CN115838768A - 一种基因敲除能够引起癫痫症状发生的动物模型构建的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种基因敲除能够引起癫痫症状的动物模型构建的方法及应用。本发明提供了一种基因敲除可以导致癫痫发生的小鼠模型的构建方法。本发明发现Fscnl基因敲除可以引起癫痫症状的发生，实施例中采用小鼠全身Fscnl基因敲除的方式构建自发性癫痫小鼠模型，相比于药物诱导的癫痫动物模型，本发明构建得到的癫痫小鼠模型100％表现癫痫症状，具有更好的稳定性以及更低的同批次诱导个体间差异。
Description
技术领域
本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种基因敲除能够引起癫痫症状发生的动物模型构建的方法及应用。
背景技术
Fscn1(Fascin，actin-bundling protein 1，聚束蛋白)属于Fascin家族。人类Fscn1基因定位于染色体7p22.1，编码的蛋白质由493个氨基酸残基组成，分子量为55kD。FSCN1可促进微丝成束，在细胞骨架结构调节和质膜突起形成过程中发挥作用。目前的研究证明，FSCN1与肿瘤的恶性程度及侵袭转移等恶性进展过程密切相关，目前并没有任何将FSCN1与癫痫进行关联的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向敲除Fscn1基因的sgRNA及敲除方法和构建癫痫动物模型中的应用，可解决癫痫模型诱导成功率低及同批次诱导个体间差异大的技术问题。
本发明提供了Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用。
本发明还提供了靶向敲除Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用。
优选的，所述Fscn1基因的敲除靶向片段包括Fscn1基因第二外显子和第三外显子的两侧内含子区域。
优选的，所述Fscn1基因的敲除靶向片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一组靶向敲除Fscn1基因的sgRNA，所述sgRNA包括M-Fscn1-E2be-gRNA up、M-Fscn1-E2be-gRNA down、M-Fscn1-E2af-gRNA up和M-Fscn1-E2af-gRNA down；
所述M-Fscn1-E2be-gRNA up的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述M-Fscn1-E2be-gRNA down的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA up的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA down的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述M-Fscn1-E2be-gRNA up和M-Fscn1-E2be-gRNA down靶向SEQ IDNO.1所述的序列；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA up和M-Fscn1-E2af-gRNA down靶向SEQ ID NO.2所述的序列。
本发明还提供了上述sgRNA在构建癫痫动物模型中的应用。
本发明还提供了一种基因敲除能够引起癫痫症状的动物模型的构建方法，包括以下步骤：将上述sgRNA和CAS9 mRNA注射到动物的受精卵内，然后移植到假孕的动物输卵管，筛选阳性F0动物；
将阳性F0动物与野生型动物交配得到F1代，筛选阳性F1杂合动物并进行自交，F2纯合动物为所述癫痫动物模型。
优选的，所述筛选包括PCR筛选，所述PCR筛选所用的引物包括M-Fscn1-F、M-Fscn1-R和M-Fscn1-deletion，其中M-Fscn1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，M-Fscn1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，M-Fscn1-deletion的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了上述构建方法得到的癫痫动物模型在解析癫痫发生的分子机制及筛选或制备治疗癫痫药物中的应用。
有益效果：本发明提供了Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用，本发明发现Fscn1基因与癫痫相关，并且通过多种手段对所述Fscn1基因进行缺失后，会引起小鼠癫痫，实施例中采用小鼠全身Fscn1基因敲除的方式构建自发性癫痫小鼠模型，相比于药物诱导的癫痫动物模型，本发明构建得到的癫痫小鼠模型100％表现癫痫症状，具有更好的稳定性以及更低的同批次诱导个体间差异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明Fscn1(-/-)缺失小鼠构建方法的基本流程图；
图2为本发明构建得到的Fscn1(-/-)敲除小鼠的敲除位点图；
图3为Fscn1基因缺失小鼠和对照小鼠的基因型鉴定图；
图4为蛋白鉴定结果图；
图5为Fscn1基因敲除小鼠的发生癫痫症状图。
具体实施方式
本发明提供了Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用。
本发明所述Fscn1基因ID：14086，基因定位于Chromosome 5。本发明所述动物优选包括哺乳动物，更优选包括啮齿类动物，最优选包括小鼠。
本发明还提供了靶向敲除Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用。
