CN115803449A - 用于前列腺癌筛查和其他疾病的家用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

因此，本公开提供了用于收集生物液体和保存包含在所述生物液体中的任何DNA和/或RNA的试剂盒。所述试剂盒包括包含纤维的用于吸附预先选择的生物液体的擦拭物，所述擦拭物浸渍有用于保存吸附到所述擦拭物中的生物液体的一种或多种对皮肤友好的化学物质。所述试剂盒包括刚性的可重新密封的管，所述管被配置成在其中容纳浸渍的擦拭物；用于密封容纳浸渍的擦拭物的刚性的可重新密封的管以用于运输的可重新密封的袋。所述试剂盒包括关于如何用预先选择的生物液体浸渍擦拭物并将其密封在可重新密封的袋中的说明书，以及配置成在其中接收容纳浸渍的擦拭物的可重新密封的袋的返回信封。

Description

用于前列腺癌筛查和其他疾病的家用试剂盒
技术领域
本公开涉及用于各种疾病的筛查的试剂盒，并且更具体地，本公开涉及用于收集和运输存在于精液(包括前列腺癌)中的精液检测疾病生物标志物的“家用(At-Home)”试剂盒。
背景技术
前列腺癌是男性中最常见的诊断癌症，预期6名男性中就有1名在其生命期内被诊断患有该癌症。女性没有任何与前列腺相当的腺体。然而，不是所有的男性都会死于前列腺癌，因为大多数新诊断的前列腺癌患者具有低风险和中等风险的形式。这是因为前列腺癌的机会性筛查在过去30年已经就位，仅产生早期的迁移(较少的晚期病例，大多数早期病例在最初出现时被发现)。机会性筛查是不被任何健康当局认为在医学上强制性的一种类型的筛查。在与患者的家庭医生或泌尿外科医生讨论其情况之后，患者被认为是有选择的。因此，这是患者的责任，而不是省/健康当局的责任。目前，前列腺特异性抗原(PSA)血液测试用于机会性筛查以鉴定患有前列腺癌的男性。
相比之下，系统性的筛查在医学上是强制性的/推荐的，并且由大多数健康当局支付费用。特定疾病的系统性筛查的测试的实例：宫颈癌的Pap涂片、结肠癌的结肠镜检查和乳腺癌的乳房X线照片；以及检测传染性疾病的COVID。其中一些由强1级流行病学证据(Pap涂片，结肠镜检查)支持，而一些由于大流行措施或强患者宣传小组(乳腺癌患者/存活者)在医学上是强制性的。对于前列腺癌的筛查，只有机会性筛查的指导方针已经就位，这是由诸如美国泌尿学协会(AUA)和加拿大泌尿学协会(CUA)的医学协会建立的。因此，前列腺癌的筛查被认为是选择性的，因为PSA测试的有瑕疵的有效性及其对男性健康的风险。
前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺癌的临床检查
PSA按照其名称是由前列腺产生的分泌酶蛋白，并且是精液的关键成分。精液是在射精过程中释放的液体，并且由两种腺体分泌物组成：前列腺液(前列腺)和精子液(精囊)。通常，精液是30％的前列腺液和70％的精子液。这两种液体保持分离并最终在射精后彼此相互作用，这时它们变得混合，形成最初“胶凝”并短暂变粘，然后变液化的精液。每个腺体产生精子功能所需的一组特定的蛋白质。前列腺液含有诸如PSA的蛋白质，并且可以含有由前列腺癌细胞分泌的，或者通过从肿瘤脱落到导管中的生物标志物，在所述导管中前列腺液分泌物在射精之前积累。精子液含有使精液暂时粘稠所需的各种蛋白质，例如精囊蛋白(Semenogelin)。相反地，前列腺液含有引起精液最初“胶凝”，然后引起其随后的精液液化的蛋白质和电解质/代谢物。这种最初的“胶凝”允许精子在短时间内粘附到子宫壁上。在数分钟内，PSA将溶解该凝胶，以允许精子向上迁移至输卵管，以找到卵。因此，PSA不是前列腺癌特异性生物标志物，它仅是前列腺特异性生物标志物。其在男性血液中被检测到仅表明前列腺存在问题，并且这可能前列腺感染、良性前列腺增生(BPH)、创伤或前列腺癌。
PSA测试是在Roswell Park Cancer Center(Buffalo,NY)开发的，并且本质上使用ELISA测定测量患者血清样品(离心后凝结血液的上部部分)中存在的PSA蛋白的量。用于ELISA测定的PSA抗体使用比色读数来定量患者血液样品中PSA的水平。通过分光光度计收集数据并通过计算机捕获和分析数据。有多种抗体可用于该测定中以检测与其它蛋白质复合或不复合的PSA形式(游离PSA、总PSA)。
PSA的性能测试特性在血液中以已知能准确预测多少百分比的患者是否患有前列腺癌的各种水平被高水平地记录。目前，泌尿外科医生使用血清中>4ng/mL的PSA(在室温下以>1,000×g离心>10分钟后，凝结血液的上清液)作为怀疑他们第一次看到的人的前列腺癌的截止值。然而，4ng/mL及以上的PSA仅用作“危险信号”。这不是泌尿外科医生形成前列腺癌诊断的主要方法；它只是一系列第一步中的一步。目前用于诊断前列腺癌的金标准是前列腺的针刺活检。这是在对患者的癌症风险进行临床评估之后进行的，所述癌症风险包括家族史、PSA值(ng/mL)、数字化直肠检查、年龄和种族。这些临床参数都起重要作用，因为目标是最小化接受针刺活检的患者的数量；这是一种高度侵入性的过程，其具有显著的副作用，因为针必须紧挨着前列腺穿刺入直肠以对前列腺进行活检。在前列腺针刺活检之后，男性可能遭遇尿血，精液血和一些失禁(尿功能降低)，并且在一些情况下遭遇败血症，这可能由于由用于获得组织的12个针中的任一个引起血液中的粪便污染而导致死亡。因此，对于泌尿外科医生来说，重要的是认识到请求针刺活检的决定可能对患者具有显著的危害，并且必须进行额外的考虑。
