CN115791648A - 食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法及实现该方法的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法及实现该方法的试剂盒。该方法将待测液体状原样或者糊状原样置于离心管或比色管中，加入亚铁氰化钾溶液与乙酸锌溶液，离心或过滤后取上清液，得到待检测样品；然后取相同体积的空白样品、待检测样品，以及不同浓度的亚硝酸钠标准溶液分别加入到多孔板中，在各孔中分别加入相同体积的氨基苯磺酸溶液与盐酸萘乙二胺溶液；最后用酶标仪在538nm下读板，得到检测结果，根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。该方法具有简单易行，检测速度快，检测通量高、检测准确性高的优点。

Description

食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法及实现该方法的试 剂盒

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法及实现该方法的试剂盒

背景技术

亚硝酸盐是含有亚硝酸根(NO₂ ^-)的盐，广泛存在于人类环境中，是自然界中最普遍的含氮化合物，最常见的是亚硝酸钠、亚硝酸钾。它们的外观及滋味都与食盐相似，并在工业、建筑业中广为使用，肉类制品中也允许作为发色剂限量使用。亚硝酸盐能使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，因而失去携氧能力而引起组织缺氧，成人摄入0.2～0.5克即可引起中毒，3克即可致死。此外，食道癌与患者摄入的亚硝酸盐量呈正相关性，在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物亚硝胺。亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中将亚硝酸盐列入2A类致癌物。

由于亚硝酸盐的毒性，在食品安全监管工作中将亚硝酸盐作为重点检测项目，GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确列出了亚硝酸盐的限量规定。但是在日常生活中，亚硝酸盐中毒和超标的事件还是时有发生，对于食品中亚硝酸盐含量的监管和测定丝毫不能放松。

现有的亚硝酸盐检测方法主要有离子色谱法和分光光度法，这两个方法是准确的定量方法，都需要比较专业的设备，前者需要离子色谱，后者需要分光光度计，因此对设备要求较高。另外，检测过程中涉及较为复杂的前处理过程，需要的检测周期较长，使用的试剂量也大，对环保造成一定的压力。除了定量方法外，也有一些快速检测的试剂盒方法，但是这些方法以定性或半定量为主，难以实现准确的定量检测。因此，目前特别需要有一种可以实现食品中亚硝酸盐的快速检测，特别是运用于菜场、商超等场所的现场高通量的准确测定。

发明内容

针对上述技术现状，本发明旨在提供一种食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法，具有简单易行，检测速度快，检测通量高，检测准确性高的优点。

本发明提供的技术方案是：一种食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法，包括如下步骤：

(1)配置A、B、C、D溶液，方法如下：

亚铁氰化钾与去离子水混匀得到浓度为(8g-12g)/100mL的亚铁氰化钾溶液，记作A溶液；

乙酸锌与冰乙酸混匀得到浓度为(17.6g-26.4g)/100mL的乙酸锌溶液，记作B溶液；

在氨基苯磺酸中加入浓度为15％-25％(v/v)的盐酸水溶液，混匀得到C溶液，其中氨基苯磺酸浓度为(0.05g-0.08g)/15mL；

盐酸萘乙二胺与去离子水混匀得到浓度为(0.02g-0.05g)/15mL的盐酸萘乙二胺溶液，记作D溶液；

(2)亚硝酸钠与去离子水混匀，得到一系列不同浓度的亚硝酸钠标准溶液；

作为优选，亚硝酸钠标准溶液的浓度为(0-1mg)/L，更优选为(0.05mg-0.5mg)/L。

(3)配置待检测样品，方法如下：

将待测液体状原样或者糊状原样置于离心管或比色管中，超声分散一定时间后加热去除蛋白等干扰，然后取出待冷却后加入A溶液、B溶液与去离子水，其中原样含量为(0.5g-1.5g)/10mL，A溶液的体积浓度为(0.5mL-1.5mL)/10mL，B溶液的体积浓度为(0.5mL-1.5mL)/10mL；然后，离心或过滤去除蛋白质等基质干扰后取上清液，得到待检测样品；所述糊状原样是将待测物粉碎至糊状得到；

作为优选，加热去除蛋白等干扰时采用放入75℃水浴锅中加热3-10min。

作为优选，根据实际需要，用去离子水稀释待检测样品5-30倍后备用。

(4)取相同体积(体积记作X)的空白样品、待检测样品以及不同浓度的亚硝酸钠标准溶液分别加入到多孔板中的不同孔中，然后，在各孔中分别加入相同体积的C溶液，混匀后加入相同体积的D溶液混匀；用酶标仪在538nm下读板，得到检测结果，根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

所述食品不限，包含水、蔬菜、肉类、蛋类等。

所述多孔板结构类似细胞培养板，孔数不限，包括6、12、24、48、96等。

所述步骤(4)中，作为优选，C溶液的其体积为(1/5-2/3)X；D溶液的体积为(1/5-2/3)X。

所述步骤(4)中，作为优选，亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果减去空白样品的检测结果作为亚硝酸钠系列标准溶液样品的标准检测结果；待检测样品的检测结果减去空白样品的检测结果作为待检测样品的标准检测结果；根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的标准检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的标准检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

