CN115791907B - 纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器及其制备方法和应用。该方法采用热收缩工艺使得电极表面形成纳米量级褶皱。由于独特的物理结构，避免了蛋白进入褶皱内部，有效地保护了褶皱内部的传感面积，实现抗蛋白污染效果。另一方面，该方案先将强阳离子电解质修饰在电极表面，然后通过强电荷引力组装修饰带负电的牛血清白蛋白。并通过低功率超声处理及磷酸盐缓冲液浸泡处理，去除不稳定结合的牛血清白蛋白，得到稳定的抗污染界面。由于多数非特异性蛋白在pH中性条件下带负电，故在带负电的牛血清白蛋白排斥作用下，非特异性蛋白难以吸附在电极表面，进一步实现长期抗蛋白污染效果。
Description
技术领域
本发明属于电化学式生物传感器领域，具体涉及一种长期抗蛋白污染传感器制备方法，特别涉及纳米褶皱及白蛋白组装修饰的长期抗蛋白污染传感器制备方法。
背景技术
电化学传感器具有灵敏度高，成本低，易小型化等优点，在生物标志物的检测方面得到了快速发展，尤其在居家检测和植入式测量方面具有独特的优势。如三诺生物和雅培公司开发的基于电化学原理的便携式血糖检测仪已走进千家万户。与此同时，研究人员开发了基于电化学原理传感器可加工为小尺寸的微电极，并植入动物体内，可实时监测其体内生物标志物，应用于疾病模型研究。然而临床待测的生物样品中，往往存在着大量的非特异性蛋白质、细胞等。这些物质的吸附，会污染电极，使传感器表面钝化，降低传感器的灵敏度、信噪比、特异性及使用寿命，甚至直接导致传感器失效。因此构建一种高效抗污染界面对于电化学传感器的临床应用至关重要。
目前，主要的抗污染方式可分为物理、表面化学修饰、生物三大类。物理抗污法主要通过在电极表面构建微纳米孔，通过尺寸效应，限制非特异性蛋白及细胞进入内部传感界面。表面化学修饰法主要在电极表面修饰亲水性、电中性的物质，如聚乙二醇（PEG）及其衍生物、两性离子聚合物及多肽等，来形成水化层，阻碍非特异性物质。生物法主要采用免疫亲和物质或降解酶来去除主要的干扰物。这些方法构建了重要的理论支撑，但仍然存在一些问题，具体包括：
物理抗污染方式：目前的纳米孔电极制备主要基于炼制合金、去合金和强酸处理，工艺粗糙、危险性高、易引入环境污染，且器件一致性差。化学抗污染方式：PEG修饰困难，且易被氧气和过渡金属氧化；两性离子材料抗污染能力均要受到pH影响，制备过程需要精密调控材料的Zeta电位且两性离子多肽易被生物样品中的酶水解。生物抗污染降解法：降解材料（酶或抗体）成本高，降解效率低，在实际测试环境中难以应用。此外，许多研究工作报道的传感器抗污染能力仍有所不足，其所采用的模拟污染测试环境，仅为单一蛋白环境或血清，可抗全血污染的工作很少。
发明内容
为了解决提高电化学生物传感器抗蛋白污染的问题，并进一步解决电化学生物传感器长期抗蛋白污染的问题，在第一方面上，根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，包括
提供亲水性纳米褶皱电极；
在所述亲水性纳米褶皱电极表面组装抗蛋白污染材料，得到表面组装抗蛋白污染材料的亲水性纳米褶皱电极；
将所述表面组装抗蛋白污染材料的亲水性纳米褶皱电极组装在所述电化学生物传感器，得到抗蛋白污染电化学生物传感器。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，制备所述亲水性纳米褶皱电极的方法，包括：
在热收缩聚合物基底沉积厚度为5~25nm的电极材料，加热后得到褶皱波长小于130nm的热收缩电极；
将所述热收缩电极通过等离子体处理，得到亲水性的纳米褶皱电极。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，所述加热是在150~160℃的加热炉中加热100s以上。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，若选择聚苯乙烯做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度为5nm-11nm；采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5nm-24nm；
若选择聚烯烃做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度不超过6nm；采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5-12nm；
