CN115814009B

CN115814009B - 一种启宫丸在制备治疗有机污染物暴露的痰湿型不孕症的药物中的应用

Info

Publication number: CN115814009B
Application number: CN202211231558.1A
Authority: CN
Inventors: 李妍; 王英骥; 陈静; 李威
Original assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Current assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Priority date: 2022-10-09
Filing date: 2022-10-09
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-10-09
Also published as: CN115814009A

Abstract

一种启宫丸在有机污染物暴露的痰湿型不孕症中的应用，它涉及医药领域，本发明的目的是为了提供一种启宫丸对有机污染物p,p＇‑DDE暴露的痰湿型不孕症应用。本发明发现p,p＇‑DDE与痰湿型不孕症的相关性，并提出了中药复方启宫丸对p,p＇‑DDE生殖毒性的拮抗作用。本发明采用启宫丸，对于p,p＇‑DDE暴露的痰湿型不孕症有显著的治疗效果。并通过动物实验，从中药抗氧化作用及纠正p,p＇‑DDE不良影响两方面阐明启宫丸治疗痰湿型不孕症及拮抗p,p＇‑DDE生殖毒性的作用和机制。为使用中药复方启宫丸的新用途降低环境污染物对机体的不良影响提供证据支持。

Description

一种启宫丸在制备治疗有机污染物暴露的痰湿型不孕症的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种启宫丸在有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症中的应用。

背景技术

启宫丸出自《医方集解》，由经典化痰方剂二陈汤化裁而来，具有祛痰化湿、开郁化气之功效，主治“妇人体肥痰盛，子宫脂满，不能孕育者”。根据中药君、臣、佐、使配伍原则，方中以半夏、橘红为君，半夏燥湿化痰，橘红理气化痰，取气顺痰降、气行痰化之意；因痰由湿生，气滞痰凝，故臣以茯苓、白术健脾渗湿，香附、神曲行气导滞，川芎行气活血；佐以生姜制半夏之毒；使以甘草和益脾、调和诸药。方中诸药合用，共奏燥湿化痰、理气活血、调经助孕之效。

流行病学调查指出，痰湿体质及痰湿证与女性不孕症的发生密切相关，而痰湿型不孕症严重影响女性生殖健康及生活质量，是目前妇产科临床亟待解决的难点问题。元代朱丹溪首次提出痰湿可致不孕，《丹溪心法》指出：“若是肥盛妇人，享受甚厚，态于酒食之人，经水不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫，宜行湿燥痰。”认为痰湿壅滞、闭塞于胞宫，而致女子不孕。痰湿型不孕症的形成在于本虚，如《石室秘录》中描述到：“肥人多痰，乃气虚也，虚则气不运行，故痰生之”，气虚、脾虚等机体运化能力降低是痰湿体质形成的基础。现代中医理论认为痰湿体质与机体的氧化还原机制之间存在密切的联系，痰湿证是氧化还原失衡的外在表现。目前研究认为，女性痰湿型不孕证的生殖功能障碍不是原发卵巢、子宫功能异常所致，而是由异常的机体内分泌环境引起卵巢、子宫的继发性改变所致。

p,p＇-DDE是一类具有高化学毒性、生物蓄积性且能够在环境中持久存在的有机化学污染物质，其来源主要是人类早期使用的有机氯农药。尽管目前国际上已经禁止和严格限制了这些化学物质的使用，但由于p,p＇-DDE的化学结构稳定且在环境中具有相当长的代谢周期，使其成为全球范围内广泛存在的有害化学物质。由于我国上世纪六氯联苯农药的大量使用，致使我国环境p,p＇-DDE浓度显著高于全球平均水平。p,p＇-DDE暴露(包括产期暴露)人群会出现糖代谢及生殖内分泌的异常，进而引起代谢异常疾病及生殖功能障碍(如女性不孕症和男性不育症)的发生。研究还发现，p,p＇-DDE能够引起体内抗氧化物质的损耗及线粒体功能的异常，导致氧化应激水平的升高，进而影响人体内的正常内分泌水平。然而，目前未见能有效干预p,p＇-DDE有害作用的方法报导。

综上所述，基于p,p＇-DDE暴露与痰湿型不孕症的关系，以及其预防和治疗是目前亟需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种启宫丸干预有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症应用。本发明研究了一种持久性有机污染物p,p＇-DDE与痰湿型不孕症的相关性，并提出了治疗痰湿型不孕症的中药复方启宫丸对p,p＇-DDE生殖毒性的拮抗作用。

