CN115814110A

CN115814110A - 功能化聚乙烯亚胺纳米复合材料的制备及其诊疗应用

Info

Publication number: CN115814110A
Application number: CN202211280770.7A
Authority: CN
Inventors: 朱静怡; 杨军星; 缪文俊; 岳林杰; 何灵秀; 柯锦平
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-10-19
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了一种功能化聚乙烯亚胺纳米复合材料的制备及其诊疗应用。本发明基于PEI.NH₂独特的理化性质，通过共价键合及物理包裹的方式，集SPECT成像元素（放射性核素¹³¹I）、CT成像元素（金纳米颗粒Au NPs）以及荧光成像元素（Cy7）于一体，并用靶向分子HA、生物相容性分子聚乙二醇（PEG）进行功能化修饰，以构建用于体内靶向肿瘤SPECT/CT/FL多模态成像的纳米体系。本发明的¹³¹I‑Au PHCNPs纳米颗粒复合材料可以较好地分散在水基溶液中，能特异性靶向CD44受体高表达的肿瘤，并表现出较好的抗癌活性。更重要的是，该¹³¹I‑Au PHCNPs纳米颗粒复合材料可以实现肿瘤靶向SPECT/CT/FL多模态成像，具有良好的癌症早期精确诊断应用前景，同时也为新型诊疗试剂的研发打下坚实地基础。

Description

功能化聚乙烯亚胺纳米复合材料的制备及其诊疗应用

技术领域

本发明属于功能化纳米材料的制备领域，具体涉及一种近红外荧光染料Cy7修饰的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒复合材料及其应用。

背景技术

癌症的统计学结果显示，低收入国家和中等收入国家的癌症发病率以及死亡率仍在逐年上升。尽管临床现在有多种癌症的治疗方法，包括：手术治疗、放射性核素治疗、化学治疗以及免疫治疗，然而这些方法仅适用于早期以及治疗敏感的癌症患者。同时，受限于临床诊断技术，大多数癌症患者确诊时已为癌症晚期。因此，以上方法旨在最大限度地消除癌细胞，以延长患者的生存期。不幸地是，这些方法的疗效会随着癌细胞对治疗药物耐药性的增加而减弱甚至消失，在实现患者长期生存方面的实践结果并不理想。因此，基于癌症早期隐蔽性强、治疗效果差以及预后差等特点，实现早期精确诊断才是降低癌症患者死亡率的关键所在。

在癌症早期诊断方面，临床应用较为广泛的有计算机断层成像（computedtomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance，MR）、正电子发射断层成像（positronemission tomography，PET）、单光子发射断层成像（single photon emission computedtomography，SPECT）等。然而，每种单一的成像方式都有其固有的局限性，它们都不能完全独立且全面的提供肿瘤的生理和病理信息。其中，核医学成像（nuclear medicineimaging，NMI）包括SPECT成像和PET成像，可以直接或间接探测注射到体内放射性核素衰变产生的伽马射线进行成像，具有超高灵敏度、无组织穿透限制等特点。然而，NMI相对较低的空间分辨率使其诊断精确度受限。CT成像具有空间分辨率高、解剖信息准确、性价比高等优势。然而，由于CT成像本身灵敏度较低，且CT信号强度通常与造影剂浓度呈正相关。因此，相对于SPECT、PET成像这类仅需微克级别造影剂即可进行灵敏成像的核医学成像方法，CT成像需要注射大量的造影剂才能有较好的成像效果。针对还未进行临床普及的荧光成像（fluorescence imaging, FL），其除了具有灵敏度高、实时可视化等优点，还具有病灶部位边界成像清晰等特点，可指导手术对肿瘤的完整切除。但由于光在组织中的散射与吸收，以及受光对组织穿透深度的影响，使得FL成像在生物医学应用中受限。因此，基于不同诊断技术固有的特点，迫切需要开发出一种集合不同成像模式的多模态成像技术，以克服单一成像的局限性，获得肿瘤组织更全面的生理信息。

纳米医学的飞速发展为实现多模态成像带来了希望。纳米材料具有纳米尺寸、高面容比、释药可控、可功能化修饰等特点，可以用于构建新型多功能纳米造影剂。在众多纳米材料中，聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI.NH₂）基于其表面丰富的氨基及内部空腔结构，使其可以作为一种优良的纳米载体，通过共价结合、物理包裹等方式负载多种成像或治疗元素，构建新型纳米复合体系用于癌症的诊断和治疗。例如，Zhu J. Y.等（Zhu, J.Y.; Shi, X. Y. et al. Langmuir, 2019, 35, 13405-13412）受PEI.NH₂纳米技术和烷氧苯基酰磺酰胺（APAS）特性的启发，设计了具有pH响应电荷翻转特性，且标记有锝-99m（^99mTc）的纳米颗粒APAS-^99mTc-Au PENs，用于癌细胞增强性SPECT/CT双模态成像。此外，ZhuJ. Y.等（Zhu, J. Y.; Zhao, J. H. et al. Biomater. Sci., 2020, 8, 3956-3965）用¹³¹I对APAS修饰的包裹有金纳米颗粒的功能化PEI.NH₂进行标记，得到¹³¹I-APAS-Au PNPs用于肿瘤的SPECT/CT双模态成像以及放射性核素治疗。因此，基于PEI.NH₂独特性质，其可将多种用于癌症诊断的成像元素集合于一体，并利用靶向试剂功能化修饰，以实现体内靶向肿瘤多模态成像。

前人在关于肿瘤靶点的研究过程中发现，分化抗原簇44（Cluster ofdifferentiation 44，CD44）分子，作为一种多功能细胞表面受体，可参与包括肿瘤转移和血管生成在内的多种生物学过程。同时，相比于正常细胞，CD44受体在胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌等癌细胞中具有显著性表达。而进一步研究发现，功能分子透明质酸（Hyaluronic acid，HA），作为一种天然的生物多糖，其可与癌细胞表面的CD44受体特异性结合。因此，基于PEI.NH₂独特的理化性质，通过共价键合及物理包裹的方式，集SPECT成像元素（放射性核素¹³¹I）、CT成像元素（金纳米颗粒Au NPs）以及荧光成像元素（Cy7）于一体，并用靶向分子HA、生物相容性分子聚乙二醇（PEG）进行功能化修饰，以构建用于体内靶向肿瘤SPECT/CT/FL多模态成像的纳米体系。