当患者将要进行前列腺针刺活检以确认前列腺癌的存在时，对于他实际上没有癌症仍然有40-50％的机会。这意味着，在泌尿外科医生的临床评估的PSA测试以及决定进行针刺活检之后，仍然存在所有这些评估都是不必要的显著机会。此外，那些被告知患有癌症的患者将进一步困惑：只有一半的病例需要立即治疗。这是因为只有少数患者患有高风险的前列腺癌，其仅在分析通过前列腺针刺活检收集的组织后才被诊断。实际上，大多数新诊断的癌症病例是低风险和中风险的。这些风险类别是基于肿瘤如何在组织学上(在显微镜下)呈现，并且这些被指定为称为Gleason Group系统的特殊评分系统。低风险前列腺癌分类为GG1；中风险前列腺癌被分类为GG2；而高风险前列腺癌分类为Gg3、4和5。我们知道，具有低风险癌症(GG1)的患者具有<1％的机会死于他们的癌症。患有中风险癌症(GG2)的患者具有约5-8％的机会死于他们的癌症。因此，普遍认为我们根本不应该将GG1前列腺癌称为“癌症”。
前列腺癌患者从机会性筛查的临床检查程序到根治性治疗(外科手术、放射疗法)已经经历了显著的发展，但是仍然存在两个主要的需要显著改进的事情：将PSA血液测试替换为机会性筛查工具和针刺活检的准确性。
通常，将精液收集在罐状容器中并保持其液体状态直到其到达实验室。这是因为通常对精液进行精子计数分析，其要求精子在液体中持续能动和存活，直到实验室分析。这也意味着通过信件发送罐状容器中的精液样品很少进行，这是因为样本到达实验室所花费的时间长度(如果使用普通信件，则需要过夜到4天)以及在信件中发送塑料容器的不便。这些限制不利地影响用于分析的精子的活力。
因此，对于RNA/DNA生物标志物和其它感兴趣的蛋白质/代谢物生物标志物的精液分析，提供一种在它们失效前与分析生物标志物相容的不同形式将是非常有利的。为了在运输到实验室进行分析期间保存和维持这些不稳定的生物实体(RNA/DNA/蛋白质/代谢物/电解质)的完整性，需要特定的装置设计。
发明内容
本公开以两种方式解决了与当前机会性筛查工具/方法相关的问题：1)对于FDA已经批准的前列腺癌生物标志物，由于精液分析在检测临床相关前列腺癌(GG2及以上)的准确率方面的显著改善，和2)收集生物液体(精液)以检测前列腺癌的非侵入性、有效且方便的方式，其保存了可能用于诊断前列腺癌的分析的生物实体的环境，所述生物实体例如蛋白质，代谢物(分解代谢物、类固醇等)、RNA、DNA和细胞。
本公开提供了用于筛查疾病包括但不限于前列腺癌的“家用”试剂盒。个体使用用0.5％ SDS+5mM EDTA溶液或RNA酶/DNA酶抑制剂的任何组合浸渍的高压灭菌纸/餐巾(纸巾、滤纸、镜头纸、纤维素/人造丝混合织物)来收集和保存自表达或射出的精液。将收集精液后的这种湿巾/干巾(wetnap/drynap)或“精液擦拭物”放入透明塑料袋(即，自封袋或更强的东西)中，然后通过邮寄发送到服务场所或核心实验室，其将分析精液中的各种生物标志物。在射精后收集和运输过程中，精液将被吸附并最终在精液擦拭物上干燥。RNA酶/DNA酶抑制剂防止靶RNA和DNA序列的进一步降解，从而保存这些生物标志物用于在核心实验室进行分析。然后将这种“预处理的纸”或精液擦拭物放入含有溶液的小瓶中，所述溶液用于洗脱含有RNA/DNA的细胞以及存在于精液液相内的无细胞RNA/DNA。该洗脱级分还将含有来自患者精液的蛋白质和代谢物，其也可用于分析癌症生物标志物。然后将洗脱级分均质化并用试剂盒进行RNA/DNA提取；然后将所得的纯化的RNA/DNA用于通过分子生物学技术和仪器进行生物标志物分析。可使用的生物标志物包括但不限于PCA3IncRNA、PSA mRNA(尿PCA3测试)；BRCA2/1DNA突变分析；血清T水平；以及Y染色体臂缺失。
因此，本公开提供了用于收集生物液体和保存所述生物液体中所包含的任何DNA和/或RNA的试剂盒。所述试剂盒包括包含纤维的用于吸附预先选择的生物液体的擦拭物，所述擦拭物浸渍有用于保存吸附到所述擦拭物中的生物液体的一种或多种对皮肤友好的化学物质。所述试剂盒包括刚性的可重新密封的管，所述管被配置成在其中容纳浸渍的擦拭物；用于密封容纳浸渍的擦拭物的刚性的可重新密封的管以用于运输的可重新密封的袋。所述试剂盒包括关于如何用预先选择的生物液体浸渍擦拭物并将其密封在可重新密封的袋中的说明书，以及配置成在其中接收容纳浸渍的擦拭物的可重新密封的袋的返回信封。
一种或多种对皮肤友好的化学物质可包括充当一般核酸酶抑制剂的化合物。
一般的核酸酶抑制剂可以包括RNA酶和DNA酶抑制剂的任何一种或组合。一般的核酸酶抑制剂可以包括十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯磺酸和焦碳酸二乙酯中的任何一种或组合。十二烷基硫酸钠(SDS)可以以约0.01％ SDS v/v至约5％ SDS v/v的范围存在。