本发明的一种启宫丸在有机污染物暴露的痰湿型不孕症中的应用，所述的启宫丸作为预防或治疗有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症的药物。

进一步地，所述的启宫丸是由半夏、香附、川芎、白术、神曲、茯苓、苍术、橘红和甘草组成。

进一步地，所述的启宫丸按照重量份数是由10-30份半夏、5-20份香附、15-30份川芎、10-20份白术、15-25份神曲、10-15份茯苓、10-15份苍术、10-20份橘红和5-15份甘草组成。

进一步地，所述的启宫丸作为以线粒体为靶点的预防或治疗有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症的药物。

进一步地，所述的线粒体为卵巢细胞内线粒体。

p,p＇-DDE是持久性有机污染物，对人类生殖机能有显著不良影响，目前尚无有效拮抗其生殖毒性的方法。卵细胞氧化/还原调节机能异常造成痰湿型不孕症女性卵子发育潜能受损，与p,p＇-DDE生殖毒性机制相似。本发明研究发现异常的氧化应激在痰湿型不孕症的发病机制中可能起到重要的作用，痰湿型不孕症的病因可能与线粒体异常暴露的氧化应激异常有关，因此，p,p＇-DDE的长期暴露可能通过进一步减弱痰湿体质患者机体已经弱化的抗氧化应激能力，进而加重和放大痰湿型不孕症患者的临床表征。

本发明基于线粒体功能的变化同时与痰湿型不孕症的疾病成因及p,p＇-DDE的生物学毒性有关，通过干预线粒体的功能则可能起到拮抗p,p＇-DDE生殖毒性并缓解痰湿型不孕症临床表征的作用。本发明使用启宫丸生药对p,p＇-DDE作用后的痰湿型不孕症大鼠灌胃治疗，本发明发现中药治疗恢复了受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症模型大鼠动情周期紊乱的动情周期，显著降低了受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症模型大鼠的血糖、血脂及血清睾酮水平，从而改善其生殖功能异常；同时启宫丸生药的灌胃治疗也显著降低了p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症模型大鼠卵巢甾体激素合成酶HSD3β及CYP17的mRNA表达水平并提高了线粒体功能相关因子PGC-1α、NRF1、TEAM及Sirt-1的蛋白表达水平。

中药复方对痰湿型不孕症疗效明确，生物学基础是调节氧化/还原调节机能异常。“p,p＇-DDE对痰湿证患者体内的氧化应激起到放大的作用，启宫丸，通过调节卵巢内抗氧化通路进而对p,p＇-DDE生殖毒性起到拮抗作用，本发明采用动物模型及卵巢组织相关因子检测的方法，进行启宫丸对受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症模型大鼠生殖毒性拮抗作用及卵巢细胞氧化应激进行研究，从中药抗氧化作用及纠正p,p＇-DDE不良影响两方面阐明启宫丸治疗痰湿型不孕症及拮抗p,p＇-DDE生殖毒性的作用和机制。

本发明针对动物实验的p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症治疗效果，为人体p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症提供了重要的治疗参考依据。

本发明包含以下有益效果：

本发明研究发现启宫丸对卵巢组织线粒体功能的有影响，启宫丸组方药物对线粒体功能有明确的调节作用。由启宫丸主要组方药物半夏、陈皮、茯苓和甘草组成的二陈汤能够显著改善非酒精性脂肪肝模型小鼠肝细胞中线粒体的能量代谢。川芎的主要成分川芎内酯则能够显著降低体外培养的大鼠肾上腺细胞的线粒体来源的活性氧改善氧化应激水平进而抑制细胞凋亡。线粒体是与能量代谢、生殖内分泌及胰岛素信号通路密切相关的细胞器，对卵巢细胞线粒体功能的调节是启宫丸发挥恢复p,p＇-DDE暴露痰湿型不孕症患者的正常排卵进而提高妊娠率、纠正痰湿型不孕症患者胰岛素抵抗状态及调节内分泌代谢的主要药效机制。

本发明证明了启宫丸对环境有机污染物p,p＇-DDE暴露大鼠及痰湿证模型大鼠生殖机能的影响，启宫丸通过改善氧化应激调节线粒体生物合成，进而纠正p,p＇-DDE暴露痰湿证模型大鼠生殖障碍。

本发明采用启宫丸，对于p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症有显著的治疗效果。并通过动物实验，从中药抗氧化作用及纠正p,p＇-DDE不良影响两方面阐明启宫丸治疗痰湿型不孕症及拮抗p,p＇-DDE生殖毒性的作用和机制。为使用中药复方启宫丸的新用途-降低环境污染物对机体的不良影响提供证据支持。