检索国内外有关基于功能化PEI.NH₂构建纳米成像造影剂的文献和专利结果显示，集合荧光染料分子Cy7、放射性核素¹³¹I和Au NPs多种成像元素于一体，并经HA功能化修饰，用于靶向肿瘤SPECT/CT/FL三模态成像的研究，还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种近红外荧光染料Cy7修饰的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒复合材料。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种近红外荧光染料Cy7修饰的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒复合材料，由以下步骤制备得到：

步骤1，向NH₂-PEG-COOH溶液中加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS进行活化，然后加入聚乙烯亚胺PEI.NH₂溶液，搅拌反应，制得PEI.NH₂-PEG-NH₂；

步骤2，向透明质酸HA溶液中加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）进行活化，然后加入步骤1制得的PEI.NH₂-PEG-NH₂，搅拌反应，制得PEI.NH₂-(PEG-HA)；

步骤3，向步骤2制得的PEI.NH₂-(PEG-HA)中加入3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯HPAO的二甲基亚砜溶液，搅拌反应，制得PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO；

步骤4，向步骤3制得的PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO中加入磺酸基-花菁7-N-羟基琥珀酰亚胺酯Cy7，避光搅拌反应，制得PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO；

步骤5，向步骤4制得的PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO中加入氯金酸（HAuCl₄）溶液，搅拌反应20-40分钟后快速加入硼氢化钠（NaBH₄）溶液进行反应，然后加入三乙胺（N(C₂H₅)₃），反应20-40分钟后，再加入乙酸酐（Ac₂O），搅拌反应，制得纳米颗粒Au PHCNPs；

步骤6，向步骤5制得的纳米颗粒Au PHCNPs中加入氯胺T以及Na¹³¹I，搅拌反应3分钟后，边搅拌边加入Na₂S₂O₅及KI，反应5分钟，最后通过脱盐柱分离纯化得到所述复合材料。

进一步地，步骤1中，EDC和NHS的物质的量之和与NH₂-PEG-COOH的物质的量之比为5：1，EDC和NHS的物质的量之比为1：1，NH₂-PEG-COOH与PEI.NH₂的物质的量之比为20：1，搅拌反应的时间为3天。

进一步地，步骤2中，EDC和NHS的物质的量之和与HA的物质的量之比为5：1，EDC和NHS的物质的量之比为1：1，HA与PEI.NH₂-PEG-NH₂的物质的量之比为30：1；搅拌反应的时间为3天。

进一步地，步骤3中HPAO与PEI.NH₂-(PEG-HA)的物质的量之比为10:1；搅拌反应的时间为1-2天。

进一步地，步骤4中Cy7与PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO的物质的量之比为16:1；搅拌反应的时间为3天。

进一步地，步骤5中氯金酸（HAuCl₄）和硼氢化钠（NaBH₄）的物质的量之比为1:5，氯金酸（HAuCl₄）与PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的物质的量之比为100:1；三乙胺（N(C₂H₅)₃）、乙酸酐（Ac₂O）和PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的物质的量之比为120-660:100-550:1；搅拌反应的时间为24h。

进一步地，步骤6中Na¹³¹I放射性活性为185-365 MBq。

上述复合材料在制备肿瘤诊疗试剂中的应用。

本发明中使用聚乙二醇（PEG）可以减少免疫细胞对材料的摄取，改善材料的生物相容性，延长材料体内的循环时间，进而延长造影时间和体内放射性核素治疗时间。

本发明中使用靶向分子HA修饰在PEI.NH₂表面，以期赋予材料体内靶向CD44受体过表达肿瘤的功能。同时，基于HA良好的生物相容性，HA的修饰还可以提高材料的生物相容性。

本发明中使用HPAO作为螯合剂，用于将放射性核素¹³¹I以HPAO作为梁桥，间接标记在PEI.NH₂表面。

本发明中使用Sulfo-Cy7 NHS ester，通过其末端NHS ester基团直接与PEI.NH₂表面氨基反应，修饰在PEI.NH₂表面，以用于体内外荧光成像。

本发明中在加入HAuCl₄溶液后，持续快速搅拌反应20-40分钟，利用AuCl₄ ^-与PEI.NH₂上氨基的亲和力，使其进入到PEI.NH₂内部空腔中，再迅速用NaBH₄还原，即得到包裹有金纳米粒子的功能化PEI.NH₂，可以有效地防止金纳米粒子的聚沉。

本发明中使用N(C₂H₅)₃和Ac₂O对PEI.NH₂表面剩余氨基进行乙酰化，以降低其表面电势，提高材料的生物相容性。N(C₂H₅)₃的加入是为了创造碱性环境保证乙酰化的顺利进行。

本发明中向形成的纳米颗粒Au PHCNPs溶液中加入Na¹³¹I，并搅拌使¹³¹I充分与AuPHCNPs上的HPAO反应，未反应的Na¹³¹I经PD-10脱盐层析柱分离，最后收集取得纯¹³¹I-AuPHCNPs。

本发明制备得到¹³¹I标记的Au PHCNPs纳米颗粒能够同时提供关于肿瘤的高分辨率解剖信息和分子水平上高灵敏度的生物信息，有望实现靶向肿瘤SPECT/CT/FL多模态成像。同时基于¹³¹I衰变过程中能够发射出β射线（0.606 MeV，89.9%），¹³¹I-Au PHCNPs纳米颗粒可用于肿瘤放射性核素治疗。

有益效果

（1）本发明的制备过程简单，反应条件温和，易于操作，所采用的制备程序可用于其它荧光成像试剂及放射性核素修饰的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒的制备，具有很好的使用价值。

（2）本发明制备的¹³¹I-Au PHCNPs纳米颗粒可以较好地分散在水基溶液中，能特异性靶向CD44受体高表达的肿瘤，并表现出较好的抗癌活性。更重要的是，制备得到的¹³¹I-AuPHCNPs纳米颗粒可以实现肿瘤靶向SPECT/CT/FL多模态成像，具有良好的癌症早期精确诊断应用前景，同时也为新型诊疗试剂的研发打下坚实地基础。

附图说明

图1为本发明靶向材料¹³¹I-Au PHCNPs和未经HA修饰的非靶向材料¹³¹I-Au PCNPs的合成路径示意图。

图2为本发明制备的（a）PEI.NH₂-PEG-NH₂，（b）PEI.NH₂-(PEG-HA)，（c）PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO，（d）PEI.NH₂-mPEG和（e）PEI.NH₂-mPEG-HPAO的核磁共振氢谱图。

图3为Cy7、PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO和PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的傅里叶红外光谱图。

