CN115838478A - 一种透明质酸衍生物或其盐及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸衍生物或其盐及其制备方法和应用，以透明质酸为母体骨架，用甲氧基聚乙二醇环氧衍生物对透明质酸进行修饰，制备聚乙二醇化的透明质酸衍生物。利用聚乙二醇线性大分子将透明质酸的骨架缠绕起来，将易于酶解的糖苷键掩蔽，延长透明质酸钠在体内的循环时间，更好的发挥保湿锁水的作用。同时聚乙二醇和透明质酸钠作为人工合成的和天然存在的高分子材料，都具有良好的生物相容性和生物可降解性，将二者结合起来，可以更好的发挥高分子材料的优势。

Description

一种透明质酸衍生物或其盐及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子技术领域，特别涉及一种透明质酸衍生物或其盐及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种天然存在的生物高分子材料，广泛存在于动物和人的关节滑液、眼球玻璃体、皮肤、细胞间隙及鸡冠等结缔组织中，是构成关节滑液、玻璃体、皮肤和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和广泛的生物学功能。由于透明质酸具有良好的生物相容性、独特的粘弹性和优良的保湿锁水性能，其在美容领域受到了广大爱美人士的喜爱，目前可被用于注入面部皮肤，减轻皱纹，改进皮肤外观和阻止皮肤衰老。
透明质酸在生产及应用时多以透明质酸钠的形式存在，天然透明质酸钠易被生物降解，在生物体内存留时间短，硬度和力学强度都不够大，限制了其应用。因此，通常利用交联剂将透明质酸钠制备成凝胶，在保留原有生物相容性的基础上，开发出抗酶解性显著提高的透明质酸钠交联改性凝胶，从而使其应用更加广泛。但任何交联剂的残留在现有技术下都不可能完全被清除，并且交联剂多为化学试剂，交联剂过量会导致生物相容性降低，注入人体时易引起免疫反应，对皮肤存在刺激性甚至细胞毒性。
在非交联透明质酸钠的研究方面，文献Adrian Ranga,etc.Hyaluronic acidhydrogels formed in situ by transglutaminase-catalyzed reaction[J].Biomacromolecules和Kazuteru Moriyama,etc.Hyaluronic acid grafted with poly(ethylene glycol)as a novel peptide formulation.Journal of Controlled Release报道了利用透明质酸钠分子中的羧基进行反应来链接聚乙二醇。
文献Irina M.Le-Deygen,etc.Poly(Ethylene Glycol)Interacts withHyaluronan in Aqueous Media.Biomacromolecules报道了利用透明质酸钠分子中的羟基与聚乙二醇进行氢键链接聚乙二醇。
现有技术中，有利用透明质酸钠分子上的氨基、羧基、羟基与聚乙二醇反应，制备具有不同性能的聚乙二醇化透明质酸钠。但目前还没有利用透明质酸钠分子中的羟基与甲氧基聚乙二醇环氧衍生物反应，以醚键的方式对透明质酸钠分子进行修饰从而制备聚乙二醇化透明质酸钠衍生物的报道。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，本发明第一方面提供了一种透明质酸的衍生物或其盐，所述的透明质酸的衍生物具有式(Ⅰ)所示结构：
Figure BDA0004044531260000021
其中，X选自：-(CR1R2)m-、-(CH2)mNH-、-NHCO(CH2)m-、-(CH2)mCONH-和-CO(CH2)m-中的一种或多种的组合，m为1-10的整数；
R1和R2独立地选自：H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、-COR3、-C(O)OR3、-C(O)NR3R4、-CH＝NR3、-CN、-OR3、-OC(O)R3、-S(O)n-R3、-NR3R4、-NR3C(O)R4和卤素；
n选自0、1和2；
R3和R4彼此独立地选自氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、杂环基和卤素；
k为聚乙二醇残基的聚合度，k为40～4600的整数(例如40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、150、200、400、500、800、1000、2000、3000、4000、4500)，优选地，k为45～4545的整数，更优选地，k为75～4545的整数，特别优选地，k为100～4545的整数；
t为透明质酸残基的聚合度，t为100～8000的整数(例如100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、5500、7000、7100、7200、7300、7400)，优选地，t为120～7500的整数，更优选地，t为700～6000的整数，特别优选地，t为1000～4000的整数；
优选地，所述X为-(CR1R2)m-；
优选地，所述m为1-5的整数，如1、2、3、4或5；
在本发明的一个实施方式中，所述m＝1。
优选地，所述R1和R2独立地选自：H、C1-C6的烷基、C3-C6的环烷基、-OR3、-NR3R4和卤素。
优选地，所述R3和R4独立地选自：氢和C1-C3的烷基。
在本发明的一个实施方式中，所述R1和R2均为H。
在本发明的一个优选实施方式中，所述X为-CH2-。
所述的盐选自：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、钴盐和四丁铵盐中的一种或多种；优选的，所述的盐为钠盐。