附图说明

图1为实验大鼠动情周期图；

图2为实验大鼠卵巢形态及TUNEL染色结果图；

图3为与对照组相比检测因子表达水平均值差异图；

图4为实验大鼠卵巢组织关键因子mRNA表达水平图；

图5为实验大鼠卵巢组织关键因子蛋白表达水平图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

在本发明的研究中发现，低浓度的p,p＇-DDE并不能对正常大鼠的体重、糖脂代谢及生殖内分泌水平产生明显的影响。但同样剂量的p,p＇-DDE作用于痰湿型不孕症模型大鼠后，则显著放大了痰湿型不孕症模型动物与对照组实验动物的差异。这种差异在体重的变化幅度、血糖、血脂水平、血清甾体激素水平、调控糖脂代谢及甾体激素合成关键因子mRNA表达水平等诸多方面都能得到印证。具体为p,p＇-DDE单独作用大鼠与对照组大鼠相比，并未对动情周期、性激素水平(T、P和E₂)、血清代谢指标(FPG、Ins、TC、TG、LDL和HDL)、氧化应激相关因子表达、甾体激素合成相关因子mRNA和线粒体功能相关因子蛋白表达产生明显影响，而p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症大鼠与单纯痰湿型不孕症大鼠相比，其生殖功能、代谢指标、氧化应激相关因子和线粒体功能相关因子出现了显著的异常或损伤。这种p,p＇-DDE对痰湿型不孕症模型大鼠表型的放大作用提示p,p＇-DDE的生物毒性作用与痰湿型不孕症发病机制之间可能具有相同的作用机制。而在痰湿型不孕症大鼠及受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症大鼠中都发现与线粒体生物合成及线粒体功能直接相关的因子蛋白表达水平的下降，则提示线粒体功能的变化可能是p,p＇-DDE生物毒性与痰湿型不孕症病因的共同机制，由线粒体功能异常所导致的氧化应激异常则是引起p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症代谢及卵巢生殖机能异常的主要原因。

本发明研究中除发现痰湿型不孕症模型大鼠具有葡萄糖耐量降低、高胰岛素血症、胰岛素抵抗及血清雄激素水平上调等代谢及生殖异常表征外，还发现卵巢组织抗氧化因子MnSOD表达水平的下降，说明痰湿型不孕症模型大鼠卵巢组织出现氧化应激。同时，本发明还发现痰湿型不孕症模型大鼠卵巢组织有关线粒体发生及线粒体功能相关因子TEAM及Sirt1蛋白表达水平下降，提示在痰湿型不孕症模型大鼠卵巢组织中线粒体的功能可能出现了异常。同时线粒体也是诱发细胞凋亡的关键细胞器。在发现线粒体功能相关因子表达异常的同时，本发明也发现痰湿型不孕症模型大鼠卵巢细胞的凋亡比率显著升高，卵泡结构发生了明显的变化。这些结果提示线粒体功能异常引起卵巢细胞氧化应激水平改变，进而引起痰湿型不孕症模型大鼠卵巢功能变化。

启宫丸是临床治疗痰湿型不孕症的经典方剂，本发明发现：1)p,p＇-DDE单独作用并未对大鼠生殖功能及代谢产生明显影响，但是，p,p＇-DDE可以放大痰湿型不孕症大鼠的临床症状和卵巢生殖功能异常，p,p＇-DDE发挥生物毒性的机制与痰湿型不孕症大鼠卵巢机能异常的病理机制都可能与细胞线粒体机能异常所引起的氧化应激有关；2)启宫丸对受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症模型大鼠血清睾酮水平异常及糖脂代谢异常有明确的治疗作用，能够恢复模型大鼠的动情周期，纠正生殖障碍，同时还能够影响模型动物的卵巢细胞线粒体活性，说明启宫丸拮抗p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症模型大鼠药效机制可能与其对线粒体机能的调节密切相关。

本发明结果发现，p,p＇-DDE长期暴露放大了痰湿型不孕症大鼠的临床表征，而且，受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症大鼠卵巢组织与线粒体生物合成及线粒体功能直接相关的因子蛋白表达水平的下降，则预示着线粒体功能的变化可能是p,p＇-DDE发挥生物毒性的机制。

实施例

一、试剂

实验用启宫丸各组分采用中药饮片，方剂组成为：半夏20克、香附20克、川芎15克、白术15克，神曲15克、茯苓15克，苍术12克、橘红12克，甘草5克。生药取自同一产地、同一批次以保证所制备实验用药物的质量与品质的均一性，实验用启宫丸汤剂采用上海达成实验设备公司DC-NSG-30型药物浓缩机对方药进行煎煮浓缩，最终药液过滤浓缩后浓度为1g生药/ml；