图4为溶解在水中的Cy7和PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的荧光光谱图。

图5为（a）PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO、Cy7和PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的紫外可见吸收光谱图。（b）不同浓度的PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO紫外可见吸收光谱图。（c）Cy7在763 nm处的标准曲线。（d）Au PHCNPs的紫外可见吸收光谱图，插图是 Au PHCNPs分散在水中的照片。

图6为本发明制备的Au PHCNPs的（a）TEM图，（b）粒径分布直方图，（c）高分辨TEM图，（d）SAED图和（e）EDS图。

图7为本发明制备的Au PHCNPs在不同（a）pH、（b）温度条件下和（c）不同时间点测得的紫外可见吸收光谱。

图8为DLS法测定的在不同时间点下，分散在（a）PBS和（b）水中的Au PHCNPs水合粒径分布；及其在不同时间点下的（c）平均水合粒径和（d）多分散系数统计图。

图9为不同放射密度元素（金或碘）摩尔浓度的（a）Au PHCNPs和（b）欧乃派克的CT成像图。（c）Au PHCNPs和欧乃派克的X射线衰减强度（HU）与放射密度元素（金或碘）摩尔浓度的函数关系图。

图10为（a）室温下，溶解于PBS缓冲液中不同时间点下¹³¹I-Au PCNPs 和¹³¹I-AuPHCNPs的放射性化学纯度以及（b）37 ℃条件下，溶解于FBS中不同时间点下¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs的放射性化学纯度。

图11为分别用（a）PBS孵育4T1-HCD44细胞，Au PCNPs 孵育（b）4T1-LCD44细胞和（c）4T1-HCD44细胞，Au PHCNPs孵育（d）4T1-LCD44细胞和（e）4T1-HCD44细胞2 h后的流式细胞术检测结果；以及4T1-HCD44细胞和4T1-LCD44细胞分别经PBS、Au PCNPs 和 Au PHCNPs处理2 h后的（f）平均荧光强度图。所有材料浓度均为5 μM。

图12 为4T1-LCD44 和 4T1-HCD44细胞分别用PBS、Au PCNPs和Au PHCNPs处理 2h 后的激光扫描共聚焦显微镜图。

图13为4T1-LCD44和4T1-HCD44细胞分别用金浓度为0、25、50、100 μM的Au PHCNPs孵育2 h后的ICP-OES分析图。

图14为（a）不同金浓度的Au PCNPs、Au PHCNPs和（b）不同放射性浓度的¹³¹I-AuPCNPs、¹³¹I-Au PHCNPs孵育4T1细胞24 h后，CCK-8法测得的4T1细胞活力。

图15为4T1细胞分别经（a）PBS，金浓度为20 μM的（b）Au PCNPs和（c）Au PHCNPs，金浓度为100 μM的（d）Au PCNPs和（e）Au PHCNPs，放射性浓度为50 μCi/mL的（f）¹³¹I-AuPCNPs和（g）¹³¹I-Au PHCNPs，放射性浓度为200 μCi/mL的（h）¹³¹I-Au PCNPs和（i）¹³¹I-AuPHCNPs处理24 h后的倒置式生物显微镜图片。

图16为分别经Au PCNPs和Au PHCNPs处理后不同时间点下的（a）4T1荷瘤鼠横断面CT成像图和（b）相应肿瘤部位的CT值。图中的白色“*”表示肿瘤位置。

图17为在注射Au PCNPs和Au PHCNPs后不同时间点下的（a）4T1荷瘤鼠体内荧光成像图和（b）相应肿瘤部位的荧光强度值。（c）分别在注射Au PCNPs和Au PHCNPs后4 h 和 6h，4T1荷瘤鼠的肿瘤与肌肉的荧光强度之比。分别在注射Au PCNPs和Au PHCNPs后24 h，4T1荷瘤鼠离体肿瘤和主要器官的（d）荧光成像图和（e）相应的荧光强度。

图18为分别在注射¹³¹I-Au PCNPs 和 ¹³¹I-Au PHCNPs后不同时间点下（a）4T1荷瘤鼠的体内SPECT成像图以及（b）相应SPECT信号强度的TBR值。4T1荷瘤鼠分别注射¹³¹I-AuPCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs 24 h后（c）不同脏器放射性强度，（d）离体肿瘤的SPECT成像图及（e）相应的SPECT信号强度。圆圈表示肿瘤位置。

图19为不同治疗组荷瘤鼠的（a）相对肿瘤体积和（b）相对体重变化曲线。

图20为不同治疗组中荷瘤鼠的肿瘤H&E染色和TUNEL染色图（图中比例尺为100 μm）。

图21为不同治疗组荷瘤鼠的肿瘤TUNEL染色图对应的肿瘤细胞凋亡率。

图22为注射Au PHCNPs后不同时间点下（0、24、48、72 h）的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤中的金含量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

（1）用10 mL的蒸馏水溶解干重为32 mg的NH₂-PEG-COOH（Mw = 2000），边搅拌边依次滴加溶于4 mL蒸馏水的干重为15.34 mg的EDC和溶于4 mL蒸馏水的干重为9.20 mg的NHS，其中EDC和NHS的物质的量之和与NH₂-PEG-COOH的物质的量之比为5：1。搅拌反应3 h后，向该溶液中加入溶于10 mL蒸馏水的干重为20 mg 的PEI.NH₂（Mw = 25000），其中NH₂-PEG-COOH与PEI.NH₂的物质的量之比为20：1。搅拌反应3天后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO = 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-PEG-NH₂。

（2）用18 mL的蒸馏水溶解干重为182.28 mg的HA（Mw = 10000），边搅拌边依次滴加溶于2 mL蒸馏水的干重为17.47 mg的EDC和溶于2 mL蒸馏水的干重为10.48 mg的NHS，其中EDC和NHS的物质的量之和与HA的物质的量之比为5：1。搅拌反应3 h后，向该溶液中加入溶于12 mL蒸馏水的干重为35 mg 的PEI.NH₂-PEG-NH₂，其中HA与PEI.NH₂-PEG-NH₂的物质的量之比为30：1。搅拌反应3天后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO = 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-(PEG-HA)。

（3）用12 mL的蒸馏水溶解干重为120 mg的PEI.NH₂-(PEG-HA)，得到PEI.NH₂-(PEG-HA)的水溶液。用12 mL的DMSO溶解干重为1.51 mg的HPAO，得到HPAO的DMSO溶液。搅拌条件下，交替依次滴加PEI.NH₂-(PEG-HA)的水溶液和HPAO的DMSO溶液，并以等体积混合该两种溶液，其中HPAO与PEI.NH₂-(PEG-HA)的物质的量之比为10：1。搅拌反应24 h后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO = 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO。