在本发明的一个实施方式中，所述的透明质酸衍生物具有如下结构：
Figure BDA0004044531260000031
本发明的第二方面提供一种如通式(ⅠI)所述透明质酸衍生物或其盐的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取透明质酸，将透明质酸与碱性溶剂混合，搅拌；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入甲氧基聚乙二醇环氧衍生物进行反应；
所述甲氧基聚乙二醇环氧衍生物具有式(III)的结构：
Figure BDA0004044531260000041
优选的，步骤(1)中所述的碱性溶剂为：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的一种或多种。
在本发明的一个优选实施中，所述的碱性溶剂为质量浓度为0.25％～0.8％的氢氧化钠溶液(如0.25％、0.35％、0.5％、0.8％)，优选为质量浓度为0.35％～0.5％的氢氧化钠溶液。
所述的透明质酸钠的分子量为4万-320万道尔顿，优选地，所述的透明质酸钠的分子量为5万-300万道尔顿，更优选地，所述的透明质酸钠的分子量为28万～240万道尔顿，特别优选地，所述的透明质酸钠的分子量为40万～160万道尔顿。
所述透明质酸与碱性溶剂的质量比为1:5-30(具体如1:5、1:10、1:15、1:20、1:25或1:30)，优选地，所述透明质酸与碱性溶剂的质量比为1:10。
所述透明质酸与甲氧基聚乙二醇环氧衍生物中聚合物单元的摩尔比为0.1～10:1(具体如0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1)。
步骤(1)中所述搅拌的时间为5～50min，优选为10～30min(如15min、16min、17min、18min、19min、20min)，更优选为10～20min。
步骤(2)中所述聚乙二醇环氧衍生物为单甲氧基聚乙二醇环氧乙烷，优选地，所述单甲氧基聚乙二醇环氧乙烷的分子量为2000-200000，例如是2000、3000、4000、5000、10000、20000、30000、50000、100000。
步骤(2)中所述的反应包括搅拌混合后放置。
优选的，步骤(2)中所述反应时间为10～24h，优选为13～21h，更优选为17～19h。
优选地，所述透明质酸衍生物或其盐的制备方法还包括纯化产物的步骤，所述纯化产物的步骤包括加入酸性试剂调节步骤(2)所得溶液为中性的步骤，和/或，加入沉淀剂沉淀产物的步骤，和/或，加入洗涤剂洗涤沉淀的步骤。
所述的酸性试剂选自：稀盐酸溶液、稀硫酸溶液、稀醋酸溶液、稀次氯酸溶液中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，所述的酸性试剂为稀盐酸溶液。
所述沉淀剂为乙腈或乙醇。
在本发明的一个实施方式中，所述的沉淀剂为乙腈。
所述洗涤剂为乙醇或水。
在本发明的一个实施方式中，所述的洗涤剂为乙醇。
在本发明的一个实施方式中，所述透明质酸衍生物或其盐的制备方法为称取透明质酸，将其用碱性溶剂溶解，搅拌10-30min至均匀，然后加入甲氧基聚乙二醇环氧衍生物，继续搅拌10～24h至物料混合均匀，室温下放置15～18小时，加入酸性试剂调节体系的PH为中性，随后加入沉淀剂进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液，用沉淀剂继续沉淀2～5次，再用洗涤剂洗涤所得沉淀1～3次，最后将所得沉淀产物放于真空干燥箱中干燥。
本发明的第三方面提供一种如通式(Ⅰ)或(ⅠI)所述透明质酸衍生物或其盐在制备用于药物、医疗美容和化妆品用途的产品中的应用。
优选地，所述的应用为如通式(Ⅰ)或(ⅠI)所述透明质酸衍生物或其盐在制备用于医疗美容用途的产品中的应用。
优选地，所述的医疗美容用途的产品为软组织填充剂。
本发明还提供一种软组织填充剂，其包括本发明如通式(Ⅰ)或(ⅠI)所述透明质酸衍生物或其盐。
本发明将聚乙二醇衍生物与透明质酸或其盐以醚键的方式进行修饰，反应产物不是交联凝胶状态，是一种可溶于水溶液的复合型高分子材料，制备的透明质酸衍生物或其盐，既保持了透明质酸的锁水保湿性能，又增强了其在体内的耐透明质酸酶酶降解性，应用于修复面部和颈部细纹时，可以减少注射频次，增强体验者的舒适度，减少经济费用。
附图说明
图1所示为对照样品的酶解分子量-时间关系图。
图2所示为样品8的酶解分子量-时间关系图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义，如：“烷基”指的是直链或支链的且不含不饱和键的烃链自由基，本发明中C1-C6的烷基指含有1-6个碳原子的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等，优选C1-C3的烷基(如甲基、乙基、正丙基和异丙基)；“环烷基”指的是脂环烃，典型的环烷基含1至4个单环和/或稠环、含3至约18个碳原子，本发明中C3-C6的环烷基是指含有3-6个碳原子的环烷基，如环丙基、环戊基、环己基等。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
称取HA60万380mg，用3.8ml 0.25％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入1g M-PEG2000-EPOX(
Figure BDA0004044531260000061