十二烷基硫酸钠(SDS)可以以约0.5％v/v的浓度存在。
一种或多种对皮肤友好的化学物质还可以包括EDTA溶液，其用于抑制RNA酶/DNA酶活性并诱导RNA/DNA与擦拭物的纤维结合。
EDTA溶液可包含约1至约5mM EDTA溶液。
所述一种或多种对皮肤友好的化学物质还可包括经选择以保存蛋白质生物标志物并防止细菌和霉菌生长的化合物。
该化合物可以是在溶液中的叠氮化钠。叠氮化钠可以以约0.01％至约0.2％的范围存在于溶液中。
根据权利要求10的试剂盒，其中叠氮化钠以<0.2％的浓度存在于溶液中。
包含纤维的擦拭物可以是包含纤维的纸和包含纤维的织物中的任何一种。
擦拭物可以包括沿着擦拭物的一个边缘的狭缝，其尺寸被设计成在DNA/RNA提取过程中被捕获在DNA/RNA管上的帽和管本身之间，从而擦拭物被披挂在管的帽上并下垂进管的内部，擦拭物的底部边缘与管的底部间隔开。
擦拭物可以包括附着其上的机器可读代码粘贴物，用于将擦拭物与被筛选/测试的患者连接，并且用于在邮寄和分析过程期间保护患者隐私。
所述试剂盒还可以包括可下载的智能电话应用程序，其被配置和编程为扫描机器可读代码粘贴物以将患者的擦拭物电子连接到他们的图表/概况，所述智能电话应用程序被配置和编程为将扫描机器可读代码粘贴物的结果电子地发送到任务为分析擦拭物的实验室，并且其中所述智能电话应用程序被配置和编程为接收来自实验室的电子传输的信息以评估被实验室接收的患者的擦拭物。
要收集的生物液体可以是精液。
通过参考下面的详细描述和附图，可以实现对本发明的功能和有利方面的进一步理解。
附图的简要说明
现在将参考附图仅以示例的方式描述本发明的优选实施方案，其中：
图1图示了根据本公开产生的精液擦拭物的五个特征；
图2图示了一旦将精液收集在擦拭物中并且患者将干燥的精液擦拭物邮寄到实验室后，将使用的精液擦拭物锚定到锥形管的过程；
图3图示了用各种类型的精液擦拭物回收的DNA的量。在使前列腺癌细胞沉积到精液擦拭物上之后，用SDS预处理精液擦拭物产生了的高DNA回收；
图4图示了用各种类型的未高压灭菌但用SDS预处理的精液擦拭物回收的RNA的量。通过高压灭菌或任何其它灭菌方法对精液擦拭物进行灭菌是至关重要的，因为观察到大部分RNA在所有擦拭物中大部分降解，但是对用SDS预处理的擦拭物观察到一定程度的保存；
图5图示了当使用前列腺癌细胞作为精液擦拭物收集的样本时，用SDS和EDTA预处理的灭菌精液擦拭物导致最高的RNA回收率；
图6图示了用SDS和EDTA预处理精液擦拭物如何抑制RNA降解，特别是在较大的尺寸(28S RNA)下。与没有预处理相比，SDS和EDTA的使用导致多回收了50％的28S RNA；
图7图示了当使用前列腺癌细胞作为精液擦拭物收集的样本时，用SDS和EDTA预处理的灭菌精液擦拭物导致最小的RNA降解，如通过RIN(RNA完整指数)所测定的；
图8图示了与对照(1E6或1×106个细胞具有的RNA)相比，用SDS和EDTA预处理的精液擦拭物导致PC3癌细胞内存在的所有RNA几乎完全的回收；和
图9图示了当使用先前从PC3癌细胞提取的纯化RNA时，用SDS和EDTA预处理的精液擦拭物导致约40％的RNA回收率。还观察到最小的RNA降解(高RIN指数)。
详细描述
将参考以下讨论的细节来描述本公开的各个实施方案和方面。以下描述和附图是本公开的示例，而不应被解释为限制本公开。描述了许多具体细节以提供对本公开的各个实施方案的透彻理解。然而，在某些情况下，为了提供对本公开的实施方案的简洁讨论，不描述公知的或常规的细节。
一些附图可以不是按比例绘制的，并且一些特征可以被放大或最小化以显示特定元件的细节，而相关元件可能已经被去除以防止使新的方面模糊。因此，在此公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是作为权利要求的基础和作为用于教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”应被解释为包括性的和开放式的，而不是排他性的。具体地说，当在包括权利要求书的本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”及其变型表示包括指定的特征，步骤或组分。这些术语不应被解释为排除其它特征、步骤或组分的存在。
如本文所用，术语“示例性”意指“用作实例、例子或说明”，且不应被解释为优选的或比本文所公开的其它配置有利。
如本文所用，术语“约”和“大约”旨在涵盖可能存在于数值范围的上限和下限中的变化，例如性质、参数和尺寸的变化。除非另有说明，术语“约”和“大约”是指加或减25％或更少。
应当理解，除非另有说明，任何指定的范围或组作为单独提及范围或组的每个成员以及其中涵盖的每个可能的子范围或子组的简写方式，并且与其中的任何子范围或子组类似。除非另有说明，否则本公开涉及并明确地并入了子范围或子组的每个特定成员以及组合。
如本文所用，术语“与…相似”当与量或参数结合使用时，是指跨越所述量或参数的大约十分之一至十倍的范围。
