CN115838824A - 一种与猕猴桃童期qtl连锁的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记及应用，涉及分子生物学及遗传育种技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；在所述分子标记的117bp存在一个SNP位点，为A或C。本发明在猕猴桃中定位了与猕猴桃童期连锁的QTL，提供了一种与猕猴桃童期QTL紧密连锁的分子标记。在常规育种方法中，猕猴桃树体生长性状在苗期很难判断，并且准确度和育种效率较低，通过检测上述与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记，即可预测猕猴桃植株的童期性状，进而进行早期筛选，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。

Description

一种与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，特别是涉及一种与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记及应用。

背景技术

分子标记技术以个体间核苷酸序列变异为基础，是生物个体遗传变异的直接反映，可以检测出生物个体之间在核苷酸序列水平上的差异，与传统的形态学标记、细胞学标记相比，它存在诸多优点：不受气候、环境等因素影响，在植物的各个组织、器官以及各发育阶段都能进行检测，多态性高。目前，该技术被广泛应用于遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱构建、系统进化研究及分子标记辅助育种等方面。

猕猴桃具有较丰富的维生素C、蛋白质、糖等营养物质和钙、磷、铁等矿物质，深受消费者的喜爱。品种是产业发展的“芯片”，传统育种依靠表型选择的育种方法耗时费力并且难度大，培育一个新品种需花费10-15年时间。猕猴桃实生育种过程中，童期一般较长，遗传是决定童期长短的因素之一。猕猴桃幼苗往往定植数年后开花，这大大增加了育种工作的时间，降低了育种效率。果树童期较长是提高育种效率的瓶颈,因此,对于猕猴桃童期长短的选择在其育种和生产实践中具有重要意义。提前选择童期相对较短的植株不仅可以合理利用土地资源，避免造成浪费，还可以大大缩短开花结果的年限，缩短育种时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的分子标记与猕猴桃童期QTL紧密连锁，可用于预测猕猴桃植株的童期性状。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子标记的117bp存在一个SNP位点，为A或C。

进一步地，所述SNP位点的基因型为AA或AC。

进一步地，所述SNP位点的基因型为AA时，猕猴桃植株的童期大于AC。

本发明还提供一种利用上述的分子标记预测猕猴桃植株童期的方法，包括以下步骤：

(1)获取待预测猕猴桃植株的基因组DNA；

(2)利用如SEQ ID NO.2-3所示的引物对，对所述基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物，之后测序获得所述扩增产物117bp的基因型，当基因型为AA时，猕猴桃植株的童期大于AC。

进一步地，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应体系包括：2×Hieff

PlusPCRMaster Mix(With Dye)25μL，正向和反向引物各2μL，基因组DNA模板3μL，ddH₂O补足至50μL。/>

进一步地，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃10sec，58℃20sec，72℃30sec；72℃5min。

本发明还提供一种预测猕猴桃植株童期的试剂盒，包含如SEQ ID NO.2-3所示的引物对。

本发明还提供上述的分子标记或试剂盒在猕猴桃育种中的应用。

进一步地，所述应用为预测猕猴桃植株的童期。

本发明公开了以下技术效果：

本发明在猕猴桃中定位了与猕猴桃童期连锁的QTL。在常规育种方法中，猕猴桃树体生长性状在苗期很难判断，并且准确度和育种效率较低，而通过检测与性状连锁的分子标记，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中猕猴桃童期的QTL位点位置明确，分子标记位点的检测方法方便快捷，不受气候、环境等影响。通过检测与性状连锁的分子标记，即可预测猕猴桃植株的童期性状，进而进行早期筛选。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为图1中华猕猴桃杂交群体遗传图谱；

图2为173个单株的童期检测结果；**表示P<0.01。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

一、方法

1.以中华猕猴桃“红阳”为母本，“博山碧玉”配套雄株为父本杂交得到F1代，从中选取173个单株作为研究对象。

2.取杂交群体173个单株及杂交亲本的新鲜嫩叶，经液氮速冻后采用SDS方法进行基因组DNA提取，并检测DNA质量。

3.质检合格的基因组DNA用酶随机打断，然后进行末端修复，加A-尾，并添加Illumina测序接头，对DNA片段进行PCR扩增富集及产物纯化，构建二倍体中华猕猴桃“红阳”、“博山碧玉”配套雄株及173个子代单株的测序文库，对测序文库进行检测，并使用实时PCR进行文库定量，最后在Novaseq 6000测序仪上采用PE 150测序策略进行测序。

4.用FASTP(版本0.18.0)对Illumina平台的原始数据进行过滤，过滤标准如下：(1)去除含有未知核苷酸(N)≥10％的reads；(2)去除phred质量评分≤20的碱基≥50％的reads；(3)删除含测序接头的reads。使用比对软件BWA(版本0.7.12)采用mem算法将过滤后的reads比对到参考基因组上，比对参数为-k32-M；比对完之后结果使用软件picard(版本1.129)进行标记，并使用变异检测软件GATK进行群体SNP检测，SNP检测结果在基因组上的分布情况见表1。

