CN115807103A

CN115807103A - 36个红细胞血型系统基因全编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒

Info

Publication number: CN115807103A
Application number: CN202211150571.4A
Authority: CN
Inventors: 应燕玲; 朱发明; 张晶晶; 洪小珍; 许先国
Original assignee: BLOOD CENTER OF ZHEJIANG PROVINCE
Current assignee: BLOOD CENTER OF ZHEJIANG PROVINCE
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2042-09-21
Also published as: CN115807103B

Abstract

本发明提供一种36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒，所述方法对36个红细胞血型系统对应基因的全部编码区序列进行捕获、文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，实现对36个红细胞血型系统基因单孔同步高通量基因分型；所述探针集为核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.871所示的探针的集合。本发明能够极大地简化多个血型系统同步分型的检测，提高工作效率，同时大大缩减了实验样本和测试成本，具有通量高、覆盖面广的特点；本发明检测的红细胞血型基因集覆盖对应基因的全部编码区序列，序列分析全面，可用于解决红细胞血型系统中存在的变异体样本基因分型难题。

Description

36个红细胞血型系统基因全编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒

技术领域

本发明属于基因分型检测技术领域，具体涉及一种36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒。

背景技术

红细胞血型系统在输血学、法医学和某些疾病的易感性等方面具有重要的意义，红细胞血型不合可引起严重的溶血反应。当红细胞血型抗原间存在不匹配时，可导致个体发生严重输血不良反应；此外部分个体由于存在抗体或者多次输血导致红细胞血型不能准确鉴定，从而难以找到合适的红细胞供者来源，这将危及患者生命。因此准确的筛选和鉴定个体红细胞血型，选择配合的血液输注可有效保障患者的输血安全。

按照我国的有关法规要求，目前输血过程中仅要求检测ABO抗原系统和RhD抗原，因此实验室常采用血清学技术鉴定A、B抗原和RhD抗原。虽然临床输血中考虑到ABO血型系统和RhD抗原的匹配性并进行了交叉配合，但是输血实践过程中仍常发生个体输血后产生意外(不规则)抗体的情形或者发生输血不良反应，其原因是可能由于存在其他红细胞血型抗原不匹配而引起。研究显示，多次输血患者红细胞意外抗体频率为0.027％～0.37％，而且不同人群和地区抗体特性和分布存在明显差异；患者体内的意外抗体会干扰个体红细胞血型定型，尤其是出现血清与O型多个谱细胞全部凝集时，常规的单一血型鉴定方法难以实现个体血型抗原的定型。

红细胞血型抗原鉴定有血清学技术和分子诊断技术，血清学技术作为经典的方法已广泛应用，但该方法具有潜在的局限性，大多数单次操作只能鉴定一个抗原，对于多个血型系统的鉴定操作较为繁重，工作量大；此外由于部分血型抗原或者稀有血型缺乏特异的抗体，因此无法采用血清学技术进行检测。同时部分患者由于多次输血后可形成混合凝集，也无法采用血清学技术准确鉴定出个体的红细胞血型情况。因此从红细胞血型准确鉴定的角度考虑，在保持原有的血清学方法基础上，迫切需要有可靠的红细胞血型分子诊断技术。

近年来随着血型分子诊断技术的发展，目前血型系统基因分型技术主要有PCR-DNA测序法、PCR-RFLP、PCR-SSP等，但这些方法主要为单一的血型系统检测；此外有基因芯片、实时荧光PCR技术、SNPaShot、多重连接依赖探针扩增技术等，虽然这些技术可以同步检测多个系统，但是它们仍不能实现大范围的红细胞血型系统高通量基因诊断。因此现有方法对血型系统基因检测区域较为有限，往往不能有效综合针对大范围的红细胞血型系统，而且存在通量不足的问题，难以实现大规模标本检测。此外红细胞血型系统中存在一定的变异体，它们的分子机制往往涉及到红细胞血型基因的全部编码区序列碱基的改变，检测面较广。

因此，从血液安全的角度，迫切需要一种新的方法实现多个红细胞血型系统基因全部编码区序列的分析，实现血型精准鉴定，提升血液安全。

发明内容

针对现有红细胞血型系统基因分型技术存在的局限性，本发明的目的在于，提供一种36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒，以实现对大范围红细胞血型的同步检测和定型。

本发明的第一个方面在于，提供一种36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步检测基因分型方法，所述方法对36个红细胞血型系统对应基因的全部编码区序列进行捕获、文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，实现对36个红细胞血型系统基因单孔同步高通量基因分型，主要包括以下步骤：