TFAM抗体(ABclonal，CAT:A13552)；PGC-1α抗体(Wanleibio，CAT:WL02123)；NRF1抗体(ABclonal，CAT:A3252)；SIRT1抗体(Wanleibio，CAT:WL02995)；TUNEL染色试剂盒(Wanleibio，CAT:WLA127a)；蛋白酶K(Merker，CA:1245680100)；Mito-Tracker Red CMXRos(beyotime，CAT：C1035)；血清胰岛素、睾酮、孕酮及雌二醇检测试剂盒(武汉恩菲，CAT：ER1113；EU0390；EU0400；EU0398)；M-MLV反转录酶(PROMEGA，CAT：M1701)；SYBR Green荧光染料定量试剂(Solarbio，CAT：PC1150&SY1020)；P,P’-DDE(TCI，CAS RN:72-55-9)。

二、实验方法

所有SD大鼠实验前于每日清晨行阴道分泌物涂片检查，HE染色后观察动情周期的变化，连续5d。选取动情周期正常的大鼠纳入实验研究。实验大鼠随机分为对照组、p,p＇-DDE作用组、痰湿型不孕症模型组、痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE干预组、中药治疗组。除对照组及p,p＇-DDE作用组每日给予1％羧甲基纤维素钠溶液灌胃外，其余各组实验动物均给予使用1％羧甲基纤维素钠配置的来曲唑(1mg/kg)及高脂乳剂(15mL/kg，猪油+胆固醇，猪油：胆固醇质量比＝10:3)灌胃处理，痰湿型不孕症模型组、痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE干预组及中药治疗组每日腹腔注射50mg/kg p,p＇-DDE连续给药20d。20d后各组维持处理方式不变，中药治疗组大鼠每日灌胃11.37g/kg中药浓缩液，其余各组大鼠给予相应体积生理盐水灌胃，每日两次，连续15d。灌胃完成后的各组大鼠经眶静脉从采血后断颈处死，解剖获取卵巢组织分别冷冻保存于液氮中或使用福尔马林固定。

1.动情周期检测

各组大鼠于中药治疗组大鼠灌胃治疗结束后，每组选取3只于每日清晨行阴道分泌物涂片检查，HE染色后观察动情周期的变化，连续9d。统计大鼠动情周期变化规律。

如图1所示，对照组及p,p＇-DDE作用组动情周期在研究期间呈现有规律的变化；痰湿型不孕症模型组动情周期规律变化消失，长时间处于发情周期的间期。痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE干预组大鼠的动情周期与模型组动物相似；中药治疗组大鼠能够发现有动情期出现，但两次动情前期的时间间隔明显长于对照组。

2.卵巢组织形态及细胞凋亡水平检测

各组获得的卵巢组织石蜡切片，经脱蜡复水后各组部分切片进行HE染色观察卵巢形态；其余切片使用TUNEL染色试剂盒，按照说明书推荐步骤进行。简要方法为：切片脱蜡复水后加入20μg/ml蛋白酶K(Merker，CAT：1245680100)37℃孵育20mins，而后50μl TUNEL反应液37℃避光孵育60mins后，使用Hoschest33342进行复染。经抗荧光猝灭封片剂封片后使用荧光显微镜观察530nm绿色荧光信号分布情况。

2.1各组实验大鼠卵巢形态及细胞凋亡水平的变化

在对比各组大鼠卵巢切片HE染色结果时(图2)，实验发现对照组及p,p＇-DDE处理组卵巢切片中可见多个黄体及不同发育阶段的各级卵泡，部分卵泡中有放射冠，两组差异不明显。而痰湿型不孕症模型组及痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE处理组卵巢组织切片中可见卵泡囊性扩张，颗粒细胞层数明显减少。在中药治疗组中可见多个黄体及不同发育阶段的各级卵泡，少量卵泡油囊性扩张。而TUNEL染色的结果也显示(如图2所示)，p,p＇-DDE作用组后大鼠卵巢细胞TUNEL阳性细胞核比率与对照组相比没有明显变化，但痰湿型不孕症模型组大鼠卵巢TUNEL阳性细胞核比率较对照组明显升高。痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE处理组大鼠卵巢TUNEL染色阳性细胞核的比率较痰湿型不孕症模型大鼠有明显提升。中药灌胃治疗明显降低了p,p＇-DDE作用后的痰湿型不孕症模型大鼠卵巢TUNEL染色阳性细胞核的比率。

