CN117949655A - 一种猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用。本发明使用OGN和UCHL1作为猪毛囊基板前体细胞的标志基因，所述OGN在NCBI数据库中的基因编号为106509723，所述UCHL1在NCBI数据库中的基因编号为396637，所述鉴定方法为：将猪胚胎表皮细胞经免疫荧光染色，能够同时检测到OGN和UCHL1的细胞是猪毛囊基板前体细胞，所述猪胚胎是指猪胚胎期37天及之前的胚胎。本发明提供的猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法应用在毛囊发育研究中。本发明公开了OGN和UCHL1比BMP7和TGFβ2更适合作为猪毛囊基板前体细胞的标志基因。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用。
背景技术
毛囊的发育是一个复杂的形态发生过程，分为胚胎期的毛囊形态学发育和出生后时期的周期性发育。胚胎期毛囊的发育涉及上皮和间充质的相互作用，其过程复杂，有大量分子和信号通路参与其中。受真皮层信号的诱导，上皮层开始增厚形成毛囊基板，作为毛囊发育的起始阶段，也是毛囊开始发育的重要形态学标志。毛囊基板几乎可以形成成体毛囊的所有细胞类型，它的形成决定了毛囊能否正常形成和发育，同时毛囊基板的数量也决定了毛发的数量。人们对毛囊基板形成以后事件的研究较多，因其在形态学上易于观察且分子标记稳定。然而，由于缺乏前瞻性的分子标记和难以区分的形态，使得毛囊基板细胞早期形成过程的细胞起源和分子机制难以研究。对其进行深入研究，有助于理解毛囊发育的过程，为人类遗传性毛发疾病的研究提供见解。
在毛囊发育研究领域中，因为世代间隔短，毛发发育具有同步性，易于操作，价格便宜，通常采用小鼠作为模型研究，但其胚胎发育相似度上与人类仍存在一定差异。而人类胚胎获取的难度和产生的伦理问题又制约了胚胎期毛囊发育的进一步研究。猪作为一种与人类同源性非常高的物种，在解剖学与生理学与人类高度相似，在胚胎期的发育过程以及毛发类型和形态与人一致性高，是一种合适的毛囊发育模式动物。但猪中关于毛囊基板形成早期的分子事件以及早期毛囊基板细胞的标志物研究甚少。中国专利202310153985.0公开的一种猪胚胎期毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用是本团队的研究成果，提供了鉴定猪胚胎期毛囊基板前体细胞的关键基因标志基因BMP7和TGFβ2，但在本团队后来的实践中发现，以BMP7和TGFβ2为标志基因对毛囊基板前体细胞进行筛选时，会发生漏筛现象，有一些毛囊基板前体细胞由于没有表达BMP7和TGFβ2，在筛选时被错过了，由于采用的是猪早期胚胎来筛选毛囊基板前体细胞，样本来源比较难得，如果有更高效的毛囊基板前体细胞的标志基因，则会大大提高猪早期胚胎使用效率，获得更多的毛囊基板前体细胞。
发明内容
为解决以上内容，本发明提出一种猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法及其应用，目的在于提供有效稳定的标定猪毛囊基板前体细胞的标志物，用于追踪早期毛囊的发育过程，探究毛囊基板形成的分子机制。
本发明提供的猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法，使用OGN和UCHL1作为猪毛囊基板前体细胞的标志基因，所述OGN在NCBI数据库中的基因编号为106509723，所述UCHL1在NCBI数据库中的基因编号为396637，所述鉴定方法为：将猪胚胎表皮细胞经免疫荧光染色，能够同时检测到OGN和UCHL1的细胞是猪毛囊基板前体细胞，所述猪胚胎是指猪胚胎期37天及之前的胚胎。
所述OGN(Gene ID:106509723)和UCHL1(Gene ID:396637)的基因序列可见Suscrofa11.1参考基因组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/fasta/sus_scrofa/)。