S1、设计合成36个血型系统基因集全部编码区序列捕获的探针；

S2、制备人基因组DNA；

S3、使用酶切打断法将人基因组DNA片段化、并进行末端修复、加A尾；

S4、将步骤S3得到的片段末端连上index接头，并进行磁珠纯化；

S5、将步骤S4纯化后片段利用不同浓度磁珠进行片段大小分选；

S6、将步骤S5得到的片段进行PCR扩增富集，扩增产物通过磁珠纯化，并进行准确定量；

S7、将步骤S6得到的纯化片段与步骤S1中的捕获探针进行液相杂交捕获反应；

S8、将步骤S7得到的液相杂交产物利用链霉亲和素偶联磁珠纯化已经与探针杂交的目的片段；

S9、将步骤S8获得的捕获产物进行PCR扩增富集，扩增产物磁珠纯化，获得捕获文库；

S10、将步骤S9获得的文库通过Aligent 4200电泳仪进行质量检测，分析文库片段的大小、质量，并通过Qubit DNA双链定量测定试剂准确定量；

S11、采用Illumina测序试剂，将步骤S10获得的文库于Illumina Miseq平台上测序；

S12、将步骤S11得到的FASTQ原始数据进行生物信息学分析，指定个体红细胞抗原系统基因型；

步骤S1中，36个红细胞血型系统基因集包括：001ABO血型系统的ABO基因、002MNS系统的GYPA和GYPB基因、003P1PK系统的A4GALT基因、004Rh血型系统的RHD和RHCE基因、005Lutheran系统的BCAM基因、006Kell系统的KEL基因、007Lewis系统的FUT3、008Duffy系统的ACKR1基因、009Kidd系统的SLC14A1基因、010Diego系统的SLC4A1基因、011Yt系统的ACHE基因、012Xg系统的XG和MIC2基因、013Scianna系统的ERMAP基因、014Dombrock系统的ART4基因、015Colton系统的AQP1基因、016Landsteiner-Wiener系统的ICAM4基因、017Chido/Rodgers系统的C4A和C4B基因、018H系统的FUT1基因、019Kx系统的XK基因、020Gerbich系统的GYPC基因、021Cromer系统的CROM基因、022Knops系统的CR1基因、023Indian系统的CD44基因、024Ok系统的BSG基因、025Raph系统的CD151基因、026JohnMilton Hagen系统的SEMA7A基因、027I系统的GCNT2基因、028Globoside系统的B3GALNT1基因、029Gill系统的AQP3基因、030Rh-associated glycoprotein系统的RHAG基因、031FORS系统的GBGT1基因、032JR系统的ABCG2基因、033LAN系统的ABCB6基因、034Vel系统的SMIM1基因、035CD59系统的CD59基因、036Augustine系统的SLC29A1基因。

相应地，步骤S1中，36个红细胞血型系统基因集全部编码区捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.871所示。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：

作为本发明的优选技术方案：步骤S1中，所有捕获探针在合成时进行5’端偶联生物素且同管混合使用；

作为本发明的优选技术方案：步骤S2～S9中，探针捕获、文库制备试剂为欣基生物的CapSeq^TM探针杂交试剂盒。

作为本发明的优选技术方案：步骤S4、S5中，磁珠法纯化及片段分选所需的磁珠为欣基生物的CapSeq SA Beads磁珠。

作为本发明的优选技术方案：步骤S10中，文库质量检测试剂为High SensitivityD1000电泳试剂，Qubit DNA双链定量试剂为Qubit dsDNA高灵敏分析试剂。

作为本发明的优选技术方案：步骤S11中，Illumina测序试剂为MiSeq SequencingReagent Kit，其规格为v2，300cycles。

作为本发明的优选技术方案：步骤S12中，生物信息学分析软件为CLC GenomicsWorkbench 21software。

本发明第二个方面在于，提供36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获检测用探针集，所述探针集为核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.871所示的探针的集合。

作为本发明的优选技术方案：所述探针的5’端偶联生物素标记，所述生物素为链亲和素。

本发明还有一个方面在于，提供36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获检测试剂盒，所述36个红细胞血型系统的同步检测试剂盒包括具有SEQ ID NO.1～SEQID NO.871所示的核苷酸序列且5’端偶联生物素标记的探针集以及用于文库构建、测序上机的试剂；