3.血清甾体激素表达水平检测

各组实验大鼠在启宫丸浓缩液或生理盐水灌胃治疗15天后，眶静脉丛取血，静置30mins后2000rpm离心10mins获取血清，保存于-70℃冰箱中。采用ELISA试剂盒按照推荐步骤对血清中睾酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E₂)水平进行检测，结果如表1和图3所示。

表1.大鼠血清指标检测结果

注：与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与痰湿型不孕症模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE作用组比较，^&P<0.05，^&&P<0.01。

4.卵巢代谢相关因子及甾体激素合成关键因子mRNA表达水平变化

结果如图4所示，与对照组比较，p,p＇-DDE作用组除HSD3β表达量显著升高外其余因子的mRNA表达水平均无显著差异。痰湿型不孕症模型组与对照组相比CPT1、TXNIP、HSD3β及CYP17的mRNA表达水平显著上升而MnSOD及CYP19的mRNA表达水平显著下降。痰湿型不孕症模型+p,p＇-DDE处理组与痰湿型不孕症模型组比较CPT1、TXNIP、HSD3β及CYP17的mRNA表达水平显著上升而MnSOD的mRNA表达水平显著下降。中药治疗组与痰湿型不孕症模型+DDE处理组相比，CPT1、TXNIP、HSD3β及CYP17的mRNA表达水平显著下降，MnSOD、CYP11及CYP19的mRNA表达水平显著上升。

5.卵巢线粒体功能相关因子蛋白表达水平变化

如图5所示，与对照组比较(与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与痰湿型不孕症模型组比较，^##P<0.01；与痰湿型不孕症模型+DDE作用组比较，^&&P<0.01)，DDE单独使用没有显著改变大鼠卵巢PGC-1α、NRF1、TEAM及SIRT1的蛋白表达水平。与对照组相比痰湿型不孕症模型组卵巢PGC-1α、NRF1、TEAM及SIRT1的蛋白表达水平均呈下降的趋势，且DDE加重了痰湿型不孕症模型大鼠卵巢PGC-1α、NRF1、TEAM及SIRT1的蛋白表达水平的下降趋势。启宫丸灌胃治疗则提高了痰湿型不孕症模型+DDE组大鼠卵巢组织中PGC-1α、NRF1、TEAM及SIRT1的蛋白表达水平。

结果1动情周期的检测属于不孕症检测的方法之一，检测的是模型动物是否有正常的排卵。p,p＇-DDE作用的大鼠一直处于动情间期，无排卵进而导致不孕的发生，而中药干预后，模型大鼠有动情期出现，说明中药恢复了大鼠的排卵，对不孕症起到了治疗作用。

综上研究结果，本发明发现，p,p＇-DDE对痰湿型不孕症模型大鼠异常的糖脂代谢异常及血清甾体激素异常有着明显的放大效应，启宫丸则对受p,p＇-DDE影响的痰湿型不孕症模型大鼠血清睾酮水平异常及糖脂代谢异常有明确的治疗作用并能恢复其排卵功能，同时还能够影响这些实验动物的卵巢细胞线粒体活性。p,p＇-DDE发挥生物毒性的机制与痰湿型不孕症大鼠卵巢机能异常的病理机制都可能与细胞线粒体机能异常所引起的细胞内氧化应激有关；启宫丸治疗p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症模型大鼠卵巢功能异常的药效机制很可能与其对线粒体机能的调节密切相关。提示卵巢细胞内线粒体活性及功能的变化很可能是连接细胞代谢与内分泌功能变化的关键节点。而以线粒体为靶点开发相应药物，则对降低环境不良因素对痰湿型不孕症患者疾病表型的影响有重要的意义。本发明通过上述实验，证明启宫丸对p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症起到了治疗作用。

Claims

1.一种启宫丸在制备用于治疗有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症的药物中的应用，其特征在于所述的启宫丸按照重量份数是由10-30份半夏、5-20份香附、15-30份川芎、10-20份白术、15-25份神曲、10-15份茯苓、10-15份苍术、10-20份橘红和5-15份甘草组成。

2.根据权利要求1所述的一种启宫丸在制备用于治疗有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症的药物中的应用，其特征在于所述的启宫丸作为以线粒体为靶点的预防或治疗有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症的药物。

3.根据权利要求1所述的一种启宫丸在制备用于治疗有机污染物p,p＇-DDE暴露的痰湿型不孕症的药物中的应用，其特征在于所述的线粒体为卵巢细胞内线粒体。