本发明所述Fscn1基因的敲除靶向片段，优选包括Fscn1基因第二外显子和第三外显子的两侧内含子区域，并且所述Fscn1基因的敲除靶向片段的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.1(GGCTACCAAATCAGCAGCCAAGG)和SEQ ID NO.2(GGAGACAGCAGGTAGTCACTTGG)所示。本发明优选通过SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列设计sgRNA，从而实现Fscn1基因的敲除。
本发明还提供了一组靶向敲除Fscn1基因的sgRNA，所述sgRNA包括M-Fscn1-E2be-gRNA up、M-Fscn1-E2be-gRNA down、M-Fscn1-E2af-gRNA up和M-Fscn1-E2af-gRNA down；
所述M-Fscn1-E2be-gRNA up的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：TAGGCTACCAAATCAGCAGCCA；
所述M-Fscn1-E2be-gRNA down的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：AAACTGGCTGCTGATTTGGTAG；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA up的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：TAGGAGACAGCAGGTAGTCACT；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA down的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：AAACAGTGACTACCTGCTGTCT。
本发明所述M-Fscn1-E2be-gRNA up和M-Fscn1-E2be-gRNA down优选靶向SEQ IDNO.1所述的序列；所述M-Fscn1-E2af-gRNAup和M-Fscn1-E2af-gRNA down优选靶向SEQ IDNO.2所述的序列。本发明对所述sgRNA的合成方法并没有特殊限定，利用本领域的常规合成方法即可，本发明实施例中优选委托擎科昆明合成部进行合成。
本发明还提供了上述sgRNA在构建癫痫动物模型中的应用。
利用上述sgRNA，可靶向SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，并实现Fscn1基因的靶向敲除，从而获得Fscn1基因敲除纯合小鼠，避免了药物诱导的不确定性，且100％表现癫痫症状，可得到一种由于Fscn1敲除导致的小鼠癫痫模型。
本发明还提供了一种基因敲除能够引起癫痫症状的动物模型的构建方法，其流程如图1所示，包括以下步骤：将上述sgRNA和CAS9 mRNA注射到动物的受精卵内，然后移植到假孕的动物输卵管，筛选阳性F0动物；
将阳性F0动物与野生型动物交配得到F1代，筛选阳性F1杂合动物并进行自交，F2纯合动物为所述癫痫动物模型。
本发明优选将上述sgRNA和CAS9 mRNA注射到动物的受精卵的核区，所述sgRNA和CAS9 mRNA的浓度优选分别为25ng/μL和50ng/μL。本发明所述筛选优选包括PCR筛选，所述PCR筛选的引物对优选包括M-Fscn1-F、M-Fscn1-R和M-Fscn1-deletion；所述M-Fscn1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：5’-ATATCATATGTGCCGTCTTTGG-3’；所述M-Fscn1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：5’-CGTTCCCTAATGTCGGCTTT-3’；所述M-Fscn1-deletion的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：5’-CACGGGCAAGTACTGGACAC-3’，(跟M-Fscn1-R在野生型中产生800bp的条带)。
本发明对所述PCR筛选的体系和程序并没有特殊限定，实施例中优选采用25μL体系：模板DNA 5μL，M-Fscn1-F引物0.5μL和M-Fscn1-R引物0.5μL；或M-Fscn1-R引物0.5μL和M-Fscn1-deletion引物0.5μL(引物的浓度各为10μM)，vazyme 2xRapid taq Master Mix12.5μL，ddH2O 6.5μL；并选择以下程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃再延伸5min。
本发明所述阳性F1杂合动物的筛选方法，优选与上述相同，在此不再赘述。本发明实施例中，在得到所述阳性F0小鼠后，与野生型C57BL/6品系小鼠交配得到F1代小鼠，并进行基因型鉴定阳性F1小鼠，阳性F1杂合小鼠自交产生野生、杂合与纯合F2代小鼠。
本发明所述鉴定阳性F1小鼠的方法优选与上述相同，在此不再赘述。在本发明中，无论是F0代还是F1代或F2代，在进行PCR鉴定时，杂合小鼠会产生一条1.7kb和一条1.1kb的条带；野生小鼠会产生一条1.7kb的条带。同时，对F2代进行鉴定时，优选还包括利用引物M-Fscn1-deletion和M-Fscn1-R进行PCR鉴定，杂合和野生小鼠都会产生一条800bp的条带，纯合小鼠不能扩增出条带。
本发明还提供了上述方法构建得到的癫痫动物模型在解析癫痫分子机制及筛选或制备治疗癫痫药物中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种基因敲除能够引起癫痫症状发生的动物模型构建的方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据图1所示流程构建Fscn1缺失(Fscn1(-/-))小鼠：
委托北京医学实验动物研究所设计Fscn1的sgRNA(SEQ ID NO.3～6)。