（4）用8 mL的蒸馏水溶解干重为80 mg的PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO，避光条件下边搅拌边滴加溶于10 mL蒸馏水的干重为4.73 mg的Cy7，其中Cy7与PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO的物质的量之比为16：1。避光条件下搅拌反应3天后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO =8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO。

（5）用6 mL的蒸馏水溶解干重为60 mg的PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO，并做避光处理，边搅拌边逐滴滴加381.04 μL的氯金酸溶液（30 mg/mL），其中氯金酸与PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的物质的量之比为100：1。搅拌反应30 min后，快速滴加溶于2 mL蒸馏水的干重为5.25 mg的NaBH₄，溶液瞬间变为酒红色，其中氯金酸与NaBH₄的物质的量之比为1:5。随后，在避光、室温条件下搅拌反应2 h后，向反应溶液中加入7.72 μL 的N(C₂H₅)₃，搅拌反应30 min后加入5.21 μL的Ac₂O，避光室温下搅拌反应24 h。最后，避光条件下将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO = 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到[(Au⁰)₁₀₀-PEI.NHAc-(PEG-HA)-Cy7-HPAO] NPs纳米颗粒（Au PHCNPs）。

（6）将得到的Au PHCNPs纳米颗粒（150 μg）溶解在250 μL PBS中，然后加入150 μg氯胺T及放射性370 MBq的Na¹³¹I（500 μL），搅拌反应3分钟后，边搅拌边加入Na₂S₂O₅（150 μg）及KI（100 μg），反应5分钟，最后通过PD-10脱盐柱分离纯化，以pH = 7.0-7.4的PBS为流动相，通过收集分离出来的放射性活性液体得到¹³¹I标记的Au PHCNPs（¹³¹I-Au PHCNPs）。反应流程参见说明书附图1。

合成过程中对所得中间产物用核磁共振氢谱进行表征，对各个峰进行积分计算可知：每分子PEI.NH₂表面修饰了16.3分子PEG（特征峰在3.5-3.75 ppm）、15.2分子HA（特征峰在1.8-2.0 ppm）、6.3分子HPAO（特征峰在6.6-6.8，6.9-7.1 ppm），参见说明书附图2。对得到的中间产物PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO进行FTIR光谱、荧光光谱以及UV-Vis光谱表征。FTIR光谱表征结果：Sulfo-Cy7 NHS ester与PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO反应后，在1700-1750cm^-1处归属于Sulfo-Cy7 NHS ester的NHS基团C=O双键伸缩振动的吸收峰消失，同时，产物PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO在1516和1206 cm^-1出现吸收峰，其分别归属于Cy7分子中共轭C=C双键和-SO₃ ^-上S=O的伸缩振动产生的吸收峰。以上所有的FTIR特征均表明Cy7成功修饰在PEI.NH₂表面，参见说明书附图3；荧光光谱表征结果：在750 nm激发光照射下，PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO溶液与Cy7溶液有几乎相同的荧光发射峰，证明Cy7修饰成功，参见说明书附图4。UV-Vis光谱表征结果：本发明中制备得到的PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO，在763nm处有强吸收峰，与Cy7的吸收峰出峰位置几乎一致，证明Cy7成功修饰在PEI.NH₂表面，且通过紫外定量分析可知，一分子PEI.NH₂表面修饰有6.1分子Cy7；参见说明书附图5a-c。同时，制备的Au PHCNPs纳米颗粒的UV-Vis光谱图中，分别在534 nm和763 nm处出现强吸收峰，分别归属于Au NPs特有的表面等离子体共振峰（SPR）和Cy7紫外特征吸收峰，表明PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO成功包裹金纳米颗粒，参见说明书附图5d。

对比实施例1

（1）用10 mL的蒸馏水溶解干重为32 mg的mPEG-COOH（Mw = 2000），边搅拌边依次滴加溶于4 mL蒸馏水的干重为15.34 mg的EDC和溶于4 mL蒸馏水的干重为9.20 mg的NHS，其中EDC和NHS的物质的量之和与mPEG-COOH的物质的量之比为5：1。搅拌反应3 h后，向该溶液中加入溶于10 mL蒸馏水的干重为20 mg 的PEI.NH₂（Mw = 25000），其中mPEG-COOH与PEI.NH₂的物质的量之比为20：1。搅拌反应3天后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO =8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-mPEG。

（2）用10 mL的蒸馏水溶解干重为30 mg的PEI.NH₂-mPEG，得到PEI.NH₂-mPEG的水溶液。用10 mL的DMSO溶解干重为1.38 mg的HPAO，得到HPAO的DMSO溶液。搅拌条件下，交替依次滴加PEI.NH₂-mPEG的水溶液和HPAO的DMSO溶液以等体积混合该两种溶液，其中HPAO与PEI.NH₂-mPEG的物质的量之比为10：1。搅拌反应24 h后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO= 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-mPEG-HPAO。

（3）用5 mL的蒸馏水溶解干重为20 mg的PEI.NH₂-mPEG-HPAO，避光条件下边搅拌边滴加溶于10 mL蒸馏水的干重为4.73 mg的Cy7，其中Cy7与PEI.NH₂-mPEG-HPAO的物质的量之比为16：1。避光条件下搅拌反应3天后，将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO = 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到PEI.NH₂-mPEG-Cy7-HPAO。

（4）用5 mL的蒸馏水溶解干重为12 mg的PEI.NH₂-mPEG-Cy7-HPAO，并做避光处理，边搅拌边逐滴滴加259.18 μL的氯金酸溶液（30 mg/mL），其中氯金酸与PEI.NH₂-mPEG-Cy7-HPAO的物质的量之比为100：1。搅拌反应30 min后，快速滴加溶于2 mL蒸馏水的干重为3.57mg的NaBH₄，溶液瞬间变为酒红色，其中氯金酸与NaBH₄的物质的量之比为1:5。避光室温条件下搅拌反应2 h后，向反应溶液中加入5.25 μL 的N(C₂H₅)₃，避光室温搅拌反应30 min后加入3.55 μL的Ac₂O，避光室温下搅拌反应24 h。最后，避光条件下将所得溶液用纤维素透析膜（MWCO = 8000-14000）在磷酸盐缓冲液中透析1天，然后在蒸馏水中透析2天，透析期间每天更换透析所用溶液3次，最后冷冻干燥处理得到[(Au⁰)₁₀₀-PEI.NHAc-mPEG-Cy7-HPAO]NPs纳米颗粒（Au PCNPs）。

