮肤样本制成单细胞悬液进行单细胞转录组测序，对上述样本的测序结果进行分析，总计得到大概18000个基因。首先基于top2000高变异度的基因，对有毛、无毛胚胎样本的细胞进行聚类，并根据细胞中经典细胞类型标记的表达进行细胞类型注释，由于毛囊形态发生于表皮结构中，所以提取出注释得到的表皮类型细胞进行亚聚类，进而划分为9个细胞亚群（见图2）。图2中， 0-8表示9个细胞亚群，其中0为滤泡间基底细胞、1为表皮细胞、2为有丝分裂活跃细胞、3为毛囊隆起部细胞、4为BMP7⁺/TGFβ2⁺细胞、5为角质分化细胞、6为祖细胞（基质/毛囊干细胞）、7为滤泡间颗粒细胞、8为角质形成细胞（皮脂腺）。

通过Seurat软件进行亚群差异表达分析，“FindAllMarkers”功能寻找亚群特异表达的基因（AdjP-value < 0.05,检测方法：Wilcoxon Rank Sum test），进而完成细胞类型注释，即首先计算得到显著的亚群特异表达基因，在这个范围里筛选，同时考虑哪些基因参与皮肤和毛囊发育过程。从图2中可见，细胞亚群1未鉴定到毛囊相关标记，标记为表皮细胞；细胞亚群4特异性高表达BMP7和TGFβ2，标记为BMP7⁺/TGFβ2⁺细胞或B/T细胞。

通过拟时序分析构建出表皮的发育轨迹，分为五种发育状态（状态1-5）。细胞比例分析统计出每个状态上的样本构成，其中胚胎期37天细胞（E37U）主要位于状态1，85天细胞（E85N和E85H）主要位于状态5，而41天和52天细胞（E41N、E41H，E52N和E52H）相对位于轨迹的中间（图3）。结果表明，这些细胞的分化方向是从状态1到状态5，可归类于毛囊发育和表皮发育两个细胞谱系，毛囊发育包括状态2和状态4，表皮发育为状态5。同时可见，毛囊基板（PC）和表皮的发育都源于状态1。

通过Seurat软件进行亚群差异表达分析，“FindAllMarkers”功能寻找亚群特异表达的基因，进而完成细胞类型注释，即首先计算得到显著的亚群特异表达基因，在这个范围里选，同时考虑哪些基因参与毛囊和皮肤发育过程。最后确定细胞亚群4为特异性高表达BMP7和TGFβ2的细胞（BMP7⁺/TGFβ2⁺细胞或B/T细胞）（AdjP-value < 0.05,检测方法：Wilcoxon Rank Sum test）。

通过拟时序分析构建出表皮的发育轨迹，分为五种发育状态（状态1-5）。细胞比例分析统计出每个状态上的样本构成，其中E37细胞主要位于状态1，E85主要位于状态5，而E41和E52相对位于轨迹的中间（图3）。结果表明，这些细胞的分化方向是从状态1到状态5，可归类于毛囊发育和表皮发育两个细胞谱系，毛囊发育包括状态2和状态4，表皮发育为状态5。同时可见，毛囊基板（PC）和表皮的发育都源于状态1。

通过分析各状态的细胞比例，发现在状态1中占比最高的细胞类型是B/T细胞，由于E37细胞主要位于状态1，其他状态中分布的少量B/T细胞不作为毛囊基板前体细胞，因为有可能是聚类的误差（图4）。对状态1细胞进一步细分，发现B/T细胞经过过渡态细胞1（TC1）向TC2或TC3分化（图5），构建拟时间轨迹进一步分析两个不同的细胞命运分化途径（图6）。接着对这一分化过程的基因动态表达分析发现，TC1→TC2主要表达毛囊基板发育相关基因，TC1→TC3主要表达表皮发育相关基因（图7），即毛囊基板形成的分子调控机制发生在E37-E41之间，沿B/T→TC1→TC2的命运分化；而另一细胞分化轨迹B/T→TC1→TC3则是表皮细胞的分化命运（图7）。此外，B/T细胞高表达基因主要涉及TGFβ和BMP信号通路，干细胞增殖/分化和细胞迁移等，BMP和TGFβ信号通路被发现是触发B/T细胞形成PC的第一个信号通路；B/T→TC1→TC2过程，基因主要参与细胞迁移、毛发周期和毛囊发育；B/T→TC1→TC3过程，基因功能富集于表皮发育（图7）。通过对B/T细胞、TC1、TC2和TC3中基于高表达基因的生物学过程和配体/受体分析发现，B/T细胞主要参与间充质细胞发育、干细胞分化、BMP和TGFβ信号通路的调控，TC2高表达基因主要参与经典毛囊发育信号通路，如WNT和NFkB/EDA通路，再次验证了BMP7和TGFβ2标记的细胞（B/T细胞）是毛囊基板前体细胞（图8）。