若选择聚对苯二甲酸乙二醇酯做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度为5-13nm；若用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5-25nm；
优选地，所述电极材料沉积厚度为10nm。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，在所述纳米褶皱电极表面组装抗蛋白污染材料，包括
S101.在聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液中孵育所述纳米褶皱电极5~60min，孵育后用去离子水冲洗吹干，其中所述聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液浓度为0.5~3wt.%；
S102.在白蛋白溶液中孵育所述纳米褶皱电极20~60min，孵育后用PBS缓冲溶液低功率超声清洗30~60s，得到电极表面静电自组装白蛋白的纳米褶皱电极，其中所述白蛋白溶液的浓度为0.5~8wt.%；
S103.在PBS缓冲溶液浸泡所述表面静电自组装白蛋白的纳米褶皱电极20~40min，然后用去离子水冲洗吹干；
优选地，所述白蛋白为牛血清白蛋白（BSA）。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，步骤S101中溶液中溶解0.05~0.2M KCL。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，步骤S101中所述聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液的浓度为1.5wt.%，溶液中溶解0.1M KCL，所述牛血清白蛋白（BSA）溶液的浓度为3wt.%。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，超声清洗机用于所述超声清洗，所述超声清洗的工作频率为40kHz，功率为144W或360W。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，所述PBS缓冲溶液为1倍磷酸盐缓冲液。
根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，褶皱的波长根据下式计算：
(1)
(2)
其中：η表示放大因子，Eelectrode表示电极材料的杨氏模量，Epolymer表示热收缩聚合物基底材料的杨氏模量，velectrode表示电极材料的泊松比，λ表示褶皱的波长，h表示电极材料的厚度，π表示圆周率。
在第二方面上，根据本申请一些实施例的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器，由所述任一项所述制备方法所得电化学生物传感器，所述电化学生物传感器，包括基底电极，所述基底电极包括所述表面组装抗蛋白污染材料的亲水性纳米褶皱电极。
在第三方面上，根据本申请一些实施例的所述电化学生物传感器，其在抗蛋白污染中的应用。
有益效果：一方面，本发明采用热收缩工艺使得电极表面形成纳米量级褶皱。由于独特的物理结构，避免了蛋白进入褶皱内部，有效地保护了褶皱内部的传感面积，实现抗蛋白污染效果。
另一方面，本发明先将强阳离子电解质修饰在电极表面，然后通过强电荷引力组装修饰带负电的牛血清白蛋白。再通过低功率超声处理及磷酸盐缓冲液浸泡处理，去除不稳定结合的牛血清白蛋白，得到稳定的抗污染界面。
另一方面，由于多数非特异性蛋白在pH中性条件下带负电，故在带负电的牛血清白蛋白排斥作用下，非特异性蛋白难以吸附在电极表面，进一步实现长期抗蛋白污染效果。同时，本发明所制备的抗污染传感器，在全血的环境中具有长期稳定性好的特点。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是传感器抗非特异性蛋白污染原理示意图。
图2是抗污染电极加工示意图。
图3是金热收缩电极相关示意图：（A）10nm金热收缩电极SEM图，（B）所选择区域的二维傅里叶变换图，（C）在0°时的轮廓图。
图4是不同浓度BSA屏蔽效果示意图。
图5是PBS浸泡30分钟后电极的电流及信噪比变化示意图。
图6是不同浓度聚乙烯亚胺（PEI）固定BSA后的抗污染效果示意图。
图7是不同浓度PDDA固定BSA后的抗污染效果示意图。
图8是15mg/mL PDDA 固定BSA后，在不同功率超声清洗后抗污染效果示意图。
图9是15mg/mL PEI固定BSA后的电极在50% FBS污染前后阻抗变化示意图。
图10是15mg/mL PDDA 固定BSA后，在144W功率超声清洗后的电极在50% FBS污染前后阻抗变化示意图。