本发明还提供一种实现所述检测方法的试剂盒，包括多孔板、五瓶粉末以及两瓶液体试剂；所述的五瓶粉末分别为亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺与亚硝酸钠；所述的两瓶液体分别为盐酸水溶液与冰乙酸。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明的检测方法所需试剂环保、方便易得并且用量少，处理速度快，设备易得便携，定量准确，能够用于不同类型食品中亚硝酸盐的测定，并且一次可检测量大，能够实现高通量的分析，非常适合在菜场、商超等一线食品流通领域开展快速检测，也适合实验室内部的快速筛查。

(2)利用本发明的方法对质控物质进行检测，所述质控物质的含量已经通过其他标准方法测定，记作指定值，利用本发明的方法的检测结果与指定值相比，用“Z-比分数”进行评价，Z定义如下：

Z＝(x-X)/ξ，x指代检测结果，X指代指定值，ξ指代标准差；当|Z|≤2，测试结果满意；当2＜|Z|＜3，测试结果有问题；当|Z|≥3，测试结果不满意；

评价得到|Z|值≤2，测试结果满意，即本发明的检测方法的检测准确度高。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明进行具体的描述，但有必要在此指出的是以下实施例仅用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

实施例1：

本实施例测定废水中亚硝酸盐的含量，包括如下步骤。

(1)配置A、B、C、D溶液，方法如下：

A溶液(亚铁氰化钾溶液)：将10.6g亚铁氰化钾放入100mL细口塑料瓶中，用少量去离子水溶解亚铁氰化钾，然后用去离子水定容至100mL；

B溶液(乙酸锌溶液)：将22.0g乙酸锌放入100mL细口塑料瓶中，用3mL冰乙酸瓶溶解乙酸锌，然后用去离子水定容至100mL；

C溶液：15mL棕色细口塑料瓶中装有0.06g对氨基苯磺酸，加入浓度为20％(v/v)的盐酸水溶液，混匀，定容至15mL，避光保存。

D溶液:将0.03g盐酸萘乙二胺放入15mL棕色细口塑料瓶中，加入去离子水混匀，定容至15mL，避光保存。

(2)配置亚硝酸钠系列标准溶液，方法如下：

在100mL棕色容量瓶中放入0.0100g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加入去离子水溶解，混匀，并稀释定容至100mL，得到E溶液；

准确移取E溶液的液体0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL于10mL容量瓶中，用去离子水定容至10mL，混匀，得到浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的亚硝酸钠系列标准溶液，临用现配。

(3)配置待检测样品，方法如下：

称取1g废水于15mL离心管或比色管中，超声30min后，放入75℃水浴锅中加热5min，取出待冷却后加入1mLA溶液(亚铁氰化钾溶液)和1mLB溶液(乙酸锌溶液)，用等离子水定容至10mL，离心或过滤后取上清液，备用。

(4)将10个样品，即，浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的亚硝酸钠系列标准溶液样品，空白样品以及待检测样品各0.15mL分别加入到96孔板中的不同孔中，分别标记为1号孔、2号孔、3号孔……9号孔。然后，在1号孔、2号孔、3号孔……9号孔中分别加入0.10mLC溶液(对氨基苯磺酸溶液)，室温下摇板1min后静置5min，随后加入0.05mLD溶液(盐酸萘乙二胺溶液)，室温下摇板1min，随后静置15min。最后，用酶标仪在538nm下读板，根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

(5)重复上述步骤(4)5次；得到的废水中亚硝酸盐检测结果见表1，取各次检测结果的平均值，测得废水中亚硝酸盐平均含量为2.46mg/L。

表1废水中亚硝酸盐的检测结果(以亚硝酸钠计)(单位：mg/L)

序号	1	2	3	4	5	6	平均值	相对标准偏差(n＝6)
									结果	2.45	2.33	2.51	2.62	2.40	2.47	2.46	4.00％

实施例2：

本实施例测定白菜中亚硝酸盐的测定，包括如下步骤。

步骤(1)至步骤(2)与实施例1相同；

(3)配置待检测样品，方法如下：

将白菜样品切碎后打至糊状，称取白菜样品1g于15mL离心管中，超声30min后，放入75℃水浴锅中加热5min，取出待冷却后加入1mLA溶液(亚铁氰化钾溶液)和1mLB溶液(乙酸锌溶液)，用等离子水定容至10mL，过滤后取上清液，再用去离子水稀释10倍后，备用。

(4)将10个样品，即，浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的亚硝酸钠系列标准溶液样品，空白样品以及待检测样品各0.15mL分别加入到96孔板中的不同孔中，分别标记为1号孔、2号孔、3号孔……9号孔。然后，在1号孔、2号孔、3号孔……9号孔中分别加入0.10mLC溶液(对氨基苯磺酸溶液)，室温下摇板1min后静置5min，随后加入0.05mLD溶液(盐酸萘乙二胺溶液)，室温下摇板1min，随后静置15min。最后，用酶标仪在538nm下读板，根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