（5）将得到的Au PCNPs纳米颗粒（150 μg）溶解在250 μL的PBS中，然后加入150 μg氯胺T及放射性370 MBq的Na¹³¹I（500 μL），搅拌反应3分钟后，边搅拌边加入Na₂S₂O₅（150 μg）及KI（100 μg），反应5分钟，最后通过PD-10脱盐柱分离纯化，以pH = 7.0-7.4的PBS为流动相，通过收集分离出来的放射性活性液体得到¹³¹I标记的Au PCNPs（¹³¹I-Au PCNPs）。反应流程参见说明书附图1。

合成过程中对该对比载体材料用核磁共振氢谱进行表征，对各个峰进行积分计算可知：一分子PEI.NH₂表面修饰了16.1分子mPEG和6.1分子HPAO。并在标记¹³¹I后，测试形成的¹³¹I-Au PCNPs放射性化学纯度在94%以上，说明成功标记¹³¹I。

本发明使用核磁共振氢谱（¹H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、荧光光谱、紫外-可见光谱（UV-Vis）、透射电子显微镜（TEM）、X射线能谱（EDS）、动态光散射（DLS）、X射线衰减测试、以及瞬时薄层色谱法（ITLC）对制备的¹³¹I-Au PHCNPs纳米颗粒进行基本表征；通过细胞增殖-毒性检测（CCK-8）法、倒置式生物显微镜、流式细胞术测试、激光扫描共聚焦显微镜、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-OES）测试、体内肿瘤SPECT/CT/FL成像测试、荷瘤鼠相对肿瘤体积变化及相对体重变化、肿瘤组织切片H&E和TUNEL染色、体内生物分布测试对制备的纳米颗粒¹³¹I-Au PHCNPs的靶向肿瘤成像性能、体内靶向肿瘤放射性核素治疗效果以及生物安全性进行评估。具体如下：

1、取实施例1制备的Au PHCNPs纳米颗粒，溶解在水中，通过紫外分光光度计测定其在400-900 nm波段的紫外吸收。结果表明，制备得到的Au PHCNPs颗粒在534 nm处出现特征吸收峰，这归因于金纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR），证明成功制备得到金纳米颗粒，参见说明书附图5d。TEM图片表明金纳米颗粒具有球形形貌，直径3.65 ± 0.84 nm，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。SAED测试结果证明了其面心立方晶体结构，同时用EDS进一步证明了产物中金元素的存在。这些测试结果表明已成功制备得到Au PHCNPs纳米颗粒，参见说明书附图6。

2、以紫外可见吸收光谱图对材料的稳定性进行分析，取实施例1制备得到的AuPHCNPs纳米颗粒配制为0.2 mg/mL的溶液，分别测定其在pH为5、6、7、10条件下，温度为6℃、25℃、37℃、50℃的条件下以及在不同时间点（第1、3、5、7天）下的紫外可见吸收光谱。从谱图中可见其峰型一致，无偏移现象，说明Au PHCNPs纳米颗粒在不同pH、不同温度条件以及较长时间内，都能保持良好的胶体稳定性，参见说明书附图7。取实施例1制备的Au PHCNPs纳米颗粒，分别分散在水和PBS中并稀释，得到0.1 mg/mL的分别以水和PBS为介质的溶液。然后采用DLS法测定了其分散在PBS和水中的Au PHCNPs在不同时间点的水动力学尺寸分布。可以发现，Au PHCNPs纳米颗粒的水合粒径和PDI没有明显变化，说明分散在水和PBS中的Au PHCNPs纳米颗粒能在一定时间段内维持良好的胶体稳定性和均匀性，参见说明书附图8。

3、将制备的Au PHCNPs溶解在水溶液中，配制200 μL金浓度为 0.1 M、0.08 M、0.04 M、0.02 M、0.01 M的溶液。同时，以临床上常用的小分子碘造影剂欧乃派克作为对照。将医用欧乃派克分别稀释为碘浓度为 0.1 M、0.08 M、0.04 M、0.02 M、0.01 M的溶液，然后，使用临床医用CT成像系统测定Au PHCNPs和欧乃派克的CT成像图和CT信号值，并比较AuPHCNPs和欧乃派克的X射线衰减系数。结果显示，在相同的金或碘浓度下，Au PHCNPs的X射线衰减强度都要高于欧乃派克。结果表明，制备得到的Au PHCNPs纳米颗粒具有比欧乃派克更高的X射线衰减系数，更优异的CT成像性能，参见说明书附图9。

4、在标记¹³¹I之后，使用ITLC评估得到的产物¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs放射性稳定性。将100 μL的放射性标记物¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs分别与1 mL PBS、FBS混合，之后利用ITLC分别测试在不同时间点（0.5、4、8、16 h）的，室温下¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs的PBS溶液，以及37℃下¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs的FBS溶液的放射性化学纯度。结果显示，在PBS和FBS两种体系中，在不同时间点下，¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs的放射性化学纯度均在94%以上，这表明未有大量的¹³¹I从载体上脱落下来，即制备的¹³¹I-Au PCNPs和¹³¹I-Au PHCNPs具有良好的体外放射性稳定性，参见说明书附图10。

5、以流式细胞术来检测制备得到的Au PHCNPs纳米颗粒对CD44受体过表达4T1细胞的靶向特异性。首先将4T1细胞接种于12孔板（2 × 10⁵细胞/孔），孵育24 h后将培养基倒掉，并将所得细胞分为两组，一组加入含有HA（10 mg/mL）的培养基，另一组加入等量纯培养基，孵育1 h后分别得到4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞。取实施例1制备得到的AuPHCNPs纳米颗粒以及对比实施例1制备得到的Au PCNPs纳米颗粒，分散在培养基中（材料终浓度为5 μM）。然后用分别含有PBS、Au PCNPs和Au PHCNPs的培养基（200 μL）分别孵育4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞2 h，结束后用PBS洗涤三次。随后用胰蛋白酶消化悬浮细胞，离心收集得到PBS处理的4T1-HCD44细胞、Au PCNPs处理的4T1-LCD44和4T1-HCD44细胞、AuPHCNPs处理的4T1-LCD44和4T1-HCD44细胞，共5组细胞，每组三个平行样。然后将收集到各组细胞悬浮于1 mL PBS中，并使用流式细胞仪测定各组细胞样品。结果显示，与PBS组细胞荧光强度相比，经Au PCNPs孵育2 h后，4T1-LCD44和4T1-HCD44细胞的荧光强度未见提高，而经Au PHCNPs孵育的4T1-HCD44细胞的荧光强度明显增强，并且显著高于Au PHCNPs孵育的4T1-LCD44细胞的荧光强度（p < 0.001）。基于HA介导的靶向性，Au PHCNPs可以实现CD44受体高表达的癌细胞靶向特异性摄取，参见说明书附图11。