图11是相同投影面积下，不同厚度热收缩电极及平面金电极对前列腺癌特异性抗原的灵敏度对比示意图。
图12是相同投影面积下，不同厚度热收缩电极及平面金电极在5mM铁氰化钾溶液中测试的DPV峰电流对比示意图。
图13是在5mM铁氰化钾溶液中添加2mg/mL BSA后，传感器连续测量0~50分钟的CV波形：（A）平面金电极（Planar）， (B) 10nm热收缩金电极（Shrink 10nm），（C）经过BSA修饰后的10nm热收缩金电极（Shrink 10nm with BSA）示意图。
图14是在5mM铁氰化钾溶液中添加2mg/mL BSA后，传感器连续测量0~50分钟的DPV峰电流变化：（A）平面金电极（Planar）， (B) 10nm热收缩金电极（Shrink 10nm），（C）经过BSA修饰后的10nm热收缩金电极（Shrink 10nm with BSA）示意图。
图15是抗污染传感器在不同浓度血清及全血污染下，在铁氰化钾体系下的峰电流变化示意图。
图16是抗污染传感器在不同浓度血清及全血污染下，在二茂铁甲醇体系下的峰电流变化示意图。
图17是抗污染传感器在BSA及血清长期污染情况下的峰电流变化示意图。
图18是抗污染传感器在兔全血长期污染情况下的峰电流变化示意图。
具体实施方式
下面通过参考附图详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。
实施例1：图2是抗污染电极加工示意图，根据图2所示一种纳米褶皱及牛血清蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，包括：
步骤1：制备纳米褶皱电极，在具体实例中，所述制备包括在热收缩聚合物表面放置掩膜版，沉积5~25nm电极材料，沉积电极材料后，将其放置在聚四氟乙烯涂层的平面上，在150~160摄氏度加热炉中加热100s以上，优选地，在160摄氏度加热炉中加热3分钟，利用等离子体处理3分钟，得到亲水性纳米褶皱电极，褶皱波长小于130nm。根据以上计算步骤，若要达到所述尺寸的纳米褶皱，则可根据热收缩聚合物和导电材料的杨氏模量及导电材料的厚度，实施特定组合实现。金和碳因为其导电性好，稳定性高等优势，可做为电化学工作电极的常用材料。由于电极厚度过低易使传感器导电性差，故所设计的电极按照经验应大于5nm。
在所述方案中，若选择聚苯乙烯做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度为5nm-11nm；采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5nm-24nm；
若选择聚烯烃做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度不超过6nm；采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5-12nm；
若选择聚对苯二甲酸乙二醇酯做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度为5-13nm；若用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5-25nm。
根据以上所确定参数，计算得到的电极褶皱波长可小于130nm，褶皱的波长根据下式计算：
(1)
(2)
其中：η表示放大因子，Eelectrode表示电极材料的杨氏模量，Epolymer表示热收缩聚合物基底材料的杨氏模量，velectrode表示电极材料的泊松比，λ表示褶皱的波长，h表示电极材料的厚度，π表示圆周率。
步骤2：制备表面抗污染材料，在一些实例中，包括将步骤1得到的亲水性纳米褶皱电极在聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液中浸泡30分钟，去离子水冲洗吹干后，在白蛋白溶液中孵育30分钟，用1倍磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，将其放置在1倍磷酸盐缓冲溶液中，并用超声清洗机，清洗60s，清洗完成后，将电极在1倍磷酸盐缓冲溶液中浸泡30分钟，即得到可长期抗污染的传感器电极。
在一些具体实例中，步骤2具体包括：