(5)重复上述步骤(4)5次，取各次检测结果的平均值，测得白菜样品中亚硝酸盐平均含量为3.07mg/kg。

实施例3：

本实施例测定香肠中的亚硝酸盐测定，包括如下步骤。

步骤(1)至步骤(2)与实施例1相同；

(3)配置待检测样品，方法如下：

将香肠样品切碎后打至糊状，称取香肠样品1g于15mL离心管中，超声30min后，放入75℃水浴锅中加热5min，取出待冷却后加入1mLA溶液(亚铁氰化钾溶液)和1mLB溶液(乙酸锌溶液)，用等离子水定容至10mL，过滤后取上清液，再用去离子水稀释20倍后，备用。

(4)将10个样品，即，浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的亚硝酸钠系列标准溶液样品，空白样品，待检测样品以及香肠质控物质各0.15mL分别加入到96孔板中的不同孔中，分别标记为1号孔、2号孔、3号孔……10号孔。其中，香肠质控样品的含量已经通过其他方式测定为15.00mg/kg，作为指定值。然后，在1号孔、2号孔、3号孔……10号孔中分别加入0.10mLC溶液(对氨基苯磺酸溶液)，室温下摇板1min后静置5min，随后加入0.05mLD溶液(盐酸萘乙二胺溶液)，室温下摇板1min，随后静置15min。最后，用酶标仪在538nm下读板，根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

(5)重复上述步骤(4)5次，取各次检测结果的平均值，测得香肠待检测样品样品中亚硝酸盐平均含量为21.22mg/kg。

测得香肠质控样品的含量是14.89mg/kg，|Z|值≤2，测试结果满意。其中Z为比分数，定义为Z＝(x-X)/ξ，x指代检测结果，X指代指定值，ξ指代标准差，此处取值为1.27；

当|Z|≤2，测试结果满意；

当2＜|Z|＜3，测试结果有问题；

当|Z|≥3，测试结果不满意。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.食品中亚硝酸盐的高通量快速检测方法，包括如下步骤：

(1)配置A、B、C、D溶液，方法如下：

亚铁氰化钾与去离子水混匀得到浓度为(8g-12g)/100mL的亚铁氰化钾溶液，记作A溶液；

乙酸锌与冰乙酸混匀得到浓度为(17.6g-26.4g)/100mL的乙酸锌溶液，记作B溶液；

在氨基苯磺酸中加入浓度为15％-25％(v/v)的盐酸水溶液，混匀得到C溶液，其中氨基苯磺酸浓度为(0.05g-0.08g)/15mL；

盐酸萘乙二胺与去离子水混匀得到浓度为(0.02g-0.05g)/15mL的盐酸萘乙二胺溶液，记作D溶液；

(2)亚硝酸钠与去离子水混匀，得到一系列不同浓度的亚硝酸钠标准溶液；

(3)配置待检测样品，方法如下：

将待测液体状原样或者糊状原样置于离心管或比色管中，超声分散一定时间后加热去除蛋白干扰，然后取出待冷却后加入A溶液、B溶液与去离子水，其中原样含量为(0.5g-1.5g)/10mL，A溶液的体积浓度为(0.5mL-1.5mL)/10mL，B溶液的体积浓度为(0.5mL-1.5mL)/10mL；然后，离心或过滤去除蛋白质等基质干扰后取上清液，得到待检测样品；所述糊状原样是将待测物粉碎至糊状得到；

(4)取相同体积(体积记作X)的空白样品、待检测样品以及不同浓度的亚硝酸钠标准溶液分别加入到多孔板中的不同孔中，然后，在各孔中分别加入相同体积的C溶液，混匀后加入相同体积的D溶液混匀；用酶标仪在538nm下读板，得到检测结果；根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述食品包含水、蔬菜、肉类以及蛋类中的一种或者几种。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述多孔板结构类似细胞培养板。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述多孔板的孔数包括6、12、24、48、96。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述步骤(2)中，亚硝酸钠标准溶液的浓度为0-1mg/L，更优选为0.05-0.5mg/L。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述步骤(3)中，根据实际需要用去离子水稀释待检测样品5-30倍后备用。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述步骤(3)中，加热去除蛋白等干扰时采用放入75℃水浴锅中加热3-10min。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述步骤(4)中，C溶液的其体积为(1/5-2/3)X；D溶液的体积为(1/5-2/3)X。

9.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述步骤(4)中，亚硝酸钠系列标准溶液样品的检测结果减去空白样品的检测结果作为亚硝酸钠系列标准溶液样品的标准检测结果；待检测样品的检测结果减去空白样品的检测结果作为待检测样品的标准检测结果；根据亚硝酸钠系列标准溶液样品的标准检测结果得到亚硝酸盐浓度与检测结果的标准曲线，然后对应该标准曲线与待检测样品的标准检测结果得到待检测样品中亚硝酸盐浓度。

10.实现如权利要求1至9中任一权利要求所述检测方法的试剂盒，包括多孔板、五瓶粉末以及两瓶液体试剂；所述的五瓶粉末分别为亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺与亚硝酸钠；所述的两瓶液体分别为盐酸水溶液与冰乙酸。