6、以激光扫描共聚焦显微镜来进一步证明制备得到的Au PHCNPs纳米颗粒对CD44受体过表达4T1细胞的靶向特异性。首先将4T1细胞接种于放置有盖玻片的12孔板（8 ×10⁴细胞/孔），孵育24 h后将培养基倒掉，将所得细胞分为两组，一组加入含有HA（10 mg/mL）的培养基，另一组加入等量纯培养基，孵育1 h后分别得到4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞。然后分别用含有PBS、Au PCNPs、Au PHCNPs的培养基（材料浓度5 μM）孵育4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞2 h。孵育结束后倒出培养基并用PBS洗涤三次，然后每孔加入2.5%戊二醛500 μL固定15 min，再用PBS洗2-3次，加入500 μL的DAPI（1 μg/mL）试剂染色20 min后，用PBS洗2-3次，最后将盖玻片上的细胞封片至载玻片上，在激光扫描共聚焦显微镜下拍摄。通过激光扫描共聚焦显微镜图片可清晰的看到，经Au PCNPs孵育的4T1-LCD44、4T1-HCD44细胞以及经Au PHCNPs孵育的4T1-LCD44细胞，均未见明显的荧光信号，而经AuPHCNPs孵育的4T1-HCD44细胞显示出较强的红色荧光信号，且荧光主要分布在细胞质内。结果表明，Au PHCNPs可以被4T1-HCD44细胞特异性摄取进入细胞质。同时，基于HA与CD44受体特异性结合特性，使得4T1-HCD44细胞对Au PHCNPs的摄取量增加。该结果与流式细胞术测试结果相一致，参见说明书附图12。

7、为进一步验证HA的修饰可以提高Au PHCNPs纳米颗粒对CD44受体过表达癌细胞的靶向性，可以增加癌细胞对Au PHCNPs纳米颗粒的摄取，通过ICP-OES检测4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞分别经不同金浓度的Au PHCNPs纳米颗粒孵育后的金摄取量。首先将4T1细胞接种于12孔板（2 × 10⁵细胞/孔），孵育24 h后将培养基倒掉，并将所得细胞分为两组。一组加入含有HA（10 mg/mL）的培养基，另一组加入等量纯培养基，孵育1 h后分别得到4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞。取实施例1制备得到的Au PHCNPs纳米颗粒溶解在培养基中，并逐步进行稀释，得到金浓度分别为25、50、100 μM的Au PHCNPs的培养基溶液。然后用含有PBS以及不同金浓度的Au PHCNPs的培养基分别孵育4T1-LCD44细胞和4T1-HCD44细胞2h，结束后用PBS洗涤三次。随后用胰蛋白酶消化细胞，并将细胞悬浮于1 mL细胞培养基中，进行细胞计数。最后，离心收集细胞，并用王水消化，待裂解完全再加入蒸馏水中将其稀释至3 mL，利用ICP-OES来测试各细胞样品中金元素含量。结果表明，随着金浓度提高，两细胞对Au PHCNPs纳米颗粒的摄取量也逐渐增加。其中，在金浓度为50 μM、100 μM时，4T1-HCD44细胞的金摄取量要显著高于4T1-LCD44细胞的金摄取量（p < 0.001）。该结果与流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜结果一致，证明由于HA介导的对CD44受体过表达癌细胞的靶向特性，可实现4T1-HCD44细胞对Au PHCNPs纳米颗粒的高量摄取，参见说明书附图13。

8、为了检测制备得到的HA靶向的Au PHCNPs材料的体外生物相容性以及¹³¹I-AuPHCNPs材料的细胞毒性，采用CCK-8法来测定分别经不同金浓度的Au PCNPs、Au PHCNPs和不同放射性浓度的¹³¹I-Au PCNPs 、¹³¹I-Au PHCNPs孵育24小时后的4T1细胞的细胞活力。将4T1细胞接种于96孔板（1×10⁴细胞/孔），并用200 μL添加有10%胎牛血清的培养基孵育过夜。然后分别用不同金浓度（0、5、10、20、50和100 μM）的Au PHCNPs、Au PCNPs和不同放射性浓度（0、10、25、50、100、200 μCi/mL）的¹³¹I-Au PHCNPs、¹³¹I-Au PCNPs处理细胞24 h。随后采用CCK-8法测定细胞在450 nm波长处的吸光度以评估材料对细胞的毒性。结果显示，在一定的金浓度范围内，经Au PCNPs、Au PHCNPs孵育细胞的细胞活力均维持在90%以上，表明材料Au PHCNPs以及Au PCNPs具有良好的生物相容性，参见说明书附图14a。材料¹³¹I-AuPHCNPs和¹³¹I-Au PCNPs表现出明显的细胞毒性，且在放射性浓度为100 μCi/mL、200 μCi/mL时，经¹³¹I-Au PHCNPs处理后的4T1细胞的细胞活力显著低于¹³¹I-Au PCNPs处理后的4T1细胞的细胞活力（p < 0.001）。结果表明，¹³¹I-Au PHCNPs的细胞毒性主要源自于标记的放射性核素¹³¹I，同时基于HA介导的靶向性，¹³¹I-Au PHCNPs被CD44受体过表达的4T1细胞特异性摄取，进而实现体外靶向癌细胞抗癌效果，参见说明书附图14b。

同样地，4T1细胞分别经不同金浓度（20和100 μM）的Au PHCNPs、Au PCNPs和不同放射性浓度（50和200 μCi/mL）的¹³¹I-Au PHCNPs、¹³¹I-Au PCNPs孵育24 h后，通过倒置式生物显微镜观察其细胞形态，来进一步验证Au PCNPs、 Au PHCNPs的生物相容性和¹³¹I-AuPCNPs、¹³¹I-Au PHCNPs的体外靶向癌细胞抗癌效果。结果显示，经PBS和Au浓度为20、100 μM的Au PHCNPs、Au PCNPs孵育后的4T1细胞形态良好。经放射性浓度为50、200 μCi/mL的¹³¹I-Au PHCNPs、¹³¹I-Au PCNPs孵育后的4T1细胞，细胞变圆，具有明显的凋亡迹象。且在放射性浓度为200 μCi/mL时，¹³¹I-Au PHCNPs处理后的4T1细胞凋亡数量显著多于¹³¹I-Au PCNPs处理后的4T1细胞凋亡数量。结果表明，¹³¹I的标记赋予了材料良好的癌细胞放射性核素治疗效果，同时基于HA介导的靶向性，¹³¹I-Au PHCNPs可以被CD44受体过表达的4T1细胞特异性高量摄取，实现体外靶向癌细胞抗癌效果，参见说明书附图15。