由北京键凯科技股份有限公司提供，下同)，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入1ml 0.25N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入20ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用20ml乙腈继续沉淀4次，再用20ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品1(0.25％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例2
称取HA60万570mg，用5.7ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入1.5g M-PEG2000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入1.5ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入30ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用30ml乙腈继续沉淀4次，再用30ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品2(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例3
称取HA60万380mg，用3.8ml 0.5％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入1g M-PEG2000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入1ml 0.5N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入20ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用20ml乙腈继续沉淀4次，再用20ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品3(0.5％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例4
称取HA60万380mg，用3.8ml 0.8％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入1g M-PEG2000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入1ml 0.8N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入20ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用20ml乙腈继续沉淀4次，再用20ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品4(0.8％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例5
称取HA60万190mg，用5.7ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入500mg M-PEG2000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入1ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入10ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用10ml乙腈继续沉淀4次，再用10ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品5(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例6
称取HA60万760mg，用7.6ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入2g M-PEG2000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置15小时。次日，加入2ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入40ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用40ml乙腈继续沉淀4次，再用40ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品6(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例7
称取HA60万760mg，用7.6ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入2g M-PEG2000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置21小时。次日，加入2ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入40ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用40ml乙腈继续沉淀4次，再用40ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品6(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例8
称取HA60万570mg，用5.7ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入2750mg M-PEG5000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入2ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入30ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用30ml乙腈继续沉淀4次，再用30ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品6(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例9
称取HA60万570mg，用5.7ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入1875mg M-PEG5000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入2ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入30ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用30ml乙腈继续沉淀4次，再用30ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品6(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例10
称取HA60万570mg，用5.7ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，加入7500mg M-PEG5000-EPOX，继续剧烈搅拌至物料混合均匀，室温下放置18小时。次日，加入2ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入30ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用30ml乙腈继续沉淀4次，再用30ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品6(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测。
实施例11
称取HA60万570mg，用5.7ml 0.35％氢氧化钠水溶液溶解，剧烈搅拌10-30min至均匀，室温下放置18小时。次日，加入2ml 0.35N HCl调节体系的PH为7左右，然后加入30ml乙腈进行沉淀，剧烈搅拌使产品颗粒均匀，离心静置去除上清液；用30ml乙腈继续沉淀4次，再用30ml无水乙醇洗涤2次，产品放于真空干燥箱中干燥，得样品11(0.35％NaOH)。取样做多角光-示差检测和核磁检测，多角光检测分子量为6.366×105Da，样品11作为计算透明质酸钠骨架上链接聚乙二醇个数的对比样品。
实施例12
对实施例1-4中的产物进行多角光-示差检测，所得出的分子量信息如表1所示：
表1
样品编号 样品1(0.25％) 样品2(0.35％) 样品3(0.5％) 样品4(0.8％)
分子量(Mw×10<sup>5</sup>) 3.585 12.02 10.5 2.696
从表1中分子量数据可以看出，反应溶液的碱浓度不能太低也不能太高。碱液浓度太低，原料反应活性不高；碱液浓度太高，透明质酸钠原料碱解的比较多。
对实施例2和实施例5中的产物进行多角光-示差检测，所得出的分子量信息如表2所示：
表2
Figure BDA0004044531260000091
从表2中分子量数据可以看出，溶剂量太多，导致体系浓度太稀，也会加快原料透明质酸钠的碱解程度。
对实施例2、实施例6和实施例7中的产物进行多角光-示差检测，所得出的分子量信息如表3所示：
表3
样品编号 NaOH浓度(％) 室温下反应时间(h) 分子量(Mw×10<sup>5</sup>)
样品2(0.35％) 0.35％ 18 12.02
样品6(0.35％) 0.35％ 15 9.352
样品7(0.35％) 0.35％ 21 8.693
从表3中分子量数据可以看出，反应时间也是限制产品性能的一个因素，反应时间过长会增加透明质酸钠原料降解风险。
对实施例8、实施例9和实施例10中的产物进行多角光-示差检测，所得出的分子量信息如表4所示：
表4
Figure BDA0004044531260000092
从表4中分子量数据可以看出，HA与甲氧基聚乙二醇环氧衍生物的投料比例也对产物的性能有一定的影响。
实施例13
以样品2和样品11为例,聚乙二醇化透明质酸钠产品中透明质酸钠双糖个数与PEG的个数比值计算方法如下(一个双糖单元的分子量为380):
样品11中的平均双糖单元个数为：6.366×105/380＝1675个；
样品2中含有的PEG2000的个数为：(12.02-6.366)105/2000＝283个
样品2中双糖个数与PEG2000的个数比为：1675/283＝6:1。
体外酶解实验：
酶解实验操作步骤：以样品8为例，称取3.4mg样品8，加入242ul灭菌注射用水，涡轮振荡20分钟，加入242ul含有10U/ml透明质酸酶得灭菌注射用水溶液，将样品混匀，放置在37度的恒温水浴环境中，每隔1小时取样采用多角光-示差检测得方法测试分子量的变化情况。
测试酶解实验的样品信息如下：