前列腺癌筛查的家用试剂盒
本文公开了一种“家用试剂盒”，其中男性提供精液样品，所述样品通过信件以常规的信封被发送到实验室进行分析。
我们定义了如本文所公开的“家用试剂盒”，其为包括以下的材料集合：1)精液擦拭物，2)可重新密封的塑料自封袋，3)纸制说明书，4)返回信封。我们将“精液擦拭物”定义为一张纸/一块织物，其浸渍有各种对皮肤友好的化学物质并将使收集到所述纸/织物上的任何精液的保存最大化。它具有各种其它设计特征，这将在下文进行描述(图1)。
将精液样品收集到专门的纸片(纸巾/镜头纸)上，所述纸片含有痕量的无毒化学物质，所述无毒化学物质将防止DNA和RNA降解。在一个实施方案中，该化学物质可以是0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液，然而应当理解，范围可以从约0.01％ SDS v/v至约5％SDS v/v变化，因为高于该上限的任何值将超过对于人类暴露的SDS的可允许的最大浓度。还应理解的是，除了SDS之外，可以使用能够抑制精液或空气中存在的RNA酶和DNA酶的任何其它化学物质，例如EDTA，其可以通过螯合酶功能必需的各种二价阳离子(Mg2+、Ca2+、Zn2+)来抑制RNA酶和DNA酶的活性。然而，对这种化学物质有一个主要要求：它必须是无毒性的或对人类皮肤无刺激性的，因为这种纸巾/镜头纸在精液收集期间将与患者的皮肤接触。可用于抑制精液中或空气中或皮肤上存在的RNA酶和DNA酶的替代化学物质包括但不限于聚乙烯磺酸和焦碳酸二乙酯，以提及一些非限制性实例。
参照图1，显示了本文公开的总体上用10显示的精液擦拭物的几个关键特征。在一个实施方案中，精液擦拭物10可以是具有五个(5)关键特征的镜头纸(“4×6”并且可以更小或更大)。应当理解，精液擦拭物不限于由镜头纸，或其它形式的纸巾，或其它织物/纸混合膜制成。例如，精液擦拭物的其它非限制性实例包括但不限于织物和作为纸纤维布混合物的材料。擦拭物中所需的基本性质如下：1)它是织物/纸形式，其可用作擦拭物以从表面吸附任何液体材料，例如精液；2)其浸渍有化学试剂(例如约0.1至约5.0％v/v SDS)，所述化学试剂将使被吸附到所述擦拭物上的精液/生物液体中存在的所有RNA酶和DNA酶失活；3)其浸渍有化学试剂(例如约1至约5mM EDTA溶液)，所述化学试剂将抑制RNA酶/DNA酶活性并优化RNA/DNA与擦拭物的纤维的结合；4)在一侧上具有小切口/开口/狭缝，在从精液擦拭物提取RNA的过程中，所述小切口/开口/狭缝充当用于将精液擦拭物固定至锥形管一侧的翼片(flap)；5)具有附着于精液擦拭物的一角的QR代码粘贴物，在测试过程中，所述QR代码粘贴物用于追踪和识别目的。
在图1的最上部的图中示出的第一个关键特征是，收集装置是一片镜头纸或任何织物，其允许使用者以简单易用的方式通过人的手从任何表面(皮肤、马桶、地板、床单等)吸附。这种形式由于擦拭物的干燥部分的吸附而允许立即干燥生物液体(精液)。图1的下一幅图中所示的第二个关键特征是用SDS(<5.0％)或任何其它对皮肤友好的无毒化学物质处理擦拭物，所述无毒化学物质用作一般的核酸酶抑制剂。它还可以任选地含有少量叠氮化钠(<0.2％)(但可以在约0.01％至约0.2％的范围内)以保存蛋白质生物标志物并防止细菌、霉菌等的生长。一旦用SDS处理，将擦拭物10干燥，然后包装到“家用试剂盒”中，然后由患者获得用于精液收集。
第三个关键特征是擦拭物经受摩擦生电(triboelectrification)，在摩擦生电后，擦拭物将变成带正电的。这将增强擦拭物10的纤维保留RNA的能力并增加其RNA结合能力以保护它。在一个实施方案中，可以使用称为乙二胺四乙酸(EDTA)(约1至约10mM)的化学物质来实现这一点。在可供选择的实施方案中，其它化学物质如聚乙烯亚胺也可以实现这一点。这些化学物质还结合任何游离的二价离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+等)，这些二价离子是酶如RNA酶保持活性所需的。可用于此目的的其它化学物质是二硫琥珀酸、二巯基丙醇、去铁胺和青霉胺。
第四个关键特征是精液擦拭物10设置有狭缝12，狭缝12在擦拭物的一端提供翼片14，翼片14允许使用者将用过的精液擦拭物锚定到锥形管的内侧，以便保持用过的精液擦拭物与包含感兴趣的生物标志物的洗脱部分分离(见下面讨论的图2)。这在整个单元的离心过程中是有效的，使得在高离心速度下，精液擦拭物将保持锚定到锥形管的一侧，而洗脱级分将浓缩在管的底部。这将允许使用者收集大部分液体用于下游步骤。
第五个关键特征是擦拭物10设置有条形码16(或QR代码或其它类似的代码)，以便将擦拭物与被筛选/测试的患者连接，并且在邮寄和分析过程期间保护患者的隐私。