文库制备的试剂为：欣基生物CapSeq SA Beads磁珠、Qubit dsDNA高灵敏分析试剂、欣基生物CapSeqTM探针杂交试剂盒；

测序上机的试剂为：MiSeq Sequencing Reagent Kit，其规格为v2，300cycles。

本发明提供36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒，与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1)、本发明是目前为止，同步检测红细胞血型数量最多、覆盖面最广的血型基因分型技术方法。目前由国际输血协会正式确认的红细胞血型系统有43个，本发明试剂盒包含了36个血型系统对应的基因的探针集(除最新定义的7个血型系统之外)，可实现对人基因组中对应目的基因的分离及富集，实现在同一反应体系中36个血型系统基因全部编码区序列的分析，进行准确的基因分型。相对于传统的血型基因分型方法，通常存在只能为单一或几个血型系统进行基因分型，且目前尚缺少部分稀有血型基因分型方法，检测区域有限等缺陷。因此往往不能有效针对较多红细胞血型系统，存在通量不足的问题，导致工作量繁重且耗时长更难以实现大规模标本多血型系统的准确鉴定。因此，本发明创造性的技术方法极大地简化了多个血型系统同步分型的检测，提高工作效率，同时大大缩减了实验样本和测试成本，具有通量高、覆盖面广的特点。

2)、本发明中所设计的探针为实现全面的序列捕获覆盖度，在探针设计过程中采用头对头形式的平铺设计方式，同时，对于特定基因高GC含量(GC>75％)序列区域，在原有平铺设计探针的基础上，进行间隔60bp长度的额外补充探针设计，通过探针密度调整确保目标区域捕获的成功率与覆盖均一性，以保证文库所包含的基因数据可以真实的反映编码区水平的点突变类型，保证对全部基因组编码区测序具有高度特异性、高准确性、卓越的重现性。

3)、本发明检测的红细胞血型基因集覆盖对应基因的全部编码区序列，序列分析全面，可用于解决红细胞血型系统中存在的变异体样本基因分型难题。红细胞血型系统中存在一定比例的亚型，如RH血型系统的亚型的突变点涉及1～10号外显子编码区序列，目前已有的实验室的分子诊断方法难以满足该类需求，单一反应体系无法实现对全编码区序列的分析来进行准确的基因分型，因此，本发明提供一种快速准确的红细胞基因分型方法。

4)、本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了目前大范围的红细胞血型系统快速准确定型的问题，具有实现高通量、覆盖面广、基金检测全面、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

附图说明

图1为生物素标记探针捕获36个血型系统对应基因目标序列获得的文库Aligent4200电泳质量检测图谱，其中从左往右，第一个峰为20bp大小的小分子Marker，中间峰为探针捕获后的文库片段，主峰大小在317bp左右，右侧峰为1000bp大小的大分子marker。

图2a-图2f分别为36个血型系统对应基因的全编码区测序覆盖度示意图。

图3a-图3e分别例举其中5个血型系统部分编码区测序序列图谱，其中：图3a为Duffy血型系统编码区部分测序图；图3b为Colton血型系统编码区部分测序图；图3c为Kx血型系统编码区部分测序图；图3d为Raph血型系统编码区部分测序图；图3e为FORS血型系统编码区部分测序图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。

本实施例中具体以献血者的血液为检测样本进行人类36个红细胞血型基因分型为例，对本发明内容做详细说明。

本发明的基于外显子捕获技术的36个红细胞血型系统基因同步基因分型检测方法包括以下步骤：

S1、合成捕获探针

人类红细胞血型：001ABO血型系统的ABO基因、002MNS系统的GYPA和GYPB基因、003P1PK系统的A4GALT基因、004Rh血型系统的RH基因、005Lutheran系统的BCAM基因、006Kell系统的KEL基因、007Lewis系统的FUT3、008Duffy系统的ACKR1基因、009Kidd系统的SLC14A1基因、010Diego系统的SLC4A1基因、011Yt系统的ACHE基因、012Xg系统的XG和MIC2基因、013Scianna系统的ERMAP基因、014Dombrock系统的ART4基因、015Colton系统的AQP1基因、016Landsteiner-Wiener系统的ICAM4基因、017Chido/Rodgers系统的C4A和C4B基因、018H系统的FUT1基因、019Kx系统的XK基因、020Gerbich系统的GYPC基因、021Cromer系统的CROM基因、022Knops系统的CR1基因、023Indian系统的CD44基因、024Ok系统的BSG基因、025Raph系统的CD151基因、026John Milton Hagen系统的SEMA7A基因、027I系统的GCNT2基因、028Globoside系统的B3GALNT1基因、029Gill系统的AQP3基因、030Rh-associatedglycoprotein系统的RHAG基因、031FORS系统的GBGT1基因、032JR系统的ABCG2基因、033LAN系统的ABCB6基因、034Vel系统的SMIM1基因、035CD59系统的CD59基因、036Augustine系统的SLC29A1基因的全部编码区序列的捕获探针由如下设计方法得到：