在制备得到的纳米褶皱电极表面滴涂蛋白固定试剂进行孵育，蛋白固定试剂选自浓度为0.5~3wt.%的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液，在优选实例中，为15 mg/mL浓度的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液。优选地，所述聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液的溶液质量分数为0.5~3wt.%，溶液中溶解有0.05~0.2M KCL。更优选地，所述聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液的溶液质量分数为1.5wt.%，溶液中溶解0.1M KCL。
在上述，蛋白固定试剂中孵育5~60分钟，优选30分钟，然后用去离子水冲洗吹干。
然后在电极表面表面滴涂浓度为0.5~8wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液进行孵育，优选地，溶液浓度为30mg/mL，孵育20~60分钟，优选30分钟。
然后用1倍PBS缓冲溶液冲洗，PBS缓冲溶液优选为1倍磷酸盐缓冲液，然后能够得到表面静电自组装牛血清白蛋白（BSA）的纳米褶皱电极。作为优选方案，将得到的电极放置在1倍PBS缓冲溶液中并用低功率超声清洗，推荐时间为30~60s，超声功率为144W或360W。
然后放入1倍PBS缓冲溶液中浸泡30分钟，优选地，在1倍磷酸盐缓冲溶液中浸泡，浸泡时间20~40分钟，优选30分钟以上，去除电极表面不稳定结合的BSA。冲洗吹干后即得到长期抗蛋白污染传感器。
如图1所示，所述传感器利用热收缩工艺制备出的纳米褶皱，其褶皱开口最大尺寸（波长）控制在130nm以下。在此尺寸范围下，体液内多数非特异性蛋白质难以进入褶皱内部，避免了诸多蛋白质的吸附。而溶液中的待测小分子如多巴胺、尿酸、铁氰化钾等，尺寸较小，依然可以进入到褶皱电极内部，检测灵敏度得到完好的保留。
此外，利用聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）在褶皱电极固定了大量牛血清白蛋白（BSA），并通过超声和浸泡处理，去除不稳定结合部分。剩余部分牛血清白蛋白（BSA）可稳定地固定在电极表面，并且，褶皱有利于所述牛血清白蛋白（BSA）稳定地固定。由于体液内多数蛋白在pH为7的条件下，呈现负电效果，而牛血清白蛋白（BSA）亦在此条件下表现为负电。利用相同电性互相相斥的原理，可进一步排斥体液内非特异性蛋白干扰。
实施例2：如图2所示，与实施例1的区别是利用热收缩聚合物基底（如聚苯乙烯、聚烯烃、聚对苯二甲酸乙二醇酯）作为抗污染传感器基底材料，此处选用聚苯乙烯。在聚苯乙烯基底材料上放置掩膜版，此处选用胶带掩膜版，直接粘贴在基底之上。然后利用真空溅射在基底表面溅射10nm金。在160℃的加热炉中加热3分钟，使之收缩至稳定。此时所得到的热收缩电极，可通过扫描电镜得到其表面形貌图，根据二维傅里叶变换可以计算得到其波长大小。计算结果如图3所示，该电极波长大约为118nm，可有效抵抗非特异性蛋白干扰。
将热收缩电极通过等离子体处理3分钟，消除电极表面疏水性，得到热收缩电极A。将热收缩电极A在15mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液中浸泡30分钟，去离子水冲洗吹干后，在3%的牛血清白蛋白中浸泡30分钟。将所得到的电极置入1PBS溶液中，低功率超声清洗60秒，然后在1PBS溶液中浸泡30分钟，吹干后即得到抗蛋白污染电极。
实验例1：根据实施例中的方案，为评估不同浓度牛血清蛋白的屏蔽效果，将不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）在金电极表面孵育30分钟，去离子水冲洗吹干后，用于抗污染测试，结果如图4所示。其中不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）包括质量分数：0%，0.5%，1%，3%，8%的牛血清白蛋白（BSA）。在实验例1中将电极先在无蛋白的1PBS溶液中孵育30分钟，去离子水冲洗吹干后，在5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾及1PBS的混合溶液中做DPV测试，所得电流值记作I0。然后将电极在不同比例的血清中孵育30分钟后，去离子水冲洗吹干后，做DPV测试，所得电流值记作I，可用百分比电流表示：I/I0*100%。受污染后的电极，百分比电流越接近100%，则说明抗污染效果越好。根据图4可以看出3%的牛血清白蛋白（BSA）修饰的电极抗污染效果最好，也即30 mg/mL浓度的牛血清白蛋白（BSA）修饰的电极抗污染效果最好。