图2显示了一旦干燥的擦拭物已经在实验室接收用于分析时，将用过的精液擦拭物10锚定到锥形管20上的过程。翼片14的设计特征使得使用者能够将洗脱溶液与用过的精液擦拭物混合，并因此将用过的精液擦拭物与其提取的生物内容物(精液中存在的RNA/DNA/蛋白质/代谢物)分离，所述生物内容物变得溶解/释放并存在于洗脱溶液中。由图1中所示的狭缝12形成的翼片14将允许使用者将镜头纸的披挂部分披挂在锥形储存管20的侧面上，如上部中间的图的中间所示，其显示了帽22与管20的其余部分分离。当使用螺帽或帽22时，镜头纸翼片14将被紧固在锥形管29和帽22的螺纹之间。这将把用过的精液擦拭物10锚定在锥形储存管20的内壁上。在加入洗脱溶液后，放置帽22，然后使用管旋转器/转子混合管20的内容物。在混合之后，整个密封的锥形管20将被离心，导致用过的精液擦拭物(管的内壁)和位于管20底部的洗脱溶液26分离。将含有精液的生物内容物的洗脱溶液转移到另一个管中用于进一步处理和通过qPCR或ELISA分析生物标志物。这种构造和设置使得能够在最少的操作或打开帽的情况下处理精液擦拭物，以防止在样品提取过程中释放来自Trizol或苯酚的任何烟雾。
图3显示了当前列腺癌细胞(PC3细胞系)直接沉积到精液擦拭物的版本上时，从精液擦拭物中回收DNA的有效性。精液擦拭物或者用SDS预处理，或者不处理，并且在癌细胞沉积到精液擦拭物上之后立即尝试DNA回收，或者在癌细胞沉积之后4天尝试DNA回收。在从精液擦拭物中洗脱DNA并提取DNA后，进行分光光度法以定量DNA产率。在不考虑是否预处理的所有组中，回收了大量的DNA。这表明精液擦拭物能够收集细胞DNA并适于回收用于随后的DNA突变分析。
图4显示了当前列腺癌细胞(PC3细胞系，1×106个细胞沉积到各擦拭物上)直接沉积到各种形式的精液擦拭物上时，从精液擦拭物中回收RNA的有效性。这些精液擦拭物不进行高压灭菌(不是无菌的)并且用SDS预处理或不进行任何处理。在癌细胞沉积到精液擦拭物上之后立即尝试RNA回收，或者在癌细胞沉积之后4天尝试RNA回收。在用SDS预处理并在癌细胞沉积后4天提取的精液擦拭物中观察到回收的最高量的RNA。回收的最低量的RNA是当未对精液擦拭物进行预处理时。然而，由于精液擦拭物在用SDS预处理之前未经高压灭菌，所以在所有精液擦拭物中大部分RNA被降解。
图5显示了对精液擦拭物进行灭菌，同时用SDS和另一种RNA稳定剂EDTA预处理外对从通过精液擦拭物收集的基于细胞的样本中回收的RNA的影响。将前列腺癌细胞沉积在精液擦拭物(PC3细胞，1×106个细胞/擦拭物)上，除了这样的一组，其中将擦拭物施加到前列腺癌细胞皿中，导致细胞的次优吸附。进行此操作以评估精液擦拭物在培养基中吸收癌细胞的能力。在T＝4天时从精液擦拭物中洗脱和提取RNA。凝胶电泳显示，用SDS或SDS+EDTA预处理的精液擦拭物具有最高的RNA回收，其中强条带代表28S RNA和18S RNA。未经处理的精液擦拭物回收了最少量的RNA。对癌细胞具有次优吸附的精液擦拭物也产生低水平的回收RNA。
图6显示了与未经处理的精液擦拭物相比，SDS和EDTA预处理的精液擦拭物如何导致大RNA种类如28S RNA种类的最大保存。使用与图5所示相同的样品，与SDS+EDTA预处理的精液擦拭物相比，未经处理的精液擦拭物中的28S RNA减少了64.3％。与未经处理的精液擦拭物相比，在精液擦拭物中单独使用SDS导致回收的28S RNA多约50％。
图7显示了用SDS和EDTA预处理的精液擦拭物如何抑制RNA降解，特别是在较大的尺寸(28S RNA)时。RNA完整指数(RIN)计算为28S RNA的量与18S RNA的量之比乘以10。当存在与18S RNA等量的28S时，则认为该样品具有优异的RNA产率和最小的RNA降解。相对于样品中的18S RNA，28S RNA的量越低，则这表明在电泳凝胶分析之前在样品中已经发生了显著的RNA降解。RIN指数在用SDS和EDTA或单独的SDS预处理的精液擦拭物中最高。在未接受预处理的精液擦拭物中观察到最低的RIN指数。
图8显示了精液擦拭物如何有效地从沉积在各种版本的精液擦拭物上的前列腺癌细胞中回收RNA。灭菌然后用SDS和EDTA预处理的精液擦拭物产生与对照样品相同量的RNA(28S和18S RNA种类)，所述对照样品是从1×106个PC3细胞中提取的RNA(约95％的回收率)。仅用SDS处理的精液擦拭物产生约70％的RNA回收率，而仅用EDTA预处理的精液擦拭物产生约35％的RNA回收率。未经预处理的精液擦拭物产生非常低的RNA回收率。
图9显示了SDS+EDTA预处理在回收沉积在精液擦拭物上的纯化RNA中的有效性。通过Trizol试剂从PC3细胞分离RNA，然后以不同的量(0.5、1.0、2.0、5.0μg)沉积到精液擦拭物上，然后在T＝3天时从精液擦拭物回收RNA。在RNA回收后，通过凝胶电泳分析样品，并与5μg起始材料RNA进行比较。2.0和5.0μg回收精液擦拭物的RIN值高(>10)。与加载对照(5.0μg)相比，5μg和2μg精液擦拭物组的RNA回收率分别为50％和38％。这些结果表明纯化的或细胞外的RNA种类可以通过精液擦拭物以最小的RNA降解(RNA>10)被充分地回收。