对照样品：HA120万Da，酶解分子量-时间关系图如图1所示；
样品2：其中HA双糖个数与PEG2000的个数比为6:1；
样品12：其中HA双糖个数与PEG2000的个数比为17:1；
样品8：其中HA双糖个数与PEG5000的个数比为13:1，酶解分子量-时间关系图如图2示；
样品9：其中HA双糖个数与PEG5000的个数比为22:1；
样品13：其中HA双糖个数与PEG5000的个数比为42:1；
PEG5000-HA样品的酶解数据：
表5
1h(×10<sup>4</sup>) 2h(×10<sup>4</sup>) 3h(×10<sup>4</sup>) 4h(×10<sup>4</sup>) 5h(×10<sup>4</sup>) 6h(×10<sup>4</sup>)
HA120万Da 57.1 35.9 32.6 29 24.9 7.7
样品8(13:1) 113.3 110.8 129.3 105.3 98.4 111.6
样品9(22:1) 92 90.2 83.5
样品13(42:1) 54.3 51.2
表6
PEG2000-HA样品的酶解数据：
Figure BDA0004044531260000101
Figure BDA0004044531260000111
从表5和表6的数据可以看出，当PEG的分子量为5000时，HA与PEG的比例在13:1—42:1时，PEG对HA的抗酶降解性都是有作用的，比例越高，作用越明显；当PEG的分子量为2000时，PEG对HA的抗酶降解性能的作用不是很大。

Claims (12)

1.一种透明质酸衍生物或其盐，所述透明质酸衍生物具有式(Ⅰ)所示结构：
Figure FDA0004044531250000011
其中，X选自：-(CR1R2)m-、-(CH2)mNH-、-NHCO(CH2)m-、-(CH2)mCONH-和-CO(CH2)m-中的一种或多种的组合，m为1-10的整数；
R1和R2独立地选自：H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、-COR3、-C(O)OR3、-C(O)NR3R4、-CH＝NR3、-CN、-OR3、-OC(O)R3、-S(O)n-R3、-NR3R4、-NR3C(O)R4和卤素；
n选自0、1和2；
R3和R4彼此独立地选自氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、杂环基和卤素；
k为聚乙二醇残基的聚合度，k为40～4600的整数；
t为透明质酸残基的聚合度，t为100～8000的整数。
2.权利要求1所述的一种透明质酸衍生物或其盐，其特征在于，所述k为45～4545的整数，优选地，k为75～4545的整数，更优选地，k为100～4545的整数；
所述t为120～7500的整数，优选地，t为700～6000的整数，更优选地，t为1000～4000的整数。
3.权利要求1所述的一种透明质酸衍生物或其盐，其特征在于，所述的X为-(CR1R2)m-，所述m为1-5的整数，优选地，所述的m为1。
4.权利要求1所述的一种透明质酸衍生物或其盐，其特征在于，所述R1和R2独立地选自：H、C1-C6的烷基、C3-C6的环烷基、-OR3、-NR3R4和卤素，所述R3和R4独立地选自：氢和C1-C3的烷基。
5.权利要求1所述的一种透明质酸衍生物或其盐，其特征在于，所述R1和R2均为H。
6.权利要求1所述的一种透明质酸衍生物或其盐，其特征在于，所述的盐选自：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、钴盐和四丁铵盐中的一种或多种；优选的，所述的盐为钠盐，具有式(II)的结构：
Figure FDA0004044531250000021
7.如权利要求1所述的透明质酸衍生物或其盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取透明质酸，将透明质酸与碱性溶剂混合，搅拌；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入甲氧基聚乙二醇环氧衍生物进行反应；
所述甲氧基聚乙二醇环氧衍生物具有式(III)的结构：
Figure FDA0004044531250000022
8.权利要求7所述的透明质酸衍生物或其盐的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括纯化产物的步骤，所述纯化产物的步骤包括加入酸性试剂调节步骤(2)所得溶液为中性的步骤；和/或，加入沉淀剂沉淀产物的步骤；和/或，加入洗涤剂洗涤沉淀的步骤。
9.权利要求7所述的透明质酸衍生物或其盐的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸与碱性溶剂的质量比为1:5-30，优选地，所述透明质酸与碱性溶剂的质量比为1:10。
10.权利要求7所述的透明质酸衍生物或其盐的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸与甲氧基聚乙二醇环氧衍生物中聚合物单元的摩尔比为0.1～10:1。
11.权利要求7所述的透明质酸衍生物或其盐的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应时间为10～24h，优选为13～21h，更优选为17～19h。
12.一种如权利要求1所述的透明质酸衍生物或其盐在制备用于药物、医疗美容和化妆品用途的产品中的应用；优选地，所述的应用为上述透明质酸衍生物或其盐在制备用于医疗美容用途的产品中的应用；更优选地，所述的医疗美容用途的产品为软组织填充剂。
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