实验例2：根据实施例中的方案，3%的牛血清白蛋白（BSA）修饰的电极，由于牛血清白蛋白（BSA）浓度较高，在血清测试中不稳定结合部分易脱落，导致测试时信号信噪比较差，抗污染效果较差。为进一步提升抗污染效果，此实施例进一步优化牛血清白蛋白（BSA）的固定方式，一方面用聚乙烯亚胺（PEI）或聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）固定牛血清白蛋白（BSA）， 并通过PBS缓冲溶液浸泡及超声处理来去除不稳定结合的牛血清白蛋白（BSA）。
金电极在3wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液孵育30分钟后，测试峰电流及信噪比，在PBS缓冲溶液浸泡30分钟后，冲洗吹干，再次测量峰电流及信噪比。如图5所示，传感器峰电流下降较小，信噪比大大提高，从37提升至180。
不同牛血清白蛋白（BSA）固定材料及浓度对比实验：如图6所示，当使用不同浓度聚乙烯亚胺（PEI）固定牛血清白蛋白（BSA）后，可以看出聚乙烯亚胺（PEI）修饰的电极，表面吸附牛血清白蛋白（BSA）的量较少，电极抗污染能力不足，峰电流均有所衰减。10mg/mL聚乙烯亚胺（PEI）固定的电极，抗污染效果最好，其峰电流在50%血清污染后，峰电流有所衰减，但仍保持96%。如图7所示，当使用不同浓度聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）固定牛血清白蛋白（BSA）后，可以看出聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）修饰的电极，对牛血清白蛋白（BSA）的引力较强，表面吸附牛血清白蛋白（BSA）的量较多，电极在血清中污染后，峰电流还有所增加。这是由于电极表面牛血清白蛋白（BSA）较多，使得不稳定结合的牛血清白蛋白（BSA）在PBS缓冲溶液及血清中浸泡过程脱落，导致电流变大。15mg/mL（即1.5wt.%）PDDA固定的电极，抗污染效果最好，其峰电流在50%血清污染后，峰电流变化小于2%。在本实验例中针对不同牛血清白蛋白（BSA）固定材料及浓度进行对比实验，实验结果表明15mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）是电极表面静电自组装牛血清白蛋白（BSA）的最佳试剂和浓度。
不同功率超声后抗污染效果对比实验：由于聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）固定的器件表面仍存在许多不稳定结合的牛血清白蛋白（BSA），结合浸泡处理后，此处采用超声振荡，进一步对比器件的抗污染效果。超声清洗功率分别为0W(未超声)，144W，252W，360W。时间为60s，频率为40Khz，采用仪器型号为KM615D。抗污染效果如图8所示，超声清洗后的电极相比无超声清洗电极（0W），具备小的测试噪声，且峰电流不会出现增大的效果。说明多余的牛血清白蛋白（BSA）得到良好的去除。144W和360W的超声清洗器件均有较好的抗污染效果。360W处理的器件，在50%血清污染后，峰电流保持为100.5%。144W处理的器件，在50%血清污染后，峰电流保持为99.2%。故可选用144W或360W超声处理器件。在本实验例中针对不同功率超声后抗污染效果进行对比，实验结果在功率144W或360W条件下超声超过30s，抗蛋白质污染效果最好。
由上述实验例，实施例所述方案的最优修饰条件为15mg/mL 聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）固定3%的牛血清白蛋白（BSA），144W或360W超声处理30s后，浸泡一小时。
为进一步评估最优修饰条件下器件的抗污染效果，此处采用电极在50%胎牛血清（FBS）污染前后交流阻抗谱的变化来表征。如图9所示，可以看出15mg/mL 聚乙烯亚胺（PEI）固定牛血清白蛋白（BSA）的器件，在血清污染后，电极的电荷转移电阻明显增加，说明电极受到污染。如图10所示，可以看出，最优修饰条件下的抗污染器件，在血清污染后，电极的阻抗谱几乎完全重合，说明电极表面没有非特异性吸附，电极未受到污染。
实验例3：根据实施例中的方案，为评估不同厚度热收缩电极的对小分子的响应灵敏度及抗蛋白污染能力，本实验例制备了不同厚度的热收缩金电极（10nm~200nm）及平面金电极，电极的投影面积均相同为7.065cm2。分别评估这些电极对蛋白及小分子的响应信号大小及灵敏度。所选蛋白为前列腺癌特异性抗原(34kDa)，该蛋白尺寸约为21nm，与体液内多数蛋白尺寸相当。所选小分子为铁氰化钾，尺寸约为0.1nm。若电极对蛋白的灵敏度越低，则说明传感器抗蛋白污染能力越强。