根据人基因组中这些基因的标准序列和位置，选择设定探针设计的起始和终止位置，并对编码区区域标记，通过探针在目标区域平铺叠式排布，覆盖全编码区目标区域，每个探针的长度设定为120bp。通过优化目标参数，在低覆盖率或高GC含量序列等难以捕获的目标序列，适当扩大目标区域，同时在原有平铺设计探针的基础上，进行间隔60bp长度的额外补充探针，通过优化参数，共得到871条探针，如表1所示，均匀同质地覆盖36个血型对应基因集的所有编码区序列。

表1 871号探针的序列

S2、制备标本基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板

取待检全血200μl，按照MagDNA Pure LC DNA Isolation Kit试剂盒说明书提取基因组DNA，并测定基因组DNA的浓度和纯度。本方案后续步骤以96个标本为例(实际工作中可根据测序芯片选择的情况调整标本数量)。

使用CapSeq探针捕获试剂盒，按下表2配制反应体系，注意冰上操作，各组分加入后，轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。

表2酶切反应体系

轻柔吸打6～8次混匀，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序：37℃，10min；65℃，30min；热盖温度设置为75℃。

按表3配置接头连接反应体系，轻柔吸打混匀后置冰上。

表3接头连接反应体系

将此配制好的45μl连接反应液加入至S3准备的反应液中，构成110μL反应体系，轻柔吸打混匀，置于20℃中反应15min，PCR仪不要启动热盖。

使用CapSeq^TM PUR Beads纯化接头连接产物。简要说明如下：96孔PCR扩增板每孔加入110μl CapSeq^TM PUR Beads磁珠，振荡混匀后室温放置5分钟。将96孔PCR扩增板放置磁力架上直到溶液变清亮，弃去上清，每孔加入200μl新鲜配制的80％无水乙醇，室温放置30s，小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)，再重复洗一次，室温干燥2～5min(注意避免过长时间干燥)。加入52.5μl无核酸酶去离子水进行洗脱。并转移约50μL上清至新的离心管中，用于后续的DNA片段长度分选。

S5、将步骤S4纯化后片段进行片段大小分选；

使用CapSeqTM PUR Beads进行片段大小的分选。简要步骤如下：第一次筛选加入0.6×体积磁珠(30μl)至50μl纯化产物中，充分吸打混匀。室温孵育5min，将反应管置于磁力架上2～5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器小心吸取上清并转移至另一新的离心管中。第二次筛选加入上清0.1×体积磁珠，用枪头吹打混匀，室温孵育5min，将反应管置于磁力架上2～5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。分选之后使用80％无水乙醇洗涤，步骤同S4。加入22.5μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)至离心管内并使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮。将反应管放置于磁力架上2～5min，使磁珠完全贴壁后，转移约20μl上清至新的离心管中，用于后续的PCR富集实验。

S6、将步骤S5得到的片段进行PCR扩增富集，扩增产物通过磁珠纯化，采用Qsep1电泳定量；

按表4配制PCR扩增体系，轻柔吸打6～8次混匀。

表4 PCR富集反应体系

瞬时离心后将PCR反应管置于PCR仪内，设置PCR仪反应程序，开启热盖，温度设置于105℃。98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，30s，12循环；72℃，1min，4℃保持；

将PCR产物取出并使用1×体积(50μL)CapSeqTM PUR Beads进行纯化，纯化步骤同S4。加入32.5μL 10mM Tris-HCl(pH 8.0)至离心管内并使用移液器吸打使磁珠充分悬浮。将反应管放置于磁力架上2～5min，使磁珠完全贴壁后，转移30μl上清至新的离心管中。利用Qsep1生物分析仪对DNA初始文库质量进行鉴定。

