CN115814107A - 一种具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒，属于制药技术领域。该纳米粒为微球结构，以聚乳酸‑羟基乙酸共聚物为基体材料，用阿仑膦酸钠进行表面修饰，辛伐他汀被物理包裹或吸附在微球表面。制备过程为：用交联耦合剂将阿仑膦酸钠的羟基与聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的羧基进行酯化反应嫁接得到阿仑膦酸钠/聚乳酸‑羟基乙酸嫁接物，之后与聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、辛伐他汀磷脂复合物采用乳化溶剂挥发法制备得到该纳米粒。本发明的纳米粒可以将辛伐他汀药物定向集中的分布于骨组织上，同时利用阿仑膦酸钠抑制骨吸收作用，从而达到抑制骨吸收与促进骨形成的双重效果，可有效治疗骨质疏松症。
Description
技术领域
本发明涉及一种具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒，属于制药技术领域。
背景技术
目前临床上用于治疗骨质疏松的药物多作用于破骨细胞，可抑制骨的吸收而不促进骨的形成，因此只能适当减缓骨质疏松症状，存在无法逆转骨量与修复已遭到破坏的骨组织的问题。例如，现有技术常用的阿仑膦酸钠(Alendronate Sodium,ALN)就是通过抑制破骨细胞活性达到抑制骨吸收的作用。另外他汀类药物也被用来治疗骨质疏松，其中辛伐他汀(Simvastatin,SIM)具有刺激骨形成的作用，有强大的诱导成骨细胞分化的能力，但是此药物本身在人体内生物利用度较低，也不具备骨组织靶向性，临床治疗过程中往往只能通过加大辛伐他汀药物用量来提高骨组织之间药物的浓度，但是会给人体内其他器官造成毒副作用。可见现有用于治疗骨质疏松的药物仍存在生物安全性较低、治标不治本的问题。
因此，提供一种具有骨组织靶向性且可实现有效治疗的药物对治疗骨质疏松具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒，该纳米粒可以实现辛伐他汀的有效骨组织传递，具有抑制骨吸收并促进骨形成的双重效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒，所述纳米粒为微球结构，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为基体材料，用阿仑膦酸钠进行表面修饰，辛伐他汀被物理包裹或吸附在微球表面。
本发明提供了一种所述具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将阿仑膦酸钠(ALN)的羟基与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA2000)的羧基进行酯化反应嫁接，得到阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)，采用乳化溶剂挥发法，将辛伐他汀磷脂复合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA15000)和阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)混合后加入二氯甲烷作为油相，聚乙烯醇(PVA)作为水相，将所述油相与所述有机相注入水相并剪切形成初乳，超声制备终乳，接着减压旋蒸将体系内大部分二氯甲烷挥干，此时在乳液中PLGA高分子材料并不溶于水，在二氯甲烷大量挥发的同时逐渐固化，形成纳米粒，而同样不溶于水的药物辛伐他汀则被物理包裹，最后将纳米粒溶液磁力搅拌过夜，使得残余的二氯甲烷挥发完全，同时使PLGA形成的纳米粒能够得到充分的固化，磁力搅拌后离心得到具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒(SIM/ALN-PLGANP)。
进一步地，所述阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)的制备方法包括以下步骤：以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)为交联耦合剂，引发聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA2000)的末端羧基和阿仑膦酸钠(ALN)之间的羟基发生酯化反应，得到阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接产物(ALN-PLGA2000)。
进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA2000)与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)的用量摩尔比为1:1.5:1.5，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA2000)与所述阿仑膦酸钠(ALN)的用量摩尔比为1:1.3。
进一步地，所述酯化反应温度为60℃，反应时间为30min，以活化聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA2000)的羧基。
进一步地，所述辛伐他汀磷脂复合物的制备方法包括以下步骤：用二氯甲烷溶解大豆卵磷脂与辛伐他汀，在40℃减压旋蒸得到辛伐他汀磷脂复合物，所述大豆卵磷脂与辛伐他汀的质量比为2：1。
进一步地，所述乳化溶剂挥发法中，辛伐他汀磷脂复合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA15000)和阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)的用量摩尔比为3:16:4。
