CN115818847A - 一种通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法，向养殖水体中投加枯草芽孢杆菌NX‑2，利用枯草芽孢杆菌NX‑2合成聚谷氨酸的氨同化途径，实现养殖水体的脱氮。该脱氮菌株NX‑2兼具异养硝化能力，能够耐受养殖水产水体高浓度的废氮，能将废弃氮循环利用，使用便利且对环境友好，在低菌浓下仍保持高效脱氮能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物环境微生物技术领域，具体涉及通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法。
背景技术
在水产养殖过程中，养殖水体中氮含量过多会对水产养殖动物及水体造成损伤，甚至对人体有间接影响。因此氮含量是水产养殖水体一个十分重要的检测指标。传统生物脱氮过程为硝化-反硝化作用，其中硝化作用是在硝化细菌的作用下氨氮转变为亚硝态氮进而转变为硝态氮；而反硝化过程则是指在反硝化细菌作用下硝态氮转变为氮气等并脱离水体，达到彻底净化的过程。除此之外，废弃氮可被循环利用参与其他生化过程，例如氨同化，它利用氨根离子将无机氮转化为有机氮，生成一些高分子含氮物质(蛋白质等)。氨同化，既能达到净化养殖水体氮污染又能重复利用无机氮，便利环保。
发明内容
发明目的：本发明发现枯草芽孢杆菌NX-2高产聚谷氨酸这一特性能够利用在养殖水产氮污染净化中，实现废弃氮的循环利用，从而提出了一种通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法。
为实现上述目的，本发明提出了一种通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法，具体地，向养殖水体中投加枯草芽孢杆菌NX-2，利用枯草芽孢杆菌NX-2合成聚谷氨酸的氨同化途径，实现养殖水体的脱氮，其中，所述草芽孢杆菌NX-2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2002年11月18日，保藏编号为CGMCC NO.0833，所述菌株信息披露于CN1164737C中。
优选地，所述枯草芽孢杆菌NX-2的接菌量范围为102-109CFU/mL。
其中，所述的枯草芽孢杆菌NX-2以氨氮、亚硝态氮为唯一氮源进行生物脱氮，脱氮效果达98％以上。
所述氨氮的浓度范围为0.1-3000mg/L；所述亚硝态氮的浓度范围为0.2-2000mg/L。
有益效果：本发明验证了枯草芽孢杆菌NX-2高产聚谷氨酸这一特性能够利用在养殖水产氮污染净化中，实现废弃氮的循环利用，从而提出了一种通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法。该脱氮菌株NX-2兼具异养硝化能力，能够耐受养殖水产水体高浓度的废氮，能将废弃氮循环利用，使用便利且对环境友好，在低菌浓下仍保持高效脱氮能力。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌NX-2的脱氮效率；
图2为野生株与突变株的菌株形态差异；
图3为野生株与突变株的脱氮能力差异；
图4为野生株与突变株的胞外聚合物产量差异；
图5为野生株与突变株的关键酶活差异；
图6为野生株与突变株的关键基因相对定量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中涉及的引物序列如下表1所示。
表1引物序列
| rocG-F | agctgaccatgacgcttct |
| rocG-R | tgaatgaaagaggcgtgctgc |
| NirC-F | cagcgcgacgggact |
| NirC-R | gacattggaatgaaaaaggcgagg |
| NarH-F | tggcatggtgcataaacgccattccttta |
| NarH-R | agcaacttgccctaatgtttgtgaaaaag |
| 16s-F(内参) | agagtttgatcctggctcag |
| 16s-R(内参) | ggttaccttgttacgactt |
| sgcapBCA-F | aaaaaggagcgatttagtcgacaggacttgtgtttaatcagcgttttag agctagaaat |
| sgcapBCA-R | agcagtaaacgcttctgcaataaaaaagcaccgactcggtgccactt |
| capBCA-UP-F | aagtggcaccgagtcggtgcttttttattgcagaagcgtttactgctac |
| capBCA-UP-R | tcccgcccacatgaaagcatcagttcacttgcttc |
| capBCA-DN-F | atattgaagcaagtgaactgatgctttcatgtgggc |
| capBCA-DN-R | ctcagcttggaggtgtttttttattaccctcgagcctttcccggacacatc |
| OUTcapBCA-F | gcactttgttaatgggtttgcc |
| OUTcapBCA-R | cgttatatacttcaatcggttc |