S7.1文库杂交封闭

按表5配置文库封闭反应体系，离心管置于真空旋转蒸发仪中，55℃真空旋转，将反应液蒸干。

表5文库封闭体系

S7.2探针杂交

(1)按表6配置探针杂交反应体系，加入已蒸干的0.2mL PCR管中，涡旋振荡器振荡混匀，室温放置5～10min；再次吸打或振荡混匀，瞬时离心。在PCR仪上进行热循环孵化，95℃，10min，热盖温度105℃。立刻加入2μl充分融化的混合探针，振荡混匀，瞬时离心，放置于PCR仪中65℃孵育2h进行杂交，热盖温度75℃。

表6探针杂交反应体系

S8、利用链亲和素偶联磁珠纯化已捕获的片段；

S8.1捕获磁珠活化

从4℃冰箱取出CapSeq SA Beads后，室温放置10min，涡旋振荡15s，充分混匀。

每孔反应取50μl Beads，放置于磁力架上，去除上清，保留磁珠，加入1X BWB，涡旋振荡10s，转移至磁力架上，去除上清。重复清洗一次，去除上清保留磁珠，马上进行下一步骤，避免磁珠在空气中过度暴露。

S8.2文库与链亲和素磁珠结合

将上述杂交的杂交液16μl全部转移至对应含磁珠的0.2ml PCR管(8联排)中，用移液器反复吸打溶液10次，充分混匀。在PCR仪器中进行65℃杂交反应，30～45min(热盖75℃)。每10～12min取出振荡5s，立即放入PCR仪器进行反应，直至满足总反应时间。

S8.3洗脱去除未结合的DNA

第一步，65℃洗脱液清洗磁珠。向上述磁珠结合放应产物中加入120μl 65℃预热的1X WI，短暂涡旋振荡。置于磁力架上，磁珠与溶液完全分离。将离心管放入PCR仪65℃，10～20s，迅速放回磁力架，去除上清。加入150μl 65℃预热的1X S-W，缓慢吸打10～15次，充分悬浮磁珠。PCR仪65℃温浴5min。利用磁力架，去除上清。利用1X S-W重复清洗磁珠一次。

第二步，室温洗脱液清洗磁珠。离心管中加入150μl室温的1X WI，加入，漩涡30s，间隔4次，共振荡2min，充分悬浮。将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液完全分离，去上清。加入150μl室温的1X WII，将离心管漩涡30S，间隔2次，共振荡1min，充分悬浮。利用磁力架分离，去除上清。加入150μl室温的1X WIII，漩涡振荡30s，去除上清。加入22.5μlNuclease-Free Water重悬磁珠。

S9、捕获产物PCR扩增富集纯化，获得捕获文库；

按表7配备PCR反应体系，进行PCR扩增富集。扩增程序：98℃，45s；98℃，15s，57℃，30s，72℃，30s，共12个循环；72℃，1min，4℃保持。扩增产物利用1X CapSeq PUR Beads纯化，步骤同S4。加入30μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，使用移液器充分悬浮磁珠，并静置2～5min洗脱DNA。

表7 PCR扩增体系

将步骤S9获得的文库采用High Sensitivity D1000电泳试剂，Aligent 4200电泳仪进行电泳，分析分选片段大小，其分选片段长度主峰为300bp左右，如图1所示，从左往右，第一个峰为小分子Maker(lower marker)，大小为20bp，中间峰为探针捕获后的大小在300bp左右的文库片段，右侧峰为大分子片段(upper marker)，大小为1000bp。目的片段长度主峰为300bp左右，即文库中的大部分片段长度位于300bp左右，符合文库制备所需的片段大小要求。

将步骤S9获得的文库进行Qubit定量后，取96个文库中浓度最低的值作为目标稀释值，把96个文库等摩尔量混合为一管，计算最终文库的摩尔浓度并Qubit定量确认，最终通过Elution Buffer调整文库浓度为4nM。取5μl 4nM文库，加入5μL 0.2N NaOH溶液，室温5min对文库进行变性，然后加入4℃预冷的HT1溶液(MiSeq Reagent Kit v2试剂盒)将文库浓度稀释至20pM，取600μl稀释后的文库加入MiSeq Reagent Kit v2试剂盒的样品孔上机测序。