说明在E37-E41之间，B/T细胞的分化决定了今后的细胞命运，有的B/T细胞分化发育为毛囊、有的B/T细胞分化发育为表皮细胞，进一步验证了要分离猪胚胎毛囊基板前体细胞要在猪胚胎37天之前。同时这里也印证了BMP7和TGFβ2两个基因是来自触发分化关键通路的代表性基因。

实施例3、候选基因功能验证

通过上述实施例，筛选到毛囊基板前体细胞的重要标记基因BMP7和TGFβ2，进一步，我们进行了形态学上的分析，结合空间转录组技术和免疫荧光技术对目的基因的表达进行验证。

空间转录组分析方法：

S1、对实施例1所获得的E37和E41胚胎进行Visium空间转录：用无菌技术分离皮肤样本，放入冷藏无菌的Hank‘s平衡盐溶液中。然后将新鲜组织立即包埋在OCT块中，放入液氮冷却的异戊烷中冷冻。

S2、文库制备：OCT切片，厚10µm，大小6.5 mm×6.5 mm，每个样本3个切片，每个捕获区1个阶段，放在一张载玻片上，按照10倍基因组学新鲜冷冻组织处理程序进行苏木精-伊红(H&E)染色。用Zeiss Palm微束激光帽对HE染色的皮肤组织切片进行成像，然后，根据10倍基因组学演示的方案，对载玻片进行组织移除和文库生成。10µm厚猪皮切片的最佳透膜时间为12min。

S3、原始测序数据处理：使用10x Genome的Space Ranger软件(1.2.2版)处理每个测序的空间转录文库，并将其与Sscrofa11.1参考基因组进行比对，并汇总每个spot的UMI计数，生成UMI计数矩阵。

S4、Spot的识别和注释：经过上述质量控制后，使用Seurat对空间转录组数据进行处理和后续分析。通过“VST”选择法筛选出2000个高变基因。然后进行主成分分析，并将数据的维度减少到前20个主成分。利用SNN算法对Spot进行聚类，并在UMAP空间上进行可视化。得到的spot聚类代表组织中的解剖区域。ST捕获的spot被分为覆盖相应组织区域的不同细胞类型，其中表皮和真皮细胞类型的空间布局与已知的解剖位置一致，从而描绘出E37（图9A）和E41（E41N/E41H）（图10A、图10B）表皮和真皮细胞亚型的空间图谱。

S5、使用cell2Location方法进行去卷积，确定了ST样本中不同细胞状态的丰度，从而确定B/T细胞分化过程的空间定位。在E37 ST样本中首次检测到B/T细胞(图9B)。TC1在E41的正常胚胎（E41N）和无毛胚胎（E41H）样本中没有显著差异（图10B）。然而，在正常猪样本E41N的表皮中检测到PC(TC2)细胞，而在无毛猪样本E41H的表皮中PC(TC2)细胞显著减少(图10B)。这表明，在正常猪中，B/T细胞分化为毛囊基板PC(TC2)细胞，足够数量PC细胞在表皮部的聚集是毛囊基板形成的基础，毛囊基板则是毛囊形态发生过程可观测到的初始结构特征，标志着毛囊开始形成。而无毛猪B/T细胞只产生很少或根本不产生TC2细胞，说明无毛猪样本中，毛囊基板前体细胞发育为正常毛囊的过程受阻。

S6、重要基因的组织免疫荧光检测

（1）对实施例1所获得的E37和E41胚胎进行石蜡切片，将切片在恒温箱中60°C到60°C放置1h；

（2）依次放入浓度均为100%的二甲苯中（Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ）,每次10分钟，一共30分钟；