实验例分别在电极表面修饰相同条件的前列腺癌特异性抗原的鼠单克隆抗体，测试其对前列腺癌特异性抗原的灵敏度，测试结果如图11所示。实验例还将不同厚度的热收缩电极和平面金电极在5mM铁氰化钾溶液中做DPV测试，峰电流结果如图12所示。根据图12可以看出，10nm热缩电极和30nm热收缩电极对蛋白的灵敏度均低于平面电极，表明二者有较好的抗污染能力。10nm热收缩电极对蛋白的灵敏度最小，约为平面电极的1/5，约为200nm热收缩电极的1/20，说明10nm热收缩电极的抗污染效果最好。根据图12还可以看出，10nm热收缩电极的对铁氰化钾的响应峰电流明显高于平面电极。说明10nm热收缩电极不仅具有良好的抗蛋白污染能力，而且保持着对小分子的高灵敏度。
实验例4：上述实验例抗污染测量方案属于间断测量，实验步骤为：在血清污染后，电极经过冲洗吹干后测量。冲洗过程有可能影响抗污染效果。为进一步评估所提出发明方案的连续抗污染效果。体液内含量最高的蛋白质一般为白蛋白，本实施例以牛血清蛋白（牛血清白蛋白（BSA））作为模拟污染源，并采用以下连续污染测量方案：
传感器放置于5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾及1PBS缓冲溶液的混合溶液做CV及DPV测试，记为0时刻的初始值。
在溶液中加入2mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）污染源。搅拌10秒后，传感器在4，11，19，30，50分钟时连续做CV及DPV测量，变化越小则说明抗污染能力越强。
分别测量三种传感器的抗污染效果：平面金电极，10nm热收缩金电极和经过牛血清白蛋白（BSA）修饰后的10nm热收缩金电极。本实施例所述牛血清白蛋白（BSA）修饰方案为实施例中的方案。
CV波形变化情况如图13所示，DPV峰电流变化情况如图14所示。可以看出，平面金电极抵抗牛血清白蛋白（BSA）连续污染的能力较差，在牛血清白蛋白（BSA）加入后，CV峰电流减小了58%，电位差增大，波形慢慢变平缓。这是因为牛血清白蛋白（BSA）粘附在电极表面，使得电极表面钝化，阻抗增大。该电极在牛血清白蛋白（BSA）连续污染50分钟后，DPV峰电流衰减至原来的17%。
使用物理抗污方式(10nm Shrink电极)后，传感器抗污染能力显著增强，在牛血清白蛋白（BSA）连续污染50分钟后，CV峰电流仅减小10%，DPV峰电流仍保持初始电流的57%。根据热收缩调控机理可粗定义褶皱波长约为130nm以下时，可保证较好的抗污染效果。
使用物理抗污与牛血清白蛋白（BSA）结合后，传感器抗污染能力进一步增强，在牛血清白蛋白（BSA）连续污染50分钟后，CV峰电流仅减小4.9%，峰电位基本不变，DPV峰电流仍保持初始电流的94%。
根据以上实验例结果，本发明的传感器在此采用的制备方法为10nm热收缩电极，牛血清白蛋白（BSA）固定方式为：15mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）固定牛血清白蛋白（BSA），超声处理60秒后，在1PBS缓冲溶液中浸泡30分钟。
实验例5：根据实施例中的方案，为评估所发明的抗污染传感器在不同测试体系下的抗污染效果，本实施例将所制备的抗污染传感器工作电极在不同浓度的血清孵育后，分别在5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾混合溶液及二茂铁甲醇溶液中测试。其中，在铁氰化钾溶液中发生的电化学反应为负价的铁氰根离子，在二茂铁甲醇溶液中发生电化学反应的反应物为0价的二茂铁分子。
所制备的抗污染传感器在不同浓度的血清溶液中孵育30分钟后，冲洗吹干后在5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾混合溶液做DPV测试，结果如图15所示。在0~100%血清污染下，传感器峰电流仍然保持为99.3%，甚至在100%全血污染下，峰电流仍然保持98.1%，可见传感器在负电测试体系下，抗污染性能优异。
所制备的抗污染传感器在不同浓度的血清溶液中孵育30分钟后，冲洗吹干后在5mM二茂铁甲醇溶液中做DPV测试，结果如图16所示。在0~100%血清污染下，传感器峰电流仍然保持为98.5%，可见传感器在0价及+1价测试体系下，抗污染性能优异。
由上述实验结果可知，本发明所制备抗污染传感器在不同测试体系下均能保持良好的抗污染能力。
实验例6：根据实施例中的方案，为评估所发明的抗污染传感器的长期抗污染效果，本实验例分别采用3%的牛血清白蛋白（BSA）作为单一蛋白污染源，100%胎牛血清（FBS）和兔全血（full blood）作为复杂蛋白污染源，长时间连续污染所制备的传感器，测试其在铁氰化钾体系下的DPV峰电流变化。