进一步地，所述剪切条件为20000rpm，所述减压旋蒸的温度为40℃，目的是挥发二氯甲烷，防止二氯甲烷倒吸，所述磁力搅拌后离心的条件为20000rpm下离心3-5min。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒，所述纳米粒为微球结构，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为基体材料，用阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物进行表面修饰，辛伐他汀被物理包裹或吸附在微球表面。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的基体材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，是一种具有良好生物相容性的无毒且无免疫原性的高分子材料，具有良好的成囊和成膜特性，可在体内生物降解为CO2和水，所以利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为药物载体制备得到的药物组合物纳米粒对人体无任何毒副作用。
本发明以EDC和HOBT为交联耦合剂，将阿仑膦酸钠的羟基与聚乳酸-羟基乙酸的羧基进行酯化反应嫁接，在药物组合物纳米粒的制备过程中，阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物的疏水端PLGA2000会插入到纳米粒核心内部，而阿仑膦酸钠作为亲水端则游离在药物组合物纳米粒表面，起到骨靶向修饰作用，聚乳酸-羟基乙酸共聚物包覆着辛伐他汀药物，实现辛伐他汀药物更定向集中的分布于骨组织上，从而降低对其他器官的毒副作用，同时利用阿仑膦酸钠抑制骨吸收作用，从而达到抑制骨吸收与促进骨形成的双重效果。
本发明制备的纳米粒可以有效提高骨质疏松症患者的骨密度，该药物在制备过程中用到的原料安全无毒，制备过程简单，适合批量化生产，为骨质疏松症的研究与治疗进一步提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的SIM/ALN-PLGA NP的结构示意图；
图2为ALN的核磁共振氢谱图；
图3为PLGA2000的核磁共振氢谱；
图4为ALN-PLGA2000的核磁共振氢谱图；
图5为实施例1制备得到的纳米粒的透射电镜图；
图6为实施例2制备得到的纳米粒的透射电镜图；
图7为实施例3制备得到的纳米粒的透射电镜图；
图8为实施例4制备得到的纳米粒的透射电镜图；
图9为实施例1制备得到的纳米粒子中辛伐他汀的高效液相色谱图；
图10为实施例3制备得到的纳米粒子中辛伐他汀的高效液相色谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所使用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA2000)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA15000)、阿仑膦酸钠(ALN)、二氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙烯醇(PVA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)均为市售购买得到，聚乙烯醇(PVA)现用现配。
本发明所述的高效液相测定方法、有机溶剂破坏提取法均为本领域的常规技术手段，且并非发明要点，在此不做赘述。
以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒(SIM/ALN-PLGA NP)的制备
阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)的制备：将500mg的PLGA2000，72mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，50mg的1-羟基苯并三唑(HOBT)混合(PLGA2000：EDC：HOBT三者投料摩尔比1：1.5：1.5)，加入20ml无水DMF后60℃搅拌，使反应物全部溶解并保温30min。再加入312mg阿仑膦酸钠(PLGA2000与阿仑膦酸钠投料摩尔比为1：1.3)，60℃继续反应24h，用去离子水透析48小时，4000rpm离心10min并清洗得阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)。
辛伐他汀磷脂复合物的制备：准确称取大豆卵磷脂10mg，辛伐他汀5mg，置于梨形瓶中加入4ml二氯甲烷，待辛伐他汀与大豆卵磷脂全部溶解后，将圆底烧瓶置于减压旋转蒸发仪上40℃减压旋蒸，使二氯甲烷挥发完全即得辛伐他汀磷脂复合物。
治疗骨质疏松症的纳米粒(SIM/ALN-PLGA NP)的制备：将80mgPLGA15000，20mg阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)与上述制备的辛伐他汀磷脂复合物混合，加入2ml二氯甲烷作为油相，聚乙烯醇(PVA)配制成2％(w/v)的水溶液作为水相，将2ml二氯甲烷油相在20000rpm高速剪切力的作用下，缓慢注入10ml的聚乙烯醇(PVA)水相中，之后继续保持20000rpm高速剪切10min，再超声10min。超声结束加入梨形瓶中，40℃减压旋蒸除去二氯甲烷后产物400rpm磁力搅拌过夜，所得悬液20000rpm离心5min，清洗得最终产物治疗骨质疏松症的纳米粒(SIM/ALN-PLGA NP)，图1为本发明实施例1制备的SIM/ALN-PLGA NP的结构示意图。
实施例2阿仑膦酸钠嫁接的靶向PLGA纳米粒(ALN-PLGA NP)的制备
阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)的制备方法同实施例1。
将80mg PLGA15000，20mg阿仑膦酸钠-聚(乳酸羟基乙酸)嫁接物(ALN-PLGA2000)加入2ml二氯甲烷制成油相，聚乙烯醇(PVA)配制成2％(w/v)的水溶液作为水相。将2ml二氯甲烷油相在20000rpm高速剪切力的作用下，缓慢注入聚乙烯醇(PVA)10ml的水相中，之后继续保持高速剪切10min，再超声10min，超声结束加入梨形瓶中，40℃减压旋蒸除去二氯甲烷后产物400rpm磁力搅拌过夜，所得悬液20000rpm离心5min，清洗得最终产物阿仑膦酸钠嫁接的靶向PLGA纳米粒(ALN-PLGA NP)。
实施例3载辛伐他汀的PLGA纳米粒(SIM/PLGA NP)的制备辛伐他汀磷脂复合物的制备方法同实施例1。