S12、将步骤S11得到的FASTQ原始数据进行生物信息学分析，指定个体红细胞抗原系统基因型。

将Miseq读出的FASTQ原始数据，采用CLC Genomics Workbench 21software专用软件分析各红细胞血型系统基因型。根据软件说明书，自主构建红细胞血型基因分型的workflow。在软件下分别导入36个红细胞血型系统基因的genomice模板，Track创建cDNA、mRNA参考序列模板。分别将FASTQ原始数据导入软件，利用QC功能对原始测序数据进行质量评价，然后利用Trim功能去掉质量低的序列和重复序列。将处理好的序列导入创建的workflow，进行Mapping和Alignment功能将所有有效读长(reads)依据不同基因标准序列进行拼接和重排，最后对测定序列的多态性进行分析。根据分析出来的多态性改变氨基酸改变分析。

由于数据信息量太大，无法用图谱展示所有序列具体图谱，为了示意，图2a-图2f分别列出了36个血型系统对应基因的全编码区捕获测序覆盖度示意图。图3a-图3e分别例举其中5个血型系统部分编码区测序序列图谱，其中：图3a为Duffy血型系统编码区部分测序图；图3b为Colton血型系统编码区部分测序图；图3c为Kx血型系统编码区部分测序图；图3d为Raph血型系统编码区部分测序图；图3e为FORS血型系统编码区部分测序图。通过软件分析，与标准参考序列比对，通过本发明所提供的方法可获得样本36个红细胞血型系统的基因分型结果。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：所述方法对36个红细胞血型系统对应基因的全部编码区序列进行捕获、文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，实现对36个红细胞血型系统基因单孔同步高通量基因分型，主要包括以下步骤：

S2、制备人基因组DNA；

S8、将步骤S7得到的液相杂交产物利用链亲和素偶联磁珠纯化已经与探针杂交的目的片段；

步骤S1中，36个红细胞血型系统基因集包括：001ABO血型系统的ABO基因、002MNS系统的GYPA和GYPB基因、003P1PK系统的A4GALT基因、004Rh血型系统的RHD和RHCE基因、005Lutheran系统的BCAM基因、006Kell系统的KEL基因、007Lewis系统的FUT3、008Duffy系统的ACKR1基因、009Kidd系统的SLC14A1基因、010Diego系统的SLC4A1基因、011Yt系统的ACHE基因、012Xg系统的XG和MIC2基因、013Scianna系统的ERMAP基因、014Dombrock系统的ART4基因、015Colton系统的AQP1基因、016Landsteiner-Wiener系统的ICAM4基因、017Chido/Rodgers系统的C4A和C4B基因、018H系统的FUT1基因、019Kx系统的XK基因、020Gerbich系统的GYPC基因、021Cromer系统的CROM基因、022Knops系统的CR1基因、023Indian系统的CD44基因、024Ok系统的BSG基因、025Raph系统的CD151基因、026JohnMilton Hagen系统的SEMA7A基因、027I系统的GCNT2基因、028Globoside系统的B3GALNT1基因、029Gill系统的AQP3基因、030Rh-associated glycoprotein系统的RHAG基因、031FORS系统的GBGT1基因、032JR系统的ABCG2基因、033LAN系统的ABCB6基因、034Vel系统的SMIM1基因、035CD59系统的CD59基因、036Augustine系统的SLC29A1基因；

2.如权利要求1所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：步骤S1中，所有捕获探针在合成时进行5’端偶联生物素且同管混合使用。

3.如权利要求1所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：步骤S2～S9中，探针捕获、文库制备试剂为欣基生物的CapSeq^TM探针杂交试剂盒。

4.如权利要求1所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：步骤S4、S5中，磁珠法纯化及片段分选所需的磁珠为欣基生物的CapSeq SA Beads磁珠。

5.如权利要求1所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：步骤S10中，文库质量检测试剂为High Sensitivity D1000电泳试剂，Qubit DNA双链定量试剂为Qubit dsDNA高灵敏分析试剂。

6.如权利要求1所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：步骤S11中，Illumina测序试剂为MiSeq Sequencing Reagent Kit，其规格为v2，300cycles。

7.如权利要求1所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获基因分型检测方法，其特征在于：步骤S12中，生物信息学分析软件为CLC Genomics Workbench21software。

8.36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获检测用探针集，其特征在于：所述探针集为核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.871所示的探针的集合。

9.根据权利要求8所述的36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获检测用探针集，其特征在于：所述探针的5’端偶联生物素标记，所述生物素为链亲和素。

10.36个红细胞血型系统基因全部编码区序列同步捕获检测试剂盒，其特征在于：所述36个红细胞血型系统的同步检测试剂盒包括具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.871所示的核苷酸序列且5’端偶联生物素标记的探针集以及用于文库构建、测序上机的试剂；