使用精液作为分析物有几个优点。首先，其是确定是否存在由前列腺癌肿瘤释放的癌症相关生物标志物的最直接的方法。这是因为前列腺癌肿瘤生长到分泌前列腺液的前列腺导管中，并且在这样做时，自然地将其自身的各种形式(细胞、细胞片段、囊泡、蛋白质、RNA/DNA、代谢物、电解质)释放或脱落到前列腺液中。因此，精液是前列腺癌特异性生物标志物如PCA3和BRCA1/2的储库(请参见下一节)。其次，与提供需要皮下针刺的血液相比，精液的自表达(通过手淫)是非侵入性的。第三，已知在精液中存在可用于诊断的几种临床上确认过的前列腺癌生物标志物，例如PCA3 IncRNA水平、PSAmRNA水平和BRCA1/2DNA突变(请参见下一节)。第四，精液样品可以在男人家私下收集，而不是在诊所提供样品。
使用用SDS(或对皮肤友好的抑制RNA酶/DNA酶的类似功能的化学物质)处理的一片纸巾/镜头纸或织物在射精后收集精液也具有各种优点。首先，将精液沉积到干燥的基底如纸巾/镜头纸上立即干燥样品并防止任何生物标志物(蛋白质，RNA/DNA)的进一步降解。这是因为核酸酶如RNA酶和DNA酶需要水性环境以便接近和结合任何周围的RNA/DNA以进行降解。
保存精液中的RNA/DNA是必需的，因为我们正在寻找两种RNA种类的水平：PCA3和PSA作为PCa的生物标志物。如果所有的蛋白质和RNA/DNA被固定到纸的纤维上，则RNA/DNA降解被显著抑制。其次，由于男性通常由于射精而产生约0.5至约4.0mL的精液，因此用SDS处理的纸巾/镜头纸的尺寸可以更小(“4×6”)以吸附收集的精液。用SDS处理的这种小尺寸的纸巾/镜头纸可以适合大多数要邮寄的纸制信封，以便在实验室进行分析。第三，由于在这种纸巾/镜头纸上存在用于收集和吸附精液的SDS，因此SDS化学物质将抑制精液中以及在吸附到纸上期间，精液可以存在的表面(马桶、润滑剂、床单等)上的任何RNA酶或DNA酶。
这意味着患者可以安全地使用其上具有SDS的纸巾/镜头纸或“精液擦拭物”来安全地清洁通过射精释放的任何或所有精液。最后，使用具有SDS的纸巾/镜头纸或“精液擦拭物”允许通过简单地添加洗脱溶液而容易地从纸上洗脱或提取遗传物质。洗脱后，可以立即进行步骤，以进行对PCA3 IncRNA和PSAmRNA水平的定量PCR。
精液擦拭物是用于性传播疾病的有效的、非侵入性的采集装置
精液擦拭物10也可用于筛查性传播疾病，例如疱疹、HIV、衣原体、淋病、滴虫病和梅毒。这是可能的，因为精液是这些疾病的储库，并且是性交期间精液交换过程中伴侣之间传播的载体介质。因此，精液擦拭物10中的防腐剂使得收集精液和擦拭男性或女性生殖器皮肤用于测试是理想的。与其它生物液体例如尿和血液穿刺(其是不准确的或者引起疼痛的)相比，这将显著地使得收集和采用更直接。这些STD的检测将通过对这些病毒传播疾病中的每一种的基因组进行qPCR分析来进行。这意味着存在于精液中的代表SARS-CoV-2RNA基因组(COVID-19)的RNA和其它大流行病毒如MERS、SARS、流感也可用作感染患者的潜在诊断或定量治疗反应。
考虑到特定的保存要求，非常有利的是具有一种用于在射精后立即保存和有效地收集精液的紧凑型装置。本公开中的收集和保存机构是用于容易地从患者皮肤或从诸如床单等表面收集精液样品的形式或纸巾/镜头纸擦拭物。这种纸基结构或装置立即将精液中的所有生物材料固定到“精液擦拭物”上，并立即干燥样品，因为精液中的液体将通过吸附通过纸基擦拭物扩散。由于生物标志物的降解仅在水性环境中是可能的，因此这种干燥效应将快速保存大多数生物标志物类型(除了细胞，例如癌细胞，精子)。它不会保存细胞，因为纸也会抽出细胞/精子中的水，从而使其不再存活。浸渍到擦拭物中的RNA酶/DNA酶抑制剂的任何组合的存在保存了存在于自表达的精液中的任何疾病生物标志物。
本文公开的“精液擦拭物”是独特的，并且被设计用于在射精之后立即收集精液并立即保存该生物液体材料。它使用非常薄的纸片(镜头纸/纸巾)作为擦拭物，以便从精液样品可以在其上的任何表面(男性生殖器皮肤、地板、马桶、床单等)有效地收集样品。(非限制性的)小尺寸(“4×6”英寸)意味着它足够紧凑以便在大多数信封中被发送到实验室。
提供给患者的精液擦拭物含有抑制降解RNA或DNA的特异性酶(核酸酶)的作用的试剂，所述特异性酶称为RNA酶和DNA酶。它还可以含有少量的叠氮化钠(至多0.02体积％)，以防止细菌或霉菌等的任何生长。
在一个实施方案中，用于抑制核酸酶的化学物质是十二烷基硫酸钠或SDS(在H2O中约0.1至约5.0体积％)，并且在该浓度下对人类皮肤没有毒性或刺激。已知的核酸酶抑制剂的其它化学物质可以代替SDS使用，只要它们对皮肤无刺激即可。这将排除熟知的RNA酶抑制剂溶液，例如对皮肤有毒性的“RNAlater”。精液擦拭纸含有促进纸纤维上的正电荷的试剂。可以通过与其它未使用的精液擦拭物的摩擦，与玻璃/塑料棒的摩擦，或加入约1至约5mM EDTA或约0.1至约1.0％聚乙烯亚胺(它们都是无毒性的或皮肤刺激性的)来进行摩擦生电。螯合二价离子(例如Ca2+、Mg2+等)的化学物质也是关键成分，因为这些化学物质通过阻断精液中的酶促活性来防止RNA/DNA和蛋白质降解。任何螯合化学物质都应该可以使用，只要它们对皮肤无刺激性即可。