本发明提供的猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法应用在毛囊发育研究中。
本发明的有益效果如下：
1、本发明发现，与BMP7和TGFβ2相比，OGN和UCHL1在猪毛囊基板前体细胞的细胞亚群中表达量更高，且在其他亚群中表达量更低，说明OGN和UCHL1比BMP7和TGFβ2更适合作为猪毛囊基板前体细胞的标志基因。本发明结合生物信息学和分子生物学，对猪胚胎期不同时间点的毛囊发育相关细胞进行分析来探究毛囊基板早期发育的过程，筛选出特异性标志物并对其进行检测，发现OGN和UCHL1是更为合适的标志物，能通过联合表达确定猪毛囊基板前体细胞的存在，有助于后续对毛囊基板发育分子机制的探究。
2、本发明提供了两种合适的标志物OGN和UCHL1，可利用流式细胞分选技术在猪胚胎早期对表达两种标志物的猪毛囊基板前体细胞进行分离和培养，在此基础上建立稳定的猪毛囊基板前体细胞系，为毛囊基板的形成的分子机制研究提供材料。
3、在前期实验中，我们利用单细胞转录组测序和空间转录组测序来探寻猪的毛囊形态发生过程，鉴定了多种毛囊发育相关细胞亚型，解析了毛囊形态发生过程中基因表达的时空图谱；阐述了毛囊基板形成的祖细胞起源、细胞信号转导和转录调控网络。基于上述分析，结合细胞实验，提出以OGN和UCHL1为标记基因鉴定猪毛囊基板前体细胞的最佳时机为胚胎期37天及之前。
附图说明
图1为猪胚胎样本表型鉴定及单细胞样品制备示意图；
图2为猪胚胎表皮的细胞聚类示意图；
图3为实施例2的毛囊基板前体细胞标记基因在E37的表达检测；
图4为实施例2所述TC2关键基因在E41的表达检测。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、单细胞转录组测序及早期毛囊基板细胞候选基因筛选。
本发明采集有毛、无毛猪胚胎样本的细胞进行聚类，并根据细胞中经典细胞类型标记的表达进行细胞类型注释的过程与专利202310153985.0公开的内容一致。
具体为：本发明采用的样本主要来自本课题组前期构建的无毛猪遗传资源群体。正常大白猪的背部是存在一定数量毛发的，本课题组在大白猪自然群体中发现一种天然背部没有毛发或者毛发稀少的种群，通过人为的交配实验发现这种无毛性状符合孟德尔遗传规律，是一种常染色体隐形遗传性状，显性性状为正常毛发，隐形性状为无毛，杂合子表现为正常毛发。在进行毛囊基板前体细胞的研究中，本课题组通过将一份杂合子正常公猪精液与4头纯合子无毛母猪进行配种，然后分别在第37天、41天、52天、85天对其中一头母猪进行药物流产，每头母猪可获得10余个胚胎(同窝胚胎)。本课题组发现，正常大白猪在胚胎期37天时表皮呈均一单层分布，在胚胎期41天表皮向真皮层生长、凹陷，形成毛囊基板的结构，并在未来会发育成毛囊并产生毛发。而无毛猪在胚胎期41天时表皮层不形成或形成极少毛囊基板结构，无毛猪的表皮层从胚胎期41天至成年，一直保持均一的状态，具体表现为不形成毛囊结构且终生没有毛发形成。因此，在胚胎期41天及以后的时期，可通过制备皮肤纵切切片并进行HE染色鉴定这个猪胚胎是正常猪还是无毛猪。划分的标准按照每1cm2的毛囊数进行划分，其中毛囊数小于1个的胚胎为无毛胚胎(Hairless,H)，毛囊数大于4个的胚胎为正常胚胎(Normal,N)。而胚胎期37天时，不管是正常猪还是无毛猪，毛囊发育均未开始，无法确定猪的表型，为不确定胚胎(Unknown，U)。
在此研究基础上，本课题组收集同窝胚胎期37天1个样本、胚胎期41天、52天、85天同窝的有毛猪和无毛猪各1个样本，共计获得7个皮肤样本，并对收集得到的7个胚胎皮肤样本制成单细胞悬液进行单细胞转录组测序和空间转录组测序(见图1)。对上述样本的测序结果进行分析，总计得到约51871个细胞和大约1.8万个基因。首先基于top2000高变异度的基因，对有毛、无毛胚胎样本的细胞进行聚类，并根据细胞中经典细胞类型标记的表达进行细胞类型注释，可分为表皮细胞、真皮细胞、周皮细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、施旺细胞六种类型。由于毛囊基板只来源于表皮细胞，在粗分类注释得到表皮类型细胞后，对表皮细胞进行亚聚类，进而划分为9个细胞亚群。对表皮细胞亚群计算得到的差异显著的基因及功能分析，对亚群进行注释，其中细胞亚群0为滤泡间基底细胞；细胞亚群2为有丝分裂活跃细胞；细胞亚群3为毛囊隆起部细胞；细胞亚群4被认为是毛囊基板前体细胞；细胞亚群5为角质分化细胞；细胞亚群6为祖细胞(基质/毛囊干细胞)；细胞亚群7为滤泡间颗粒细胞；细胞亚群8为角质形成细胞(皮脂腺)；细胞亚群1未鉴定到毛囊相关标记，标记为表皮1(见图2)。