80mg PLGA15000，20mgPLGA2000与上述制备的药物磷脂复合物混合，加入2ml二氯甲烷作为油相，聚乙烯醇(PVA)配制成2％(w/v)的水溶液作为水相，将2ml二氯甲烷油相在20000rpm高速剪切力的作用下，缓慢注入10ml的聚乙烯醇(PVA)水相中，之后继续保持高速剪切10min，再超声10min，超声结束加入梨形瓶中，40℃减压旋蒸除去二氯甲烷后产物400rpm磁力搅拌过夜，所得悬液20000rpm离心5min，清洗得最终产物载辛伐他汀的PLGA纳米粒(SIM/PLGA NP)。
实施例4普通不载药PLGA纳米粒(PLGA NP)的制备
将80mg PLGA15000，20mgPLGA2000，加入2ml二氯甲烷制成油相，聚乙烯醇配制成2％(w/v)的水溶液作为水相，将2ml油相在20000rpm高速剪切力的作用下，缓慢注入10ml的聚乙烯醇水相中，之后继续保持高速剪切10min，再超声10min，超声结束加入梨形瓶中，40℃减压旋蒸除去二氯甲烷后产物400rpm磁力搅拌过夜，所得悬液20000rpm离心5min，清洗得最终产物普通不载药PLGA纳米粒(PLGA NP)。
性能测试：
a.实施例1制备得到的阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)核磁共振分析
利用核磁共振仪对实施例1制备得到的阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)的结构进行确证。分别取PLGA2000和阿仑膦酸钠各10mg溶于0.5ml氘代二甲基亚砜中，使其最终浓度为20mg/ml；取实施例1制备得到的阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物(ALN-PLGA2000)25mg溶于0.5ml氘代二甲基亚砜中，使其最终浓度为50mg/ml，用核磁共振仪记录核磁共振图谱，通过对比阿仑膦酸钠与PLGA2000的核磁共振氢谱，对嫁接物ALN-PLGA2000的特征峰进行结构分析。ALN的核磁共振氢谱图见图2，PLGA2000的核磁共振氢谱图见图3，ALN-PLGA2000的核磁共振氢谱图见图4。
b.形态测定
取实施例1-4制备得到的纳米粒，分别分散在去离子水中，以2％(w/v)的磷钨酸溶液作为染色剂将50ug/ml的各纳米粒溶液加在碳支持膜上，染色后室温下自然晾干，透射电镜观察各纳米粒的形态及大小。实施例1-4制备得到的纳米粒的透射电镜图分别见图5-8。
c.实施例1与实施例3制备得到的纳米粒子载辛伐他汀药量及包封率的测定
使用高效液相测定方法(HPLC)测定载药量，色谱条件：色谱柱为Diamonsil TC18；流动相为25mM磷酸二氢钠水溶液一乙腈；流速1ml/min；柱温：30℃；检测波长：239nm；进样量：100μL。采用标准曲线测定辛伐他汀的含量，标准曲线制备方法如下：称取辛伐他汀原料药10mg，置于10ml容量瓶中，取甲醇滴加至刻度，摇匀，即得1.0mg/ml的辛伐他汀甲醇溶液；接着取lmg/ml的辛伐他汀甲醇溶液用流动相稀释成一系列浓度，通过HPLC检测其色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，辛伐他汀浓度为横坐标，绘制得到辛伐他汀标准曲线，用于测定药物含量。实施例1制备得到的纳米粒子中辛伐他汀的高效液相色谱图见图9，实施例3制备得到的纳米粒子中辛伐他汀的高效液相色谱图见图10，由图9和10可以看出，辛伐他汀在18分钟左右开始出峰，19分钟左右结束。
采用有机溶剂破坏提取法测定实施例1与实施例3制备得到的纳米粒子载辛伐他汀药量及包封率，测定结果见表1。
表1实施例1与实施例3制备得到的纳米粒子载辛伐他汀药量及包封率
通过表1数据，说明本发明技术方案制备得到的SIM/ALN-PLGANP仍具有较高的包封率及载药量，ALN的加入对包封率及载药量没产生影响。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将阿仑膦酸钠的羟基与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的羧基进行酯化反应嫁接，得到阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物；采用乳化溶剂挥发法，将辛伐他汀磷脂复合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物混合后加入二氯甲烷作为油相，聚乙烯醇作为水相，将所述油相注入所述水相并剪切，超声、减压旋蒸，磁力搅拌后离心，制备得到所述具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物的制备方法包括以下步骤：以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑为交联耦合剂，引发聚乳酸-羟基乙酸共聚物的末端羧基和阿仑膦酸钠之间的羟基发生酯化反应，得到阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑的用量摩尔比为1:1.5:1.5，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与所述阿仑膦酸钠的用量摩尔比为1:1.3。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酯化反应温度为60℃，反应时间为30min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辛伐他汀磷脂复合物的制备方法包括以下步骤：用二氯甲烷溶解大豆卵磷脂与辛伐他汀，减压旋蒸得到辛伐他汀磷脂复合物。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳化溶剂挥发法中，所述辛伐他汀磷脂复合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸嫁接物的用量摩尔比为3:16:4。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述剪切条件为20000rpm，所述减压旋蒸的温度为40℃，所述磁力搅拌后离心的条件为20000rpm下离心3-5min。
8.一种权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的具备骨靶向的治疗骨质疏松症的纳米粒。
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