将快速响应(QR代码)粘贴物放置在提供给患者的擦拭物的一个角上。这将允许使用者将患者的精液擦拭物与他们的图表/概况电子“连接”到，并允许患者和他们选择的医生看到他们的测试结果。这将消除在用过的精液擦拭物在信件中发送时对其中包含的任何自我识别信息的任何需要。专用于精液擦拭物技术的智能电话应用程序可以用于扫描QR代码，然后QR代码将患者的精液擦拭物电子“连接”到他们的图表/概况。关于已经连接到使用者/患者的精液擦拭物的这种信息将被电子发送到核心实验室。
核心实验室将能够确认精液擦拭物将已经到达，并确定由患者/医生进行的测试命令。该精液擦拭物申请路径将提高所进行的测试的准确性，同时还最小化在整个提交过程中使用的患者识别信息的量。该应用程序还可以接收关于精液擦拭物的信息(接收的确认、精液擦拭物测试的时间表、错误等)，并通过智能电话应用程序将其发送给患者/使用者。精液擦拭物特定的智能电话应用程序还可以用于帮助患者在智能电话应用程序扫描QR代码之后提供支付，从而将该特定的精液擦拭物连接到患者的ID。
这种应用程序还可以用作他们的家庭医生或泌尿外科医生的通信端口，并且还包含与前列腺癌筛查、治疗选择和关于各种相关主题的多媒体文件有关的材料库。应用程序还可以提供关于如何使用精液擦拭物以及如何经由邮寄提交使用过的精液擦拭物的指令。精液擦拭物特定的应用程序也可用于临床试验，并通过电子格式获得用于使用精液擦拭物进行分析的试验的知情同意书。
用于使对患者的擦拭物中提供的RNA/DNA降解最小化的化学试剂也可以被施加到塑料袋的内表面，以形成内袋，在其中精液擦拭物被输送到实验室。一旦用过的“精液擦拭物”被放置在袋中，该袋然后被放置在返回信封中以便在信件中被发送，这也将有助于最小化RNA/DNA降解。
一旦在实验室接收到具有吸附和干燥的精液的擦拭物，则通过使用专有溶液最大限度地提取来自擦拭物的所有生物材料，并且这些通常由蛋白酶抑制剂和用于分析代谢物的强酸的混合物组成，例如柠檬酸盐以及锌和镁；用于分析RNA/DNA/蛋白质的苯酚和强酸。这些洗脱溶液用于将精液样品从擦拭物转移到溶液中，用于随后的分析，例如qPCR或比色测定(蛋白质、柠檬酸盐、锌水平)。该专有溶液将在接收使用过的“精液擦拭物”样本的实验室中使用。
本发明的“家用”试剂盒可用于代替前列腺癌筛查的血清PSA水平。它还可以用于收集其它生物液体，例如鼻液、痰、粪便、皮肤/汗液、骶骨液、伤口和月经血。它允许患者提交任何类型的生物液体用于可以由邮寄发送的进一步的分析。包含同意书、信息/小册子/说明书、湿巾/干巾，储存用过的湿巾/干巾的袋和返回信封的信封体现了生物液体收集的整个过程。
总之，本文提供了一种提供给患者的试剂盒，其包括收集自表达的精液的“精液擦拭物”(例如，纸巾、滤纸、镜头纸、织物)，其浸渍有0.5％SDS溶液和5mM EDTA或也对皮肤友好的RNA酶/DNA酶抑制剂。当用于收集射精后的任何精液时，该湿巾/干巾或“精液擦拭物”将被放置在透明塑料袋(即，自封袋或更强的东西)中，然后在信件中被发送到将分析精液的服务场所。在精液擦拭物暴露于精液后，精液将被吸附并最终干燥。整合到提供给患者的精液擦拭物中的RNA酶/DNA酶抑制剂将防止靶RNA和DNA序列的进一步降解。也被共浸渍到精液擦拭物中的RNA稳定剂如EDTA也将防止靶RNA和DNA序列的进一步降解，因为它将螯合RNA酶/DNA酶活性所必需的任何二价离子(Mg2+、Ca2+、Zn2+等)。一旦在测试实验室接收，将该“精液擦拭物”置于含有用于提取RNA、DNA、蛋白质或代谢物的溶液的小瓶中。然后将含有感兴趣的生物分析物的洗脱溶液用于用试剂或试剂盒进行的RNA/DNA提取。待测生物标志物包括PCA3 IncRNA、PSA mRNA(尿PCA3测试)；BRCA2/1DNA突变分析；血清T水平；Y染色体缺失。
因此，精液擦拭物是有效收集和最大限度保存精液及其生物分析物成分，如靶RNA分子、DNA、染色体、蛋白质、蛋白质复合物、聚糖、代谢物、细菌、病毒和细胞的有效试剂盒；所有这些都可以存在于精液中。这些生物学实体及其水平或突变状态可用于鉴定患者是否患有给定的疾病状况。特定生物标志物的水平或突变状态将取决于与生物分析物(RNA、DNA、染色体、蛋白质、蛋白质复合物、聚糖、代谢产物、细菌、病毒、细胞)的水平/突变相关的生物学。对那些生物标志物水平或突变的定量分析将使用目前接受的技术和仪器。例如，PCA3 RNA(前列腺癌特异性的靶RNA或RNA生物标志物)定量将使用数字液滴PCR或实时PCR仪器。基于蛋白质和基于聚糖的生物标志物的定量将依赖于质谱技术或ELISA测定或蛋白质免疫印迹分析(如果可能的话)。鉴定任何特定的DNA突变(例如用于发展前列腺癌的高风险的BRCA2)将依赖于能够进行DNA的下一代测序的仪器和试剂盒。
评估导致男性不育症的先天性缺陷将是使用核型细胞遗传学技术来鉴定Y染色体的截短形式的存在。为了鉴定是否存在某些细菌，一般的微生物学技术，例如在各种培养基(具有各种营养物的固体琼脂)上培养感兴趣的微生物将是有意义的。定量PCR/实时PCR也可用于各种细菌的检测。同样的技术也可用于定量精液中病毒(即SARS-CoV-2)的存在。定量PCR/实时PCR的使用需要设计对感兴趣的基因/RNA序列具有特异性的PCR引物。