9、基于材料Au PHCNPs良好的X射线衰减特性，以及体外对CD44受体过表达癌细胞靶向性，将测试Au PHCNPs体内靶向肿瘤CT成像性能。选取4-6周的成年雌性BALB/c裸鼠（20-25 g）分为两组（n = 3），皮下接种4T1细胞（3 × 10⁶细胞/鼠），待3周后肿瘤生长至0.5-1.2 cm³，即可用于体内靶向肿瘤CT成像研究。首先将戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射至两组荷瘤鼠进行麻醉，之后采取尾静脉注射方式将Au PHCNPs（[Au] = 68.4 mM, 100 μL）的PBS溶液注射至一组荷瘤鼠体内，将Au PCNPs（[Au] = 68.4 mM, 100 μL）的PBS溶液注射至另一组荷瘤鼠体内。在不同时间点下（0、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24 h）通过MicroCT成像系统扫描荷瘤鼠，进行体内CT成像。从图中可以看到，分别经Au PHCNPs和Au PCNPs处理的两组荷瘤鼠肿瘤部位的CT图像亮度以及相应的CT信号值都呈现先增强后减弱的趋势，在6 h时达到峰值。且在注射后6 h，经Au PHCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位CT信号值显著高于经Au PCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位CT信号值（p < 0.001）。结果表明，基于HA介导的靶向性，HA修饰的Au PHCNPs能特异性地递送至肿瘤部位，并在肿瘤部位高量富集，实现体内靶向肿瘤CT成像，参见说明书附图16。

10、前述结果已经证明，Cy7的修饰赋予了Au PHCNPs和Au PCNPs优异的体外荧光成像性能，同时基于已经证明的Au PHCNPs对CD44受体过表达癌细胞的靶向特异性，将测试Au PHCNPs的体内靶向肿瘤荧光成像性能。采用前述方法建立肿瘤模型，荷瘤鼠分为两组（n= 3）。将所有荷瘤鼠麻醉，之后采取尾静脉注射方式，将Au PHCNPs（5 nmol，100 μL）的PBS溶液注射至一组荷瘤鼠体内，将Au PCNPs（5 nmol，100 μL）的PBS溶液注射至另一组荷瘤鼠体内。在不同的时间点（0.5、1、2、4、6、8、12、16、24 h）使用活体成像系统（IVIS）对荷瘤鼠进行荧光成像（EX = 730-750 nm，EM = 750-780 nm）并记录目标部位荧光值。在注射材料24h后，将两组荷瘤鼠安乐死，并获取主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤组织，进行荧光成像并记录相应的荧光强度值。体内FL成像结果显示，在给药后6 h，分别经Au PHCNPs和AuPCNPs处理的4T1荷瘤鼠肿瘤部位的荧光亮度以及相应的荧光信号值都达到峰值，且经AuPHCNPs处理的4T1荷瘤鼠肿瘤部位的荧光信号强度显著高于经Au PCNPs处理的4T1荷瘤鼠肿瘤部位的荧光信号强度（p < 0.001）。T/M值定量分析结果显示，在注射后4和6 h经AuPHCNPs处理的4T1荷瘤鼠的T/M值均显著高于经Au PCNPs处理的4T1荷瘤鼠的T/M值（p <0.001）。同时，对离体各器官和肿瘤的荧光成像以及相应荧光信号强度值定量分析结果显示，除肿瘤外材料在肝、肺、肾器官也有较高摄取。另外可以清楚地看到，经Au PHCNPs处理的4T1荷瘤鼠肿瘤部位的荧光亮度以及荧光信号强度值均显著高于经Au PCNPs处理的4T1荷瘤鼠。以上结果表明，基于HA介导的靶向作用，Au PHCNPs可以特异性地递送至肿瘤部位，并在肿瘤部位高量富集，进而实现更高灵敏度的体内靶向肿瘤FL成像，参见说明书附图17。

11、基于制备的材料¹³¹I-Au PHCNPs良好的放射性稳定性，以及体外对CD44受体过表达癌细胞的靶向性，将进一步测试¹³¹I-Au PHCNPs体内靶向肿瘤SPECT成像性能。采用前述方法建立肿瘤模型，荷瘤鼠分为两组（n = 3）。将荷瘤鼠麻醉，之后采取尾静脉注射方式，将¹³¹I-Au PHCNPs（[¹³¹I] = 2.5 mCi/mL, 100 μL）的PBS溶液注射至一组荷瘤鼠体内，将¹³¹I-Au PCNPs（[¹³¹I] = 2.5 mCi/mL, 100 μL）的PBS溶液注射至另一组荷瘤鼠体内。在不同时间点下（0.5、1、2、4、6、8、12、16、24 h）使用SPECT成像系统扫描荷瘤鼠，进行体内SPECT成像，并记录相应时间点下肿瘤与背景的SPECT信号值，以获得TBR值。在注射后24 h，将两组荷瘤鼠安乐死，收集并用伽马计数器测试主要器官（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、软组织）和肿瘤的放射性强度。最后对获得的两组荷瘤鼠的离体肿瘤进行单独SPECT成像，并记录相应的相对SPECT信号强度。从体内SPECT成像图可以看到，给药后6 h，经¹³¹I-Au PHCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位的信号值明显高于经¹³¹I-Au PCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位的信号值。TBR值定量分析结果显示，相比于经¹³¹I-Au PCNPs处理的荷瘤鼠，在研究的时间范围内（0.5-24h），经¹³¹I-Au PHCNPs处理的荷瘤鼠具有更高的TBR值。离体肿瘤以及各器官的放射性强度定量分析结果显示，大量的¹³¹I-Au PHCNPs和¹³¹I-Au PCNPs分布在肝和肠中，少量分布在肺、胃、脾、肾和肿瘤中，在心脏和软组织中分布更少，且¹³¹I-Au PHCNPs在肿瘤部位的积累要显著高于¹³¹I-Au PCNPs在肿瘤部位的积累，因此¹³¹I-Au PHCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位具有更高的放射性强度（p < 0.001）。最后离体肿瘤SPECT成像以及相对信号强度定量分析结果显示，经¹³¹I-Au PHCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位的SPECT信号更强，其肿瘤部位的相对SPECT信号强度显著高于经¹³¹I-Au PCNPs处理的荷瘤鼠肿瘤部位的相对SPECT信号强度（p< 0.001）。以上结果表明，基于HA介导的靶向作用，¹³¹I-Au PHCNPs可以被特异性地递送至肿瘤部位，实现较为灵敏的体内靶向肿瘤SPECT成像，参见说明书附图18。