实施例1枯草芽孢杆菌NX-2的脱氮能力。
将枯草芽孢杆菌NX-2在降解测试培养基中培养48h后，取样检测其氨氮以及亚硝态氮降解率。NX-2在24h内对氨氮和亚硝态氮降解率分别达到99.7％，99.1％(图1)。
实施例2构建聚谷氨酸缺失菌株ΔcapBCA。
枯草杆菌NX-2中的无标记基因敲除是通过CRISPR/Cas9n系统。pDR-sgRNA-capBCA质粒的构建方法如下：设计20bp的capBCA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)目标序列(表1中加下划线的序列)，并用引物sgcapBCA-F/R引入sgRNA盒中。用引物capBCA-UP-F/R和capBCA-DN-F/R分别通过PCR扩增capBCA基因的上游和下游区域。随后，将组装好的sgRNA-capBCA-UP-capBCA-DN片段导入SalI/XhoI消化的pDR-sgRNA中，从而产生了pDR-sgRNA-capBCA。通过电穿孔将从大肠杆菌GM2163中提取的质粒pNX-Cas9n转化到枯草杆菌NX-2中。
实施例3野生菌NX-2与突变菌ΔcapBCA的差异分析。
1)将野生菌与突变菌在LB平板上划线培养过夜，比较两者的形态差异；
野生菌与突变菌在LB平板上形态差异显著，野生菌表面呈淡黄色，湿润粘稠，相反，突变菌表面干燥(图2)。
2)将两个菌株在降解测试培养基中培养48h内，比较两者的脱氮率；
分别将两个菌株在降解测试培养基中培养48h后，检测比较对氨氮以及亚硝态氮降解率。实验结果表明，野生菌对氨氮以及亚硝态氮降解率远优于突变菌(图3)。这证明了敲除聚谷氨酸合成酶将会影响此菌株的脱氮效率，间接证明了枯草芽孢杆菌NX-2具高效脱氮能力与其合成聚谷氨酸特性有密切联系。
3)将两个菌株分别在发酵培养基中培养24h后，收集菌液，8000g，10min离心，去上清，三倍体积醇沉，再次离心，烘干并称重。比较两者的胞外聚合物产量；
检验两个菌株的胞外聚合物产量，发现突变菌胞外聚合物产量只达0.2g/L，而野生菌胞外聚合物产量高达28.2g/L(图4)。缺失聚谷氨酸合成酶导致菌株胞外聚合物产量严重降低。
4)利用试剂盒检测两个菌株的亚硝酸盐还原酶、硝酸盐还原酶(江苏草本源生物科技)以及谷氨酸脱氢酶(上海茁彩生物科技)酶活。
为了进一步探索枯草芽孢杆菌的脱氮途径，针对以上三个酶活进行检测。其中，关于氮代谢中的两个关键酶活，亚硝酸盐还原酶以及硝酸盐还原酶，在野生菌与突变菌中并没有存在显著性差异，这表明，两个菌在氮代谢方面的活力无差异。但在谷氨酸代谢中的谷氨酸脱氢酶，这两个菌存在着显著性差异(图5)，这表明，两个菌在利用无机氮形成有机氮的过程中存在着巨大不同。野生菌谷氨酸脱氢酶酶活明显高于突变菌，进一步验证了NX-2脱氮与其产聚谷氨酸能力相关。
实施例4 qPCR相对定量分析。
将NX-2在降解测试培养基中培养3、6、12h，并使用总RNA提取试剂提取RNA。使用PrimeScript RT Master Mix Kit(TaKaRa Bio,Inc.)将提取的RNA逆转录为cDNA。随后，cDNA被用作模板，通过qPCR确定相关基因(NirC、NarH、rocG等)的表达。
qPCR分析结果显示，由于菌株在生长早期需要大量的氮源，NirC和NarH的相对表达量在3h内得到提高，另外，rocG也被上调。在6h后，rocG仍被上调，而NirC和NarH的相对表达水平显示出不同程度的下调。这表明NX-2氮代谢途径在这个阶段被削弱，而氨同化途径将继续被提升。在12小时，NirC和NarH仍然同样下调，而rocG在3和6h显示出小幅下降，但总体上是上调的(图6)。最后，对三个时间点的分析表明，NX-2的反硝化途径主要是通过氨同化途径而不是氮代谢。
经以上实验证明，进一步确定了枯草芽孢杆菌NX-2的脱氮途径为氨同化，将养殖水体的无机氮经谷氨酸脱氢酶转化为谷氨酸，进入谷氨酸代谢途径，再进一步在聚谷氨酸合成酶作用下形成聚谷氨酸，达到养殖水体废弃氮的净化目的。
本发明提供了一种利用氨同化途径高效脱氮的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (4)
1.一种通过氨同化实现养殖水体高效脱氮的方法，其特征在于，向养殖水体中投加枯草芽孢杆菌NX-2，利用枯草芽孢杆菌NX-2合成聚谷氨酸的氨同化途径，实现养殖水体的脱氮，其中，所述草芽孢杆菌NX-2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2002年11月18日，保藏编号为CGMCC NO.0833。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌NX-2的接菌量范围为102-109 CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌NX-2以氨氮、亚硝态氮为唯一氮源进行生物脱氮，脱氮效果达98%以上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨氮的浓度范围为0.1-3000 mg/L；所述亚硝态氮的浓度范围为0.2-2000 mg/L。
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