测试结果如图17及图18所示，可见所制备的传感器在21天的牛血清白蛋白（BSA）长期污染下，峰电流仍然保持97.7%，在21天的FBS长期污染下，峰电流仍然保持97.8%。故所制备的抗污染传感器长期稳定性良好。
此外，该抗污染传感器甚至可以在全血污染条件下保持长期稳定，如图18所示，在15天的兔全血长期污染下，峰电流仍然保持为93.9%。故所制备的抗污染传感器长期稳定性良好。
本发明属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种基于纳米褶皱及牛血清蛋白组装修饰的长期抗蛋白污染传感器制备方法与应用。该方法采用热收缩工艺使得电极表面形成纳米量级褶皱。由于独特的物理结构，避免了蛋白进入褶皱内部，有效地保护了褶皱内部的传感面积，实现抗蛋白污染效果。另一方面，该方案先将强阳离子电解质修饰在电极表面，然后通过强电荷引力组装修饰带负电的牛血清白蛋白。并通过低功率超声处理及磷酸盐缓冲液浸泡处理，去除不稳定结合的牛血清白蛋白，得到稳定的抗污染界面。由于多数非特异性蛋白在pH中性条件下带负电，故在带负电的牛血清白蛋白排斥作用下，非特异性蛋白难以吸附在电极表面，进一步实现长期抗蛋白污染效果。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括
提供亲水性纳米褶皱电极；
在所述亲水性纳米褶皱电极表面组装抗蛋白污染材料，得到表面组装抗蛋白污染材料的亲水性纳米褶皱电极；
将所述表面组装抗蛋白污染材料的亲水性纳米褶皱电极组装在所述电化学生物传感器，得到抗蛋白污染电化学生物传感器；
其中，在所述纳米褶皱电极表面组装抗蛋白污染材料，包括
S101.在聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液中孵育所述纳米褶皱电极5~60min，孵育后用去离子水冲洗吹干，其中所述聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液浓度为0.5~3wt.%；
S102.在白蛋白溶液中孵育所述纳米褶皱电极20~60min，孵育后用PBS缓冲溶液低功率超声清洗30~60s，得到电极表面静电自组装白蛋白的纳米褶皱电极，其中所述白蛋白溶液的浓度为0.5~8wt.%；
S103.在PBS缓冲溶液浸泡所述表面静电自组装白蛋白的纳米褶皱电极20~40min，然后用去离子水冲洗吹干；
所述白蛋白为牛血清白蛋白（BSA）。
2.根据权利要求1所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，制备所述亲水性纳米褶皱电极的方法，包括：
在热收缩聚合物基底沉积厚度为5~25nm的电极材料，加热后得到褶皱波长小于130nm的热收缩电极；
将所述热收缩电极通过等离子体处理，得到亲水性的纳米褶皱电极。
3.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述加热是在150~160℃的加热炉中加热100s以上。
4.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，聚苯乙烯做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度为5nm-11nm。
5.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，聚苯乙烯做热收缩聚合物基底，采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5nm-24nm。
6.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，聚烯烃做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度不超过6nm。
7.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，聚烯烃做热收缩聚合物基底，采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5-12nm。
8.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，聚对苯二甲酸乙二醇酯做热收缩聚合物基底，采用金做电极材料，则金电极材料沉积厚度为5-13nm。
9.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，聚对苯二甲酸乙二醇酯做热收缩聚合物基底，采用碳做电极材料，则碳电极材料沉积厚度为5-25nm。