本课题组发现，OGN和UCHL1有可能是比BMP7和TGFβ2更合适的毛囊基板前体细胞的标志基因，因此使用Seurat软件中的“FindMarkers”功能来进行两组差异基因的对比，找寻特异性更强的标记基因。其中pct.1代表该基因在对应细胞亚群所有细胞中表达的比例，pct.2代表该基因在其他亚群所有细胞中表达的比例，pct.1与pct.2的差值越大，越能代表该基因在特定亚群的特异性。相较于专利202310153985.0公开的在先发现的BMP7和TGFβ2基因，本实施例发现，在细胞亚群4中表达OGN和UCHL1的细胞比例(pct.1)显著高于表达BMP7和TGFβ2的细胞比例，除细胞亚群4的其他亚群所有细胞中表达OGN和UCHL1的细胞比例(pct.2)远远低于表达BMP7和TGFβ2的细胞比例，同时OGN和UCHL1在细胞亚群4中pct.1与pct.2的差值显著大于BMP7和TGFβ2(见表1)。本实施例的结果说明，相较于BMP7和TGFβ2，OGN和UCHL1在细胞亚群4中表达量更高，且在其他亚群中表达量更低，说明OGN和UCHL1基因的特异性更强，更能代表细胞亚群4的特征，表明OGN和UCHL1是更为合适的猪毛囊基板前体细胞的标记基因。
表1细胞亚群4的差异基因对比结果
同时，虽然有文献提到OGN和UCHL1均与毛囊的形态发育相关，但本实施例首次发现，OGN和UCHL1是比BMP7和TGFβ2更为合适的猪毛囊基板前体细胞的标记基因。
实施例2、候选基因功能验证
在空间转录组水平和组织蛋白质水平对OGN和UCHL1作为毛囊基板前体细胞的标志基因进行鉴定。
在空间转录组水平上分析中，对样本的制备、原始测序数据处理及分析方法与专利202310153985.0公开的内容一致，不同之处在于映射细胞的标志基因为OGN和UCHL1。具体为：
S1、对实施例1所获得的E37和E41胚胎进行Visium空间转录；
S2、文库制备；
S3、原始测序数据处理，生成UMI计数矩阵；
S4、Spot的识别和注释：经过上述质量控制后，使用Seurat对空间转录组数据进行处理和后续分析。ST捕获的spot被分为覆盖相应组织区域的不同细胞类型，其中空间布局显示表皮为薄薄的一层，真皮处于表皮的下面且相对于表皮较厚，与真实的解剖位置和形态一致，从而描绘出E37(图3A)和E41N(图4A)/E41(图4B)表皮和真皮细胞亚型的空间图谱。
在E37 ST样本中首次检测到O/U细胞(图3B)，且与表皮细胞重叠，定位准确。TC1在E41的正常胚胎(E41N)和无毛胚胎(E41H)样本中没有显著差异(图4C)。然而，在正常猪样本E41N的表皮中检测到PC(TC2)细胞，而在无毛猪样本E41H的表皮中PC(TC2)细胞显著减少(图4C)。这表明，在正常猪中，O/U细胞分化为毛囊基板PC(TC2)细胞，足够数量PC细胞在表皮部的聚集是毛囊基板形成的基础，毛囊基板则是毛囊形态发生过程可观测到的初始结构特征，标志着毛囊开始形成。而无毛猪O/U细胞只产生很少或根本不产生TC2细胞，说明无毛猪样本中，毛囊基板前体细胞发育为正常毛囊的过程受阻。整体结果展示了OGN和UCHL1这两个标志基因在空间上定位的准确性，与单细胞转录组结果一致性高，表明OGN和UCHL1是合适的标志物，能很好地反应毛囊基板前体细胞的特征。
在组织蛋白水平的验证上，除一抗的选择上，其余步骤与专利202310153985.0公开的内容一致。具体为：
(1)对实施例1所获得的E37和E41胚胎进行石蜡切片，将切片在恒温箱中60℃到60℃放置1h；
(2)依次放入浓度均为100％的二甲苯中(Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ),每次10分钟，一共30分钟；