（3）依次放入浓度均为100%，95%，80%的乙醇中（Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ），10min/次,共30min；

（4）流水冲洗5min；

（5）PBS洗1次（10-15min）；

（6）抗原修复液倒满切片盒，盖上盖子，放于微波炉中高火5min，然后转低火20min；

（7）取出装有切片的盒子静置使其自然冷却约一小时；

（8）pbs洗三次，5min/次；

（9）在孵育盒里放一些pbs，将玻片擦干（注意千万不要擦到组织）平放于湿盒中，滴加5%的羊血清（具体用量根据片子的数量配置），用移液枪吸取滴在组织上，每个组织约需要液体30μL，注意羊血清要完整覆盖组织，整个过程要保持组织是湿润状态。然后将片子放在保湿盒中，室温放置30min；

（10）一抗：取两张E37U样本，甩干玻片上的羊血清，用干净的纸擦干组织周围残留液体，分别进行BMP7+KRT14（表皮标记物）双标以及TGFβ2+KRT14双标（BMP7抗体购自abmart公司，PA1101，Rabbit polyclonal antibody to BMP7，稀释比例1：200；TGFβ2抗体：Rabbitpolyclonal antibody to TGFβ2，PA2154S，1：200稀释；KRT14抗体：购自santa公司，sc-53253，1：200稀释）用pbs对一抗进行稀释，稀释后的一抗滴加并完整覆盖组织，将滴加完一抗的片子放在保湿盒中，4°C放置过夜。同样的方法选择E41N和E41H的样本，分别进行TC2重要基因（wnt5a，wnt10b）的表达验证（wnt5a购自abmart公司，货号T56869；wnt10b购自abmart公司。货号TD9038）；

（11）二抗：将Alexa Fluor 488（绿色荧光）标记山羊抗小鼠IgG(H+L)和AlexaFluor 647（红色荧光）标记山羊抗兔IgG(H+L)按照1：500混合稀释后滴在组织上，片子放在湿盒中，室温放置30min，敷二抗开始以后的操作都在避光环境下进行；

（12）PBS洗3次，5min/次；

（13）擦干组织周围的液体，滴加即用型DAPI，孵育2min；

（14）PBS洗3次，5min/次；

（15）封片：擦干组织周围液体，在组织上滴一滴抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片。由于盖玻片较容易滑动，可在盖好盖玻片后用指甲油涂抹盖玻片四周进行固定；

（16）拍片：染色完成后立即用共聚焦显微镜进行拍摄并分析，如图9C所示，在E37样本中检测到BMP7⁺/TGFβ2⁺细胞，与单细胞分析结果及空间转录组结果一致。同时，在正常猪样本E41N的表皮中检测到的TC2细胞显著多于无毛猪样本E41H表皮中的TC2细胞（图10C），与空间转录组结果一致。

以上实验进一步证明了在猪胚胎37天之前，即毛囊发育诱导期之前，猪胚胎表皮中特异性表达BMP7和TGFβ2的细胞是毛囊基板前体细胞。随着细胞发育，该前体细胞会朝着两个细胞命运分化，在正常猪中这种前体细胞受到相关因子的调控，主要分化为毛囊基板，即PC(TC2)细胞，因此BMP7/TGFβ2可以作为毛囊基板前体细胞的重要筛选标志。

本发明利用单细胞转录组数据来评估正常猪和无毛猪在不同时期毛囊形态发生。鉴定了多种不同的毛囊相关细胞亚型，解析了毛囊基板形成的祖细胞起源及相关标志物，并结合形态学检测对相关标记物进行验证，找到了猪胚胎期毛囊基板前体细胞的重要标记基因，可以应用于哺乳动物的毛发发育研究。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法，其特征在于，使用BMP7和TGFβ2作为猪胚胎期毛囊基板前体细胞的标记基因，所述BMP7在NCBI数据库中的基因编号为492315，所述TGFβ2在NCBI数据库中的基因编号为397084；所述鉴定方法为：将猪胚胎表皮细胞经免疫荧光染色，能够同时检测到BMP7和TGFβ2的细胞是毛囊基板前体细胞。

2.根据权利要求1所述猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法，其特征在于，所述猪胚胎为猪胚胎期37天及之前的胚胎。

3.权利要求1所述猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法在毛囊发育研究中的应用。

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