10.根据权利要求4-5、7-9任一项所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述电极材料沉积厚度为10nm。
11.根据权利要求1所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S101中溶液中溶解0.05~0.2M KCL。
12.根据权利要求1所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S101中所述聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液的浓度为1.5wt.%，溶液中溶解0.1M KCL，所述牛血清白蛋白（BSA）溶液的浓度为3wt.%。
13.根据权利要求1所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，超声清洗机用于所述超声清洗，所述超声清洗的工作频率为40kHz，功率为144W或360W。
14.根据权利要求1所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲溶液为1倍磷酸盐缓冲液。
15.根据权利要求2所述的纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，褶皱的波长根据下式计算：
(1)
(2)
其中：η表示放大因子，Eelectrode表示电极材料的杨氏模量，Epolymer表示热收缩聚合物基底材料的杨氏模量，velectrode表示电极材料的泊松比，λ表示褶皱的波长，h表示电极材料的厚度，π表示圆周率。
16.一种纳米褶皱及白蛋白组装修饰的抗蛋白污染电化学生物传感器，其特征在于，由所述权利要求1-15任一项所述制备方法所得电化学生物传感器，所述电化学生物传感器，包括基底电极，所述基底电极包括所述表面组装抗蛋白污染材料的亲水性纳米褶皱电极。
17.一种权利要求16所述电化学生物传感器在抗蛋白污染中的应用。
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Families Citing this family (1)
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Citations (1)
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| CN115144448A (zh) * | 2022-08-02 | 2022-10-04 | 清华大学 | 基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用 |
Family Cites Families (5)
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| DE60303207T2 (de) * | 2002-06-21 | 2006-09-14 | Applied Nanosystems B.V. | Verfahren zur bindung einer verbindung an eine oberfläche |
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| CN115201302B (zh) * | 2022-07-04 | 2024-02-02 | 青岛科技大学 | 一种电化学传感器及其制备方法与应用 |
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2022
- 2022-11-10 CN CN202211403095.2A patent/CN115791907B/zh active Active
Patent Citations (1)
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| CN115144448A (zh) * | 2022-08-02 | 2022-10-04 | 清华大学 | 基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用 |
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| CN115791907A (zh) | 2023-03-14 |
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