(3)依次放入浓度均为100％，95％，80％的乙醇中(Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ)，10min/次,共30min；
(4)流水冲洗5min；
(5)PBS洗1次(10-15min)；
(6)抗原修复液倒满切片盒，盖上盖子，放于微波炉中高火5min，然后转低火20min；
(7)取出装有切片的盒子静置使其自然冷却约一小时；
(8)pbs洗三次，5min/次；
(9)在孵育盒里放一些pbs，将玻片擦干(注意千万不要擦到组织)平放于湿盒中，滴加5％的羊血清(具体用量根据片子的数量配置)，用移液枪吸取滴在组织上，每个组织约需要液体30μL，注意羊血清要完整覆盖组织，整个过程要保持组织是湿润状态。然后将片子放在保湿盒中，室温放置30min；
(10)一抗：取两张E37U样本，甩干玻片上的羊血清，用干净的纸擦干组织周围残留液体，分别进行OGN+KRT14(表皮标记物)双标以及UCHL1+KRT14双标(OGN抗体购自Proteintech公司，12755-1-AP，Rabbitpolyclonal antibody to OGN，稀释比例1：100；UCHL1抗体购自Boster公司，BM4990，Rabbitpolyclonal antibody to UCHL1，1：100稀释；KRT14抗体：购自Santa公司，sc-53253，1：200稀释)，用pbs对一抗进行稀释，稀释后的一抗滴加并完整覆盖组织，将滴加完一抗的片子放在保湿盒中，4℃放置过夜。同样的方法选择E41N和E41H的样本，分别进行TC2重要基因(wnt5a，wnt10b)的表达验证(wnt5a购自abmart公司，货号T56869；wnt10b购自abmart公司。货号TD9038)；
(11)二抗：将Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记山羊抗小鼠IgG(H+L)和AlexaFluor 647(红色荧光)标记山羊抗兔IgG(H+L)按照1：500混合稀释后滴在组织上，片子放在湿盒中，室温放置30min，敷二抗开始以后的操作都在避光环境下进行；
(12)PBS洗3次，5min/次；
(13)擦干组织周围的液体，滴加即用型DAPI，孵育2min；
(14)PBS洗3次，5min/次；
(15)封片：擦干组织周围液体，在组织上滴一滴抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片。由于盖玻片较容易滑动，可在盖好盖玻片后用指甲油涂抹盖玻片四周进行固定；
(16)拍片：染色完成后立即用共聚焦显微镜进行拍摄并分析。如图3C所示，在E37样本中检测到OGN+/UCHL1+细胞，表明实施例1通过数据分析得到细胞亚群4的标志物OGN和UCHL1确实在毛囊基板形成的早期前体细胞中有所表达，与单细胞分析结果及空间转录组结果一致。两者共同验证了本发明找到的毛囊基板前体细胞标志物OGN和UCHL1的准确性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (2)
1.一种猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法，其特征在于，使用OGN和UCHL1作为猪毛囊基板前体细胞的标志基因，所述OGN在NCBI数据库中的基因编号为106509723，所述UCHL1在NCBI数据库中的基因编号为396637；所述鉴定方法为：将猪胚胎表皮细胞经免疫荧光染色，能够同时检测到OGN和UCHL1的细胞是猪毛囊基板前体细胞，所述猪胚胎为猪胚胎期37天及之前的胚胎。
2.权利要求1所述猪毛囊基板前体细胞的鉴定方法在毛囊发育研究中的应用。
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|---|---|---|---|
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