12、采用前述方法建立肿瘤模型，待肿瘤体积生长至0.5-1.2 cm³时将30只荷瘤鼠随机分为6组（n = 5）。随后采取尾静脉注射的方式，分别将¹³¹I-Au PHCNPs（[¹³¹I] = 1.0mCi/mL, 200 μL）、¹³¹I-Au PCNPs（[¹³¹I] = 1.0 mCi/mL, 200 μL）、Au PHCNPs（200 μL与¹³¹I-Au PHCNPs浓度相同）、Au PCNPs（200 μL与¹³¹I-Au PCNPs浓度相同）、Na¹³¹I（[¹³¹I] =1.0 mCi/mL, 200 μL）的生理盐水溶液以及生理盐水（200 μL）注射至6组荷瘤鼠体内，每3天注射一次。于注射前用数显游标卡尺测量一次所有荷瘤鼠的肿瘤尺寸和体重，之后每3天测量一次肿瘤尺寸及体重，并计算肿瘤体积（V = L × W²/2，L为肿瘤长径，W为肿瘤短径）以及相对肿瘤体积（RTV = V_t/V₀，V₀为分笼给药前测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积），以评估荷瘤鼠肿瘤体积和体重变化。

荷瘤鼠分别经¹³¹I-Au PHCNPs、¹³¹I-Au PCNPs、Au PHCNPs、Au PCNPs、Na¹³¹I的生理盐水溶液以及生理盐水治疗处理21天后，将荷瘤鼠安乐死，解剖荷瘤鼠获取肿瘤组织。随后将离体肿瘤依次用10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋，然后制备得到厚度为4 μm的相应的组织切片。最后通过H&E以及TUNEL染色法处理得到的组织切片，在光学显微镜下拍摄并采集所有染色图像，然后用ImageJ软件对随机选取区域内的TUNEL阳性细胞进行统计分析，以获得肿瘤细胞凋亡率。

相对肿瘤体积以及体重定量分析结果显示，¹³¹I-Au PHCNPs治疗组的荷瘤鼠有着最慢的肿瘤生长速度，且在治疗周期结束后，¹³¹I-Au PHCNPs治疗组荷瘤鼠的相对肿瘤体积远小于其他各治疗组荷瘤鼠的相对肿瘤体积。且各治疗组荷瘤鼠体重以及体重变化趋势几乎一致。以上结果表明，基于HA介导的靶向作用，¹³¹I-Au PHCNPs显示出优异的体内靶向肿瘤放射性核素治疗效果，且制备的材料对荷瘤鼠的体重几乎没有影响，参见说明书附图19。为进一步评估制备材料的体内靶向抗肿瘤效果，对获得的离体肿瘤切片进行H&E、TUNEL染色，并统计肿瘤细胞凋亡数量（TUNEL阳性细胞）。可以看到，与其他治疗组相比，¹³¹I-AuPHCNPs治疗组显示出最多的肿瘤细胞凋亡数量。定量分析结果显示，¹³¹I-Au PHCNPs治疗组荷瘤鼠的肿瘤细胞凋亡率显著高于¹³¹I-Au PCNPs治疗组荷瘤鼠的肿瘤细胞凋亡率，参见说明书附图20、21。以上结果表明，诱导肿瘤细胞凋亡的作用主要来自于¹³¹I的放射性核素治疗效果，且基于HA介导的靶向作用，使得¹³¹I-Au PHCNPs能够被特异性递送至肿瘤部位，进而展现出体内靶向抗肿瘤效果。

13、在验证了¹³¹I-Au PHCNPs的体内外SPECT/CT/FL多模态成像以及放射性核素治疗效果后，基于材料中金的存在，通过测试体内各主要器官（心、肝、脾、肺、肾）及肿瘤组织在不同时间点（24、48、72 h）的金含量，以评估材料在体内的代谢情况。采用前述方法建立肿瘤模型，将12只荷瘤鼠分为四组（n = 3），分别在尾静脉注射Au PHCNPs后不同时间点（0、24、48、72 h）处死各组荷瘤鼠，获取主要器官及肿瘤组织并称重。最后将各器官及肿瘤组织用王水消化，通过ICP-OES测量各组织脏器中金含量，并进行定量化分析。可以看到，在注射后72 h，各器官的金浓度已经接近甚至达到注射前水平。结果表明，制备的材料能够很好地被代谢出体外，而不会在体内长期滞留，参见说明书附图22。

Claims

1.一种近红外荧光染料Cy7修饰的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒复合材料，其特征在于：由以下步骤制备得到：

步骤2，向透明质酸HA溶液中加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS进行活化，然后加入步骤1制得的PEI.NH₂-PEG-NH₂，搅拌反应，制得PEI.NH₂-(PEG-HA)；

步骤5，向步骤4制得的PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO中加入氯金酸溶液，搅拌反应20-40分钟后快速加入硼氢化钠溶液进行反应，然后加入三乙胺，反应20-40分钟后，再加入乙酸酐，搅拌反应，制得纳米颗粒Au PHCNPs；

2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤1中，EDC和NHS的物质的量之和与NH₂-PEG-COOH的物质的量之比为5：1，EDC和NHS的物质的量之比为1：1，NH₂-PEG-COOH与PEI.NH₂的物质的量之比为20：1，搅拌反应的时间为3天。

3.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤2中，EDC和NHS的物质的量之和与HA的物质的量之比为5：1，EDC和NHS的物质的量之比为1：1，HA与PEI.NH₂-PEG-NH₂的物质的量之比为30：1；搅拌反应的时间为3天。

4.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤3中HPAO与PEI.NH₂-(PEG-HA)的物质的量之比为10:1；搅拌反应的时间为1-2天。

5.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤4中Cy7与PEI.NH₂-(PEG-HA)-HPAO的物质的量之比为16:1；搅拌反应的时间为3天。

6.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤5中氯金酸和硼氢化钠的物质的量之比为1:5，氯金酸与PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的物质的量之比为100:1；三乙胺、乙酸酐和PEI.NH₂-(PEG-HA)-Cy7-HPAO的物质的量之比为120-660:100-550:1；搅拌反应的时间为24h。

7.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤6中Na¹³¹I放射性活性为185-365MBq。

8.权利要求1所述的复合材料在制备肿瘤诊疗试剂中的应用。