本发明的优选实施方案的上述描述已被提出以说明本发明的原理，而不是将本发明限制于所说明的特定实施方案。本发明的范围意图由所附权利要求书及其等同物所涵盖的所有实施方案来限定。

Claims (17)

1.用于收集生物液体和保存包含在所述生物液体中的任何DNA和/或RNA的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含纤维的用于吸附预先选择的生物液体的擦拭物，所述擦拭物浸渍有用于保存吸附到所述擦拭物中的生物液体的一种或多种对皮肤友好的化学物质；
b)刚性的可重新密封的管，其被配置成在其中容纳浸渍的擦拭物；
c)用于密封容纳浸渍的擦拭物的所述刚性的可重新密封的管以用于运输的可重新密封的袋；
d)关于如何用预先选择的生物液体浸渍所述擦拭物并将其密封在可重新密封的袋中的说明书；以及
e)返回信封，其配置成在其中接收容纳浸渍的擦拭物的可重新密封的袋。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述一种或多种对皮肤友好的化学物质包括充当一般核酸酶抑制剂的化合物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述一般核酸酶抑制剂包括RNA酶和DNA酶抑制剂中的任何一种或组合。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述一般核酸酶抑制剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯磺酸和焦碳酸二乙酯中的任何一种或组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述十二烷基硫酸钠(SDS)以约0.01％SDS v/v至约5％SDS v/v的范围存在。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述十二烷基硫酸钠(SDS)以约0.5％v/v的浓度存在。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种对皮肤友好的化学物质还包括EDTA溶液，其用于抑制RNA酶/DNA酶活性并诱导RNA/DNA与所述擦拭物的纤维结合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述EDTA溶液包括约1至约5mM的EDTA溶液。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种对皮肤友好的化学物质还包括经选择以保存蛋白质生物标志物并防止细菌和霉菌生长的化合物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述化合物是在溶液中的叠氮化钠。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述叠氮化钠以约0.01％至约0.2％的范围存在于溶液中。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述叠氮化钠以<0.2％的浓度存在于溶液中。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述含有纤维的擦拭物是含有纤维的纸和含有纤维的织物中的任何一种。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的试剂盒，其中所述擦拭物包括沿着所述擦拭物的一个边缘的狭缝，其尺寸被设计成在DNA/RNA提取过程中被捕获在DNA/RNA管上的帽和管本身之间，从而所述擦拭物被披挂在所述管的帽上并下垂进所述管的内部，其中所述擦拭物的底部边缘与所述管的底部间隔开。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒，其中所述擦拭物包括附着其上的机器可读代码粘贴物，所述机器可读代码粘贴物用于将所述擦拭物与正被筛查/测试的患者相连接，并且用于在邮寄和分析过程期间保护患者的隐私。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括可下载的智能电话应用程序，其被配置和编程为扫描所述机器可读代码粘贴物以将患者的擦拭物电子连接到他们的图表/概况，所述智能电话应用程序被配置和编程为将扫描所述机器可读代码粘贴物的结果电子地发送到任务为分析所述擦拭物的实验室，并且其中所述智能电话应用程序被配置和编程为接收来自所述实验室的电子传输的信息以评估被实验室接收的患者的擦拭物。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的试剂盒，其中待收集的生物液体是精液。
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