将体外合成Fscn1 sgRNA和CAS9 mRNA显微注射到C57BL/6品系小鼠(动物中心)的受精卵的核区；再将小鼠受精卵细胞移植到假孕C57BL/6品系小鼠的输卵管中，获得F0代小鼠并进行基因型鉴定(利用引物M-Fscn1-F、M-Fscn1-R和M-Fscn1-deletion)；
将阳性F0小鼠(M-Fscn1-F和M-Fscn1-Rd的PCR扩增产生一条1.7kb和一条1.1kb的条带)与野生型C57BL/6品系小鼠交配得到F1代小鼠，利用上述方法进行基因型鉴定，将所述阳性F1杂合小鼠(M-Fscn1-F和M-Fscn1-R的PCR扩增产生1.7kb和一条1.1kb条带，M-Fscn1-R和M-Fscn1-deletion的PCR扩增产生800bp左右条带)自交产生野生(M-Fscn1-F和M-Fscn1-R的PCR扩增产生一条1.7kb的条带)、杂合(M-Fscn1-F和M-Fscn1-R的PCR扩增产生一条1.7kb和一条1.1kb条带)与纯合F2代小鼠(M-Fscn1-F和M-Fscn1-R的PCR扩增产生一条1.1kb的条带)。同时利用引物M-Fscn1-deletion和M-Fscn1-R对F2代小鼠进行再次进行验证，其中杂合和野生小鼠都会产生一条800bp的条带；纯合小鼠不能扩增出条带。
通过基因敲除技术得到的小鼠模型发生癫痫症状的比率为100％，避免了药物诱导的不确定性；并且同批次野生和Fscn1基因缺失的小鼠个体由Fscn1杂合雌鼠与雄鼠杂交得到，所有Fscn1基因缺失纯合小鼠和野生小鼠的培育条件保持一致，有效降低小鼠个体间差异(图2显示敲除位点)。
实施例2
剪取小鼠脚趾并对其编号，上肢脚趾从左到右，代表十位数。下肢脚趾从左到右，代表个位数。将剪下的脚趾放入裂解液中，提取DNA。利用M-Fscn1-F和M-Fscn1-R进行PCR扩增实验，结果如图3中A所示，Fscn1(-/+)杂合小鼠产生1.7kb和1.1kb左右的两条带，WT野生小鼠只产生一条1.7kb的条带，Fscn1(-/-)纯合小鼠只产生一条1.1kb的条带。同时利用M-Fscn1-R和M-Fscn1-deletion的引物进行PCR，结果如图3中B所示，WT小鼠和Fscn1(-/+)杂合小鼠产生800bp左右的条带，Fscn1(-/-)纯合小鼠不能扩增出条带。
实施例3
将基因型鉴定后的野生小鼠和Fscn1(-/-)纯合小鼠处死解剖，取其肝脏和肺组织，组织破碎后提取蛋白，用Western Blot检测蛋白水平的Fscn1表达，结果如图4所示，在纯合小鼠组织中Fscn1无表达。
实施例4
将野生型和Fscn1(-/-)纯合小鼠养到4-5月龄以上，给予一定刺激，观察小鼠的癫痫症状发生。
采集小鼠癫痫发作时2秒-13秒的照片，如图5所示。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用。
2.靶向敲除Fscn1基因在构建癫痫动物模型中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述Fscn1基因的敲除靶向片段包括Fscn1基因第二外显子和第三外显子的两侧内含子区域。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述Fscn1基因的敲除靶向片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.一组靶向敲除Fscn1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括M-Fscn1-E2be-gRNAup、M-Fscn1-E2be-gRNA down、M-Fscn1-E2af-gRNA up和M-Fscn1-E2af-gRNA down；
所述M-Fscn1-E2be-gRNA up的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述M-Fscn1-E2be-gRNA down的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA up的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA down的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求5所述的sgRNA，其特征在于，所述M-Fscn1-E2be-gRNA up和M-Fscn1-E2be-gRNA down靶向SEQ ID NO.1所述的序列；
所述M-Fscn1-E2af-gRNA up和M-Fscn1-E2af-gRNA down靶向SEQ ID NO.2所述的序列。
7.权利要求5或6所述sgRNA在构建癫痫动物模型中的应用。
8.一种基因敲除能够引起癫痫症状的动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5或6所述sgRNA和CAS9 mRNA注射到动物的受精卵内，然后移植到假孕的动物输卵管，筛选阳性F0动物；
将阳性F0动物与野生型动物交配得到F1代，筛选阳性F1杂合动物并进行自交，F2纯合动物为所述癫痫动物模型。
9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述筛选包括PCR筛选，所述PCR筛选所用的引物包括M-Fscn1-F、M-Fscn1-R和M-Fscn1-deletion，其中M-Fscn1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，M-Fscn1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，M-Fscn1-deletion的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
10.权利要求8或9所述构建方法得到的癫痫动物模型在解析癫痫分子机制及筛选或制备治疗癫痫药物中的应用。
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