表1SNP检测结果在基因组上的分布情况

5.根据以上分析得到的SNP信息，使用treebest软件，邻接法(neighbor-joiningmethods)构建进化树，使用plink和GCAT64软件进行主成分分析，使用admixture软件分析群体结构，完成对构图群体的群体分析。

6.经过初步的质量过滤以及变异检测，得到包含变异信息的VCF文件，进一步对其进行过滤，标准如下：(1)利用bcftools软件过滤SNP标记；(2)利用Plink软件去除基因型缺失率大于0.02的标记，去除样本缺失率大于0.03的样本，去除次等位基因频率小于0.05的标记；(3)利用R程序保留亲本基因型为“0/0×0/1”、“0/1×0/0”、“0/1×0/1”、“0/1×1/1”、“1/1×0/1”的标记，去除子代中不产生分离的标记，(4)进行卡方检验，去除严重偏分离的标记。SNP过滤结果汇总见表2。

表2SNP过滤结果汇总

7.使用Lep-MAP3软件进行遗传图谱构建，中华猕猴桃杂交群体遗传图谱见图1。每个连锁群重复5次，选择似然值最高的一次作为最终结果。获得各标记间的遗传位置和标记到各个遗传位置的LOD值矩阵，构建出二倍体中华猕猴桃杂交群体的高密度遗传连锁图谱。

8.对173个杂交子代单株进行测量评估，计算树苗定植后到开花的年限。

9.QTL定位使用R/qtl进行，使用复合区间作图法cim()函数，扫描步长为1cM，设置LOD阈值为3，最终检测到与童期相关的QTL位点。

10.分子标记检测步骤：

(1)取杂交群体173份子代单株及杂交亲本的新鲜嫩叶，经液氮速冻后采用SDS方法进行基因组DNA提取。

(2)按照2×Hieff

Plus PCR Master Mix(With Dye)试剂盒说明，设计50μL反应体系：2×Hieff/>

Plus PCR Master Mix(With Dye)25μL，正向和反向引物各2μL，猕猴桃基因组DNA模板3μL，ddH₂O补足至50μL。

(3)PCR扩增程序见表3。

表3

PCR扩增程序结束后，放置4℃保存。

(4)PCR产物进行Sanger测序检测标记位点，根据分子标记处的碱基类型预测猕猴桃童期，从而实现高效育种的目的。

二、结果

1.与猕猴桃童期性状相关的分子标记信息见表4。

表4与猕猴桃童期性状相关的分子标记信息

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扩增产物(SEQ ID NO.1)：

AGTGTCCCTATAAAGTATAAACTCATTTGGTGCAAATGGGATTAGGATAGTAATTAGTTTACGTACAAACGGGATATAACAACCTTTTATTTTGATAAGAAAAATGGATTGATACCAACAGCAAATGAATTCGTTTTATCTTCTTCTGTTTTTGCGTTTAATCAAATGCCACACAGTATTAGGGAGAATATAAATAATATAGTTGTTCATCTCTATAATAACTTAAGTTTTTAGATTAGTTGATGATTAGTAATGTATTATCATATCTAGATAATAGATTGTGCGTTGTATTGAGA；下划线处为A或C。

表5分子标记与猕猴桃童期性状的关联性分析

如表5和图2所示，对于猕猴桃Group14染色体的第10647638个碱基，该位点的基因型为AA的平均童期为2.27年，该位点的基因型为AC的平均童期为1.92年，差异极其显著(P<0.01)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种与猕猴桃童期QTL连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子标记的117bp存在一个SNP位点，为A或C。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述SNP位点的基因型为AA或AC。

3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述SNP位点的基因型为AA时，猕猴桃植株的童期大于AC。

4.一种利用权利要求1-3任一项所述的分子标记预测猕猴桃植株童期的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待预测猕猴桃植株的基因组DNA；

(2)利用如SEQ ID NO.2-3所示的引物对，对所述基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物，之后测序获得所述扩增产物117bp的基因型，当基因型为AA时，猕猴桃植株的童期大于AC。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应体系包括：2×Hieff

Plus PCR Master Mix(With Dye)25μL，正向和反向引物各2μL，基因组DNA模板3μL，ddH₂O补足至50μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃10sec，58℃20sec，72℃30sec；72℃5min。

7.一种预测猕猴桃植株童期的试剂盒，其特征在于，包含如SEQ ID NO.2-3所示的引物对。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的分子标记或权利要求7所述的试剂盒在猕猴桃育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为预测猕猴桃植株的童期。

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